CN106376501A - 一种生产泥鳅四倍体的方法 - Google Patents

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魏杰
李雅娟
张蕊
徐其征
林忠乔
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梁雨婷
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Abstract

本发明公开了一种生产泥鳅四倍体的方法，所用雄亲鱼为自然四倍体泥鳅，雌亲鱼为二倍体泥鳅，干法受精，受精后立即将受精卵放入0℃水中处理50‑60min,之后置于常温曝气水中正常孵化。本发明选用染色体数目不同的两种泥鳅即二倍体(2n＝50)和四倍体(4n＝100)泥鳅，通过冷休克处理抑制第二极体释放，诱导四倍体，对其所产生后代的染色体数目、DNA相对含量、血红细胞核体积、染色体数目及微卫星等进行了较系统的分析，证明四倍体泥鳅诱导真实性和可靠性，为泥鳅种质资源保护与利用以及进一步对泥鳅在水产养殖在生产起到应用价值。

Description

一种生产泥鳅四倍体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种生产泥鳅四倍体的方法。
背景技术
鱼类多倍体育种是基于染色体组操作基础上发展起来的育种技术，长期以来是水产界追踪研究的热点。三倍体的不育特性在渔业资源管理中越来越受到重视。一般认为不育的三倍体鱼能将性腺发育的能量转化为肌肉生长的能力，使其具有潜在的生长优势。另外三倍体鱼的不育性对控制养殖鱼类的过渡繁殖和保护天然种质资源也具有极其重要的意义，而且三倍体鱼还可以作为转基因鱼的理想载体，解决转基因鱼的生态安全问题。鉴于三倍体鱼的种种优势，制备三倍体鱼也就成为广大研究者追求的目标。自20世纪50年代以来,多倍体诱导技术已在鱼类遗传育种领域得到广泛的应用,国内外已先后在三棘刺鱼、鲤、水晶彩鲫等30多种鱼类育种中成功获得三倍体，其中三倍体的异育银鲫、湘云鲫、湘云鲤已进行了商品化生产，达到了产业化水平。多倍体技术在生产上发挥着越来越重要的作用。
以往人工诱导鱼类四倍体是鱼类体外受精后，通过物理、化学及生物方法抑制第一次受精卵卵裂而达到染色体加倍，如戈文龙通过抑制第1次卵裂使染色体加倍上获得成功，胚胎阶段观察到许多四倍化胚胎，但不能孵出仔鱼，或是孵出仔鱼但多为畸形难以找到活体四倍体鱼。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供一种生产泥鳅四倍体的方法。
本发明的技术方案如下：
一种生产泥鳅四倍体的方法，所用雄亲鱼为自然四倍体泥鳅，雌亲鱼为二倍体泥鳅，干法受精，受精后立即将受精卵放入0℃水中处理50-60min,之后置于常温曝气水中正常孵化。
所述的方法，鱼卵发育时，每隔12小时换水一次，孵化后1天换水一次，三日后进行投喂，一日喂2次。
本发明选用染色体数目不同的两种泥鳅即二倍体(2n＝50)和四倍体(4n＝100)泥鳅，通过冷休克处理抑制第二极体释放，诱导四倍体，对其所产生后代的染色体数目、DNA相对含量、血红细胞核体积、染色体数目及微卫星等进行了较系统的分析，证明四倍体泥鳅诱导真实性和可靠性，为泥鳅种质资源保护与利用以及进一步对泥鳅在水产养殖在生产起到应用价值。
附图说明
图1三倍体和四倍体泥鳅的血红细胞(比例尺＝5μm)，a.对照组三倍体b.处理组四倍体
图2利用流式细胞计数鉴定倍性的相关图形(以鳍组织为材料，进行倍性鉴定)：A对照组2n B处理组3n C处理组 4n
图3，为泥鳅鳍组织原代细胞迁出(比例尺为50μm)，注：A 3n泥鳅鳍组织原代培养出细胞；B 4n泥鳅鳍组织原代培养迁出代细胞
图4不同倍体泥鳅鳍细胞染色体中期分裂相及细胞染色体数目，a:三倍性泥鳅鳍细胞染色体中期分裂相b:三倍体鳍细胞染色体数目，c：四倍体泥鳅鳍细胞染色体中期分裂相d：四倍体鳍细胞染色体数目
图5泥鳅基因组DNA 1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图6.Mac63多倍体诱导后代中的部分聚丙烯电泳图谱；A.处理组B.对照组；
图7 Mac24在雄核发育后代中的部分聚丙烯电泳图谱；A.处理组B.对照组；
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
材料方法
所用雄亲鱼为自然四倍体泥鳅(4n＝100)(♂)取自湖北省赤壁市,雌亲鱼二倍体泥鳅(2n＝50)(♀)取自大连市农贸市场，其倍性经血红细胞核体积测量、流式细胞仪检测确定，暂养于细胞遗传与工程实验室水族箱中，暂养温度为22±1℃。
选取健康，性腺发育良好、体表无伤的泥鳅个体作为亲本进行杂交,人工催产,干法受精。受精后迅速置于0、3、6℃水中，处理50-60min,之后置于常温(22±1℃)曝气水中正常孵化,以未做冷休克处理作为对照组，鱼卵发育时，每隔12小时换水一次，孵化后1天换水一次，三日后进行投喂，一日喂2次。
早期胚胎染色体标本制备：分别取发育眼胞期的单个胚胎30个，用镊子去卵膜和卵黄放入盛有0.0025％的秋水仙素中处理60min，0.8％的柠檬酸钠低渗15min，卡诺固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)固定，冷冻过夜。冷滴片，Olympus AH2油镜下观察拍照。
杂交子代早期胚胎染色体倍性鉴定结果表明，对照组子代100％为三倍体，0℃处理组的四倍体率与3、6℃两组相比最高为83％。
表1对照组与处理组子代胚胎染色体数目统计
1、对12月龄鱼的倍性进行鉴定
(1)血红细胞核体积测量
用准备好的苯甲醇稀释液(1ml/L)来麻醉鱼体，在臀鳍偏上方抽血少许，迅速滴在载玻片上。风干后滴一滴甲醇于载玻片上，之后用吉姆萨染色5分钟，自然风干后在显微测微下拍照，测量长度。每尾鱼做血涂片1张，每张图片随机测量50个细胞。分别测量红细胞和红细胞核的长径(a)、短径(b)，细胞核体积按下面公式计算：V＝4/3×π(a/2)(b/2)2,根据体积鉴定倍性。
(2)流式细胞仪检测
分别在已知二倍体泥鳅作为对照、三倍体泥鳅和冷休克处理组泥鳅为研究对象。使用苯甲醇(1ml/2L)将泥鳅麻醉；蒸馏水清洁泥鳅尾鳍，使用70％乙醇消毒镊子和剪刀，擦净后从麻醉泥鳅的尾鳍尖端剪取1mm2组织，加入已配好的100ul裂解液；轻离心管轻振荡器上震荡，每10min振荡一次，共计30min。避光条件下，DAPI荧光染料冲洗,使样品管液体体积最终在1.5～2ml之间,SK-1快速混匀仪振荡3～5min,用300～500目小筛网过滤混悬液到配套的测试小管中,轻弹试管，使细胞悬液均匀混合。采用已知二倍体泥鳅作为对照，在分析待测鱼鳍样品的DNA相对含量。统计多倍体鱼苗的比率。实验数据用实验仪器为德国产Partec PAS-III型流式细胞仪,使用ModFit LT软件进行转换读取数据。
(3)鳍细胞培养及染色体标本制备
1)原代培养
本实验中用到的泥鳅倍性均经血红细胞核测量及流式细胞仪检测确定，四倍体，三倍体分别使用3尾。参照李霞的方法略有改动。实验前将状态良好的泥鳅放在含有双抗消毒液的曝气淡水中暂养16h-24h(1000IU/mL青霉素，1000ug/mL链霉素)，添加少量的食盐有去除泥鳅表面皮肤粘液及杀菌的等作用。实验开始之前先用70％的酒精工作台和使用的剪刀镊子进行消毒，准备好后用1‰苯甲醇麻醉后,泥鳅麻醉后放置在灭菌的托盘上，带入超净工作台中，先用酒精擦拭放入到10％的碘伏浸泡15min；后用青霉素和链霉素的混合液(500IU/mL青霉素,500ug/mL链霉素)浸泡30min；每15min换次液体轻轻吹打，放置一会轻轻洗掉液体，再分别用PBS漂洗和5％FBS-DMEM/F12培养基漂洗各一遍。灭菌的剪刀进行过火再次灭菌将鳍组织剪成小块，也可用0.5％的透明质酸酶和0.2％的胶原酶消化30min后洗掉酶混合液后添加培养基轻轻吹打均匀种于25cm2细胞培养瓶中,在25℃、CO2培养箱中，细胞贴服到壁上后补加细胞培养基。启动原代培养至细胞长成单层。
2)传代培养
定期观察培养瓶，细胞长满一层冰铺满整个培养瓶的瓶底，吸出培养瓶中的培养液,加入0.25％的胰蛋白酶溶液1mL,30s后吸去胰蛋白酶溶液,使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜,继续消化1min,轻磕细胞培养瓶。将之前吸出的培养液加回,用吸管吹打,制成细胞悬液；将细胞悬液以体积比1:1分到两个新的培养瓶中；并补加培养液至5mL；在25℃、CO2培养箱中培养至细胞长成单层后继续用此方法传代。定期更换一部分细胞培养液，使细胞得到充分对营养。
3)鳍组织细胞染色体标本的制备
A细胞选取与秋水仙素处理
选择传代培养20代以内的细胞，在倒置显微镜下观察，确认细胞生长状态良好，且铺满全瓶。在无菌环境下添加秋水仙素溶液，使终浓度为1.5μg/ml，然后继续放在25℃、CO2(5％)培养箱中培养3h。
B取材与低渗
细胞培养结束后，将细胞从培养箱中取出，吸出培养基放在提前准备好的干净青霉素小瓶中。在细胞中加入1ml左右的0.25％胰酶溶液，室温消化2min。将之前吸出的培养基再加回培养瓶中，终止胰酶消化。用弯头吸管反复吹打瓶底，确保贴壁的细胞全部浮起，制成细胞悬液。收集细胞悬液到锥形离心管中，1500r/min，离心10min。弃上清，加入25℃预热的0.8‰的柠檬酸钠低渗液3-5ml，用弯头吸管不断吹打成细胞悬浊液。放在25℃、CO2(5％)培养箱中处理40min。
C固定
低渗结束时，先加入数滴新鲜配制的-20℃预冷的卡诺固定液(甲醇：冰乙酸＝3:1)，放入碎冰中预固定3-5min；1000r/min，离心5min，弃上清，加入3-5ml卡诺固定液，低温处理15min，该步骤重复三次；最后一次换上新的固定液后放入-20℃冷冻箱过夜后，即可长期保存。
D制片
将固定好的细胞样品从冰箱中取出，1000r/min，离心5min，弃上清；根据沉淀的多少加入1-2滴50％冰乙酸，将沉淀吹起、吹打成细胞悬液后，加少量新鲜配制的卡诺固定液，继续吹打。取出冰箱中预冷的载玻片，参照冷滴片的方法进行滴片、过火；室温自然风干。
E Giemsa染色
染色体标本在室温自然风干后，用Giemsa染色液(磷酸二氢钾：磷酸氢二钠：Giemsa母液＝7:3:1)染色45min，蒸馏水冲洗掉多余的染液，自然风干。荧光显微镜(LeicaDM2000)下观察拍照。
2、亲子鉴定
本实验中用到的泥鳅倍性均用流式细胞仪检测确定，在其中随机选取四倍体，三倍体泥鳅各30尾鱼鱼鳍，剪取父母本尾鳍分别保存在95％的酒精中待用。
1)基因组DNA提取
采用常规酚-氯仿法提取三种泥鳅基因组DNA，加入100μL的TE缓冲液(pH＝8.0)，并稀释至100ng/μl，-20℃保存备用。
2)引物来源
引物参考Morishima(2001,2008)，并在GenBank中进行核对,。引物由上海生物工程公司合成。本实验选取了泥鳅的5个微卫星位点进行分析(表2)。
表2微卫星引物的序列及其长度
3)PCR反应体系：表3
表3泥鳅微卫星位点的PCR扩增体系组分
反应体系组分 体积(μl)
灭菌去离子水(DDW) 9
10×Buffer(Mg2+free) 1.5
dNTPs(2.5mM) 0.8
MgCl2(2.5mM) 1.5
Forward Primer(10μM) 1
Reverse Primer(10μM) 1
r Taq E(1U/μl) 0.2
DNA(100μg/μl) 1
总体积 16
4)PCR反应程序：
95℃预变性5min，随后变性→复性→延伸35个循环，95℃变性1min，54℃～60℃复性30s，72℃下进行延伸30s，72℃最后延伸10min，结束后放入4℃.
5)聚丙烯凝胶电泳检测
本实验用8％非变性聚丙烯凝胶电泳检测。将凝固好的胶固定在电泳仪上，吹打气泡。预电泳10min。同时将选择扩增产物加入等体积的Loading Buffer，每个样品上样3μl，2000bp Marker作为分子标记，140V恒电压，至第一条指示带至胶的另一前沿(约3h)，结束电泳。
冲洗：纯水冲洗胶板2次，洗去残留在胶上的TBE电泳液。
染色：在浓度为1％的硝酸银中染色15min。
漂洗：倒掉染色液，纯水冲洗胶板，将残留的硝酸银冲洗掉，进行显色。
显色：将胶在配制好的显影液(现用现配，无水碳酸钠，氢氧化纳，甲醛)中，轻轻摇动直到条带的出现，约15min。
漂洗：用自来水冲洗胶板，在用蒸馏水冲洗
进行拍照、扫描。胶板可以永久保存。使用Gel-Pro Analyzer4.5软件度电泳谱条带进行分析。
结果
3.1血红细胞核体测量
与其它鱼类红细胞一样，泥鳅红细胞呈椭圆球体，具有致密的椭圆形细胞核(图1a，1b)。如表4所示，血红细胞核体积测定三倍体红血球核体积为34.85±2.28μm，四倍体红血球核体积为51.43±5.02μm。结果表明四倍体泥鳅的红细胞核长轴、短轴以及体积都显著大于三倍体(P<0.01)。
表4对照组和处理组血红细胞核测量结果
参数Variable 三倍体Triploid(n) 四倍体Tetraploid(n)
长轴Major axis of nucleus(μm) 5.69±0.29(50)A 7.33±0.43(50)B
短轴Minor axis of nucleus(μm) 3.42±0.14(50)A 3.66±0.19(50)B
核体积Nuclear volume(μm) 34.85±2.28(50)A 51.43±5.02(50)B
注：同行数据不同大写字母“A”“B”表示差异极显著(P<0.01)
3.2流式细胞仪检测
经血红细胞核测定已知的三倍体和四倍体进行流式细胞仪进一步检测。将泥鳅正常二倍体DNA相对含量设置为50，并作为对照组，如图2A所示。检测结果显示：三倍体泥鳅中尾鳍细胞中的DNA相对含量在75处出现第一个峰值，如图2B所示，表明其细胞中DNA相对含量为正常二倍体的1.5倍；而图2C所示细胞中DNA相对含量在100处出现是正常二倍体相对值的2倍，此为四倍体泥鳅。倍性性鉴定结果表明(表5)，流式细胞仪共检测一龄鱼147尾，其中三倍体泥鳅共31尾，占总数的21.1％，四倍体泥鳅共116尾，占总数的78.9％。
表5检测个体数和倍性结果
倍性 样本数 雌 雄 倍化率％
Ploidy Numberof samples Female Male Times of rate
三倍体Triploid 31 14 17 21.09％
四倍体Tetraploid 116 49 67 78.91％
合计Total 147
3.3鳍细胞体外培养及染色体标本制备
本试验在无菌条件下，原代细胞培养已启动，细胞迁出及组织贴壁生长如图3所示。下一步传代培养在20代以内，制备染色体并计数观察，如图4(a,b)所示。不同倍性分别观察30个细胞染色体数目，如图4(c,d)所示3n染色体众数为75条，4n细胞染色体众数为100条。
3.4基因组DNA的制备结果
泥鳅基因组DNA琼脂糖凝胶电泳(图5)。制备1％的琼脂糖凝胶，吸取3μl DNA样品与2μl的溴酚蓝轻轻混匀，第一个泳道加入DL2000bp的Marker，进行电泳检查基因组DNA的质量，置于凝胶成像系统中紫外灯照射下进行观察拍照，将质量不好的剔除掉。所有基因组DNA大分子较完整且纯度较高且含杂质量极少。
3.5微卫星标记检测
选用了15对微卫星引物对多倍体诱导后代及亲本进行微卫星分析，其中引物在GenBank核对，鉴定结果详见表6，按其片段大小对每个基因座位上基因型进行定义，在15对所选的微卫星引物中，有4对筛选出来的引物(Mac24、Mac37、Mac63、Mac425)亲本基因型有差异，可用来进行多倍体后代鉴定，鉴定结果详见表6。父本、母本及多倍体子代的位点在Mac63(图6A)、Mac24(图7B)中显示，杂交四倍体后代的基因条带分别来自父本、母本，由此分析多倍体诱导来自极体释放受到抑制，使其染色体加倍而得到。
表6冷休克后代三倍体，四倍体的基因型
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种生产泥鳅四倍体的方法，其特征在于，所用雄亲鱼为自然四倍体泥鳅，雌亲鱼为二倍体泥鳅，干法受精，受精后立即将受精卵放入0℃水中处理50-60min,之后置于常温曝气水中正常孵化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，鱼卵发育时，每隔12小时换水一次，孵化后1天换水一次，三日后进行投喂，一日喂2次。
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