CN103343136B - 一种海水鲆鲽鱼类转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种海水鲆鲽鱼类转基因方法，是将携带有外源基因的质粒转移到性成熟的雄鱼精巢中，然后收集转基因雄鱼的精液并和雌鱼的成熟卵进行授精，从而通过精子将外源基因转入受精卵中，这样就避免了对受精卵进行显微注射而导致胚胎大量死亡的难题。本发明的方法可将外源基因有效转入鲆鲽鱼类受精卵中，外源基因在转基因鱼苗中整合的阳性率为12%-21%，为鲆鲽鱼类基因转移研究提供了一种新的方法，解决了鲆鲽鱼类受精卵难以通过显微注射进行转基因的问题，为鲆鲽鱼类基因工程育种提供了新的技术手段。

Description

一种海水鲆鲽鱼类转基因方法

技术领域

本发明属于海水鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种海水鲆鲽鱼类转基因方法，即将外源基因向半滑舌鳎等海水鲆鲽鱼类高效转移的方法。

背景技术

基因转移是研制高产、抗病动植物新品种的重要手段，也是分析基因功能的有效方法。鱼类因其怀卵量大，受精卵体外发育，易于操作等优点而得到了广泛的关注。1985年,中国科学院水生生物研究所朱作言等将外源生长激素基因显微注射到鲫鱼受精卵，获得成功。此后，世界各国对转基因鱼的研究做了大量工作，并取得很大进展。受精卵显微注射是进行鱼类基因转移的主要方法，它操作简单，效率较高，因而在小型模式鱼类及一些淡水鲤科鱼类转基因研究中得到广泛应用。例如，采用受精卵显微注射技术已经获得转基因鲤鱼(Cyprinus carpio)，鲫鱼(Carassius auratus)和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)等。而受精卵显微注射方法在海水鱼类，特别是海水鲆鲽鱼类的转基因研究却鲜见报道。这是因为海水鲆鲽鱼类受精卵显微注射技术很难建立：首先，海水鲆鲽鱼类受精卵,卵膜紧贴胚胎，不易剥落，很难将外源基因质粒显微注射到受精卵的动物极；其次，海水鲆鲽鱼类受精卵属于浮性卵，而且动物极朝下，在海水中很难固定，因而难以进行显微注射操作；第三，海水鲆鲽鱼类受精卵在显微注射后成活率很低，基本上难以发育、生长下去；最后，海水鲆鲽鱼类仔鱼具有变态的特点，在变态前后仔鱼死亡率较高，通常需要有数千尾以上的仔鱼才能培育长大，即使采用受精卵显微注射技术获得数百个显微注射的胚胎，也很难培育长大为成鱼。因此，有关海水鲆鲽鱼类基因转移的成功研究迄今未见报道，这也成为限制海水鲆鲽鱼类转基因育种和基因功能分析研究的瓶颈因子。因此，探索海水鲆鲽鱼类外源基因转移的新方法，对于半滑舌鳎等海水鲆鲽鱼类基因工程育种和基因功能分析等至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种海水鲆鲽鱼类转基因方法，即一种不用受精卵显微注射而进行半滑舌鳎等鲆鲽鱼类基因转移的方法，从而解决目前半滑舌鳎等鲆鲽鱼类缺乏有效的转基因方法、不能进行大规模转基因研究的难题。

本发明的海水鲆鲽鱼类转基因方法，是将携带有外源基因的质粒转移到性成熟的雄鱼精巢中，然后收集转基因雄鱼的精液并和雌鱼的成熟卵进行授精，从而通过精子将外源基因转入受精卵中，这样就避免了对受精卵进行显微注射而导致胚胎大量死亡的难题。

本发明的方法，其具体步骤如下

1）转基因质粒的构建：

在真核表达载体的启动子下游插入目的基因构建成转基因质粒；

其中启动子为鱼类性腺特异表达的VASA基因启动子或全身表达的CMV病毒基因启动子；

2）转基因质粒向雄鱼精巢的转移：

通过大肠杆菌对转基因质粒进行扩增和大量制备，将纯化后的转基因质粒溶液浓度调为100μg/ml；将制备好的阳离子脂质体溶液与转基因质粒溶液进行混匀，静置10分钟；选取鲆鲽鱼类性成熟的雄鱼，按每尾雄鱼150-300μl的剂量将转基因质粒混合液转入雄鱼精巢中；

其中阳离子脂质体溶液与转基因质粒溶液的体积比为3:1；

3）转基因雄鱼精液的收集与检测：

转基因质粒转入后48h，收集雄鱼的精液，取部分精液提取精子DNA，在转基因质粒启动子区和目的基因区分别设计特异PCR引物，进行PCR扩增，确定含有转基因质粒上的特异基因片段的转基因阳性精液；同时，取部分转基因阳性精液在显微镜下观察精子活力，选取精子活力大于50%以上的用于与卵子进行人工授精；

4）转基因阳性精液与卵子的人工授精:

收集成熟雌鱼的未受精卵，向卵中添加转基因阳性精液，进行人工授精，将授精卵转入温度为18-22℃的海水中孵化，受精卵孵化进行转基因鱼的培育；

其中未受精卵和转基因阳性精液的体积比为1～3：2～10；

5）外源基因整合的检测及转基因鱼的鉴定:

在转基因质粒启动子区和目的基因区分别设计特异PCR引物，取孵化培育的转基因鱼苗鳍条，提取DNA用作PCR模板，进行PCR扩增，确定含有转基因质粒上的特异基因片的转基因阳性鱼苗，将转基因阳性个体收集起来，进行培育制作转基因品系。

本发明的方法可将外源基因有效转入鲆鲽鱼类受精卵中，外源基因在转基因鱼苗中整合的阳性率为12%-21%，为鲆鲽鱼类基因转移研究提供了一种新的方法，解决了鲆鲽鱼类受精卵难以通过显微注射进行转基因的问题，为鲆鲽鱼类基因工程育种提供了新的技术手段。

附图说明

图1：本发明使用的pVASA-Ndmrt1质粒图谱；

图2：转基因质粒pVASA-Ndmrt1在转基因雄鱼精子中检测结果的电泳图；其中，M:marker，1、水作为模板的阴性对照，2、正常雄鱼精子对照，3-12、转基因雄鱼精子DNA检测结果。

图3：外源基因pVASA-Ndmrt1在转基因精液授精后获得的雄鱼后代62天检测结果电泳图；其中1、转基因阳性鱼，2、阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

一、转基因质粒的构建：

采用鱼类性腺特异表达的VASA基因启动子或全身表达的CMV病毒基因启动子等基因启动子，在启动子下游插入半滑舌鳎性别相关基因或其它基因的序列，构建成转基因质粒。

下面以真鲷VASA基因启动子驱动的半滑舌鳎DMRT1基因转基因质粒的构建为例进行详细说明。

(1)基因元件：采用带有真鲷vasa启动子和增强的绿色荧光蛋白基因的质粒pPmvasGFP作为转基因载体构建的起始载体，该质粒启动子的构建参照Lin etal.（2011）方法进行。半滑舌鳎dmrt1基因全长cDNA（序列见邓思平，陈松林，2008中国水产科学，15（4）：577-584）采用Vd_S和nVd_A引物扩增获得:采用序列为（Vd_S:5′-TATGGATCCTATGAACAAGAACAAGCAGC-3′,nVd_A:5′-TAAAGATCTGGTACCAATTATTTGTTTGTTTCACCGT-3′）的引物从半滑舌鳎精巢中扩增半滑舌鳎dmrt1基因的cDNA编码区。按照常规分子克隆方法将半滑舌鳎dmrt1cDNA编码区序列亚克隆到pPmvasGFP载体中去；

(2)dmrt1 cDNA亚克隆片段；

(3)限制性核酸内切酶；

(4)引物：dmrt1转基因载体构建特异引物：

Vd_S:5′-TATGGATCCTATGAACAAGAACAAGCAGC-3′

nVd_A:5′-TAAAGATCTGGTACCAATTATTTGTTTGTTTCACCGT-3′

Vd_S和nVd_A用于dmrt1天然蛋白表达载体（pVASA-Ndmrt1）的构建。根据载体真鲷vasa启动子设计特异上游引物cPVASA_S，根据dmrt1cDNA序列设计特异下游引物用于鉴定pVASA-Ndmrt1转基因阳性个体：

cPVASA_S:5′-CTATGTGGAGTCTGCCTGG-3′

dmrt1-JA：5′-CATGAGACATCTGCTGGTATTGC-3′

(5)T4DNA连接酶

(6)Taq DNA聚合酶

(7)胶回收试剂盒：用于回收PCR产物和限制性内切酶酶切产物

(8)基因工程菌：大肠杆菌

(9)电泳试剂：琼脂糖，TAE缓冲液

(10)实验所需设备：离心机，超净工作台，低温水循环仪，PCR仪，生化培养箱，恒温摇床，移液器，电泳仪，凝胶成像仪，冰箱

1、方法：

（1）dmrt1基因编码区的亚克隆：

分别使用Vd_S和nVd_A引物，通过PCR方法获得dmrt1编码区片段，构建pVASA-Ndmrt1转基因载体。

dmrt1基因编码区的亚克隆

PCR反应程序:

PCR产物使用胶回收试剂盒回收纯化，用于酶切反应。

（2）酶切反应

使用BamHI对dmrt1回收片段分别进行单酶切，使用BamH I单酶切pPmvasGFP质粒。

单酶切体系：

反应温度：37℃，反应时间：4h。

分别酶切Ndmrt1片段和质粒pPmvasGFP，使用胶回收试剂盒纯化片段，然后用于连接反应。

（3）连接反应

以BamH I单酶切的线性pPmvasGFP为骨架，Ndmrt1为插入片段，分别进行连接，构建pVASA-Ndmrt1载体。

连接反应体系（10μl）：

（4）转化至大肠杆菌并鉴定

1.将连接产物与感受态细胞混匀，轻轻混匀，以免破坏细胞，然后放置于冰上40min。

2.放置于42℃水浴90sec热击，然后立即放置于冰上冷却。

3.加入1mL LB培养基，在37℃下，培养1h，转速为150rpm。

4.取100μL细胞悬液涂布于含有Amp的LB平板上。

5.放置于37℃培养箱中培养12－16h，待长出单克隆菌落后进行检测。

6.菌落PCR鉴定阳性克隆。

分别使用cPVASA_S和dmrt1-JA鉴定转基因pVASA-Ndmrt1阳性菌株。

PCR鉴定pVASA-Ndmrt1转基因阳性菌株

PCR反应程序：

利用琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物的特异性。

7.将阳性克隆进行测序最终鉴定构建好的载体。

二、转基因质粒向雄鱼精巢的转移：

通过大肠杆菌对转基因质粒进行扩增和大量制备，将纯化后的转基因质粒溶液浓度调为100μg/ml。用手电筒强光照射半滑舌鳎等鲆鲽鱼类性成熟雄鱼的腹部，找到精巢部位，按每尾雄鱼150-250μl的剂量将转基因质粒混合液（1份转基因质粒溶液：3份阳离子脂质体溶液）注入雄鱼精巢中。

下面以真鲷VASA基因启动子驱动的半滑舌鳎DMRT1基因转基因质粒pVASA-Ndmrt1的大量制备和转移为例进行详细说明。

一）、阳离子脂质体（DC-Chol/DOPE）溶液的制备

脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25～1000nm不等。根据脂质体可以和细胞膜融合的特点，脂质体可用于转基因，或制备的药物，将药物送入细胞内部。当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡。

（一）将0.016g DC-CHOL与0.042g DOPE（DC-CHOL与DOPE摩尔比为1:2）用200ml氯仿溶解。

（二）待溶解完全后，45度真空抽滤将氯仿挥发，再用16mlPBS（PH7.4）溶解DC-CHOL/DOPE至DC-CHOL浓度为1μg/mL备用。

二）、转基因质粒pVASA-Ndmrt1的大量制备

1.将转基因质粒pVASA-Ndmrt1与商业上购买的感受态细菌混合，轻轻混匀，以免破坏细胞，然后放置于冰上40min。

2．放置于42℃水浴90sec热击，然后立即放置于冰上冷却2min。

3．加入1mL LB培养基，在37℃下，培养60min，转速为150rpm。

4．取100mL菌液涂布于含有Amp的LB平板上。

5．放置于37℃培养箱中培养12h，待长出单克隆菌落后，进行PCR检测，挑起阳性克隆至5ml的LB培养基中，过夜培养。

6．将过夜培养的菌液2ml接种至200ml的LB培养基中，培养12h。

7．将培养12h后的菌液离心去上清，收集菌泥。

8．用无内毒素质粒大提试剂盒（天根），提取质粒，并将质粒浓度调整为1μg/μL。

三）、转基因质粒pVASA-Ndmrt1向雄鱼精巢的转移

1.将制备好的阳离子脂质体DC-CHOL/DOPE3份（150μl）与转基因质粒pVASA-Ndmrt1溶液1份（50μl）进行混匀，静置10分钟。

2.按照常规方法选取2-3龄的半滑舌鳎性成熟雄鱼，体重一般在150-300克。用手将雄鱼立起，腹面朝里，采用手电筒强光照射性成熟雄鱼的性腺部位，慢慢的将配置好的脂质体与转基因质粒混合液150-300μl从腹面注入雄鱼精巢中，随后将雄鱼放回水缸中。

3.观察注射转基因质粒的雄鱼，发现活力没有降低，在注射性腺的位置有个微微的突起，但随时间的推迟，突起渐渐消失。

三、转基因雄鱼精液的收集与检测

转基因质粒注射后48h，用手轻轻挤压注入过转基因质粒溶液的雄鱼的精巢部位，将挤出的精液收集于干燥的试管中，取10-20微升精液提取精子DNA，在转基因质粒启动子区和目的基因区分别设计特异PCR引物，进行PCR扩增，含有转基因质粒上的特异基因片段者为转基因阳性精液。同时，取2-4微升转基因阳性精液在显微镜下观察精子活力，选取精子活力大于50%以上者，用于下一步与卵子进行人工授精，以制备转基因鱼。

下面以真鲷VASA基因启动子驱动的半滑舌鳎DMRT1基因转基因质粒pVASA-Ndmrt1转移后雄鱼精液的收集与检测为例进行详细说明。

一）注射转基因质粒48h后，取注射转基因质粒的半滑舌鳎雄鱼，将其置于干净的湿海绵上，并用湿毛巾将头部盖住。

二）一手轻轻按住雄鱼头部，另一手由后向前的顺序向生殖孔方向用力，轻轻挤压雄鱼的生殖腺。

三）取2μl精液用50μl的海水稀释后在显微镜(尼康，日本)下观察精子活力，只有精子活力在50%以上，且无污染的才能用于本实验，再另取15μl精液置于-20℃用于DNA提取。

四）PCR检测精子中转基因质粒

1.精子DNA提取

（1）在15μl的精液中，加入500μl的裂解液（10mmol/L Tris-CL,PH8.0;100mmol/L EDTA,PH8.0;100mmol/L NaCL;0.5%SDS）,15μl的蛋白酶K（10mg/mL），充分混匀，轻轻摇匀，55℃消化1h，每半小时摇动一次，消化至澄清。

（2）在裂解好的样品中加入500μl的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液，晃动10min后12000rpm离心10min，取上清液300μl。

（3）重复反应②一次。

（4）在上清液中加入600μl预冷的无水乙醇沉淀DNA，用70%无水乙醇洗涤两次。待酒精挥发完全后，用50μl的灭菌超纯水溶解。

2.PCR检测精子中转基因质粒

PCR引物序列分别为上游引物cPVASA-s:5′-ctatgtggagtctgcctgg-3′；下游引物dmrt1-JA：5′-CATGAGACATCTGCTGGTATTGC-3′。

反应体系及条件如下：

反应条件

3、PCR产物的电泳

将PCR产物10μl点样在1%的琼脂糖上电泳15min，然后在紫外灯下观察电泳条带。如果能观察到1068bp的目的带，表明为pVASA-Ndmrt1转基因阳性精子。

对15组pVASA-Ndmrt1转基因雄鱼精子进行检测，其中10尾能挤出精液，6尾能在精子DNA中检测到目的条带（图2）。计算得到的转基因效率为60%(表1)。

表1：转基因雄鱼精子中转基因阳性率统计

四、转基因阳性精液与卵子的人工授精

用湿毛巾将性成熟的雌鱼头部盖住，一只手按住雌鱼头部，另一只手按照由后向前的顺序向生殖孔方向用力，轻轻挤压鱼的生殖腺部位，将卵挤出，向50-150毫升卵中添加100-500μl转基因阳性精液，进行人工授精，将授精卵转入温度为18-23℃的海水中孵化，按常规方法进行苗种培育。

下面以半滑舌鳎转基因阳性精液与卵子的人工受精为例进行详细说明。

1.取材时先取卵，再取精液。取卵时，双手托住雌性亲鱼置于干净湿海绵上，并用另外的湿毛巾将鱼头部盖住。用吸水纸或医用脱脂棉将其生殖孔及周围区域轻轻擦净。

2.一人用手轻轻按住雌鱼头部，另一人双手按照由后向前的顺序向生殖孔方向用力，轻轻挤压鱼的生殖腺部位，将卵挤出，挤出液体后先弃去粪便等污物，待流出的卵在灯光照射下呈明亮的油状时，将卵盛在事先准备好的干净白瓷盆内，收集卵量为50-150ml.

3.稍后用同样的方法处理雄鱼。精液挤出后，也应先弃去粪便等污物，待流出精液呈较纯的乳白色后，用经过消毒的干燥玻璃吸管将精液吸入干净的烧杯内，每尾雄鱼至少收集100μl以上精液。精、卵都准备好后，采用人工干法授精，授精后将受精卵置于23℃过滤海水中孵化。

4.对6个注射pVASA-Ndmrt1转基因质粒的雄鱼精液授精获得的受精卵和出苗数进行了统计分析，结果如表2。6个转基因家系鱼苗的孵化率为75-80%，达到了实用化水平。

表2：6个注射pVASA-Ndmrt1转基因质粒雄鱼精液获得的授精卵和出苗数结果统计

五、外源基因整合的检测及转基因鱼的鉴定

在转基因质粒启动子区和目的基因区分别设计特异PCR引物，取转基因雄鱼精液产生的鱼苗鳍条少许，提取DNA用作PCR模板，进行PCR扩增，如能扩增出转基因质粒上的特异基因片段者为转基因阳性鱼苗，将转基因阳性个体收集起来，进行培育制作转基因品系。

下面以pVASA-Ndmrt1转基因质粒在半滑舌鳎转基因鱼苗中的整合检测为例进行详细说明。

1.取少许转基因雄鱼精液授精后获得的鱼苗鳍条，提取基因组DNA，DNA提取方法同上。

2.PCR检测方法同转基因精子检测方法。

3.将PCR产物10μl点样在1%的琼脂糖上电泳15min，然后在紫外灯下观察电泳条带。如果能观察到1068bp的目的带，表明为转基因阳性个体。

4.对注射pVASA-Ndmrt1转基因质粒的雄鱼后代取其中一个家系进行不同时期转基因检测，结果显示在25天鱼苗的24尾中能检测到3尾具有外源基因整合；在40天鱼苗的60尾中能检测到10尾鱼苗含有转基因质粒；在62天鱼苗的60尾中能检测到13尾鱼苗含有转基因质粒（表3和图3）。

表3.转基因鱼阳性率检测

上述结果表明本发明的方法可以高效的将外源基因转入到鱼苗中，具有很好的推广应用价值。

Claims (3)

1.一种海水鲆鲽鱼类转基因方法，包括有如下的步骤：

1)转基因质粒的构建：

在真核表达载体的启动子下游插入目的基因构建成转基因质粒；

2)转基因质粒向雄鱼精巢的转移：

通过大肠杆菌对转基因质粒进行扩增和大量制备，将纯化后的转基因质粒溶液浓度调为100μg/ml；将制备好的阳离子脂质体溶液与转基因质粒溶液进行混匀，静置10分钟；选取鲆鲽鱼类性成熟的雄鱼，按每尾雄鱼150-300μl的剂量将转基因质粒混合液转入雄鱼精巢中；且阳离子脂质体溶液与转基因质粒溶液的体积比为3:1；

3)转基因雄鱼精液的收集与检测：

转基因质粒转入后48h，收集雄鱼的精液，取部分精液提取精子DNA，在转基因质粒启动子区和目的基因区分别设计特异PCR引物，进行PCR扩增，确定含有转基因质粒上的特异基因片段的转基因阳性精液；同时，取部分转基因阳性精液在显微镜下观察精子活力，选取精子活力大于50％以上的用于与卵子进行人工授精；

4)转基因阳性精液与卵子的人工授精

收集成熟雌鱼的未受精卵，向卵中添加转基因阳性精液，进行人工授精，将授精卵转入温度为18-22℃的海水中孵化，受精卵孵化进行转基因鱼的培育；

5)外源基因整合的检测及转基因鱼的鉴定

在转基因质粒启动子区和目的基因区分别设计特异PCR引物，取孵化培育的转基因鱼苗鳍条，提取DNA用作PCR模板，进行PCR扩增，确定含有转基因质粒上的特异基因片段的转基因阳性鱼苗，将转基因阳性个体收集起来，进行培育制作转基因品系。

2.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于所述的步骤1)转基因质粒的构建中的启动子为VASA基因启动子或CMV病毒基因启动子。

3.如权利要求1所述的转基因方法，其特征在于所述的步骤4)转基因阳性精液与卵子的人工授精中未受精卵和转基因阳性精液的体积比为1～3：2～10。