CN102477423B - 一种从克氏原螯虾虾壳中提取dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产动物分子生物学DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法。其步骤为：将浸泡在乙醇溶液中的克氏原螯虾虾壳剪碎，向离心管中加入适量组织裂解液、EDTA、二硫苏糖醇和蛋白酶K等，经水浴裂解、乙酸铵抽提等步骤，得到克氏原螯虾总DNA。本发明具有操作简单、方便，所用试剂毒性较小，样本取样时对实验动物伤害小，样本易长期保存，且提取的DNA降解程度比从虾尾肌中提取的DNA降解程度低。本发明制备的DNA可以用于克氏原螯虾种群遗传多样性分析及相关分子生物学应用。

Description

一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法

技术领域

本发明属于水产动物分子生物学DNA样品制备技术领域，具体涉及一种从克氏原螯虾虾壳中提取DNA的方法。本发明制备的DNA可以用于克氏原螯虾种群遗传多样性分析及相关分子生物学应用。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，隶属于甲壳纲，十足目，螯虾科，原螯虾属，原产于墨西哥北部和美国南部，现已成为世界上著名的入侵物种之一。由于其个体较大，适应性强，能忍受长达4个月的枯水期，繁殖率高，可形成单优势种群，压制、排挤或破坏本地物种，危及到本地物种的生存安全，影响入侵地生物多样性。然而，由于其较高的经济价值，克氏原螯虾已成为我国一个重要的淡水经济养殖品种。为防止该入侵物种借助人工养殖的作用继续扩散，应积极开展其种群调节和控制的各项研究，以最大化地消除其入侵的负面影响，提高其经济价值。近年来此类研究主要集中在克氏原螯虾在我国的种群遗传多样性、种群遗传结构、与抗逆性相关基因以及分子标记等方面，而采集样本和提取样本DNA是这些相关研究的基础。

目前，不仅克氏原螯虾，其它虾也多是采集尾肌作为样本DNA的来源，尚未见到以虾壳为样本DNA来源的报道。以虾尾肌为样本DNA来源具有如下缺点：1.虾尾肌在采集和保存的过程中容易发生不同程度的腐败(肉离体后一般会经历肉的僵直、肉的成熟、肉的腐败三个连续变化过程，猪肉和鸡肉等畜禽肉一般经历前两阶段的时间较长，而虾鱼肉一般经历前两个阶段的过程很短，极易进入腐败过程)，其所含DNA也会随之发生一定程度的降解，夏季采样时此种现象尤为明显；2.取虾尾肌往往需要处死虾，因此对于有些种用虾或者还需要继续饲养以进行后续实验的虾来说，取尾肌则是行不通的；3.如果在采样过程中虾尾肌发生污染，则污染源无法剔除。若以虾壳为样本DNA来源则可克服以上缺点，具有较强的应用性。然而，由于虾壳坚硬，很难裂解，再加上虾壳中含有丰富的甲壳素在提取过程中很难洗涤干净，目前亦尚未见到从虾壳中成功提取DNA的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，该种方法操作方便，所用试剂毒性较小，其样本取样时对实验动物伤害小，样本易长期保存，且提取的DNA降解程度比从肌肉中提取的DNA降解程度低，经过检测和检验能满足后续相关实验研究的需要。

实现本发明的技术方案如下：

一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，包括以下步骤：

1)取克氏原螯虾虾壳50mg，用滤纸吸干后置入2ml的离心管中，用剪刀将虾壳剪碎；

2)向步骤1)的离心管中加入500μL的组织裂解液，0.5M的EDTA60μL，1M的二硫苏糖醇40μL和20mg/mL的蛋白酶K 10μL，于65℃下水浴4-5h，期间每隔0.5～1h摇匀一次，得到样品1；

3)将步骤2)的样品1取出置冰上冷却后，加入7.5M的乙酸铵200μL，充分混匀，冰上冷却5min，得到样品2；

4)将步骤3)的样品2用冷冻离心机于4℃，12000rpm，离心10min后，吸取上清液移入另一离心管中，重复步骤3)，得到样品3；

5)用冷冻离心机将步骤4)中的样品3于4℃，12000rpm下离心10min后，取上清液移入另一离心管中，按体积比加入1～1.5倍的异丙醇，轻轻摇动1～2min，得到样品4；

6)采用冷冻离心机将步骤5)中的样品4于4℃，12000rpm下离心10min后，弃去上清，得DNA沉淀样品1；

7)将步骤6)中的沉淀加入浓度为70％的乙醇1mL进行洗涤，用冷冻离心机于4℃下12000rpm，离心10min后弃去上清，得到DNA沉淀样品2；

8)将步骤7)中的沉淀加入无水乙醇1mL进行洗涤，用冷冻离心机于4℃下12000rpm，离心10min后弃去上清，得到DNA沉淀样品3；

9)将步骤8)的DNA沉淀样品3于室温置于敞开的离心管内直至可见的痕量的乙醇挥发殆尽(注意不要使样品长时间干燥，否则很难溶解)后，加入20-40μL灭菌双蒸水，置于4℃冰箱12-24h直至DNA样品完全溶解，得到克氏原螯虾总DNA溶液。

其中

步骤2)所述的组织细胞裂解液组分如下：100mM Tris-HCl，pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％十二烷基硫酸钠。

本发明具有以下优点：

1.本发明中使用的试剂毒性比常规的酚氯仿法提取DNA所用试剂的毒性要小，且能从坚硬的外壳中提取出足够浓度和高质量的DNA以满足后续相关实验的需求。

2.本发明中利用的虾壳属于虾体中的坚硬组织，因为坚硬的外层对于时间和外界环境因素有很强的抵抗力，可防止内层的DNA分子受到破坏，同时能够有效地防止外源性DNA的污染。此外，外表坚硬的组织即便采取洗、刮、磨等手段，也不会破坏内层的DNA分子，能更彻底地去除外源性DNA的污染。

3.本发明中采用无水乙醇保存虾壳，经无水乙醇浸润过的虾壳取出吸干后用剪刀很容易剪碎，不需要粉碎或研磨，简单方便，易于操作。

4.因虾壳DNA分子有坚硬的外层保护，其取材后样本保存时间会比肌肉取材样本要长得多，所以从其内提取的DNA的降解程度较低。从图1中可见琼脂糖检测虾壳DNA的拖带现象没有肌肉DNA的严重，可见从虾壳提取的DNA的降解程度比从虾尾肌中提取DNA的降解程度低。

5.克氏原螯虾的螯足具有再生功能，若以部分螯足作为DNA来源样本，可以在不处死克氏原螯虾的情况下获取DNA，同时可以继续饲养和观测其生长。

附图说明

图1：琼脂糖检测不同个体虾尾肌和虾壳DNA的降解情况。图中：M为marker(1Kb DNAladder)；1、3和5为肌肉组织DNA；2、4和6为外壳DNA。

图2：对分别以虾壳DNA和虾尾肌DNA为模板的PCR产物检测。图中：M为marker(DL2000)；1为以虾尾肌DNA为模板的PCR产物；2为以虾壳DNA为模板的PCR产物。

图3：以引物PCLG-09扩增的部分群体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中：M为marker(puc18DNA/MspI)；其余泳道为引物PCLG-09对群体中部分个体DNA的扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步阐述本发明，但是实施例不会构成对本发明的限制。

实施例1提取克氏原螯虾虾壳DNA

从市场购买新鲜的克氏原螯虾，取其部分虾壳，置于无水乙醇中浸泡保存(保存时间为一个月)

1)试剂配制：

A)组织细胞裂解液：100mM Tris-HCl，pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％十二烷基硫酸钠(SDS)；

B)0.5M EDTA：23.3g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H₂O)溶于100mL双蒸水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，搅拌的同时加入NaOH调节pH值至8.0，然后高压蒸汽灭菌(121℃，灭菌20min)，常温保存(注：二水乙二胺四乙酸二钠需加入NaOH将溶液的pH值调至8.0时才会溶解)。

C)1M二硫苏糖醇(DTT)：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4mL水，分成小份贮存于-20℃；

D)20mg/mL蛋白酶K：在100mg蛋白酶K的原装瓶中加入5mL灭菌双蒸水，分成小份贮存于-20℃；

E)7.5M乙酸铵：50mL双蒸水中加入28.9g乙酸铵，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌；

F)70％乙醇：70mL的无水乙醇加上30mL的灭菌双蒸水配成100mL70％乙醇溶液，4℃贮存。

G)其它试剂如异丙醇等直接冷藏备用。

2)按以下步骤提取DNA：①取约50mg外壳(经无水乙醇保存)，用滤纸吸干后置入2ml离心管，用剪刀将虾壳充分剪碎；②加入500μL的组织细胞裂解液、60μL的EDTA、40μL的DTT和10μL的蛋白酶K(20mg/mL)；③56℃水浴过夜或65℃4-5h，期间每隔0.5～1h摇匀一次；④拿出冷却至室温或置冰上冷却，加入200μL的乙酸铵，充分混匀，冰上冷却5min或置4℃10min；⑤4℃，12000rpm，10min，然后吸取上清液移入另一新的离心管，加入200μL的乙酸铵，充分混匀，冰上冷却5min或4℃10min；⑥4℃，12000rpm，10min；然后吸取上清液移入另一新的离心管，加入约1～1.5倍上清液体积的异丙醇，轻轻摇动1～2min；⑦4℃，12000rpm，10min，弃去上清，留沉淀；⑧加入70％乙醇1ml进行洗涤，4℃，12000rpm，10min；⑨弃去上清，加入无水乙醇1ml进行洗涤，4℃，12000rpm，10min；⑩室温晾干，加入40μL的ddH₂O，-20℃贮存备用。

实施例2

按照实施例1的步骤，其中克氏原螯虾虾壳是用无水乙醇保存为3个月的材料。

实施例3

按照实施例1的步骤，其中克氏原螯虾虾壳是用无水乙醇保存为6个月的材料。

实施例4两种提取DNA方法的比较

本实施例通过采用实施例1方法提取虾壳DNA，与常规的酚氯仿法(萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)提取虾尾肌DNA(组织部位不同，但是提取的DNA个体相同)的结果比较，验证了从虾壳中提取的DNA纯度和浓度同样可以满足后续相关实验的要求。

克氏原螯虾群体30尾个体，雌雄各15尾，分别取虾壳和虾尾肌做样本，无水乙醇分装保存。取虾壳和虾尾肌用滤纸吸干后，按本发明方案从虾壳中提取DNA，并用常规酚氯仿法(萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)从虾尾肌中提取DNA，提取的部分样本DNA用1.0％琼脂糖凝胶检测结果见图1，提取的全部样本DNA均用仪器NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)检测其纯度和浓度，结果见表1：

表1克氏原螯虾虾壳DNA和虾尾肌DNA样本的浓度和纯度检测结果

从表1可得，从虾壳中提取的DNA的浓度范围为132.7～938.8ng/μL，平均浓度为318.6ng/μL；OD260/280值1.79～2.08，平均值为1.95；从虾尾肌中提取的DNA浓度范围为148.1～1687.3ng/μL，平均浓度为673.1ng/μL；OD260/280值1.78～2.07，平均值为1.93。可见两种方法提取的DNA其浓度和纯度均能满足后续相关实验的需求。

实施例5利用实施例4提取的DNA进行酚氧化酶原基因proPO部分片段的克隆。

对实施例4中提取的虾壳DNA(编号Sf2)和虾尾肌DNA(编号Tf2)，用引物PPO-F(GCCAGGATAATACCCTACTC)和PPO-R(TGTCATGGCAGAATGCCAGC)进行PCR扩增。

反应体系为(50μL)：10×Buffer 5μL、dNTP(10mM)2μL、引物PPO-F 1μL、引物PPO-R1μL、DNA 3μL、LA-Taq 0.5μL、ddH2O 37.5μL。

反应程序为：94℃，5min；94℃，30sec，57℃，45sec，72℃，3min，5个循环；94℃，30sec，52℃，45sec，72℃，3min，24个循环；72℃，10min，4℃保存。

扩增结果用1.0％的琼脂糖凝胶进行检测(见图2)，均可见一条大小在1.6～1.8kb片段的条带，虾壳和虾尾肌DNA两者的扩增结果一致，条带大小均和LI Yan-he等的研究结果相符(LI Yan-he，ZHENG Fang-liang，CHEN Hong-quan，WANG Han-zhong，WANG Liu-quan andXU Di-ping.(2009)Cloning and Sequence Analysis of Prophenoloxidase from Haemocytes of theRed Swamp Crayfish，Procambarus clarkii.Agricultural Sciences in China 8(3)：369-379)。这表明从虾壳中提取DNA的质量可以满足PCR的需求。

实施例6利用7对微卫星引物对一个克氏原螯虾群体进行扩增分析

本实施例进一步验证了用本发明方法提取的虾壳DNA质量可以满足后续相关PCR的要求，可用于克氏原螯虾种群遗传学的研究。

从江苏省常州市武进区横林镇采集克氏原螯虾50尾个体，雌雄各25尾，取虾壳约50mg，无水乙醇保存，按实施例1的步骤提取DNA。用7对微卫星引物PCL02、PCL24(Zhu Z Y YueG H.(2008)Eleven polymorphic microsatellites isolated from red swamp crayfish，Procambarusclarkii.Molecular Ecology Resources 8：796-798)、PcLG-03、PcLG-07、PcLG-09、PcLG-29、PcLG-32(Belfiore N M，May B.(2000)Variable microsatellite loci in red swamp crayfish，Procambarus clarkii，and their characterization in other crayfish taxa.Molecular Ecology9：2231-2234)对所提的虾壳DNA进行PCR扩增。

反应体系为(15μL)：10×PCR buffer(1.5μL)、10mM dNTPs(0.2μL)、Taq DNA聚合酶(1U)、10μM上下游引物(各0.5μL)、DNA模板(2μL)、加ddH₂O至15μL。

PCR反应循环参数为：95℃预变性2min；然后95℃变性30s，50-60℃(引物不同其退火温度不同，具体可参考文献Zhu ZY et al(Zhu Z Y，Yue G H.(2008)Eleven polymorphicmicrosatellites isolated from red swamp crayfish，Procambarus clarkii.Molecular EcologyResources 8：796-798)和Belfiore NM et al.(Belfiore N M，May B.(2000)Variable microsatelliteloci in red swamp crayfish，Procambarus clarkii，and their characterization in other crayfish taxa.Molecular Ecology 9：2231-2234))退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增产物检测：采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在200V电压下电泳，然后进行银染照相。根据每个个体电泳结果显示的条带位置的不同确定其基因型，以puc18DNA/MspImarker作对照。

使用POPGENE version 1.31软件(http://www.ualberta.ca/～fyeh/popgene_download.html)统计分析该群体微卫星位点的观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)，Hardy-Weinberg平衡偏离指数计算公式为：D＝(Ho-He)/He，多态信息含量按Botstein等(1980)的公式计算：

$\mathrm{PIC}=1-\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{p_i}^2-\underset{i=1}{\overset{m-1}{\mathrm{\Σ}}}\underset{j=i+1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}2{p_i}^2{p_j}^2$

其中pi和pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率，m为等位基因数。

分析结果如下：

应用7对引物对克氏原螯虾常州地理群的50个个体进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(其中以引物PCLG-09扩增的部分群体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图3)。读取全部基因型，7个基因位点获得了67个等位基因。不同的引物获得的等位基因数为3-22个不等，7个微卫星位点均具有较高的多态性，PCLG-03获得22个等位基因，等位基因数最多，该位点多态性最好。

表2克氏原螯虾群体在7个微卫星位点上的多态信息含量(PIC)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和Hardy-Weinberg平衡偏离指数统计

表3克氏原螯虾群体在7个微卫星位点上的平均等位基因数(Na)、平均有效等位基因数(Ne)、平均多态信息含量(PIC)、平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)

7个微卫星位点在群体中的等位基因数观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量、Hardy-Weinberg平衡偏离指数和平均等位基因数以及平均有效等位基因数等数据统计结果见表2和表3。结果表明，不同位点在该群体中都表现出不同程度的多态性，不同座位上的等位基因数在3-22之间，平均每个座位上的等位基因数为9.5714，平均有效等位基因数为5.0190，平均多态信息含量为0.6769，平均观测杂合度为0.4638和平均期望杂合度为0.7214，说明该地方的克氏原螯虾的遗传多样性处于较高水平。

刘炜利用7个多态性微卫星位点(PclG02、PclG04、PclG07、PclG08、PclG17、PclG28、PclG29)探讨了东部地区6个克氏原螯虾群体(镇江、邵伯湖、高宝湖、洪泽湖、微山湖、兴化)的遗传多样性状况(刘炜.(2008)克氏原螯虾肌肉肌苷酸含量及遗传多样性研究(硕士学位论文).扬州：扬州大学)，结果显示，克氏原螯虾期望杂合度值为0.6288，多态信息含量为0.5460，说明这些地区克氏原螯虾遗传多样性处于较高水平。王长忠等(2009)利用17对微卫星引物对南京、盱眙、合肥、南昌4个克氏原螯虾地理群体进行了遗传多样性研究(王长忠、李忠、梁宏伟、呼光富、吴勤超、邹桂伟、罗相忠.(2009)长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析.生物多样性17(5)：518-523)，结果表明，4个地理群体的平均观测杂合度为0.4322-0.4826、平均期望杂合度为0.4024-0.6121、平均多态信息含量为0.3408-0.5624，4个克氏原螯虾群体的遗传多样性处于中等水平，其中南京群体遗传多样性最高。本研究中常州群体的结果与以上研究结果较为一致。说明在种群遗传研究中，从虾壳中提取的DNA能够满足实验需求，因此虾壳可以作为种群遗传相关研究的DNA来源样本。

Claims (2)

1.一种从克氏原螯虾的虾壳中提取DNA的方法，其特征包括以下步骤：

1)取经无水乙醇保存处理后的克氏原螯虾虾壳50mg，用滤纸吸干后置入2ml的离心管中，用剪刀将虾壳剪碎；

2)向步骤1)的离心管中加入500μL的组织细胞裂解液、0.5M的EDTA60μL、1M的二硫苏糖醇40μL和20mg/mL的蛋白酶K 10μL，于65℃下水浴4-5h，期间每隔0.5～1h摇匀一次，得到样品1；

3)将步骤2)的样品1取出置冰上冷却后，加入7.5M的乙酸铵200μL，充分混匀，冰上冷却5min，得到样品2；

4)将步骤3)的样品2用冷冻离心机于4℃，12000rpm，离心10min后，吸取上清液移入另一离心管中，重复步骤3)，得到样品3；

5)用冷冻离心机将步骤4)中的样品3于4℃，12000rpm下离心10min后，取上清液移入另一离心管中，按体积比加入1～1.5倍的异丙醇，轻轻摇动1～2min，得到样品4；

6)采用冷冻离心机将步骤5)中的样品4于4℃，12000rpm下离心10min后，弃去上清，得DNA沉淀样品1；

7)将步骤6)中的沉淀加入浓度为70％的乙醇1mL进行洗涤，用冷冻离心机于4℃下12000rpm，离心10min后弃去上清，得到DNA沉淀样品2；

8)将步骤7)中的沉淀加入无水乙醇1mL进行洗涤，用冷冻离心机于4℃下12000rpm，离心10min后弃去上清，得到DNA沉淀样品3；

9)将步骤8)的DNA沉淀样品3于室温置于敞开的离心管内，待乙醇挥发干净后，加入20-40μL灭菌双蒸水，置于4℃冰箱12-24h直至DNA样品完全溶解，得到克氏原螯虾总DNA溶液；

其中

步骤2)所述的组织细胞裂解液组分如下：100mM Tris-HCl，pH8.0；50mM EDTA，pH 8.0；1％十二烷基硫酸钠。

2.权利要求1所述的方法在克氏原螯虾种群遗传多样性分析中的应用。

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