CN117004739A - 一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法，该方法利用一种红罗非鱼越冬期黑斑性状的检测试剂，所述检测试剂检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组的LG3_11647206位点的基因型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。应用方法在红罗非鱼幼年时期就可以早期筛选出会发生黑斑体色变异的体色表型，从而避免红罗非经历越冬期产生的黑斑性状影响鱼的品相及经济效益。并且可以在在杂交育种初期就能筛选后代的体色表型，从而满足各种需求的要求。

Description

一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法
技术领域
本发明涉及罗非鱼育种技术领域，更具体地，涉及一种判断罗非鱼越冬期黑斑性状的方法。
背景技术
红罗非鱼属于丽鱼科(Cichlidae)，罗非鱼属(Tilapia)，是尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非鱼杂交的突变种，彩虹鲷是尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非鱼杂交的一种突变种。体色有粉红、红色、橘红、拨红、橘黄等。其后代会分离出黑色；体型有尼罗罗非鱼型，奥尼鱼型、莫桑比克鱼型等。我国大陆养殖的红罗非鱼最初引种于南亚和中国台湾省，红罗非鱼属热水性鱼类，它具有生长快、食性杂、繁殖力强，适应盐度广、生命力强、耐低氧、海水和淡水都可以养殖等优点，颇受消费者喜爱。由于红罗非鱼鲜艳的体色，其也可作为具有观赏价值的热带鱼类。
在实际生产中，部分红罗非鱼会在越冬期出现黑斑体色变异，该黑斑表型的初期表现为分布在鱼体腹部，下颌，胸鳍，臀鳍及尾鳍的弥散状黑色斑点，随着越冬期的进程该黑斑逐渐密集且开始向背部蔓延，黑色斑点逐渐形成黑色斑块且颜色变深。在越冬期结束后，该黑斑会逐渐褪色但不会完全消失。因此，这种体色变异对红罗非鱼的品相及其经济价值造成了巨大的影响。但目前为止，影响红罗非鱼黑斑体色变异的环境因素及遗传因素还不明确，同时红罗非鱼因其遗传背景复杂、自交不亲和等特点严重制约了红罗非鱼优良品种的遗传育种及新品种的选育。因此通过开发与越冬期黑斑表型性状相关的标记，应用分子标记辅助育种，弥补常规杂交育种的缺陷，有利于定向选择育种，缩短育种年限，为红罗非鱼越冬期稳定体色品种育种的早期选择做铺垫。
现有技术也有包含与红罗非鱼体色相关的分子标记及越冬期红罗非鱼黑斑性状相关的微卫星分子标记。如中国水产科学研究院淡水渔业研究中心申请的中国发明专利《一种调控红罗非鱼体色分化的miRNA及其应用》，提供了红罗非鱼皮肤组织的miR-138-5p，可作为遗传因素形成的“黑斑”和“红斑”体色的红罗非鱼miRNA分子标记，通过该分子标记可广泛用于红罗非鱼品种鉴别、保种和分子辅助选择育种，但是与本发明中越冬期红罗非鱼黑斑性状不是同一种体色表型。因此该分子标记不适用于选育红罗非鱼越冬期稳定体色品种的选育。如中山大学申请的中国发明专利《红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其应用》，提供了两对与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物。
微卫星是多年来推断亲缘关系常用的标记，它具有其他标记类型不具备的特点：单座位信息，共显性，由于低频下的许多等位基因导致的高变异性，通过自动化的高通量潜力和适于对从野生种群获得的法医样品的分析的短DNA片段。但是，微卫星很难找到或者多态性差。基因分型易于发生突变(分型错误)，且有明显比例的基因座具有分离无效等位基因，所有这些都可能引起假亲本排除。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种判断罗非鱼越冬期黑斑性状的方法。红罗非鱼有部分几率在越冬期会发生黑斑体色变异，本发明应用混池基因组测序(pool-seq)和ED_calculate的方法对越冬期黑斑性状进行QTL定位，发现了与红罗非鱼越冬期黑斑性状关联较显著的QTL候选区间：LG3：11204728-12894413，进一步，根据基因组测序结果筛选获得与黑斑性状全基因组显著水平相关的SNP突变位点，在QTL区间开发位于LG3_11647206(ENSEMBL release_105版本https://asia.ensembl.org/Oreochromis_niloticus/Info/Index)开发S NP分子标记并设计检测引物，所述检测引物核苷酸序列如SEQ ID NO 1和2所示。通过SNP快速筛选在越冬期体色保持稳定的红罗非鱼亲鱼，最终选育出在越冬期体色保持稳定，不产生黑斑变异的红罗非鱼品种。
而SNP相比于串联重复微卫星等多态性标记，SNP是基于单核苷酸的突变，突变频率较低，遗传稳定性相对较高。同微卫星标记相比较而言，虽然单个SN P位点只有两种多态性，但其在整个物种基因组上却占据多态性位点的90％以上，由于其具有等位基因性因而在任何群体中其等位基因频率均可估计出来。同时S NP分子标记在应用时无需测量片段长度，可以摆脱电泳分型的瓶颈，因此检测快速可实现自动化分析。
本发明的第一个目的是提供一种红罗非鱼越冬期黑斑性状的检测试剂。
本发明的第二个目的是提供检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组LG3_11647206位点的基因型的试剂在制备判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组LG3_11647206位点的基因型的试剂在判断红罗非鱼越冬期黑斑性状中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法。
本发明的第五个目的是提供一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的试剂盒。
本发明的第六个目的是提供所述的检测试剂、所述的检测方法和/或所述的检测试剂盒在红罗非鱼分子育种中应用，其特征在于，所述分子育种为红罗非鱼越冬期黑斑性状。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明要求保护一种红罗非鱼越冬期黑斑性状的检测试剂，所述检测试剂检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组的LG3_11647206位点的基因型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
优选地，所述检测试剂为检测引物。
更优选地，所述检测引物的核苷酸如SEQ ID NO.1～2所示。
SEQ ID NO 1：5’-TCTCAGAAATCACAGCCACCTC-3’；
SEQ ID NO 2：5’-AGGCAGCGTTAGCCACAGG-3’。
本发明还要求保护，检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组(https://ftp.ensembl.org/pub/release-105/fasta/oreochromis_niloticus/)
LG3_11647206位点的基因型的试剂在制备判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的试剂盒中的应用，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
以及，检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组LG3_11647206位点的基因型的试剂在判断红罗非鱼越冬期黑斑性状中的应用，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
优选地，所述检测试剂为检测引物。
更优选地，所述检测引物的核苷酸如SEQ ID NO.1～2所示。
SEQ ID NO 1：5’-TCTCAGAAATCACAGCCACCTC-3’；
SEQ ID NO 2：5’-AGGCAGCGTTAGCCACAGG-3’。
本发明还要求保护，一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法，利用任一所述检测试剂检测所述的基因型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
本发明还要求保护，一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的试剂盒，含有任一所述检测试剂。
以及所述的检测试剂、所述的检测方法和/或所述的检测试剂盒在红罗非鱼分子育种中应用，所述分子育种为红罗非鱼越冬期黑斑性状
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种红罗非鱼越冬期黑斑体色相关的SNP分子标记，并进一步利用该SNP分子标记开发了检测引物和判断罗非鱼越冬期黑斑体色性状的方法。该方法不仅可以应用于越冬期红罗非鱼体色变异的早期预测筛选，还可以应用于罗非鱼的分子辅助育种。应用该SNP分子标记在红罗非鱼幼年时期就可以早期筛选出会发生黑斑体色变异的体色表型，从而避免红罗非经历越冬期产生的黑斑性状影响鱼的品相及经济效益。并且可以在在杂交育种初期就能筛选后代的体色表型，从而满足各种需求的要求。同时鉴于红罗非鱼育苗周期长、遗传背景复杂等特点，本发明还会提高红罗非鱼育种的筛选效率，缩短育种年限。这将为准确高效评估红罗非鱼越冬期体色稳定品种的选育奠定夯实可靠的技术基础。
附图说明
图1为红罗非鱼群体体色分级参考标准，将红罗非鱼每一个面分成8个部分，分别按照覆盖面积、到达部位，颜色深浅及色块密集度四个指标进行打分，括号内是评分等级，累加评分得到性状值。
图2为本发明越冬期体色稳定的极端红罗非鱼个体(上图为体色稳定组)和体色变异的极端黑斑红罗非鱼(下图为：体色变异组)的体色性状示意图。
图3为本发明中1号群体间采用ED值计算方法在全基因组水平上鉴定的与红罗非鱼越冬期体色黑斑性状显著相关的SNP位点；x轴(横轴)显示SNP在染色体基因组上的位置(bp)。y轴(纵轴)是全基因组上每个SNP计算后的ED值。
图4为本发明中1号群体在红罗非鱼三号染色体上鉴定得到SNP分布及候选QTL区间；
图5为本发明中2号群体SNP分子标记基因型及表型关联示意图，black为体色变异红罗非鱼，red为体色稳定红罗非鱼，red/black为两种表型红罗非鱼中均出现。
图6为本发明2号红罗非鱼群体(体色稳定红罗非鱼群体和体色变异红罗非鱼群体各48尾)单核苷酸多态性标记基因型统计图，black为体色变异红罗非鱼，red为体色稳定红罗非鱼。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1全同胞家系红罗非鱼黑斑性状的全基因组QTL定位
一、实验方法
用于测序文库构建的为全同胞家系群体中越冬期体色稳定和发生黑斑体色变异的红罗非鱼群体，按照体色性状值进行筛选后，选取越冬期体色鲜艳稳定的红罗非鱼作为体色稳定组，及发生明显黑斑变异的红罗非鱼作为体色变异组，体色稳定组和体色变异组分别选取48个个体。对96尾红罗非鱼的尾部鳍条取样并进行DNA提取。Qubit 3.0荧光分光光度计测定每个个体鳍条样品的DNA浓度后等量混合，之后，送往测序公司进行illuminaHiSeq 2×150bp测序。
1、红罗非鱼体色性状值评定及样本收集
选取1个正在经历越冬期的全同胞家系红罗非鱼共500尾(1号群体)，经过对体色表型进行体色评级和性状值统计淘汰体色不明显的红罗非鱼。
具体体色分级的方法为：将红罗非鱼每一个面分成8个部分(如图1)，分别按照覆盖面积、到达部位，颜色深浅及色块密集度四个指标进行打分，括号内是评分等级，累加评分得到性状值，打分标准见表1：
表1：
将性状值进行排序后，将群体得分最低的48个体色稳定的红罗非鱼个体定义尾体色稳定组和得分最高的48尾发生体色变异的黑斑红罗非鱼定义为体色变异组。图2为体色稳定组和体色变异组的罗非鱼性状示意图。
1号群体挑选96尾红罗非鱼进行混池测序建库(48尾体色稳定红罗非鱼和48尾体色变异红罗非鱼)，剪取以上96尾红罗非鱼的少量鳍条保存于无水乙醇中用于基因组DNA的提取。
2、样本DNA的提取及混池测序基因组文库的构建
利用基因组DNA提取试剂盒分别提取1号群体的96尾红罗非鱼基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳技术检测所有样本个体DNA质量，并利用Qubit 3.0检测DNA浓度，保证用于构建基因文库的DNA质量与浓度达标，后续分别进行全基因组混池基因组文库建库。
3、混合DNA文库的高通量测序
采用Illumina HiSeqTM2500进行高通量测序，对测序得到的原始测序序列，即rawdata，进行过滤，去掉低质量的reads、接头、过多的N的reads，获得clean data。
4、QTL作图分析
(1)SNP分子标记的获取
首先根据连接接头的序列对测序数据进行拆分，使用bowtie2软件将每个个体的测序数据比对Ensembl上公布的尼罗罗非鱼的参考基因组(ENSEMBL release_105版本https://ftp.ensembl.org/pub/release-105/fasta/oreochromis_niloticus/)上。使用Samtools软件获取SNP位点，对获得的SNP位点进行过滤，过滤掉子代测序质量小于10、个体测序深度小于10、总深度小于200的位点；删除群体中最小等位基因频率小于0.1，缺失率大于2％的SNP；亲本中，过滤掉测序质量不大于10，测序深度不大于20，且存在插入或缺失的SNP。
(2)基于SNP标记和性状值的QTL定位分析
使用计算混池群体ED(Euclidean distance)值的方法对分离群体进行质量性状或者数量性状主效QTL区间的精确定位。ED法具有很强的去除背景噪音能力，一大优势就是无需亲本的信息即可进行群体间QTL定位。通过计算不同混池间各突变型的频率距离，采用距离差异来反映标记与目标区域的连锁强度根据得到的混池间的SNP位点集及基因型的深度信息，计算混池间的突变频率差异。同时为降低单个SNP位点计算带来的偏差，对得到的结果进行EDloess拟合。阈值的选择使用分位数方法，即对所有的拟合值从小到大排序，选择大于99％(常用)的SNP标记ED值作为筛选时的阈值，之后根据ED值进行全基因组及单个染色体绘图，将主效QTL区间进行可视化。
二、实验结果
通过全基因组混池重测序技术鉴定了1号群体中体色稳定和体色变异的96个个体的全基因组SNP。通过Samtools软件获取SNP位点，进一步过滤掉测序质量小于10、个体测序深度小于10、总深度小于200的位点，最终剩下60108个SNP位点；删除群体中最小等位基因频率小于0.1，缺失率大于2％的SNP，最终得到1126个高质量的SNP，其中达到基因组水平显著(p＝0.05)的SNP标记109个，通过对SNP进行基因注释，获得候选基因，并最终筛选得到29个落于已注释基因内的SNP。
对全基因组SNP的ED值进行loess拟合后，将SNP的ED值及在染色体上的位置进型全基因组及三号染色体的可视化绘图(如图3和图4)。可以发现全基因组显著水平的SNP集中分布在红罗非鱼三号染色体的11-13M之间，之后通过SNP的位置信息得到QTL区间的精确定位位于LG3:11204728-12894413bp。说明，与红罗非鱼越冬期黑斑性状关联较显著的QTLs区间位于红罗非鱼LG3:11204728-12894413bp。
实施例2红罗非鱼越冬期黑斑性状与SNP分子标记的基因型的关系
一、实验方法
根据混池重测序定位到的与红罗非鱼越冬期黑斑相关的QTL区间内，按照基因组显著水平进行筛选后，选取了位点落在已知生物学功能的基因上显著性最高的SNP位点(LG3_11647206，ENSEMBL release_105版本)进行分子标记开发及基因型检测。
1、实验对象
再选取1个正在经历越冬期的全同胞家系红罗非鱼共500尾(2号群体)，按照实施例1的方法过对体色表型进行体色评级和性状值统计淘汰体色不明显的红罗非鱼。2号群体挑选96尾红罗非鱼用于分子标记开发及验证(48尾体色稳定红罗非鱼和48尾体色变异红罗非鱼)；剪取以上96尾红罗非鱼的少量鳍条保存于无水乙醇中用于基因组DNA的提取。
对于2号群体位于LG3_11647206(ENSEMBL release_105版本https://ftp.ensembl.org/pub/release-105/fasta/oreochromis_niloticus/)的SNP位点基因型检测，并统计其基因型与表型的关系。
2、提取样本DNA
按照实施例1的方法提取2号群体的96个个体基因组DNA，作为模板DNA。
3、引物设计
在NCBI上下载LG3_11647206附近的基因组DNA序列，使用引物设计软件Primer5在SNP标记附近设计产物大小100～200bp的SNP标记引物。设计的SNP标记引物信息如下：
SEQ ID NO 1：5’-TCTCAGAAATCACAGCCACCTC-3’；
SEQ ID NO 2：5’-AGGCAGCGTTAGCCACAGG-3’。
4、PCR反应
使用东盛PCR MIX试剂盒进行SNP分子标记的扩增。PCR反应体系为：2×PCR DSMix 25μL，上下游引物各1.25μL，上述模板DNA2.5μL，补充水至总体积50μL。
PCR反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s，循环数为35，72℃延伸10min。
5、一代Sanger测序及基因型检测
PCR未纯化产物及SEQ ID NO 1～2所示引物送往测序公司进行Sanger一代测序，对测序后ab1文件进行该位点的基因型的统计。
二、实验结果
测序结果使用Snapgene软件查看测序峰图，统计该位点(LG3_11647206，ENSEMBLrelease_105版本)基因型，不同基因型测序峰图如图5所示，
根据分子标记PCR产物测序峰图与红罗非鱼3号染色体DNA序列进行比对，通过统计LG3:11647206位点的基因型，结果如图6所示。其中38个个体位于LG3:11647206位点(ENSEMBL release_105版本)的的基因型为CC，8个个体的基因型为TT，48个个体的基因型为TC。
结合每个个体的表型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼，而杂合基因型TC在两种表型红罗非鱼中均有一定概率出现。
结果显示体色稳定红罗非鱼中SNP均为未突变(TT)及杂合突变(TC)，黑斑红罗非鱼中SNP均为纯合突变(CC)及少量杂合突变(TC)，所以LG3:11647206位点(ENSEMBLrelease_105版本)存在一个SNP分子标记的基因型，其与红罗非鱼越冬期黑斑性状高度关联，可用于判断可以判断红罗非鱼是否会在后续越冬期通过环境因素的诱导出现黑斑性状，可以用于后续的分子标记辅助育种，辅助筛选出越冬期体色稳定的红罗非鱼亲本，构建越冬期体色稳定的红罗非鱼品系。
实施例3一种检测罗非鱼越冬期黑斑的方法
1、提取样本DNA
2、PCR反应
PCR反应引物为：
SEQ ID NO 1：5’-TCTCAGAAATCACAGCCACCTC-3’；
SEQ ID NO 2：5’-AGGCAGCGTTAGCCACAGG-3’。
PCR反应体系为：2×PCR DS Mix10μL，上下游引物各0.8μL，上述模板DNA4μL，补充水至总体积20μL。
PCR反应条件为：94℃预变性3min，变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃20s，循环数为35，72℃延伸10min；
3、一代Sanger测序
利用SEQ ID NO 1～2所示引物对PCR未纯化产物进行Sanger一代测序。
4、结果判读
PCR产物测序结果使用Snapgene软件查看测序峰图，根据PCR产物测序峰图与红罗非鱼3号染色体DNA序列进行比对，统计LG3:11647206位点(ENSEMBL release_105版本)的基因型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼，，而杂合基因型TC在两种表型红罗非鱼中均有一定概率出现。根据SNP分子标记的基因型可以判断红罗非鱼是否会在后续越冬期通过环境因素的诱导出现黑斑性状。

Claims (10)

1.一种红罗非鱼越冬期黑斑性状的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组的LG3_11647206位点的基因型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂为检测引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述检测引物的核苷酸如SEQ IDNO.1～2所示。
4.检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组LG3_11647206位点的基因型的试剂在制备判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的试剂盒中的应用，其特征在于，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
5.检测红罗非鱼ENSEMBL release_105版本基因组LG3_11647206位点的基因型的试剂在判断红罗非鱼越冬期黑斑性状中的应用，其特征在于，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为检测引物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测引物的核苷酸如SEQ ID NO.1～2所示。
8.一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的方法，其特征在于，利用权利要求1到3任一所述检测试剂检测权利要求1中所述的基因型，基因型为TT的个体为越冬期不出现黑斑性状的体色稳定红罗非鱼，基因型为CC的个体为越冬期出现黑斑性状的体色变异红罗非鱼。
9.一种判断红罗非鱼越冬期黑斑性状的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1到3任一所述检测试剂。
10.权利要求1所述的检测试剂、权利要求8所述的检测方法和/或权利要求9所述的检测试剂盒在红罗非鱼分子育种中应用，其特征在于，所述分子育种为红罗非鱼越冬期黑斑性状。
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