CN105624310A - 一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记及应用，属于分子生物技术和遗传育种领域。本发明所述的影响猪肌内脂肪性状的分子标记位于猪8号染色体的核苷酸序列第23147683个位点上，其核酸序列如SEQ？IDNO:1猪基因组序列第400个核苷酸处有一个G>A等位基因突变。本发明为猪的遗传改良提供了一个新的标记，有利于优良品系猪的遗传育种工作。

Description

一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术和遗传育种领域，特别涉及一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记及应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们越来越重视自身的健康，美味、营养、绿色的肉质品已成为人们追求的新目标，猪肉作为人体的一种主要、普遍的动物性油脂来源，消费者对猪肉品质的要求也越来越高。养猪业发展的研究重点一直是培育出具有优质、高产、高品质的猪。养猪业的发展是通过种猪的经济性状决定的，而经济性状是依靠表型选择等育种方法来进行遗传改良，存在费时耗力的不足；因此找到能够提高生产性能、降低生产成本的主效基因分子标记，并基于分子标记的遗传改良方法成为了猪育种工作者的重要工作方向之一。

随着分子生物学技术的发展，科学家们凭借这一技术手段，已有一大批与猪的日增重、活体体长、活体体高、眼肌面积等重要的生长性状有着显著关联的分子标记和主效基因被鉴定，大大加速了猪遗传改良的进程。分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，通过分子标记的方法，不仅能缩短育种时限，大大减少育种的人力物力消耗；另外，分子标记的多样性更使得分子标记在动物育种中的应用潜力大大提高。

我国是猪肉生产大国和消费大国，肉的品质是影响肉类行业自身发展和消费者利益的重要指标。肌内脂肪作为一个重要的生长性状，它是影响猪肉品质的一个重要因素，肌内脂肪的含量与猪肉的风味、嫩度和多汁性直接相关，且与猪肉的食用品质关系密切。根据Aberle等人于2001年编写的《Principlesofmeatscience(fourthedition)》，这本世界权威的肉品科学参考书写到：肌肉脂肪(intramuscularfat,IMF)是沉积在某块肌肉内的肌纤维与肌束间的脂肪。肌内脂肪沉积形成的大理石纹对肉的颜色、嫩度风味和系水力等感官品质、食用品质和加工品质有重要影响，这同时也是影响消费者购买与否的关键因素之一。影响肌内脂肪的分子标记的发现对猪业的发展起着重要推动作用。

猪的品种不同其肌内脂肪也有所不同，中国地方猪种肌内脂肪含量相比国外猪种有明显优势，国外猪种中杜洛克的的肌内脂肪表现最好，其肉色、风味、嫩度、多汁性均较好。因此，研究肌内脂肪对改善猪肉品质、生产对人体健康有利的肉产品以及提高猪产业的经济效益有重要意义，利用分子标记及相关检测技术使得肌内脂肪性状在遗传育种改良上取得进展。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其中序列中的R显示碱基突变位置，其中R是G或A，导致猪肌内脂肪性状的不同,从而影响猪肉品质。

所述分子标记的SNP位点对应于国际猪基因组10.2版本参考序列8号染色体的核苷酸序列第23147683个核苷酸位点G>A突变，该SNP记位点如SEQIDNO：1猪基因组序列g400G>A单碱基突变。

上述的SEQIDNO:1序列的制备方法，具体步骤如下所示：提取猪全基因组DNA，根据NCBI中公布的猪8号染色体第23147683个位点前后400bp构成的序列信息，设计PCR扩增引物对，引物对序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3，进行PCR扩增，PCR产物送测，获得序列如SEQIDNO：1所示的DNA片段，其中DNA片段中的R显示碱基突变位置，400bp处的R是G或A。

上述的影响猪肌内脂肪性状的分子标记在中国地方种猪肌内脂肪性状遗传育种上的应用也在本发明的保护范围内。

本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定上述影响猪肌内脂肪性状的分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：

正向引物如SEQIDNO：2所示；

反向引物如SEQIDNO：3所示。

上述的引物对在鉴定影响猪肌内脂肪性状中的应用也在本发明的保护范围内。

上述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用也在本发明的保护范围内。

上述的引物对在调节猪肌内脂肪中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明的再一目的在提供一种筛选优良肌内脂肪性状的猪品种的方法，其特征在于：确定种猪核心群中种猪的权利要求1所述的分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪基因组10.2版本参考序列猪8号染色体上第23147683个位点的GG型个体，淘汰该点的AA型个体和AG型个体，可以显著提高种群肌内脂肪性状，从而达到改善猪肉质品质的目的。

所述种猪包括纯种杜洛克及其合成系群体。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的申请人前期利用所构建的大规模纯种杜洛克及其合成系群体，采用AlokaSSD500V型B超和BioSoftToolboxForSwine软件相结合的方法，活体测定广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司972头纯种杜洛克及其合成系第10～11肋间距背中线6～7cm处一点的肌内脂肪含量。通过全基因组扫描检测到了8号染色体上影响肌内脂肪的分子标记及其主效SNP，并通过结合NCBI基因库分析该主效SNP位点在8号染色体第23147683个位点上。本发明从猪8号染色体的第23147683个位点选取前后400bp构成序列，并建立相应的分子标记检测方法，分析其与猪肌内脂肪性状的关系，为猪的遗传改良提供一种新的分子标记。

附图说明

图1为纯种杜洛克猪的8号染色体上肌内脂肪性状的全基因组关联(GWAS)分析图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logP值。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实验动物：本发明的试验猪种选自广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种杜洛克及其合成系群体。

实施例1具体解释本发明中分子标记的发明过程

1.猪全基因组60KSNP判型

从上述资源群体中选取的972头杜洛克种公猪中的每个个体采集一小块耳样，全基因组DNA通过使用标准苯酚-氯仿法提取得到，再使用Nanodrop-1000核酸蛋白分析仪检测这些DNA的质量，然后将合格的DNA样品统一稀释至50ng/μl，送北京怡美通德有限公司在IlluminaBeadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60KSNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，剔除检出个体率在95％以下、家系孟德尔错误率大于0.1、最小等位基因频率小于0.05且哈代-温伯格平衡显著性水平高于10^-6的SNP，最终得到约4万个SNP的有效基因型数据。

2.全基因组关联(GWAS)分析

本发明以R语言开发平台，用GenABEL软件包中的混合线性模型，猪全基因组60kb芯片标记基因型数据和胴体表型数据进行GWAS分析。该模型是y＝1μ+Xb+Sc+Za+e,所测得的表型值为y，总体平均值为μ,性别和批次的固定效应向量为b,c为其余的微性效应，a为随机加性效应向量，e为残差，X、Y、Z是对固定效应和随机效益的关联矩阵。SNP与猪肌内脂肪性状关联程度的显著性阈值通过Bonferrini法计算，染色体水平显著阈值为1除以有效SNP位点数量。GWAS分析结果如图1所示。从图1可知，在纯种杜洛克及其合成系中，8号染色体中存在一点与肌内脂肪显著相关的SNP位点为ASGA0038200。

3.不同基因型与肌内脂肪表型的关联性分析

从表1可知，SNP位点的ASGA0038200的基因型与杜洛克猪的肌内脂肪含量呈极显著关系，说明该SNP标记与杜洛克猪的肌内脂肪性状呈极显著相关。肌内脂肪的含量与猪肉的风味、嫩度和多汁性直接相关，三种基因型中AA型的肌内脂肪含量最高，而GG型的肌内脂肪含量最低，根据国际猪基因组10.2版本参考序列猪8号染色体上第23147683个位点，种猪继代选育AA型个体，淘汰该点的GG型个体和AG型个体，利用分子标记及相关检测技术使得肌内脂肪性状在遗传育种改良上取得进展。

表1SNPASGA0038200与肌内脂肪之间的相关性

注：p值是基因型与肌内脂肪含量间的相关系数。

4.猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪种选自广东温氏食品集团股份有限公司种猪分公司的纯种杜洛克及其合成系群体。猪基因组DNA的提取采用广州飞扬生物工程有限公司生产的TissueDNAKit试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：

(1)剪下猪的耳组织30mg，放入1.5ml的离心管中，加入200μlTLBuffer，用枪头吹打均匀。

(2)加入25μlOBProteaseSolution，剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜。

(3)12000rpm离心5分钟，移出上清液至新的1.5ml离心管中，然后加入200μlBLBuffer,涡旋混匀。

(4)70℃水浴锅孵育10分钟。

(5)加入200μl无水乙醇，，涡旋混匀。

(6)放置HiBindDNAMiniColumn到2ml收集管上，转移上述溶液(包括任何形式的沉淀物)到HiBindDNAMiniColumn中。

(7)12000rpm离心1分钟，倒掉滤液。

(8)往HiBindDNAMiniColumn中加入500μlHBCBuffer，12000rpm离心30秒，弃去滤液和收集管。

(9)HiBindDNAMiniColumn放置到一个新的2ml收集管上，加入700μlDNAWashBuffer，12000rpm离心30秒，弃去滤液和收集管。

(10)重复第9步，之后12000rpm空离2分钟。

(11)取出HiBindDNAMiniColumn，放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。

(12)对收集到的溶液进行DNA的浓度及质量进检测后置于-20℃下保存备用。

5.目的DNA序列引物设计和PCR扩增

在Ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的8号染色体上SEQIDNO:1的DNA序列。并利用引物设计软件primerpremier6.0设计序列表SEQIDNO：2的引物，引物由上海生工生物工程有限公司设计完成。

(1)引物设计

设计的引物的DNA序列如下所示：

正向引物：5’TTCCTCTGGCTCAATATCTC3’，

反向引物：5’TCTGACTTCCTGACTTACTT3’。

(2)PCR扩增

利用上述引物在纯种杜洛克及其合成系群体猪基因组DNA中进行PCR扩增，10μL的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中,包括1μL猪基因猪DNA、双蒸水3.4μL，2×TagPCRStanMixwithLoadingDye5μL、设计的正反向引物各0.3μL。PCR的运行程序如下：预变性94℃反应5min；然后94℃变性30s，退火为61.6℃30s，之后72℃延伸35s，33个循环；最后72℃继续延伸10min，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳跑胶。

(3)DNA序列测序PCR扩增产物委托苏州金唯智生物科技有限公司直接测序，测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。通过对SEQIDNO:1序列中的第401个位碱基突变进行检测，该突变等位基因频率在杜洛克猪种中存在显著的差异。本发明还公开了制备猪肌内脂肪分子标记的方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种影响猪肌内脂肪性状的分子标记，其特征在于：所述分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其中序列中的R显示碱基突变位置，其中R是G或A，导致猪肌内脂肪性状的不同。

2.一种用于鉴定权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的核酸序列如下所示：

正向引物如SEQIDNO：2所示；

反向引物如SEQIDNO：3所示。

3.权利要求1所述的影响猪肌内脂肪性状的分子标记在中国地方种猪肌内脂肪性状遗传育种上的应用。

4.一种筛选优良肌内脂肪性状的猪品种的方法，其特征在于：确定种猪核心群中种猪的权利要求1所述的分子标记，并根据所述分子标记做出相应的选择：种猪的继代选育国际猪基因组10.2版本参考序列猪8号染色体上第23147683个位点的GG型个体，淘汰该点的AA型个体和AG型个体。

5.根据权利要求4所述的筛选优良肌内脂肪性状的猪品种的方法，其特征在于：所述种猪包括纯种杜洛克及其合成系群体。

6.权利要求2所述的引物对在鉴定影响猪肌内脂肪性状中的应用。

7.权利要求2所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。

8.权利要求2所述的引物对在调节猪肌内脂肪中的应用。