CN105349525A - 精子基因组dna的提取试剂及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精子基因组DNA的提取试剂包括：预处理试剂Ⅰ：pH为7.4-8.5，溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：50-300mM可溶性盐，1-200mM？EDTA；预处理试剂Ⅱ：pH为7.4-8.5，溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：30-150mMTris.Cl，1-50mM的EDTA，300-700mM可溶性盐，0.5-3％SDS，1-5％β-巯基乙醇；蛋白酶K；RNA酶。还提供了使用上述试剂提取精子基因组DNA的方法。该精子基因组DNA的提取试剂及其方法，对精子样本DNA抽提产率高、纯度高。

Description

精子基因组DNA的提取试剂及其方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种精子基因组DNA的提取试剂及其方法。

背景技术

基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA的提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容。我们通常需要大量高质量的动物基因组DNA来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些DNA是从动物的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。对于雄性动物而言，精液样本相对于其他组织更容易获得，利用精液来提取动物DNA是更有效的方法。

动物精液中含有高浓度的蛋白质，精子细胞膜较厚，一般的裂解方法难以使其破裂，释放基因组，并且精子中含大量精胺和亚精胺，这是一类小分子阳离子，与DNA结合后导致DNA溶解性下降。因此，提取高纯度的精子基因组DNA较为困难，而高浓度、密度的精子，提取其DNA更为困难，如附睾精液。

目前提取基因组DNA的方法主要有传统的酚氯仿抽提法和试剂盒法，其中酚氯仿抽提法操作繁琐且难以满足高质量实验的要求；试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是目前大多是针对血液、组织的专门提取试剂盒。这些方法对精子样本DNA抽提产率低、纯度低，难以满足高要求的分子生物学和高通量基因组实验的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种精子基因组DNA的提取试剂及其方法，对精子样本DNA抽提产率高、纯度高。

基于上述目的本发明提供的精子基因组DNA的提取试剂，包括：

预处理试剂Ⅰ：pH为7.4-8.5，溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：

50-300mM可溶性盐，1-200mMEDTA；

预处理试剂Ⅱ：pH为7.4-8.5，溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：

30-150mMTris.Cl，1-50mM的EDTA，300-700mM可溶性盐，0.5-3％SDS，1-5％β-巯基乙醇；

蛋白酶K：80-120μg/ml；

RNA酶：8-12mg/ml。

可选地，所述预处理试剂Ⅰ中的可溶性盐是NaCl、KCl或NaAc。

可选地，所述预处理试剂Ⅱ中的可溶性盐是NaCl、KCl或NaAc。

其中，预处理试剂Ⅰ为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。预处理试剂Ⅱ中添加NaCl、KCl或NaAc，其单价金属离子能置换与DNA结合的精胺和亚精胺，SDS消除残留的精胺和亚精胺，β-巯基乙醇破坏精子细胞膜表面的蛋白质结构，释放其基因组DNA，达到对细胞的裂解消化作用。同时，预处理试剂Ⅱ中Tris.Cl、EDTA、NaCl的混合液为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到破坏。用上述试剂预处理样本，可以提高精子DNA抽提产率、纯度高，可以满足高要求的分子生物学和高通量基因组实验的要求。

基于相同的发明构思，本发明还提供了使用上述试剂提取精子基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)分离精子，用磷酸缓冲液洗涤，离心、去上清；

2)预处理试剂Ⅰ洗涤，离心、去上清；

3)清洗后的精子中加入预处理试剂Ⅰ、预处理试剂Ⅱ、蛋白酶K、RNA酶，充分震荡，消化；

4)用基因组DNA抽提试剂盒法进行抽提；

5)溶解并存储。

优选地，步骤1)中所述精子总数1-20×10⁶个，体积为10～20μl。

优选地，步骤1)中磷酸盐缓冲液用量为：每次500-1200μl。

优选地，步骤2)预处理试剂Ⅰ的用量为：300～500μl。

优选地，步骤3)中消化时间为6-18h，温度为50-60℃。

优选地，步骤3)中预处理试剂Ⅰ为150-300μl、预处理试剂Ⅱ为150-300μl、30-50μl蛋白酶K、10-30μlRNA酶。

本发明提供的提取精子基因组DNA的方法清洗精子细胞，去除精液中的精浆，即去除了精浆中大量水、果糖、蛋白质和多肽、其他糖类(如葡萄糖)、酶类(如前列腺素)、无机盐和有机小分子等干扰精子DNA的抽提效果的物质，加入预处理试剂Ⅰ洗涤，使精子中DNA全程处于被保护的环境，防止其在加入蛋白酶后使释放出的DNA降解。因用磷酸盐缓冲液清洗后再用预处理试剂Ⅰ洗涤，更进一步去除影响最终纯度的杂质，使DNA在整个过程中处于受保护的环境，从而提高了最终纯度。

在预处理试剂Ⅱ中加入β-巯基乙醇，更有效的破坏细胞膜蛋白质结构，释放基因组DNA，提高抽提效率。另外，对两个预处理试剂中的pH进行了控制，使DNA处于更加稳定的状态，降解率降低，从而提高了抽提效率。基于相同的发明构思，本发明还提供了精子基因组DNA的提取试剂盒，该试剂盒包括上述预处理试剂Ⅰ、预处理试剂Ⅱ、蛋白酶K、RNA酶。

通过以上所述可以看出，本发明提供的精子基因组DNA的提取试剂及其方法，可以有效提取动物精子样本DNA，抽提产率高、纯度高，满足高要求的分子生物学和高通量基因组实验的要求，适用广泛、操作简便成本低、方便易得。

附图说明

图1为本发明实施例精子基因组DNA的提取试剂及方法提取公猪精子样本DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

实施例1：提取公猪精子样本DNA及分析

1、试剂

预处理试剂Ⅰ：pH＝8.0，溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：

150mMNaCl，10mMEDTA，该EDTA的pH＝8.0。

预处理试剂Ⅱ：pH＝8.0，溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：

100mMTris.Cl，该Tris.Cl的pH＝8.0，10mMEDTA，500mMNaCl，1％SDS，2％β-巯基乙醇。

蛋白酶K：100μg/ml；

RNA酶：10mg/ml。

2、实验样本的准备

采集4只公猪的附睾精液进行平行实验，往公猪的附睾输精管中注入空气或磷酸盐缓冲液，从附睾体和附睾尾的连接处分离出输精管，开口，将精子注入到离心管中保存。或采集动物正常射出的精液。

采取附睾精子为样本避免了对试验动物进行调教过程，大大减少了收集精子样本的时间，减少人力和饲养成本，节约试验成本以及试验周期，分离附睾精子是利用还未调教公猪精液最方便有效的方法。

精子计数：总数10×10⁶个，15μl用于基因组DNA的提取。

3、用步骤1中的试剂进行精子样本基因组DNA的提取

①将分离得到的公猪的附睾精子加入到1.5ml离心管中用磷酸盐缓冲液洗三次，每次1ml，1000rpm/min，离心3min，弃上清；

②用500μl预处理试剂Ⅰ洗一次，1000rpm/min，离心3min，弃上清；

③对清洗后的精子中加入200μl预处理试剂Ⅰ，200μl预处理试剂Ⅱ，40μl蛋白酶K，20μlRNA酶，充分震荡混匀后，56℃水浴，消化12h；

④用基因组DNA抽提试剂盒法(Qiagen组织血液DNA抽提试剂盒)进行抽提；

⑤用无RNA酶及DNA酶的水或DEPC水溶解DNA并存储。

4、DNA质量检测

步骤3中提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，并使用NanoDrop-2000微量核酸蛋白检测仪对DNA浓度进行检测。

图1为本发明实施例精子基因组DNA的提取试剂及方法提取公猪精子样本DNA的琼脂糖凝胶电泳图。如图1所示，其中孔道M1为DNAmarker，孔道1-4分别为提取的四只公猪的精子样本基因组DNA，上样量均为1μl。琼脂糖浓度为0.8％的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶电泳显示，提取四只公猪的精子样本基因组DNA均可见清晰条带。

使用Nano-2000微量核酸蛋白检测仪对核酸浓度进行检测，结果见下表：样本1-4分别为四只猪精子样本基因组DNA。采用上述试剂及方法抽提猪精子基因组DNA浓度均>50ng/μl，其A260/280均为1.8-2.0间，浓度高，纯度好，稳定性高。并且，本发明提供的精子基因组DNA的提取试剂及其方法也可用于羊、牛、熊猫或野生动物的精子基因组DNA的提取。

表1DNA浓度检测结果

实施例2：提取猪精子样本DNA及分析

实施例1中步骤1的试剂替换为下述试剂，其余与实施例1相同，提取猪精子样本DNA，检测。

预处理试剂Ⅰ：pH＝8.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：

250mMKCl，150mMEDTA，该EDTA的pH＝8.0。

预处理试剂Ⅱ：pH＝8.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：

130mMTris.Cl，该Tris.Cl的pH＝8.0，45mMEDTA，650mMKCl，2.5％SDS，4％β-巯基乙醇。

蛋白酶K：80μg/ml；

RNA酶：9mg/ml。

使用NanoDrop-2000检测提取的猪精子样本DNA，其浓度达88ng/μl，OD值(A260/280)为1.83。

实施例3：提取猪精子样本DNA及分析

实施例1中步骤1的试剂替换为下述试剂，其余与实施例1相同，提取猪精子样本DNA，检测。

预处理试剂Ⅰ：pH＝8.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：

50mMNaAc，50mMEDTA，该EDTA的pH＝8.0。

预处理试剂Ⅱ：pH＝8.0，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：

30mMTris.Cl，该Tris.Cl的pH＝8.0，20mMEDTA，300mMNaAc，0.5％SDS，1％β-巯基乙醇。

蛋白酶K：110μg/ml；

RNA酶：12mg/ml。

使用NanoDrop-2000检测提取的猪精子样本DNA，其浓度达85ng/μl，OD值(A260/280)为1.87。

实施例4：不同抽提方法结果对比

采用下列不同方法对同一公猪精子样本DNA进行抽提，比较不同方法抽提DNA的质量。

方法一：样品磷酸盐缓冲液洗三次后，采用蛋白酶K消化不同时间后，试剂盒DNA抽提法抽提。

方法二：样品采用磷酸盐缓冲液洗三次，加入试剂1(Tris.Cl,EDTA,NaCl,SDS)200μL(未添加β-巯基乙醇)、试剂2(DTT,NaAc)200μL、40μL蛋白酶K、20μLRNA酶，不同时间消化后采用试剂盒DNA抽提法。

方法三：样品采用磷酸盐缓冲液洗三次后，采用传统的酚氯抽提DNA法。

方法四：本发明实施例1的方法抽提DNA，其中消化时间分别为6h和12h。

检测结果见下表：

表2不同方法提取基因组DNA的浓度检测结果

可见本发明采用的方法抽提的DNA浓度和纯度明显高于其他方法。

通过以上所述可以看出，本发明提供的精子基因组DNA的提取试剂及其方法，可以有效提取动物精子样本DNA，抽提产率高、纯度高，满足高要求的分子生物学和高通量基因组实验的要求，适用广泛、操作简便成本低、方便易得。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种精子基因组DNA的提取试剂，其特征在于，包括，

预处理试剂Ⅰ：pH为7.4-8.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：

50-300mM可溶性盐，1-200mMEDTA；

预处理试剂Ⅱ：pH为7.4-8.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：

30-150mMTris.Cl，1-50mM的EDTA，300-700mM可溶性盐，0.5-3％SDS，1-5％β-巯基乙醇；

蛋白酶K：80-120μg/ml；

RNA酶：8-12mg/ml。

2.根据权利要求1所述的精子基因组DNA的提取试剂，其特征在于，所述预处理试剂Ⅰ中的所述可溶性盐是NaCl、KCl或NaAc。

3.根据权利要求1所述的精子基因组DNA的提取试剂，其特征在于，所述预处理试剂Ⅱ中的所述可溶性盐是NaCl、KCl或NaAc。

4.一种使用权利要求1所述的提取精子基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分离精子，用磷酸缓冲液洗涤三次，离心、去上清；

2)预处理试剂Ⅰ洗涤一次，离心、去上清；

3)清洗后的精子中加入预处理试剂Ⅰ、预处理试剂Ⅱ、蛋白酶K、RNA酶，充分震荡，消化；

4)用基因组DNA抽提试剂盒法进行抽提；

5)溶解并存储。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述精子总数1-20×10⁶个，体积为10～20μl。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中磷酸盐缓冲液用量为：每次500-1200μl。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)预处理试剂Ⅰ的用量为：300～500μl。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中消化时间为6-18h，温度为50-60℃。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中预处理试剂Ⅰ为150-300μl、预处理试剂Ⅱ为150-300μl、30-50μl蛋白酶K、10-30μlRNA酶。

10.包括权利要求1-3任意一项所述的试剂的精子基因组DNA提取试剂盒。