CN112322753B - 与猪肉肌内脂肪相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子标记技术和遗传育种领域，具体涉及一种与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供的SNP分子标记为WU_10.2_10_48312614，其为国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第43603091个核苷酸位点，该位点碱基多态性为G和T。此外，本发明提供了检测该位点的上下游引物序列，以便进行高效检测。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因及对该位点的快速检测，能够为猪肉中肌内脂肪含量调控相关的SNP分子标记辅助育种提供参考依据，同时对培育具有优良肉品质性状的肉猪品种和猪肉品质改良具有重要意义。

Description

与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物标记技术和遗传育种领域，具体涉及一种与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

我国是肉类生产和消费大国，肉类总产量占世界总产量三分之一左右，其中猪肉占到一半以上。近年来，随着人们生活水平的不断提高，对猪肉的需求逐渐由“量”向“质”转变，即猪肉的品质问题成为人们日益关注的重点，美味、营养、健康肉品已成为人们追求的新目标。在影响猪肉品质的诸多因素中，肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量发挥着重要作用，与猪肉的嫩度、多汁性和风味高度相关，是决定猪肉品质的决定因素。因此，通过提高猪肉中肌内脂肪含量对于改善猪肉肉质、提高食用价值、满足广大消费者的要求具有重要的现实意义。

IMF是猪肉中脂肪沉积的主要形式之一，它指的是同一部位肌肉内部、肌纤维之间沉积的脂肪，主要位于肌内膜、肌束膜或肌外膜上，主要成分是磷脂和甘油三酯。有研究表明，肌内脂肪的含量越低，肌肉的嫩度、多汁性、风味及总体可接受程度也越低，2％-3％的肌内脂肪含量是衡量肉质的一个理想标准。此外，猪的肌内脂肪性状具有相对较高的遗传力(h²＝0.52)。因此，研究肌内脂肪对改善猪肉品质、生产健康肉产品及提高猪产业经济效益具有重要意义，开发和利用分子标记及相关检测技术使得肌内脂肪性状在遗传育种改良中获得较快进展。

猪的全基因组关联分析(genome－wide association study，GWAS)是一种主要以单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)为分子遗传标记，充分利用群体水平的连锁不平衡，来进行全基因组水平上的关联分析以定位影响肉质性状表型的分子标记及其效应的方法。目前，对于猪肉质性状的全基因组关联分析已越来越多。Casiró等在杜洛克×皮特兰杂交系上进行GWAS分析发现了多个与肉质性状相关的候选基因；van Son等对杜洛克和长白公猪进行GWAS分析发现了影响猪皮下脂肪中脂肪酸组成的主效SNP分子标记；以及Pena等在伊比利亚猪上发现了5个影响猪脂肪组成的区域，其中包含了多个可以影响猪肌内脂肪含量的标记和基因。本发明通过GWAS分析筛选得到与肌内脂肪性状相关的SNP分子标记，为猪肉质性状的改良提供了新的遗传资源。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供的SNP分子标记WU_10.2_10_48312614，为国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第43603091个核苷酸位点，该位点碱基多态性为G和T。此外，本发明提供了检测该位点的上下游引物序列，以便进行高效检测。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因及对该位点的快速检测，能够为猪肉中肌内脂肪含量调控相关的SNP分子标记辅助育种提供参考依据，同时对培育具有优良肉品质性状的肉猪品种和猪肉品质改良具有重要意义。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：

一种与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记为WU_10.2_10_48312614，其为国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第43603091个核苷酸位点，该位点碱基是G或T。

优选地，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5′端起第101位碱基是G或T。其中序列中的第101位碱基是G或T，导致猪肉中肌内脂肪含量产生差异。

本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够增加猪肉肌内脂肪的遗传进展，从而有效提高优质猪肉生产的经济效益。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列为：

IMF-F1：5′-TGTTTCCTCCCGCAAGACTC-3′

IMF-R1：5′-TGATGGGTGGATGTAGGCCA-3′。

本发明提供了一种用于检测上述所述的SNP分子标记的试剂盒，包括上述所述的引物对。

本发明还提供了一种用于鉴定上述所述的SNP分子标记的探针和含有该探针的试剂盒。

优选地，所述检测猪的国际猪参考基因组11.1版本10号染色体上第43603091个核苷酸位点的基因型的方法包括以下步骤：

(1)提取待测猪的基因组DNA；

(2)采用权利要求3所述的引物对，将所述待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物；

(3)对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果；

(4)将所述测序结果与SEQ ID NO：1进行比对，确定所述待测猪的如上述所述的SNP分子标记的基因型。

优选地，所述待测猪均为“杜长大”三元杂猪。

本发明提供了上述所述的SNP分子标记在提高猪肉肌内脂肪中的用途。

本发明提供了一种应用上述的SNP分子标记选育/辅助选育高/低猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系的方法，所述方法是：提取猪的基因组DNA，检测10号染色体的第43603091位点的脱氧核苷酸，测出第43603091位点的脱氧核苷酸为G或T，确定待测猪的基因型是GG型、GT或TT型，据育种需求，选择GG型、GT或TT型基因的猪进行下一步的选种和/或育种，所述GG型基因的猪肉肌内脂肪含量高于GT和TT型。

本发明提供了上述所述的引物对或上述所述的试剂盒在提高猪肉肌内脂肪含量中的用途。

本发明的有益效果在于：

本发明筛选并确定影响猪肉肌内脂肪的分子标记，提供一种用于鉴定与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记以及引物对和试剂盒，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于猪肉肌内脂肪性状遗传改良中，从而提高猪肉的肌内脂肪含量，继而改善猪肉品质，增加优质猪肉生产。本发明通过优选该SNP的优势等位基因，能够提高猪肉的肌内脂肪含量，从而有效提高优质猪肉生产及商品猪育种的经济效益。

附图说明

图1为本发明的曼哈顿图。附图标记说明：涉及猪肉肌内脂肪性状，红色箭头指向标记的为本发明筛选的SNP分子标记WU_10.2_10_48312614，该标记位于猪10号染色体上。

图2为本发明克隆的所筛选分子标记所在的DNA片段凝胶电泳图，其中M表示DNA分子量标准(100bp DNA Ladder)，1、2、3、4、5表示扩增的DNA片段。其中，100bpMarker分子量标准，条带从上至下依次为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。

图3为本发明中筛选的SNP突变位点的序列比对分型图，其中箭头表示突变位点。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：与猪肉肌内脂肪性状相关的SNP分子标记的获取方法

(1)表型数据采集

本实施例的基础研究群体为582头三元杂猪，全部来自广西扬翔农牧有限公司，其中公猪249头，母猪333头。性状测定部位为第13～14肋间的背最长肌，测定方法为索氏提取法。采集完的表型数据均采用平均值±3倍标准差的标准进行筛选，最终剩余522头有效数据。

(2)组织DNA提取

利用磁珠法提取试剂盒(武汉纳磁生物)提取公猪精液样品DNA，提取步骤：

①裂解：将20mg肌肉组织样品置于1.5mL离心管中，进行破碎，加入500μL裂解液(试剂盒自带)和5μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，摇匀震荡后置于65℃水浴锅裂解1小时左右。

②沉淀DNA：取裂解完成的样品上清液200μL至新的2.2mL方孔深孔板①，再加入200μL结合液和350μL异丙醇。

③核酸提取：将①号深孔板置于核酸自动化提取仪(NanoMagBio S-96)工位1上，将装有磁珠、洗涤液①、洗涤液②和洗涤液③以及洗脱液(100μL/孔)的深孔板分别置于工位2～6上。仪器参数设置如表1。

表1核酸提取仪的参数设置

④DNA检验：利用紫外-可见光分光光度计(Nanodrop2000)测定DNA样品的浓度和纯度，DNA的完整性由1％琼脂糖凝胶电泳检测。DNA质量控制标准为：DNA总量大于1000ng；OD260/OD280介于1.6～1.8之间；OD260/OD230介于1.8～2.1之间；琼脂糖凝胶电泳条带清晰，无明显拖带。

(3)基因分型与质量控制

对于检验合格的DNA，采用GGP 50k SNP(GeneSeek，US)芯片进行基因分型，获得覆盖全基因组的50697个SNP分子标记。根据最新版的猪参考基因组(Sscrofa11.1)，采用NCBI基因组比对程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对所有SNP分子标记的物理位置进行更新，并剔除基因组物理位置重复和未知的SNP分子标记。筛选常染色体上的SNP分子标记，采用Plink软件(version 1.9)进行质量控制，质控标准为：个体检出率≥90％，SNP检出率≥90％，最小等位基因频率≥0.01，哈迪-温伯格平衡p值≥10^-6。然后采用Beagle软件(version 4.1)对基因型缺失位点进行基因型填充，并按照上述质控标准对填充后基因型数据进行二次质控，最后得到582个个体的34,057个SNP分子标记，提取上述522头含有效表型猪的SNP分子标记数据用作后续GWAS分析。

(4)统计模型

本研究选用多标记关联分析模型，即采用R语言环境下的MVP软件包中的FarmCPU模型进行GWAS分析，具体模型如下：

Y_n＝T_niW_i+P_njQ_j+e_n

其中，Y_n表示为第n个个体的表型值向量，T_ni为固定效应，包括性别、猪场、不同批次(年-季联合效应)、i个pseudo QTNs的基因型和前三个主成分，P_nj表示第n个体的第j个标记；W_i和Q_j分别表示对应的效应；e_n表示残差向量，服从正态分布， 表示残差方差。

(5)标记筛选

Bonferroni校正法是通过将0.05/N值作为校正后的阈值，来判定与目标性状显著相关的SNP分子标记，其中N为假设检验次数或GWAS分析的SNP分子标记个数。该方法假设每次假设检验之间是独立的，忽略了SNP分子标记间可能存在的相关性，往往存在过度校正而导致假阴性结果增加的问题。因此，本研究采用1/N值，即P＝2.94*10^-5，作为与目标性状显著相关SNP分子标记的判定标准。利用所有标记的p值作曼哈顿图，筛选与性状关联显著SNP分子标记，如图1所示。并采用方差分析和多重比较(R语言)，分析电导率标记不同基因型群体三元杂商品猪肉质差异情况，多重比较分析模型如下：

Y_ijkl＝μ+G_i+F_j+BYS_k+M_l+e_ijkl

其中，Y_ijkl为个体肉质性状表型值；μ为平均数；G_i为第i性别效应，F_j为第j场别效应，BYS_k为第k个批次-年-季效应；M_l为第l个基因型效应；e_ijkl为随机残差。

关联分析见表2。

表2 WU_10.2_10_48312614标记位点不同基因型个体的猪肉肌内脂肪含量差异

表2说明：P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异极显著。

由表2可知，WU_10.2_10_48312614标记位点为GG和GT基因型个体的肌内脂肪含量(IMF)显著高于TT个体，由于肌内脂肪含量与肉品质呈正相关，所以基因型为GG和GT的个体的肉品质显著高于TT个体，所以T是不利于肌内脂肪沉积的等位基因。

序列表SEQ ID NO:1是本发明筛选的与筛选与猪肉肌内脂肪关联的SNP分子标记WU_10.2_10_48312614的上下游100bp核苷酸序列，核苷酸序列长度为201bp，在该序列的第101位碱基处的K处存在一个G/T的等位基因突变。该突变能引起SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列产生多态性。

实施例2：

根据上述实施例1筛选得到的基因结果，显示与猪肉肌内脂肪关联的SNP分子标记WU_10.2_10_48312614，该分子遗传标记位于猪的第10号染色体的第43603091核酸位点，该位置为一个G>T突变，对应位于核酸序列表SEQ ID N0.1的第101位核酸位点。

实施例3：

设计实施例1中得到的SNP分子标记WU_10.2_10_48312614所在片段的引物，具体为：

从Ensemble数据库(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)中检索到候选SNP分子标记上下游各500bp、总计1001bp的DNA序列信息，利用Primer Primier5.0软件设计扩增引物，利用NCBI中Primer-Blast工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/)进行引物检索，选取特异性高的引物作为备选引物。以备选引物进行阳性样本的PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳。以凝胶电泳图像的片段与目的片段进行比对，筛选长度一致、不含杂带的引物。将PCR扩增产物送广州华大基因公司进行测序，测序结果与目的片段比对，测序序列与目的片段序列一致的引物为合格引物，引物序列如下：

(SEQ ID NO:2)IMF-F1：5′-TGTTTCCTCCCGCAAGACTC-3′

(SEQ ID NO:3)IMF-R1：5′-TGATGGGTGGATGTAGGCCA-3′。

引物由南宁市茵诺生物公司合成。

实施例4：

实施例1中得到的SNP分子标记WU_10.2_10_48312614在三元商品猪群体内的验证。

1、提取商品猪基因组DNA

采集6头猪的肉样，放置于自封袋内，-20℃冰箱保存备用。

使用磁珠法提取试剂盒(武汉纳磁生物)提取所选群体肌肉组织样品DNA，具体步骤参照实施例1中肉样组织DNA提取。

2、目的片段PCR扩增与测序

用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增：取DNA模板3μL、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的引物各0.5μL、PCR Mix试剂10μL、双蒸水6μL；设置PCR扩增体系：预变性94℃3min；变性94℃30s；退火58℃30s；延伸72℃30s；33个循环；然后延伸5min。

PCR产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为423bp，电泳图见图2，将剩余的扩增产物送华大基因公司进行测序，测序结果用Clone Manager软件与GenBank中猪的相关基因片段序列比对、分析，判读g.43603091G/T的基因型，基因分型峰图见图3。由图3可知，该SNP分子标记的基因分型检测出GG和TT两种基因型，说明本研究针对WU_10.2_10_48312614位点所设计的引物序列可有效检测出其基因型。

实施例5：

本领域技术人员很容易根据本发明的分子遗传标记设计出用于扩增该分子标记的引物或鉴定所述分子标记的探针，从而用于该遗传标记的检测，例如通过PCR扩增得到所述分子遗传标记，再通过克隆测序得到相应的序列，或者通过Bsm-RFLP多态性进行检测。因此，本发明还包括用于扩增所述分子遗传标记的引物或鉴定所述分子遗传标记的探针，以及含有所述引物或探针的试剂盒。

实施例6：

可应用本申请的分子遗传标记辅助进行猪的育种或辅助育种工作，具体方法为：提取猪的基因组DNA，检测10号染色体的第43603091位点的脱氧核苷酸，测出第43603091位点的脱氧核苷酸为G或T；根据该位点基因型判断待测猪的基因型是GG型、GT或TT型；根据育种需求，选择GG型、GT或TT型基因的猪进行下一步的选种和/或育种；其中，GG型基因的猪肉肌内脂肪含量高于GT和TT型；上述GG基因型为猪第10号染色体的第43603091位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；GT基因型为猪第10号染色体的第43603091位脱氧核糖核苷酸为G和T的杂合体；TT型为猪第10号染色体的第43603091位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体。

综上所述，使用本申请的方法能简单、高效、准确的获取与猪肉肌内脂肪相关的分子遗传标记，根据该突变可设计出用于扩增该分子标记的引物和鉴定分子标记的探针；快速筛选出具有高猪肉肌内脂肪含量的猪，对培育具有优良肉品质性状的肉猪品种和猪肉品质改良具有重要意义。

上述说明是针对本发明较佳可行试验例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 广西扬翔股份有限公司

佛山科学技术学院

广西扬翔农牧有限责任公司

广西扬翔猪基因科技有限公司

<120> 与猪肉肌内脂肪相关的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪属(Sus scrofa)

<220>

<221> misc_feature

<222> (101 )..( 101)

<223> k is g or t

<400> 1

atctaaaaaa aaattttgag tgagtgaccg cagatacaag gcaacaggta agaaaaactg 60

ggtattgtaa ctattcctgt ccttgaaata aattctatca kaaggagagg aagaggctta 120

agagcaaggc agaaaattaa tgtaagttaa agaatttttt gggtgggggg gcctgggctt 180

aatgcagcag cttaatgtgg g 201

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtttcctcc cgcaagactc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatgggtgg atgtaggcca 20

Claims (3)

1.一种用于检测SNP分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核酸序列为：

IMF-F1：5′-TGTTTCCTCCCGCAAGACTC-3′

IMF-R1：5′-TGATGGGTGGATGTAGGCCA-3′；

所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5′端起第101位碱基是G或T。

2.一种检测SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对。

3.如权利要求1所述的引物对或如权利要求2所述的试剂盒在选育/辅助选育高/低猪肉肌内脂肪含量的猪品种或品系中的应用。