CN112175942A - 一种精子dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种精子DNA提取方法。该方法包括如下步骤：1)取精液样本清洗后，用裂解缓冲液进行裂解，得到裂解后的溶液；2)将裂解后的溶液与醇类溶剂混匀后，取沉淀物；3)将步骤2)的沉淀物用柠檬酸钠溶液进行洗涤，取沉淀物；其中，裂解缓冲液包括：4.03～4.45M的硫氰酸胍、0.095～0.105M的氯化钠、0.95～1.05％的十二烷基肌氨酸钠、0.1425～0.1575M的二硫苏糖醇和0.19～0.21mg/mL的蛋白酶K，以无菌水配制。本发明的精子DNA提取方法，提取时间短、总量大、质量高，可满足后续各种分子遗传学实验的需求。

Description

一种精子DNA提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种精子DNA提取方法。
背景技术
基因组DNA是动物遗传物质的载体，其在基因工程、环境检测、环境净化、农业、畜牧业、食品业、药品和基因治疗等领域都有广泛的应用。随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA的提取与保存成为动物科学实验和育种生产过程中越来越重要的内容。
尼罗罗非鱼属于丽鱼科，具有世代周期短，生长速度快，无肌间刺，等特点，已成为世界性的主要水产养殖经济鱼类。尼罗罗非鱼在水温适宜或水温可控的地区可全年进行繁殖或养殖，因此不仅具有重要的商业经济价值，还可作为模式动物用于开展大型经济鱼类分子育种科学研究。目前有关尼罗罗非鱼分子育种研究主要采用的遗传学技术手段之一是基因操作，而快速准确鉴定基因操作后代是否携带目标性状可遗传变异是评价基因操作效果的直接手段。通常将基因操作后的待测罗非鱼亲本与野生型个体测交，通过测交后代的基因型和表型判定待测亲本基因操作的效果。这种基于获得测交后代筛选基因操作待测亲本的技术流程需要建立多个交配组合，占用大量的实验空间资源和人力成本，不利于快速精准获得基因操作目标阳性亲本。而直接对基因操作后待测罗非鱼亲本雄鱼的精液进行基因型鉴定，可快速准确地选择目标阳性雄鱼个体。
然而，常规的基因组DNA提取方法(如苯酚-氯仿提取方法)或DNA提取试剂盒无法获得高质量的精子DNA，主要是因为精子中的DNA处于高度压缩状态，且精子中含有其他体细胞所没有的特殊蛋白质(如精蛋白)。精子DNA围绕精蛋白形成染色质基本结构，而后精蛋白分子内外巯基进一步氧化形成的二硫键广泛交联，从而使染色体逐渐浓缩，更加稳定。成熟精子核这一致密化现象对保护精子基因组在精子面临外界应激时保持完整性具有重要作用，能够保证遗传物质完整的传递到后代中。研究发现，精子中高度压缩的DNA和蛋白质结合的紧密程度是普通体细胞中DNA和蛋白质结合紧密程度的至少6倍。因此，常规方法无法使精子的基因组DNA与精蛋白有效分离，导致精子DNA在消化中释放困难、抽提产率低、纯度低，难以满足高要求的分子生物学。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种精子DNA提取方法，能够获得产率高、纯度高的高质量DNA。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明一方面提供了一种精子裂解缓冲液，包括4.03～4.45M的硫氰酸胍、0.095～0.105M的氯化钠、0.95～1.05％的十二烷基肌氨酸钠、0.1425～0.1575M的二硫苏糖醇和0.19～0.21mg/mL的蛋白酶K，以无菌水配制。
本发明将常规组织细胞裂解液中的Tris-HCl和EDTA分别更改为硫氰酸胍(guanidine thiocyanate)和二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DDT)。硫氰酸胍是一种促溶剂，具有很强的蛋白质变性能力；采用硫氰酸胍能够裂解细胞膜，破坏蛋白的二级结构，使核蛋白和核酸分离，从而使蛋白酶K消化掉核蛋白，增强了蛋白酶K消化蛋白的能力。二硫苏糖醇是强还原剂，切割二硫键的能力很强，可使鱼精蛋白和精子DNA彻底分离。也有部分文献报道的精子DNA提取方法中使用2-疏基乙醇，2-疏基乙醇毒性较DTT更高，而DTT毒性低，气味不是特别难闻，效率高。因此基于安全性和提取效率等多方面的考虑，DTT是提取精子DNA时的最佳选择。十二烷基肌氨酸钠是一种使蛋白质变性的离子型去污剂，可以破坏生物的细胞膜，并且在高盐溶液中的溶解性能很好，因此是可用于硫氰酸胍溶液中一种理想去污剂。十二烷基磺酸钠(Sodium laurylsulfonate)也是DNA提取过程中常用的去污剂，然而十二烷基磺酸钠在高盐溶液中的溶解度很低，效果不理想。本发明通过对裂解体系进行优化，使得精子裂解充分完全，裂解液均匀、澄清、透亮，便于后续DNA提取。
本发明另一方面还提供了一种精子DNA提取方法，包括如下步骤：
1)取精液样本清洗后，用精子裂解缓冲液进行裂解，得到裂解后的溶液；
2)将裂解后的溶液与醇类溶剂混匀后，取沉淀物；
3)将步骤2)的沉淀物用柠檬酸钠溶液进行洗涤，取沉淀物；
其中，精子裂解缓冲液包括：4.03～4.45M的硫氰酸胍、0.095～0.105M的氯化钠、0.95～1.05％的十二烷基肌氨酸钠、0.1425～0.1575M的二硫苏糖醇和0.19～0.21mg/mL的蛋白酶K，以无菌水配制。
本发明使用特定的裂解缓冲液，使得精子裂解充分完全，裂解液均匀、澄清、透亮，便于后续DNA提取。然后再用醇类溶剂使DNA从裂解液中析出后，用柠檬酸钠溶液清洗DNA沉淀，可以去除DNA上可能附着的盐离子等杂质，因为在有高盐和乙醇的环境中，钠离子会中和负价的磷酸盐基团，从而使DNA持续保持沉淀状态。
根据本发明的一些实施方式，步骤1)中，精液样本清洗时使用的洗涤缓冲液组分包括：0.1425～0.1575M的氯化钠和0.0095～0.0105M的EDTA，以无菌水配制。优选地，使用洗涤缓冲液清洗精液样本1～2次。优选地，洗涤缓冲液的用量为精液样本体积的9～11倍。洗涤缓冲液用来去除精液中可能存在的其它无关杂质，比如水、尿液等；多次清洗可以进一步去除精液中无关杂质，提高精液的纯度。
根据本发明的一些实施方式，所述裂解缓冲液的用量为精液样本体积的19～21倍；优选地，在50～60℃的水浴中裂解1～3h。其中裂解缓冲液用量过多，可能会造成DNA提取量相对较小，试剂浪费等问题；用量过少则导致裂解不充分。孵育时间可以根据沉淀的体积进行调整。
根据本发明的一些实施方式，所述醇类溶剂为无水乙醇或异丙醇；优选为异丙醇。更优选地，异丙醇的用量为精液样本体积的15～17倍；无水乙醇的用量为精液样本体积的30～34倍。利用DNA溶解于水而不溶解与醇类溶剂的特点，使精子DNA从裂解液中析出。
根据本发明的一些实施方式，步骤2)为：裂解液置于室温环境下使其恢复到室温，然后加入预冷的醇类溶剂，混匀，得到DNA沉淀。通常情况下，上下轻轻颠倒混匀25次即可发现DNA沉淀(白色絮状物)的形成。
根据本发明的一些实施方式，柠檬酸钠溶液的浓度为0.095～0.105M，用量为精液样本体积的30～35倍。
根据本发明的一些实施方式，步骤3)中，在柠檬酸钠溶液进行洗涤后，还包括用乙醇进行洗涤，以及用TE缓冲液或无菌水进行溶解的过程。用乙醇洗涤的目的是进一步去除DNA中多余杂质，得到纯度高的DNA。
根据本发明的一些实施方式，所述乙醇为75％乙醇。
根据本发明的一些实施方式，所述TE缓冲液的pH为7.5～8.5；优选为8。
根据本发明的一些实施方式，所述步骤3)为：将步骤2)的沉淀物与柠檬酸钠溶液混匀，置于室温13～17min，每4～6min轻轻上下颠倒混匀液，离心，取沉淀物，并重复操作1～2次；将得到的沉淀物用75％乙醇洗涤，离心，弃上清；吸走多余的乙醇，然后置于室温静置约9～11min，至无残留的乙醇为止；然后加入3～5倍精液样本体积的TE缓冲液(pH 8.0)或者无菌ddH2O，置于60～70℃水浴中孵育30min-60min，直到沉淀完全溶解为止。
室温静置的时间不能过长或过短，静置时间过长会导致DNA过度干燥，进而造成溶解困难，静置时间过短则会导致DNA中有乙醇残留，影响后续实验。因此，必须根据实际获得DNA沉淀的体积，灵活调室温静置的时间。从精子中提取得到的DNA不同于普通组织提取的DNA，精液中提取的DNA浓度很高，结合的很牢固，室温下溶解速度很慢，因此建议使用60～70℃(优选65℃)水浴加热进行溶解，同时间断进行震荡处理，加速DNA的溶解。可将最终获得DNA溶液置于室温环境下，过夜溶解，以达到使DNA充分溶解的目的。
根据本发明的一些实施方式，所述精子来自鱼类，优选来自可以通过挤压腹部获得精子的鱼类，优选来自罗非鱼，更优选来自尼罗罗非鱼。
根据本发明的一些实施方式，精子的采集方法为：用干净的毛巾包裹住鱼体，一个人用左手握住鱼，将鱼的腹部朝上(即腹部朝向天空)，右手轻轻挤压腹部，当生殖孔有精液流出时，另外一个人用微量移液器迅速吸取精液并转移到指定编号的离心管中，将装有精液的离心管置于冰上暂存；同时用扫码器扫描鱼体腹部，读取和记录雄鱼芯片代码，与离心管编号建立一一对应关系。
传统的罗非鱼精液采集方法仅适用于个体较大、精子较多的个体，对于个体较小、精液较少时，根本无法采集到精液。本发明的采集方法使得在鱼类个体较小、精液较少时也可以采集到足量的精液，保证后续提取精子DNA的成功提取。并且建立一一对应关系，可有效避免由于临时现场编号导致罗非鱼个体编号(PIT芯片代码)和精液样品顺序错位的发生。
本发明的有益效果：
本发明对裂解缓冲液的组成和配比进行了调整，其能够使精子充分裂解，得到的裂解液为均匀、澄清、透明的溶液。而常规的苯酚-氯仿法和商业DNA提取试剂盒在第一步精子裂解时就失败了，裂解后得到的是凝胶物质，无法获得均匀、澄清、透亮的溶液，进而无法进行后续的DNA提取操作而最终获得精子DNA。本发明还对DNA的步骤和使用试剂进行了优化，通过这种特定组合，实现了精子DNA的高效提取。本发明的精子DNA提取方法，提取时间短、总量大、质量高，可满足后续各种分子遗传学实验的需求。
附图说明
图1为提取得到的精子DNA的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。所有操作处理、试剂保存等，如无特殊说明，均在室温下进行操作和保存。
主要试剂的配置：
6M硫氰酸胍溶液，称取7.09g硫氰酸胍溶解于无菌ddH2O，定容至10mL。
15％十二烷基肌氨酸钠溶液，称取3.75g十二烷基肌氨酸钠溶解于无菌ddH2O，定容至25mL。
5M氯化钠(NaCl)，称取11.69g氯化钠溶解于无菌ddH2O，定容至50mL。
1M二硫苏糖醇溶液，称取1.54g二硫苏糖醇溶解于无菌ddH2O，定容至10mL，分装成500μL/份于-20℃保存，避免反复冻融。
20mg/mL蛋白酶K，称取200mg蛋白酶K溶解于无菌ddH2O中，定容至10mL，分装成500μL/份于-20℃保存，避免反复冻融；
0.5M乙二胺四乙酸二钠(EDTA，pH 8.0)，称取23.30g乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H2O)溶解于无菌ddH2O中，在磁力搅拌器上搅拌均匀，调节pH到8.0，定容至100mL，高压蒸汽121℃灭菌20min；
异丙醇，提前置于-20℃保存；
75％乙醇，量取75mL无水乙醇加入25mL无菌ddH2O中；
10mM Tris-HCl，称取0.12g Tris-HCl溶解于无菌ddH2O中，调节pH到8.0，定容至100mL；
0.1M柠檬酸钠溶液，称取0.29g柠檬酸钠解于10％乙醇中，定容至10mL。
实施例1尼罗罗非鱼雄鱼个体的鉴定
(1)用干净的毛巾包裹住鱼体，一个人用左手握住鱼，将鱼的腹部朝上(即腹部朝向天空)，右手轻轻挤压腹部，生殖孔(即肛门后面的孔)呈乳突状的即为雄鱼，生殖孔呈细缝状的即为雌鱼。
(2)当发现雄鱼时，另外一个人用扫码器扫描鱼体腹部，读取和记录雄鱼芯片代码和性别信息，以便统计最终雄鱼个体数目和来源情况。
实施例2尼罗罗非鱼雄鱼精液的采集
(1)取无菌1.5mL离心管，根据雄鱼个体数目在离心管顶部盖子上标识样品序号(如共有20个雄鱼，则标识为：1、2、3……18、19、20)。将编号后的离心管按顺序放在离心管架中，并将离心管架置于冰上备用。
(2)用干净的毛巾包裹住鱼体，一个人用左手握住鱼，将鱼的腹部朝上(即腹部朝向天空)，右手轻轻挤压腹部，当生殖孔有精液流出时，另外一个人用200μL微量移液器迅速吸取精液并转移1.5mL到指定编号的离心管中，同时用扫码器扫描鱼体腹部，读取和记录雄鱼芯片代码，与离心管编号建立一一对应关系。
(3)当某个雄鱼经挤压腹部而无法获得精液时，则不扫描该雄鱼的芯片代码，避免发生芯片代码和样品管编号错位。
实施例3尼罗罗非鱼精子DNA的提取
(1)取30μL精液置于1.5mL离心管中，加入300μL洗涤缓冲液，轻轻颠倒混匀，800g离心10min，弃上清。
(2)再次加入300μL洗涤缓冲液对精液进行二次清洗，方法同上，800g离心10min，弃上清。
(3)向上述步骤中获得沉淀中加入600μL裂解缓冲液，置于56℃水浴中孵育1h，直至沉淀消化完毕，得到均一、澄清的溶液。
(4)孵育结束后将离心管从水浴中取出，置于室温环境下使其恢复到室温，然后加入480μL的预冷异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，直到可看到明显的DNA沉淀为止。通常情况下，上下轻轻颠倒混匀25次即可发现DNA沉淀(白色絮状物)的形成。
(5)将步骤(4)中形成的DNA沉淀转移至提前加有1mL 0.1M柠檬酸钠溶液的1.5mL离心管中，置于室温15min，每5min轻轻上下颠倒离心管，5000g离心3min，弃上清。重复步骤(5)操作1次。
(6)用75％乙醇洗涤沉淀1次，5000g离心3min，弃上清。
(7)快速离心步骤(6)残留的乙醇，用200μL移液器吸走多余的乙醇，然后置于室温环境下约10min，至离心管内无残留的乙醇为止。
(8)向上述沉淀中加入150μL TE缓冲液(pH 8.0)或者无菌ddH2O，置于65℃水浴中孵育30min-60min，直到沉淀完全溶解为止。(注意：每隔一段时间将离心管拿出来轻轻拍打管壁或震荡，以加速DNA的溶解)。将最终获得DNA溶液置于室温环境下，过夜溶解，已达到使DNA充分溶解的目的。
其中，洗涤缓冲液：600μL 5M NaCl溶液+400mL 0.5M EDTA溶液+19mL无菌ddH2O；裂解缓冲液：2.12mL 6M硫氰酸胍溶液+60μL 5M NaCl溶液+200μL 15％十二烷基肌氨酸钠溶液+450μL 1M二硫苏糖醇溶液+30μL 20mg/mL蛋白酶K溶液+140μL无菌ddH2O。
实施例4提取到的尼罗罗非鱼精子DNA的质量检测
(1)采用琼脂糖凝胶电泳检测实施例3提取得到的精子DNA的质量。
取5μL溶解完全的精液DNA加入1μL DNA上样缓冲液混合均匀，上样，用1.5％琼脂糖凝胶100V电压电泳1h，凝胶成像系统拍照保存。
电泳结果如图1所示，其中，M1为DL1000 DNA梯状条带，最大片段大小为1000bp；M2为1kb DNA梯状条带，最大片段为10000bp。1#和2#点样孔是以2个样品的精液DNA为模板，进行PCR扩增检测，结果显示1#和2#样品均扩增出目的条带，符合预期。3#和4#点样孔是直接将1#和2#样品的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳上进行检测，可见一个大约10kb的目的条带，符合预期。1#～4#点样孔的琼脂糖电泳检测结果显示，提取的精液DNA片段完整、无弥散、质量高，可满足后续分子遗传学实验需求。
(2)采用NanoDrop-2000检测实施例3中提取得到的DNA浓度。
取1μL溶解完全的精液DNA上样检测。检测结果如表1所示。DNA浓度测定结果显示提取DNA浓度均大于400ng/μL，A260/A280均在1.8～2.0之间，浓度高，纯度好。
表1尼罗罗非鱼精液DNA浓度检测结果
Figure BDA0002715797530000071
Figure BDA0002715797530000081
综上，可以看出，本发明提供的尼罗罗非鱼精子DNA采集和提取方法可获得高质量的精液DNA，实验操作流程简单高效，所需试剂成本低，提取周期短，获得精液DNA质量好，浓度高，可满足后续分子遗传学实验需求。
对比例1
为了对比本发明DNA提取方法与普通组织细胞DNA提取方法、以及商业DNA提取试剂盒的效果差异，进行了对比实验。
使用相同的精子，分别采用本发明的DNA提取方法、普通组织细胞DNA提取方法(苯酚-氯仿法)、商业DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)提取方法进行精子DNA提取，其对比分析结果如表2所示。通过表2可以发现，使用普通的组织细胞DNA提取法或者商业DNA提取试剂盒法，均无法使精液彻底裂解，进而无法进行后续的精子DNA提取操作。而本发明的DNA提取方法，可使精液彻底裂解为均一、澄清、透亮的溶液，进而可以得到高质量的精子DNA。
表2本发明方法与已报道的DNA提取法提取精子DNA的效果对比分析
Figure BDA0002715797530000082
Figure BDA0002715797530000091
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。

Claims (10)

1.一种精子裂解缓冲液，其特征在于，包括4.03～4.45M的硫氰酸胍、0.095～0.105M的氯化钠、0.95～1.05％的十二烷基肌氨酸钠、0.1425～0.1575M的二硫苏糖醇和0.19～0.21mg/mL的蛋白酶K，以无菌水配制。
2.一种精子DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取精液样本清洗后，用精子裂解缓冲液进行裂解，得到裂解后的溶液；
2)将裂解后的溶液与醇类溶剂混匀后，取沉淀物；
3)将步骤2)的沉淀物用柠檬酸钠溶液进行洗涤，取沉淀物；
其中，精子裂解缓冲液包括：4.03～4.45M的硫氰酸胍、0.095～0.105M的氯化钠、0.95～1.05％的十二烷基肌氨酸钠、0.1425～0.1575M的二硫苏糖醇和0.19～0.21mg/mL的蛋白酶K，以无菌水配制。
3.根据权利要求2所述的精子DNA提取方法，其特征在于，步骤1)中，精液样本清洗时使用的洗涤缓冲液的组分包括：0.1425～0.1575M的氯化钠和0.0095～0.0105M的EDTA，以无菌水配制。
4.根据权利要求2所述的精子DNA提取方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的用量为精液样本体积的19～21倍；优选地，在50～60℃的水浴中裂解1～3h。
5.根据权利要求2所述的精子DNA提取方法，其特征在于，所述醇类溶剂为无水乙醇或异丙醇；优选为异丙醇。
6.根据权利要求2所述的精子DNA提取方法，其特征在于，步骤2)为：裂解液置于室温环境下使其恢复到室温，然后加入预冷的醇类溶剂，混匀，得到DNA沉淀。
7.根据权利要求2所述的精子DNA提取方法，其特征在于，柠檬酸钠溶液的浓度为0.095～0.105M，用量为精液样本体积的30～35倍。
8.根据权利要求2所述的精子DNA提取方法，其特征在于，步骤3)中，在柠檬酸钠溶液进行洗涤后，还包括用乙醇进行洗涤，以及用TE缓冲液或无菌水进行溶解的过程。
9.根据权利要求2至8任一项所述的精子DNA提取方法，其特征在于，所述精子来自鱼类，优选来自罗非鱼，更优选来自尼罗罗非鱼。
10.根据权利要求9所述的精子DNA提取方法，其特征在于，精子的采集方法为：用干净的毛巾包裹住鱼体，将鱼的腹部朝上，轻轻挤压腹部，当生殖孔有精液流出时，用微量移液器迅速吸取精液并转移到指定编号的样品管中。
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