CN111304256B - 一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法，属于转基因鱼研究与生产技术领域，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。采用本发明提供的溶液能够延长鱼卵受精孔的开放时间，以方便外源基因直接进入鱼卵。
Description
技术领域
本发明属于转基因鱼研究与生产技术领域，尤其涉及一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法。
背景技术
现在常见的导入技术有：显微注射法、精子携带法和点穿孔法等。其中显微注射法是目前最常用和比较有效的基因导入方法。显微注射法是最先采用的转基因方法，被广泛应用并取得了较好的结果。其方法为在显微镜下，用直径几微米的玻璃细针插入受精卵中，注入一定量的外源基因，注射后的受精卵于室温下在生理盐水中发育成鱼苗。
显微注射的缺点是：鱼卵外壳的完整受到破坏，显微注射后的卵死亡率较高；显微注射对注射时间要求比较严格，必须在受精后二至十六细胞期间注射，否则容易产生嵌合体；显微注射效率不高，一次能操作的鱼卵数量较少；对注射人来说技术难度较高。
精子携带法的缺点：精子和外源DNA结合效率不高，而且不稳定，会造成不同批次的转基因鱼阳性比例不稳定。外源DNA通过精子导入到受精卵后被降解的几率比较高，不太容易整合到基因组中。
鱼卵的外壳有受精孔，是精子进入鱼卵的通道，其大小与精子相当，一般是导入外源DNA直径的几十到几百倍大小的，所以外源DNA很容易通过受精孔进入未受精的卵。但是受精孔在鱼卵进入自然环境后，鱼卵壳很快会吸水膨胀，受精孔消失。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法，采用本发明提供的溶液能够延长鱼卵受精孔开放的时间，有助于外源基因导入鱼卵中。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。
优选的，所述水为蒸馏水。
本发明还提供了一种利用受精孔导入外源基因的方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的溶液与阳离子脂质体Lipofecter、外源基因混合，得到混合溶液；
2)将所述步骤1)得到的混合溶液与鱼卵混合后振荡10～30min。
优选的，所述步骤1)溶液与阳离子脂质体Lipofecter的体积比为1:0.1。
优选的，所述步骤2)混合溶液的体积与鱼卵的个数比为4ml:1000个。
优选的，所述步骤2)振荡的时间为20min。
优选的，所述步骤2)振荡的速度为60转/min。
优选的，所述鱼卵为罗非鱼或鲤鱼的鱼卵。
本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。采用本发明提供的溶液能够延长鱼卵受精孔的开放时间，以方便外源基因直接进入鱼卵。在本发明中，所述溶液和鱼类体液成份接近，盐浓度相当，在本溶液中鱼卵可以不吸水而保持原样，让受精孔一直开放。
本发明和现有技术相比有如下优点：
1、和显微注射相比对鱼卵伤害很小；
2、和显微注射相比对实施人员技术要求较低；
3、和显微注射相比一次性可以处理大量的鱼卵；
4、和显微注射相比对进入的外源DNA不容易被降解；
5、和精子携带法相比导入效果稳定性高，后代阳性比例高。
附图说明
图1为第一次PCR扩增图谱；
图2为第二次PCR扩增图谱；
图3为DANA返座元PCR扩增图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液，所述溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g。在本发明中，所述水优选为蒸馏水。
本发明还提供了一种利用受精孔导入外源基因的方法，包括以下步骤：
1)将上述技术方案所述的溶液与阳离子脂质体、外源基因混合，得到混合溶液；
2)将所述步骤1)得到的混合溶液与鱼卵混合后振荡10～30min。
在本发明中，所述溶液与阳离子脂质体Lipofecter的体积比优选为1:0.1。在本发明中，所述阳离子脂质体的作用是和外源DNA序列在盐溶液中形成聚合体更容易进入鱼卵。
本发明对所述外源基因的序列没有特殊限定，任意基因序列皆可，本发明对所述外源基因的用量没有特殊限定。
在本发明中，所述阳离子脂质体优选为Lipofecter，本发明对所述Lipofecter的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。
在本发明中，所述混合溶液的体积与鱼卵的个数比优选为4ml:1000个。在本发明中，所述鱼卵优选为罗非鱼或鲤鱼的鱼卵，所述鱼卵通过性成熟待产的母鱼通过人工催熟，人工挤出，所述鱼卵不能接触到水分。在本发明中，所述振荡的时间优选为20min，所述振荡的速度优选为60转/min。
本发明将得到的混合溶液与鱼卵混合后振荡10～30min，再与精子混匀、震荡3～5min后加入清水激活精子，再震荡3～5min完成受精过程，得到受精卵。在本发明中，所述受精卵在自然状态下孵化。鱼卵在母鱼体内成熟后受精孔就打开，进入低盐溶液会很快关闭，精子也就无法进入，本发明提供的溶液处理后的鱼卵仍然可以受精，说明受精孔一直没有关闭，清水一激活精子完成受精，受精孔就关闭了。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以罗非鱼为实验对象，导入的基因是人工设计的一个多聚赖氨酸基因，如SEQ IDNo.1所示，具体序列如下：
ATGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGcaccaccaccaccaccacTGATGATAAGAGTGA。人工合成这段序列后，克隆到pcDNA3.1表达载体中。
根据pcDNA3.1表达载体的序列，设计了两对引物。第一步反应利用引物(SEQ IDNo.2：gcttagggttaggcgttttgcgc；SEQ ID No:3：gcgcaaaacgcctaaccctaagc，扩增产物包含CMV启动子到加尾序列的下游)进行扩增。反应体系为50μl，包含2×Mastermix 25μl、引物5μl、超纯水18μl，突变体基因组DNA2μl。扩增程序为：95℃预变性2min，33个循环(95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸2min)；72℃延长5min。
选择性成熟的罗非鱼雌雄鱼各四条，在29℃的水箱中培养。通过观察发现发情的母鱼，人工挤出成熟的鱼卵，鱼卵不沾水。取浸泡溶液4ml(浸泡溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g)，加入阳离子脂质体Lipofecter 400μl，再加入需要上述PCR产物80μl，混匀。然后和1000个鱼卵混合，60转/分钟缓慢震荡20min。再加入精子，混匀，加入清水激活精子，完成受精过程。
受精卵在自然状态下孵化。
取刚刚孵化出来的小鱼5条，加入500μl STE和5μl蛋白酶K，55℃孵育4h。待裂解完全后，加入500μl的酚：氯仿(1:1)，涡旋震荡12,000g，离心10min；取上清液；加入2.5倍的无水乙醇，混匀后12,000g离心10min；弃上清，加入1ml 75％乙醇，混匀；12,000g离心10min；弃上清，通风橱晾干。加入50μl超纯水，37℃溶解。
第一步反应利用引物(SEQ ID No.4：gcttagggttaggcgttttgcgc；SEQ ID No:5：agcatgcctgctattgtctt)进行扩增。反应体系为50μl，包含2×Mastermix25μl、引物5μl、超纯水18μl、突变体基因组DNA 2μl。扩增程序为：95℃预变性2min，33个循环(95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸2min)；72℃延长5min。第二步反应利用引物(SEQ ID No:6：ttttggcagtacatcaatgg；SEQ ID No:7：cagacaatgcgatgcaatttc；扩增产物包含目的基因片段)(5μM)进行扩增。反应体系为50μl，包含2×Mastermix 25μl(诺唯赞公司)、引物5μl、超纯水18μl、第一步PCR产物2μl。扩增程序为：95℃预变性2min，33个循环(95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸2min)；72℃延长5min。结果如图1和2。
图1箭头所指的条带为目的条带，由于导入序列进入鱼卵的数量在不同个体中有差异，而且插入位点也有所不同，所以不同样品扩增的效率不完全一样。图2是利用第一次扩增产物作为模板的扩增图谱，其中最亮的条带就是包含目的片断的扩增产物，可以见到几乎所有样品都含有目的条带。
实施例2
以鲤鱼作为实验对象，导入的基因是斑马鱼一个小型反坐元DANA，如SEQ ID No.8所示，具体的核苷酸序列如下所示:
ggcgacacagtggcgcagtaggtagcacgattgcctcacagcaagaagatcgctggttcgagtctcggctgggtcagttggcatttctgtgtggagtttgcatgttctcgccgtgttcgcatgggtttcctccgggtgctctggtttcccccacagtccaaagacatgcggtacaagtgaattgggtaggctaaattgttcgtagtgtatgtgtgtgaatgggagtgtattggcatttcccattgatgggttgcagctggaagggcatccgctgcgtaaaagatatgctggaaaagttggtggttcattgggctgtggcgaccccagaataataaagggactaagccaaaaagaaaaaa。
将目的基因构建至pEB-GFP(T2A)PURO慢病毒表达载体上。用E coli XL1-BLUEMRF’感受态细胞转化，挑选阳性克隆，摇菌，抽提质粒，用限制性内切酶SphI线性化。
选择性成熟的鲤鱼雌雄鱼各一条，注射鱼用绒毛膜促性腺激素40mg/kg，在室温的水箱中培养。第二天早晨人工挤出成熟的鱼卵。取浸泡溶液4毫升(浸泡溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g)加入阳离子脂质体Lipofecter400μl，再加入需要上述线性化质粒4μg，混匀。然后和1000个鱼卵混合，60转/分钟缓慢震荡20min。再加入精子，混匀，轻轻震荡几分钟，加入清水激活精子，完成受精过程。受精卵在自然状态下孵化。
取刚刚孵化出来的小鱼8条，加入500μl STE和5μl蛋白酶K，55℃孵育4h。待裂解完全后，加入500μl的酚：氯仿(1:1)，涡旋震荡12,000g，离心10min；取上清液；加入2.5倍的无水乙醇，混匀后12,000g离心10min；弃上清，加入1ml 75％乙醇，混匀；12,000g离心10min；弃上清，通风橱晾干。加入50μl超纯水，37℃溶解。
扩增反应利用引物(SEQ ID No.9：ttttttctttttggcttagtc；SEQ ID No:10：ggcgacacagtggcgcagta)进行扩增。反应体系为50μl，包含2×Mastermix 25μl、引物5μl、超纯水18μl、突变体基因组DNA2μl。扩增程序为：95℃预变性2min，33个循环(95℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸2min)；72℃延长5min。结果见图3。
从图3中可以看出，DANA返座元扩增图谱，DANA返座元长359bp，8个样中三个有明显扩增条带，三个有不明显扩增条带，两个没有扩增条，表明8个样中3个确定有目标条带，即基本断定目标序列已经进入样品基因组中；两个为阴性，样品没有目标序列；三个有不明显扩增条带，表明目标序列进入样品后被不同程度降解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 一种延长鱼卵受精孔开放时间的溶液和利用受精孔导入外源基因的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag 60
aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag caccaccacc accaccactg atgataagag 120
tga 123
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttagggtt aggcgttttg cgc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcaaaacg cctaacccta agc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttagggtt aggcgttttg cgc 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcatgcctg ctattgtctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttttggcagt acatcaatgg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagacaatgc gatgcaattt c 21
<210> 8
<211> 359
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcgacacag tggcgcagta ggtagcacga ttgcctcaca gcaagaagat cgctggttcg 60
agtctcggct gggtcagttg gcatttctgt gtggagtttg catgttctcg ccgtgttcgc 120
atgggtttcc tccgggtgct ctggtttccc ccacagtcca aagacatgcg gtacaagtga 180
attgggtagg ctaaattgtt cgtagtgtat gtgtgtgaat gggagtgtat tggcatttcc 240
cattgatggg ttgcagctgg aagggcatcc gctgcgtaaa agatatgctg gaaaagttgg 300
tggttcattg ggctgtggcg accccagaat aataaaggga ctaagccaaa aagaaaaaa 359
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttttttcttt ttggcttagt c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcgacacag tggcgcagta 20
Claims (6)
1.一种利用受精孔导入外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将延长鱼卵受精孔开放时间的溶液与阳离子脂质体Lipofecter、外源基因混合，得到混合溶液；
2)将所述步骤1)得到的混合溶液鱼卵混合后振荡10～30min；
步骤1)所述延长鱼卵受精孔开放时间的溶液以水为溶剂，每升包括氯化钠6g、氯化钾0.15g、氯化钙0.1g、碳酸氢钠0.1g、磷酸二氢钠0.1g和葡萄糖1g；
所述鱼卵包括罗非鱼鱼卵和/或鲤鱼鱼卵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)延长鱼卵受精孔开放时间的溶液与阳离子脂质体Lipofecter的体积比为1:0.1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)混合溶液的体积与鱼卵的个数比为4ml:1000个。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)振荡的时间为20min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)振荡的速度为60转/min。
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