CN108179200B - 一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用 - Google Patents

一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用，属于水产动物分子遗传育种领域。本发明成功获得2对微卫星引物对，获得与克氏原螯虾高繁殖力性状高度连锁的2个微卫星位点。紧密连锁的分子标记可以加速物种育种进程和提高选择的准确性，选择含有克氏原螯虾高繁殖力性状连锁标记的个体作为亲本，将会大大加快选育进度，获得具有高繁殖力性状的克氏原螯虾新品种。

Description

一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用
技术领域
本发明涉及与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用，属于动物分子遗传育种领域。
背景技术
克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗名小龙虾，动物分类学上隶属节肢动物门，甲壳纲，十足目，螯虾亚目，蝲蛄科，原螯虾属。该虾原产于北美地区，1929年经日本引入我国江苏南京及安徽滁州地区。经过几十年的自然迁徙、繁衍与人类的养殖活动，现已广泛分布于我国大部分省市的河流、湖泊、水库、池塘、沟渠、稻田等自然水域中，成为我国重要的淡水经济虾类之一。
随着养殖面积的扩大，克氏原鳌虾苗种紧缺问题越来越严重，克氏原鳌虾卵粒大，受精卵直径达到或超过1mm，抱卵量小，繁殖用亲本用量大，所占养殖成本比例高。克氏原螯虾每个亲虾抱卵量一般只有150-600粒，与经济沼虾类个体抱卵量达几万粒相比相差甚远。克氏原螯虾养殖业一直急需选育出高抱卵量的良种亲本。传统的选择育种在生长性状方面选育具有优势，但对繁殖、抗病等性状由于遗传力低，选择育种效率很低，生产实践中成功的报道极少。针对繁殖、抗病等遗传力低的性状选育，通过寻找与性状连锁的标记进行分子标记辅助选育是比较有效的手段。
微卫星标记是目前研究动物保护遗传学中最理想的一类分子标记，微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。有关克氏原螯虾的微卫星标记和高抱卵量连锁的研究国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供了与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用，该引物和方法可以应用于克氏原螯虾高繁殖力性良种选育。选择含有高繁殖力群体连锁标记的个体作为亲本进行选育，将会大大加快克氏原螯虾高繁殖力良种品系的选育进度。
技术方案
与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用，其特征在于，采用以下步骤：
一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的2个微卫星标记的微卫星引物对，具体如下表：
表1 两对引物信息
Figure BDA0001589336360000021
一种获得与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记的方法，包括如下步骤：
步骤1，取克氏原螯虾高繁殖力个体和克氏原螯虾低繁殖力个体组成两个群体；
步骤2，分别提取两个群体中每个个体的基因组DNA；
步骤3，利用权利要求1所述的微卫星引物对对两个群体的基因组DNA进行PCR扩增，扩增后的产物在10％的非变性的聚丙烯酰胺胶电泳，然后银染，根据聚丙烯酰胺胶上面显示的DNA条带大小筛选多态性高的引物；
步骤4，对多态性高的引物跑出的DNA条带大小进行分析，利用spss软件进行基因型与表型性状的线性回归分析，采用最大似然比法，以P＝0.05作为阈值检测单一分子标记与性状的连锁关系，检测得到和克氏原螯虾高繁殖力性状紧密连锁的微卫星位点。
进一步，所述的获得与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记的方法，其特征在于，步骤1中取克氏原螯虾高繁殖力个体的数量为24个以上。
进一步，所述的获得与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记的方法，步骤1中取克氏原螯虾低繁殖力个体的数量为24个以上。
进一步，所述的获得与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记的方法，步骤3中PCR扩增的PCR反应体系是15ul：10×PCR Buffer 1.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，MgCl21.5ul，上下游引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，DNA模板2ul，超纯水8.3ul。
进一步，所述的获得与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记的方法，步骤3中PCR扩增的反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用10％的聚丙烯酰胺胶进行电泳和银染。
进一步，以上克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的2个微卫星标记的微卫星引物对在克氏原螯虾遗传育种领域的应用。
以上提供的方法检测到2个微卫星位点(位点1和位点2)和克氏原螯虾高繁殖力性状紧密连锁。对以引物对1进行实验的实验结果进行分析，140bp条带在克氏原螯虾低繁殖力群体中出现的频率为0％，在高繁殖力群体中出现的频率为54％(P＜0.01)。对以引物对2进行实验的实验结果进行分析，110bp条带在克氏原螯虾低繁殖力群体中出现的频率为0％，在高繁殖力群体中出现的频率为23.80％(P＜0.05)。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
利用本发明提供的2对克氏原螯虾微卫星引物可以实现对克氏原螯虾繁殖力性状的遗传检测。通过本发明可以筛选出高繁殖力的个体作为亲本，减少广大养殖户的投入，增加每年的收入。
选择含有高繁殖力群体连锁标记的个体作为亲本进行高繁殖力克氏原螯虾良种品系选育，将会大大加快选育进度，克服了现有技术手段进行繁殖力相关性状选育效率低下，效果差的难题。本发明获得的与克氏原螯虾高繁殖力连锁的标记有重要的应用价值。
本发明发现了2个克氏原螯虾微卫星标记与克氏原螯虾的高繁殖力性状紧密连锁，该连锁标记的开发为克氏原螯虾的遗传管理、人工繁殖配种制定、选育高繁殖力克氏原螯虾新品种奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星位点1条带图；
图2为本发明实施例1得到的与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星位点2条带图。
具体实施方式
实施例1
1.从江苏省盐城市克氏原螯虾养殖场取101尾抱卵的克氏原螯虾，称量每尾克氏原螯虾的重量，计数每尾克氏原螯虾的抱卵量，计算每尾的抱卵数量和体重的比值。根据比值结果排序，取相对抱卵量最小的24个个体组成低繁殖力群体，该群体每个个体的相对抱卵量的值小于5(卵粒/克体重)，取相对抱卵量最大的24个个体组成高繁殖力群体，该群体每个个体的相对抱卵量的值大于10(卵粒/克体重)。采集克氏原螯虾的组织，提取克氏原螯虾的DNA，提取方式采取传统的酚-氯仿抽提途径。具体步骤如下：
1.1每个个体取0.1g肌肉放于1.5ml的离心管内，剪碎，加入450μLSTE抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0)、35μL SDS(10％)、15μL蛋白酶K(0.2％)。
1.2将离心管放入放在55℃的水浴锅内水浴1个小时至澄清透明。
1.3在离心管内加入700ul Tris饱和酚，放在震荡机上混匀30分钟，4℃下12000转/min离心10min，将上清液转移入另一个干净的eppendorf管中(注意用尖端剪平的1mL管头吸取上清液，以防混淆下层沉淀)。
1.4在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(酚、氯仿、异戊醇比例为25：24：1)，振荡混匀15min后，4℃下12000转/min离心10min，吸上清液于另一新Eppendorf管中。
1.5上清液中加入等体积氯仿，振荡混匀15min后,4℃下12000转/min离10min，吸取上清液。
1.6加入-20℃预冷的无水乙醇1mL沉淀DNA，收集沉淀。
1.7用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加入200μL TE(10mmol/LTris-HCl，pH 8.0；0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)，室温充分溶解。
2.利用本发明提供的2组克氏原螯虾微卫星引物(表1)对克氏原螯虾样品进行PCR扩增，PCR反应体系是25ul：10×PCR Buffer 2.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，MgCl2 1.5ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，Taq酶0.3ul，DNA模板3ul，超纯水13.2ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。把PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离和银染，根据银染结果统计PCR扩增产物的基因型。
利用spss软件对条带大小进行分析，进行基因型和相对抱卵量大小性状的线性回归分析，采用最大似然比法，以P＝0.05作为阈值检测各个引物条带大小和性状的连锁关系，检测到位点1和位点2和克氏原螯虾的相对抱卵量的大小紧密连锁，如表2所示P＜0.05。
本实验结果为：微卫星位点1(见图1)的140bp条带和克氏原螯虾高繁殖力性状紧密连锁，微卫星位点2(见图2)的110bp条带和克氏原螯虾高繁殖力紧密连锁。
表2 回归的分析结果及遗传效应估计
Figure BDA0001589336360000041
实施例2
1. 2016年10月份在江苏省盐城市克氏原螯虾养殖场收集个体健壮，生长良好，附肢齐全，克氏原螯虾抱卵亲本2000尾。用带有数字编号的可以收紧的塑料套环扣在克氏原螯虾大螯基部，对每个抱卵虾进行编号；
2.对附着于母体腹部体外附肢克氏原螯虾不同发育期受精卵，用消毒镊子夹取分别在腹部前、中、后三个部分采集5-10个受精卵(总计15-30粒)于eppendorf管中，速冻于液氮中带回实验室-80度冰箱暂存；
3.提取克氏原螯虾2000尾抱卵虾不同发育期的胚胎的基因组DNA，提取方式采用北京康为世纪生物试剂有限公司Soil Genomic DNA Kit。
4.采用本发明提供的微卫星微引物对1和引物对2分别对克氏原螯虾样品进行PCR扩增，PCR反应体系是25ul：10×PCR Buffer 2.5ul，2.5mmol/L dNTP 0.5ul，MgCl2 1.5ul，每组反应体系两对引物的上下游引物各1ul，Taq酶0.3ul，DNA模板3ul，超纯水13.2ul。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。把PCR扩增产物在10％的聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离和银染，根据银染结果统计PCR扩增产物的基因型。
5.筛选出含有高繁殖力性状连锁的微卫星标记的抱卵虾：用引物对1筛选出带有140bp的目标条带的抱卵虾共560尾，用引物对2筛选出带有110bp的目标条带的抱卵虾共240尾，合计800尾，进行单独培育，孵幼，幼体培育，获得含有高繁殖力性状连锁标记的选育一代群体。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的微卫星标记及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatgcacctt tacctgaat 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttggtgtg gtcatca 17
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taacgattcc cagaaaatca ggtt 24
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catcataatc ccattgtacc ttctca 26

Claims (2)

1.一种与克氏原螯虾高繁殖力性状连锁的2个微卫星标记的微卫星引物对，其特征在于，包括以下序列：引物对1：F：TATGCACCTTTACCTGAAT；R：TGTTGGTGTGGTCATCA；引物对2：F：TAACGATTCCCAGAAAATCAGGTT；R：CATCATAATCCCATTGTACCTTCTCA，其中所述高繁殖力为相对抱卵量大，相对抱卵量大为抱卵数量和体重的比值。
2.权利要求1所述的微卫星引物对在选育高繁殖力克氏原螯虾中的应用，所述高繁殖力为相对抱卵量大，相对抱卵量大为抱卵数量和体重的比值。
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