CN106916884B

CN106916884B - 一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记ssr450及其应用

Info

Publication number: CN106916884B
Application number: CN201611219855.9A
Authority: CN
Inventors: 夏军红; 谷小慧; 梁明; 龙金华
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN106916884A

Abstract

本发明公开了一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450及其应用。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明开发的尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450，其特异性强，能较好地区分出耐盐和不耐盐个体。因此，该分子标记可用于尼罗罗非鱼耐盐个体的快速筛选和选育，提高生产效益。

Description

一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450及其应用。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)原产于非洲大陆和中东地区咸淡水域，因形似鲫鱼故又称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目(Perciformes)、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属Tilapia。罗非鱼具有食性杂，生长快繁殖强，味道鲜美且肌间刺少等优势，是世界水产业重点科研培养的淡水养殖鱼类，也是联合国粮农组织(FAO)推广的重要养殖品种。目前，我国罗非鱼养殖年产量世界第一，占世界罗非鱼产量的60％左右，主要有莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、吉富罗非鱼等养殖品种。其中，尼罗罗非鱼因体型相对较大、质嫩刺少、生长快等优势，现已成为世界性的主要养殖鱼类品种之一，产量也在逐年递增。但其耐盐性不强，不能在海水中养殖，只能局限在淡水中养殖。随着我国对内陆淡水环境的保护加强，淡水养殖可利用水域面积短缺，尼罗罗非鱼的淡水养殖业将受到很大程度的制约。与此同时，我国还存在大量未被利用的盐碱水域。这些盐碱水域具有高盐、高碱、高PH和复杂离子组成等特点，不利于罗非鱼的养殖，从而大大限制了这些水域的开发和利用。因此，培养一种适合在咸海水中养殖的耐盐性品种对于这些水域的开发和渔业持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性的区分出耐盐和不耐盐尼罗罗非鱼个体的尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450。

本发明的尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物，其特征在于，包括：

上游引物：5’-GCCGCAGTGCTTTTACCATTAG-3’；

下游引物：5’-CATTTCCACTCGTCTCATCTGTCC-3’。

本发明的第三个目的是提供一种筛选尼罗罗非鱼耐盐个体的筛选方法，其特征在于，提取待测尼罗罗非鱼的基因组DNA，以上述尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物进行PCR反应，然后对PCR产物进行基因分型，判断待测尼罗罗非鱼是否为耐盐个体。

所述的PCR反应为以20μl计算：

所述的PCR反应条件为：95℃,3min；然后95℃,40s,61℃,30s，72℃,1min,34个循环；72℃，10min。

本发明的第四个目的是提供上述尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物在尼罗罗非鱼耐盐个体的快速筛选和选育中的应用。

相比于现有技术，本发明的优点和效果：

我国咸海水养殖面积充足，而尼罗罗非鱼具有生长速度快，肉质细腻但是不耐盐的特点。为了充分利用我国广阔的咸海水域，大面积养殖尼罗罗非鱼，提高经济效益，解决尼罗罗非鱼不耐盐缺陷变得至关重要。本发明开发的尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450，其特异性强，能较好地区分出耐盐和不耐盐个体。因此，该分子标记可用于尼罗罗非鱼耐盐个体的快速筛选和选育，提高生产效益。

附图说明

图1是急性高盐处理条件下各30个极端个体的分子标记SSR450的PAGE电泳、银染条带。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

一、全同胞家系的构建及实验样品的获取

2015在广州市五龙岗水产发展有限公司挑选优质尼罗罗非鱼亲鱼1对成功构建了1个全同胞家系(N＝400)。尼罗罗非鱼实验鱼在广州市五龙岗水产发展有限公司进行淡水养殖，运回中山大学东校区鱼类养殖实验室进行急性耐盐处理。

实验在2.0×1.5×1.2鱼池中进行，先将有疾病表征的尼罗罗非鱼捞出，以免影响实验。实验前饥饿一天，处理期间不投饵，不换水。从上午10点开始，每隔15分钟往鱼池中倒入一包海盐(1斤/包)，逐渐增加鱼池内盐浓度，用盐度计随时检测盐浓度，并用捞网搅拌扩散，防止局部盐度过高。

中午12点17分，开始有尼罗罗非鱼死亡，停止倒入海盐，马上打捞出死亡的尼罗罗非鱼，进行称重，记录下尼罗罗非鱼死亡时间与重量。接下来的两小时内，陆续有尼罗罗非鱼死亡。捞出刚死亡的尼罗罗非鱼后，剪下鱼左腮，保存于无水乙醇中，以尼罗罗非鱼死亡先后为顺序编号，备用。耐盐性指标为尼罗罗非鱼死亡时间，先死的尼罗罗非鱼对盐敏感，耐盐性低，后死的对盐不敏感，耐盐性高。

二、基因组DNA的来源和提取

亲代和子代DNA的提取

样品：实施例1中实验获得的400条尼罗罗非鱼的鱼鳃，耐盐和不耐盐的各200条。实验中仅对两个极端共281条鱼进行了基因分型。

DNA提取步骤：

使用东盛基因组DNA快速提取试剂盒提取亲本DNA，提取的DNA稀释到10ng/μl后于-20℃保存备用。子一代DNA使用96孔板进行提取，步骤如下：

1、取一1.5ml的96孔板，置于冰上，每孔加入300μl的Set buffer(10mM TrispH8.0，50mM EDTA pH 8.0，200mMNaCl，0.5％SDS)，50μl蛋白酶K(20mg/ml)；

2、用灭过菌的剪刀剪下3*3mm²大小的鱼鳃样品，放在滤纸上，将样品上残留的无水乙醇吸干，放到裂解液中；

3、简短离心后放入摇床中，将温度设置为55℃，转速80rpm，消化过夜；

4、取硅胶柱(96孔)，下面用96孔板承接滤液，每孔加240ul 6M现配的NaI，再加入80μl的裂解液，2000g离心1min，倒去滤液；

5、每孔加入240μl的wash buffer(10mM Tris pH7.5，1mM EDTA pH7.5，100mMNaCl，50％乙醇)，2000g离心3min后，静置干燥5min；

6、每孔加入120μl的纯水，在室温下静置2min后，2000g离心2min得到DNA样品；

7、1％琼脂糖凝胶电泳，120v电泳30min，凝胶成像系统拍照。提取的DNA稀释5倍后放入-20℃保存备用。

三、微卫星引物的获得

1、微卫星引物的多态性筛选

登录UCSC网站(https://genome.ucsc.edu/)，找到尼罗罗非鱼LG18连锁群QTL区间(21-25Mb)，在该区间近中间位置的转录本LG18.1114(chrLG18:23,031,649-23,051,010)内发现存在含(CA)n碱基重复的SSR序列。下载该基因的序列，用EditSeq软件进行序列的剪切，将剪切后的序列(如SEQ ID No.1所示，即为分子标记SSR450)用PrimerSelect软件进行引物设计，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，引物的上游引物：5’-GCCGCAGTGCTTTTACCATTAG-3’，下游引物：5’-CATTTCCACTCGTCTCATCTGTCC-3’。

即分子标记SSR450的扩增引物：

上游引物：5’-GCCGCAGTGCTTTTACCATTAG-3’；

下游引物：5’-CATTTCCACTCGTCTCATCTGTCC-3’。

2、PCR反应反应体系为：PCR DS Mix 10μl，上下游引物(上游引物：5’-GCCGCAGTGCTTTTACCATTAG-3’，下游引物：5’-CATTTCCACTCGTCTCATCTGTCC-3’)各0.8μl，模板DNA 2μl，补充水6.4μl至总体积20μl，反应条件设为95℃,3min；然后95℃,40s,61℃,30s，72℃,1min,34个循环；72℃,10min，得到PCR产物。

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测

1)制胶

取纯水25ml，5×TBE 4ml，Acr-bis(30％)10.7ml，TEMED 26μl，APS(10％)280μl，用玻璃棒充分搅拌均匀，将配置好的凝胶注入组装好的两玻璃板之间，轻轻插入梳子，静置1-2小时，待其凝固。

2)电泳

胶凝固后，将胶连同玻璃板一起取下，安置在电泳槽中；依次序将步骤三的PCR产物进行点样，每孔3μl；盖好上盖，将电压调到200V，电泳10分钟后，将电压调到600v，继续电泳1.5小时。

3)银染

电泳结束后，排出缓冲液，从电泳槽中取下玻璃板，用薄板轻轻撬开两块玻璃板，将凝胶放入装有纯水的盘中，使凝胶与玻璃板脱离；倒掉纯水，加入500ml的染色液(1％AgNO₃)，染色大约5分钟后将胶转移到装有纯水的盘中，漂洗5-10秒，倒掉纯水，加入显色液(20g NaOH+0.5g Na₂CO₃+4ml甲醛溶液(37％)加入1L纯水中，使用前置入冰中预冷，显色约10-15min，至条带开始呈现，倒掉显色液，加入纯水浸泡5min，观察条带并拍照(图1)。

五、基因分型

根据亲子代之间的遗传规律对图1的PCR产物凝胶电泳银染照进行基因型读取，条带的读取原则为：子代的条带必须一条来自父方，一条来自母方，从而确定子代的基因型。将读取的基因型用Excel进行整理并统计分析，确定该标记的可行性(表1，表1中序号与图1中的序号相同的为同一样本，其中A,B,C分别代表三个不同的等位基因，自下而上依次与条带对应，根据条带的位置命名基因型，AC和BC代表两种不同的基因型。根据上述的条带读取原则即遗传规律可知，母本的基因型为AC，父本的基因型为BC，那么子代的基因型肯定一个来自于父本，一个来自于母本。AC型子代的A基因来自母亲，C基因则来自于父亲，BC 型子代的B基因来自于母亲，C基因则来自于父亲)。

表1

六、用卡方检验法验证标记SSR450的可行性

1)提出假设：

对不耐盐和耐盐罗非鱼群体基因型是否有差异进行分析，检验耐盐与基因型有无关联？

a.H₀：耐盐与基因型无关；H_A：耐盐与基因型有关。

b.给出显著水平0.01

c.计算统计数χ²：先计算列联表中各项的理论次数：

2)计算理论值

不耐盐AC型：

不耐盐BC型：

耐盐AC型：

耐盐BC型：

3)计算自由度：

df＝(r-1)(c-1)＝(2-1)(2-1)＝1

4)计算χ²值

5)统计推断

查χ²值表，当df＝1时，χ_0.01 ²＝6.63，而

p<0.01，应拒绝H₀,接受H_A，说明耐盐与基因型密切相关，不耐盐和耐盐群体相比，基因型有显著差异。

6)得出结论：当显著性水平为0.01时，分子标记SSR450的两个不同基因型频率在耐盐个体和不耐盐个体间具有显著差异，从而证明该分子标记对罗非鱼的耐盐性具有非常好的鉴定作用。

七、用MapQTL6对耐盐和不耐盐个体基因型的有效性进行评估。

1、通过MapQTL6软件选择Kruskal-Wallis方法对个体基因型与表型的关系进行分析。

2、结果显示，该分子标记SSR450的K值为159.452，且为极显著性相关；耐盐个体BC基因型的均值为6030.6秒，不耐盐个体AC基因型的均值为1521.77秒。研究显示具有BC基因型的耐盐个体在急性高盐处理下平均能存活6030.6秒，而具有AC基因型的不耐盐个体平均只能存活1521.77秒，耐盐个体相比不耐盐个体平均多存活1.25小时。

序列表

<110>中山大学

<120>一种尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450及其应用

<160>1

<210>1

<211>304

<212>DNA

<213>尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）

<400> 1

GCCGCAGTGC TTTTACCATT AGACACAAAG TAATCAGGGT TTCGAGCAGC TGTCAACAGA 60

AACCACAATG AATAGTTCGC ACAGAAACAC GCACGCACAC AATTTGTCTC CGAAGATTAC 120

CGTTGTCACA CACACACACA TTCTGTGTCC ACACGGCATT ATCTGCTGCA TCACTGGGCC 180

AACACAAAAG ACAAGACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 240

CACAGAGCAG TAATAACAAC AGAGGAAACT AAGAGATACA GGACAGATGA GACGAGTGGA 300

AATG 304

Claims

1.一种筛选尼罗罗非鱼耐盐个体的筛选方法，其特征在于，提取待测尼罗罗非鱼的基因组DNA，以尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物进行PCR反应，然后对PCR产物进行基因分型，判断待测尼罗罗非鱼是否为耐盐个体；

所述的尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物，包括：

上游引物：5’-GCCGCAGTGCTTTTACCATTAG-3’；

下游引物：5’-CATTTCCACTCGTCTCATCTGTCC-3’。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的PCR反应为以20μl计算：

3.尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物在尼罗罗非鱼耐盐个体的快速筛选和选育中的应用；

所述的尼罗罗非鱼耐盐相关分子标记SSR450的PCR引物，包括：

上游引物：5’-GCCGCAGTGCTTTTACCATTAG-3’；

下游引物：5’-CATTTCCACTCGTCTCATCTGTCC-3’。