CN109652424B - 一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用，本发明发现了能够促进植物体细胞胚发生的功能基因RID3(AT3G49180)和YUC10(AT1G48910)。通过异位表达上述功能基因，不经过愈伤组织，能够直接在拟南芥子叶上诱导形成体细胞胚。本发明的诱导体细胞胚直接发生的方法，具有培养简易、诱导周期短、诱导频率高等优势，可用于植物细胞的分化、发育、全能性表达和作物品种改良、人工种子的生产、优质种质资源的保存、突变体筛选等方面的研究。

Description

一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用。

背景技术

被子植物从双受精形成合子开始到胚胎发育成熟变成种子，这个发育过程先后经历了合子激活，细胞的分裂分化、极性的建立、模式的形成和器官的形成等，并且胚胎的发育是受到精确的遗传调控的。受精前的卵细胞在代谢上相对静止，只有在与精细胞融合之后，才能被激活从而启动胚胎发育的过程(蒋丽等，2007)。体细胞胚的起始却与此不同，植物体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)是指植物体细胞在未经性细胞融合的情况下，模拟有性的合子胚胎发生而发育形成一个新个体的形态发生过程，它不需要经过双受精的过程，可以由体细胞直接发育而来，但这个过程可能需要特定的培养条件、激素环境、或者是分子调控等因子作为起始信号。除胡萝卜体细胞胚的诱导外，很多植物的小孢子可以去分化并经胚胎发生途径形成单倍体植株，这一过程称为花粉胚胎发生。当小孢子受到饥饿或高温等外界环境胁迫时，配子体发育就会停滞，新的发育模式形成，此时将小孢子转移到正常环境，它会持续分裂，最终形成体细胞胚(Touraev and Heberle-Bors,1999)。20世纪90年代起，拟南芥体细胞胚胎发生体系已经开始建立并随后逐步完善。拟南芥叶片原生质体能够诱导体细胞胚的产生，但是在球形胚早期体细胞胚的发育终止(Luo and Koop,1997；O’Neill and Mathias,1993)。Sangwan(1992)和Wu(1992)等报道了以未成熟合子胚作为外植体首先诱导胚性愈伤组织的产生，进而诱导体细胞胚胎发生(Sangwan et al.,1992；Wu et al.,1992)。在这个系统中，从合子胚诱导获得的体细胞胚可以发育成为完整植株，而合子胚外植体的发育时期对于诱导愈伤组织的形成和体细胞胚胎发生至关重要(Wu et al.,1992)。2002年，Ikeda-Iwai等人又修改了上述培养体系(Ikeda-Iwai et al.,2002)。在新体系中，合子胚外植体首先诱导产生初级体细胞胚，然后在液体培养基中悬浮培养产生胚性细胞团，进而诱导产生次级体细胞胚。这种液体培养系统不仅提高了胚性细胞的增殖速率，还增加了次级体细胞胚的数量。

一般而言，体细胞胚的产生需要激素的诱导，通常利用生长素或细胞分裂素来诱导。依此而论，体细胞胚的发生需要经过两个过程：首先，是在生长素的作用下获得形成体细胞胚的能力；其次，是去除生长素后体细胞胚的形成。当然，还存在另一条诱导体细胞胚的途径，就是通过异位表达特定的拟南芥基因来诱导体细胞胚的发生。在拟南芥中，LEAFYCOTYLEDON(LEC)基因家族的LEC1、LEC2、FUSCA 3(FUS3)在胚胎的发生过程中具有重要的作用，它们突变体的表型均为子叶具有真叶的特征。LEC1特异的在胚胎中表达，过表达LEC1致使幼苗仍保持胚胎特性，如：子叶无法张开，根也无法伸长，在茎端分生组织处形成类似胚胎的结构等(Lotan et al.,1998)。LEC2和FUS3是VIVIPAROUS1/ABSCISIC ACIDINSENSITIVE 3-LIKE B3(VP1/ABI3-like B3)家族的转录因子(Luerssen et al.,1998；Stone et al.,2001)，通过蛋白序列比对可知，LEC2和FUS3具有43％的同源性。异位表达LEC2基因可以促进体细胞胚的发生，致使体细胞向胚性细胞发生转变(Stone et al.,2001)。植物通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是极其普遍的现象。

早在60年前，体细胞胚胎发生技术在胡萝卜上就取得了重大进展，使其达到商业化水平。体细胞胚发生技术是一种无性繁殖技术，能使少量的优质种子得以扩繁。现在，人们正致力于运用此项技术大规模繁殖珍稀植物物种，体细胞胚发生不再仅仅被看作是研究植物全能性和形态发生基本过程的实验室技术，而被看作是用于植物优良基因型大规模繁殖的一种方法。体细胞胚发生途径也是林木树种转基因的一个有效的再生体系，未来体细胞胚发生技术有可能使许多林木和园艺植物的优良基因型达到商业化繁殖水平。另外，体细胞胚发生途径还是木本植物基因工程的一种重要转化体系。体细胞胚的诱导和发生也是制备人工种子的基础。体细胞胚的干化及用海藻酸钠等材料包裹体细胞胚制成人工种子，为选择基因型的廉价无性繁殖及无病毒无性系的贮存和生产提供了可能。还可以利用体细胞胚的特点，采用超低温保存及干化处理方法保存优质种质资源。总而言之，这一发育途径为研究植物细胞的分化、发育、全能性表达和作物品种改良、人工种子的生产、优质种质资源的保存、突变体筛选等提供了良好的实验体系，在理论上和应用中都具重大意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，发现了能够促进植物体细胞胚发生的功能基因RID3(AT3G49180)和YUC10(AT1G48910)。通过异位表达上述功能基因，不经过愈伤组织，能够直接在拟南芥子叶上诱导形成体细胞胚。本发明的诱导体细胞胚直接发生的方法，具有培养简易、诱导周期短、诱导频率高等优势，可用于植物细胞的分化、发育、全能性表达和作物品种改良、人工种子的生产、优质种质资源的保存、突变体筛选等方面的研究。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供促进植物体细胞胚发生的功能基因，是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因；

4)由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

本发明的第二方面，提供携带上述功能基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

携带上述功能基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在促进植物体细胞胚发生中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供如下a)-f)中任一项所述的DNA片段在促进植物体细胞胚发生中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价；

d)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

e)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

f)DNA片段，与d)或e)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.4所示的蛋白等价。

上述应用中，通过上调a)-f)中任一项所述的DNA片段的表达，以促进植物体细胞胚的直接发生。

本发明的第四方面，提供如下1)-6)中任一项所述的蛋白在促进植物体细胞胚发生中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

4)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

5)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

6)在SEQ ID NO.4所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

上述应用中，通过上调1)-6)中任一项所述的蛋白的表达量和/或活性，以促进植物体细胞胚的直接发生。

本发明的第五方面，提供一种诱导体细胞胚直接发生的方法，包括以下步骤：

将上述a)-f)中任一项所述的DNA片段导入到出发植株中，筛选出转基因阳性植株后进行体细胞胚的诱导培养，直接生成体细胞胚。

作为优选，所述诱导培养的方法为：将转基因阳性植株的种子置于含有雌二醇的1/2MS培养基上，春化处理打破休眠，春化结束后进行光照培养；种子萌发后4-6天，将幼苗移至新的含有雌二醇的1/2MS培养基上，继续培养至在幼苗的子叶上生成体细胞胚。

更优选的，所述1/2MS培养基中含有雌二醇的浓度为10μmol/mL。

更优选的，所述春化处理的条件为：4℃春化处理3天。

本发明的第六方面，提供一种人工种子的生产方法，将上述a)-f)中任一项所述的DNA片段导入到植物细胞、组织、器官或植株中，获得体细胞胚，利用获得的体细胞胚生产人工种子。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种在拟南芥子叶上不经过愈伤组织直接诱导产生体细胞胚的培养体系：分别异位表达RID3和YUC10，无需添加外源的植物激素，只需要在基本的培养基上培养，就能够在转基因植株的子叶上诱导形成体细胞胚。该体系具有操作简单，培养程序简易，培养周期短，发生频率高的优势，由于体细胞胚发生体系较为稳定，可以在分子水平上研究其胚胎发生的机制。且对于与生产结合进行规模化种苗生产也具有指导意义。

附图说明

图1为植物表达载体pER8::RID3载体结构图。

图2为诱导培养pER8::RID3转基因植株，体细胞胚起始发育示意图，pSERK1::GFP在体胚中的表达模式及pRID3::GUS在合子胚中表达模式。

图A第一张图为诱导培养的pER8::RID3转基因幼苗，红色虚线所圈为子叶叶尖凹陷的致密细胞；第二张图为诱导培养10天左右的幼苗，红色区域所示为多细胞球形体细胞胚；第三张图为诱导培养14天的幼苗，红色区域所示为成熟的体细胞胚。

图B为pSERK1::GFP在体胚中的表达模式。

图C为pRID3::GUS在合子胚中表达模式。

图3为扫描电镜观察pER8::RID3转基因植株体细胞胚的单细胞起始及发育过程。

图4植物表达载体pER8::YUC10载体结构图。

图5为诱导培养pER8::YUC10转基因植株，体细胞胚起始发育示意图，pSERK1::GFP在体胚中的表达模式及pYUC10::GFP在合子胚中表达模式。

图A第一张图为诱导培养的pER8::YUC10转基因幼苗；第二张图为诱导培养10天左右的幼苗，红色区域所示为多细胞球形体细胞胚；第三张图为诱导培养14天的幼苗，红色区域所示为成熟的体细胞胚。

图B为pSERK1::GFP在体胚中的表达模式。

图C为pYUC10::GFP在合子胚中表达模式。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，体细胞胚的发生技术具有广泛的应用。植物体细胞胚的发生是一个复杂而有序的过程，很多基因特异的在体细胞胚中表达，发现调控体细胞胚发生的关键基因并进行遗传操作，是促进体细胞胚发生的一条行之有效的途径。但技术的难点在于如何从众多的基因中找到与体细胞胚发生相关的关键基因。

本发明人通过大量的工作，发现了能促进植物体细胞胚发生的功能基因RID3(AT3G49180)和YUC10(AT1G48910)，其中，基因RID3编码WD40重复类亚家族蛋白，其核酸序列如SED ID NO.1所示，该基因编码区全长为1317bp，氨基酸序列如SED ID NO.2所示，编码438个氨基酸。基因YUC10编码一个生长素合成关键酶，其核酸序列如SED ID NO.3所示，该基因全长为2124bp，氨基酸序列如SED ID NO.4所示，编码383个氨基酸。本发明研究发现，RID3和YUC10两个基因分别过量表达可以较高效率的诱导体细胞胚的直接发生。

基于发现的上述RID3和YUC10两个功能基因，本发明的保护内容还包括与上述两个功能基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白功能等价。本文所指的“与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.2或SEQID NO.4所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白典型的生物学功能是促进植物体细胞胚的发生。通过上调SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白的表达量和/或活性，可以高效率的诱导体细胞胚的直接发生。

这些与RID3和YUC10两个功能基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的RID3和YUC10两个功能基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明RID3和YUC10两个功能基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlinand Altschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述RID3和YUC10两个功能基因是从拟南芥幼苗cDNA中扩增获得，其具体步骤如下：

1.拟南芥幼苗RNA的提取和纯化。

2.cDNA第一链的合成。

3.RID3基因的克隆：

以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGGTCGACATGGAGATTACTGTAATCGCTTC-3'，如SEQ ID NO.5所示；

下游引物:5'-GCACTAGTTCAATTGGTACCACCGATTTGTTC-3'，如SEQ ID NO.6所示。

其中划横线部分依次为SalⅠ，SpeⅠ酶切位点。

4.YUC10基因的克隆：

以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGACTAGTCAAGAAATGGAGACCGTAGTGGTGA-3'，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物:5'-GCTCTAGATCTTGCAGGTTAATGAATACAGCTTCAA-3'，如SEQ ID NO.8所示。

其中划横线部分依次为SpeⅠ，XbaⅠ酶切位点。

PCR扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μL)，2μl下游引物(5μmol/μL)，5μl 10×PCRbuffer，2μl dNTP混合液(2.5mM)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U)，2μl cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μl PCR产物与pEASY-Blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养，进行序列测定。选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒DNA。

获得上述的目标基因后，将目的片段转入由雌二醇(17-β-estradiol)诱导的诱导型表达载体pER8中，获得诱导型的pER8::RID3(载体图谱见图1)，pER8::YUC10(载体图谱见图4)，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。

为了后期验证胚状体结构的遗传学属性及RID3和YUC10基因的功能，需要分析合子激活基因SERK1在体细胞胚中的表达，以及RID3和YUC10基因各自在合子胚中的表达。发明人又分别构建了以SERK1和YUC10启动子连接GFP报告基因的pSERK1::GFP，pYUC10::GFP，RID3启动子连接GUS报告基因的pRID3::GUS表达载体。SERK1启动子序列如SED ID NO.9所示，该序列全长为5130bp。RID3启动子序列如SED ID NO.10所示，该序列全长为2634bp。YUC10启动子序列如SED ID NO.11所示，该序列全长为2667bp。

该类启动子序列从拟南芥幼苗基因组DNA中扩增获得，其具体步骤如下：

1拟南芥幼苗DNA的提取和纯化。

2SERK1基因启动子的克隆：

以DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGAAGCTTGCTTCCAAAGGATCTATGTGGCG-3'，如SEQ ID NO.12所示；

下游引物:5'-GCGGATCCCCACATAACTCGACTCCATTTC-3'，如SEQ ID NO.13所示。

其中划横线部分依次为Hind III，BamH I酶切位点。

3RID3基因启动子的克隆：

以DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGATCGATCTCCTTCTCCGCCTCATCATTC-3'，如SEQ ID NO.14所示；

下游引物:5'-GCTCTAGAATAGCTCAGAGAAAGAGGGAAGTAAA-3'，如SEQ ID NO.15所示。

其中划横线部分依次为Cla I，Xba I酶切位点。

4YUC10基因启动子的克隆：

以DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGAAGCTTCCGCCACTGAGTTGTGCTTG-3'如SEQ ID NO.16所示；

下游引物:5'-GCCTCGAGCACTACGGTCTCCATTTCTTGTGTTTAG-3'如SEQ ID NO.17所示。

其中划横线部分依次为Hind III，Xho I酶切位点。

PCR扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μL)，2μl下游引物(5μmol/μL)，5μl 10×PCRbuffer，2μl dNTP混合液(2.5mM)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U)，2μl cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μl PCR产物与pEASY-Blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养，进行序列测定。选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒DNA。

获得上述的目标基因后，分别将SERK1，YUC10的启动子片段转入表达载体pROKII-GFP中，获得pSERK1::GFP，pYUC10::GFP表达载体，将RID3的启动子片段转入表达载体pBI121-GUS中，获得pRID3::GUS表达载体，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。最后利用农杆菌介导转化Col生态型拟南芥花序，并最终筛选获得了具有抗性的植株。另外将分别含有pER8::RID3和pER8::YUC10侵染pSERK1::GFP的转基因阳性植株，最后获取具有抗性的植株。将分别含有pER8::RID3和pER8::YUC10的转基因的种子置于含有10μmol/mL雌二醇的1/2MS萌发培养基上，4℃春化处理3天打破休眠；春化结束后将拟南芥种子进行光照培养(22℃，16小时光照和8小时黑暗)；种子萌发后5天左右可以观察到子叶叶尖呈凹陷状，细胞致密且颜色较周围细胞浅；将幼苗移至新的含有10μmol/mL雌二醇的1/2MS培养基上继续培养，培养至14天左右，可以观察到在幼苗的子叶上长出了类似于胚状体的结构(图2，图5)。为了证明该结构为体细胞胚，将含有pER8::RID3和pER8::YUC10的pSERK1::GFP的转基因阳性植株的种子置于含有10μmol/mL雌二醇的1/2MS萌发培养基上，4℃春化处理3天打破休眠；春化结束后将拟南芥种子进行光照培养(22℃，16小时光照和8小时黑暗)；种子萌发后48小时左右可以观察SERK1的表达模式，之后依次按培养时间顺序(72小时，96小时及120小时)进行观察。研究证明该结构为体细胞胚，并且为单细胞起始(图2，图5)。同时利用扫描电镜技术细致观察了pER8::RID3培养材料上体细胞胚的起始与发育过程，也证实了体细胞胚的单细胞起始，具有完整的子叶，胚轴(图3)。RID3基因诱导体细胞胚发生的频率为48％(图2)，YUC10基因诱导体细胞胚发生的频率为27％(图5)。另外，发明人观察了pRID3::GUS及pYUC10::GFP在合子胚中的表达，结果显示，RID和YUC10能够特异的在合子胚中表达(图3，图5)，表明RID3和YUC10基因能够调控合子胚的发育。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1:RID3和YUC10基因克隆及植物表达载体构建

1.1拟南芥组织总RNA的提取

利用Trizol试剂盒提取植物材料的总RNA，操作步骤如下：

(1)在离心管中加入1mL的Trizol试剂；

(2)去除细胞壁残渣、蛋白、多糖、及脂肪：将约0.1g的植物材料于液氮中研磨，将粉末转至离心管中，振荡器混匀，室温下静置5min，随后12000rpm，4℃，离心10min；

(3)分相：将上清转入新的离心管中，加入200μL的氯仿，剧烈摇晃15s，随后室温静置2-3min，12000rpm，4℃，离心15min；

(4)沉淀、去多糖：将无色水相(约600μL)转入新的离心管中(切不要吸到中间层)，加入250μL异丙醇和250μL高盐溶液，上下颠倒混匀，15-30℃静置10min，12000rpm，4℃，离心10min；

高盐溶液的配方：0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L氯化钠等体积混合溶解，DEPC水处理后高温灭菌；

(5)清洗：用200μL的枪将多余上清吸除，随后加入1mL冰预冷的75％乙醇，震荡混匀，7500rpm，4℃，离心5min；

(6)用真空泵干燥，吸除乙醇，37℃，10min，不要干燥彻底，否则溶解困难；

(7)加适量的RNAase-free的水(一般20μL)，枪打溶解，也可置于55-60℃溶解10min，然后迅速冰浴5min，稍离心，-80℃保存即可。

为确保RNA质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的RNA样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：RNA纯度为OD260/280和OD260/230均在1.8-2.0范围内，RNA浓度在1.0-2.0μg/μl范围内。

1.2反转录cDNA第一链的合成

在0.2ml DEPC处理的离心管中顺序加入1μl 50μM Oligo dT Primer和15.5μl总RNA，70℃变性6分钟，迅速冰浴10分钟。在上述离心管中顺序加入2μl dNTP Mixture(10mM)，5μl 5×PrimerScript Buffer，0.5μl RNase Inhibitor(40U)，1μl PrimerScriptRTase(200U)，加DEPC-H₂O至25μl。在PCR仪上运行程序为25℃，10分钟；42℃，90分钟；95℃，5分钟。程序结束后，样品于-80℃冻存待用。

1.3RID3和YUC10基因的克隆

RID3基因的克隆：

以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGGTCGACATGGAGATTACTGTAATCGCTTC-3'；(SEQ ID NO.5)

下游引物:5'-GCACTAGTTCAATTGGTACCACCGATTTGTTC-3'；(SEQ ID NO.6)。

其中划横线部分依次为SalⅠ，SpeⅠ酶切位点。

YUC10基因的克隆：

以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGACTAGTCAAGAAATGGAGACCGTAGTGGTGA-3'，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物:5'-GCTCTAGATCTTGCAGGTTAATGAATACAGCTTCAA-3'，如SEQ ID NO.8所示。

其中划横线部分依次为SpeⅠ，XbaⅠ酶切位点。

PCR扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μL)，2μl下游引物(5μmol/μL)，5μl 10×PCRbuffer，2μl dNTP混合液(2.5mM)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U)，2μl cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μl PCR产物与pEASY-Blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养，然后进行序列测定，选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒DNA。

1.4植物表达载体的构建

获得上述的目标基因后，将目的片段转入由雌二醇(17-β-estradiol)诱导的诱导型表达载体pER8中，获得诱导型的pER8::RID3，pER8::YUC10，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施例2:SERK1、RID3及YUC10启动子的克隆及植物表达载体的构建

2.1植物基因组DNA的提取

采用小量法提取拟南芥的基因组DNA。提取方法如下：

(1)取新鲜的植物叶片，于液氮中研磨成粉末；

(2)加入500μL DNA提取液，振荡混匀，置于60℃水浴中2min；

(3)取出后向离心管中加入500μL苯酚，振荡混匀，12000rpm，离心5min；

(4)取上清，转入新的1.5mL离心管中，加入500μL苯酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，12000rpm，离心5min；

(5)取上清，转入新的离心管中，加入500μL氯仿，振荡混匀，12000rpm，离心5min；

(6)将上清转入新的离心管中，加入30μLNaAc(pH＝5.4，3mol/L)和350μL异丙醇，颠倒混匀，12000rpm，离心5min(此步骤不可过分剧烈，以防基因组DNA断裂)；

(7)弃上清，70％乙醇清洗沉淀，12000rpm，离心1min；

(8)重复步骤7的操作，然后用真空泵去除乙醇，不可过分干燥，否则沉淀极难溶解；

(9)30-50μLddH₂O回溶沉淀(提前预热ddH₂O帮助DNA溶解)。取3μL电泳检测。若电泳条带清晰，则证明提取的基因组DNA未降解。

2.2植物基因组DNA的纯化

(1)用500μL的TE回溶沉淀，并加入5μL RNaseA，37℃处理1-2h；

(2)取少量DNA跑电泳，检测RNA是否除尽。如果已除尽，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，混匀，室温8000-10000rpm离心5min；

(3)将上清转入新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿，混匀，8000-10000rpm离心5min；

(4)将上清液转入新的1.5mL离心管，加入1/10体积的NaAc(pH＝5.2，3mol/L)和两倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h；12000rpm离心10min；

(5)弃上清，70％乙醇漂洗沉淀；

(6)重复步骤5后，37℃烘干；

(7)用20-50μL ddH₂O溶解沉淀。

2.3SERK1、RID3及YUC10启动子的克隆

SERK1基因启动子的克隆：

以DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGAAGCTTGCTTCCAAAGGATCTATGTGGCG-3'；(SEQ ID NO.12

下游引物:5'-GCGGATCCCCACATAACTCGACTCCATTTC-3'；(SEQ ID NO.13)。

其中划横线部分依次为Hind III，BamH I酶切位点。

RID3基因启动子的克隆：

以DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGATCGATCTCCTTCTCCGCCTCATCATTC-3'；(SEQ ID NO.14)；

下游引物:5'-GCTCTAGAATAGCTCAGAGAAAGAGGGAAGTAAA-3'；(SEQ ID NO.15)。

其中划横线部分依次为Cla I，Xba I酶切位点。

YUC10基因启动子的克隆：

以DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-GGAAGCTTCCGCCACTGAGTTGTGCTTG-3'；(SEQ ID NO.16)；

下游引物:5'-GCCTCGAGCACTACGGTCTCCATTTCTTGTGTTTAG-3'；(SEQ ID NO.17)。

其中划横线部分依次为Hind III，Xho I酶切位点。

PCR扩增体系为2μl上游引物(5μmol/μL)，2μl下游引物(5μmol/μL)，5μl 10×PCRbuffer，2μl dNTP混合液(2.5mM)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U)，2μl cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至25μl。

扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，循环33次；72℃延伸10分钟。

取4μl PCR产物与pEASY-Blunt3载体连接，然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。筛选出阳性克隆后挑取阳性菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养，然后进行序列测定，选取测序正确的菌落培养，碱法提取质粒DNA。

2.4植物表达载体的构建

获得上述的目的片段后，分别将SERK1、YUC10的启动子片段转入表达载体pROKII-GFP中，获得pSERK1::GFP、pYUC10::GFP表达载体，将RID3的启动子片段转入表达载体pBI121-GUS中，获得pRID3::GUS表达载体，并进一步利用获得的该载体转化农杆菌。本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施例3：农杆菌介导的拟南芥花序的转化及抗性植株的获得

拟南芥的转化步骤如下：

(1)农杆菌的准备应在转化前一天进行，用100mL加相应抗生素的培养液活化农杆菌。第二天上午即可转化拟南芥；

(2)配置浸染液：5％蔗糖溶于ddH₂O中，加入0.03-0.05％Silwet L-77；

(3)5000-6000rpm离心5-8min，弃上清液，收集菌体；

(4)用侵染液悬浮菌体；

(5)将拟南芥的花序浸泡至侵染液中轻轻震荡约30s；

(6)然后将拟南芥横置于纸箱子中，覆膜，黑暗放置一天；

(7)第二天放回光照条件下继续生长。

根据植株的长势，隔5-7天可浸染一次，浸染3次后的拟南芥植株正常生长，收种子。种子经消毒处理后，均匀铺在含筛选标记的潮霉素抗性培养基上，选取具有抗性的幼苗转入育苗盆中继续培养。

实施例4：阳性转基因植株的诱导培养

拟南芥的萌发与培养过程如下：

(1)将种子先用70％的酒精浸泡消毒5min后，再使用2.6％的NaClO浸泡消毒10min，最后用灭菌的0.1‰Tween ddH₂O清洗6-8遍，均匀平铺于含有10μmol/mL雌二醇的1/2MS萌发培养基上；

(2)4℃春化处理3天打破休眠；

(3)春化结束后将拟南芥种子进行光照培养(22℃，16h光照和8h黑暗)；

(4)种子萌发后5天左右，将幼苗移至新的含有10μmol/mL雌二醇的1/2MS培养基上继续培养；

(5)培养至14天左右，可以观察到在幼苗的子叶上长出了类似于胚状体的结构，进行发生频率的统计。

(6)利用遗传分子标记pSERK1::GFP对培养72小时，96小时及120小时的幼苗的子叶进行观察，证实该胚状体结构的遗传学属性。

实施例5：启动子连接GFP报告基因的共聚焦显微镜观察和图像处理

分别带有pSERK1::GFP标记的诱导型的pER8::RID3和pER8::YUC10，以及pYUC10::GFP的转基因材料均在LEICA DM6000CS型共聚焦激光扫描显微镜中观察。发出GFP绿色荧光的材料用488nm argonion激光激发，叶绿素的自发荧光用大于BP650的滤光片检测信号，激发光同GFP的激发波长。图像先经LSM 5Image Browser(LEICA)处理，输出为JPEG图像后，用Adobe Photoshope 6.0处理。

实施例6：启动子连接GUS报告基因的染色分析

具体操作如下：将需要染色的带有pRID3::GUS标记的拟南芥不同发育阶段的角果沿腹缝线剖开，露出胚珠，然后在90％丙酮中冰浴固定15～20分钟；用不含X-Gluc的缓冲液漂洗2～3遍，每遍5分钟；加入GUS染色液，真空抽气两次，各10分钟。37℃反应，时间20分钟到10小时不等(根据实际组织着色情况而定)；染色结束后需停止反应。用70％乙醇脱色，制成临时装片，利用Olympus BH-2荧光显微镜观察胚胎的染色情况。

实施例7：扫描电子显微镜观察

具体操作步骤如下：

(1)将诱导培养不同时间段的pER8::RID3子叶胚性化的叶尖切下放入预冷的4％戊二醛固定液中，抽气，4℃放置过夜。

(2)在缓冲液中短暂清洗后,经10％、30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、100％系列乙醇脱水，每级1小时。

(3)用乙酸异戊酯置换材料中的乙醇，具体作法是：100％乙醇、75％乙醇-25％乙酸异戊酯、50％乙醇-50％乙酸异戊酯、25％乙醇-75％乙酸异戊酯、100％乙酸异戊酯、100％乙酸异戊酯，每级30分钟。

(4)用Hitachi HCP-2二氧化碳临界点干燥器进行干燥。

(5)干燥后的材料，用导电胶将其固定在金属台上喷金。

(6)最后将金属台置于扫描电镜的观察室中，用Hitachi 800扫描电镜观察并采集照片。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种诱导体细胞胚直接发生的方法和应用

<130> 2018

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> RID3基因

<400> 1

atggagatta ctgtaatcgc ttcttcctca atcgatgaag gaattggaag ttgggatctc 60

aaaaccggga cagagcagct tcaattcaag ccgtgtgctt ctccggcgca tggtctcacc 120

gccgtcggcg aaaaatttct cgcctcctct cagctctcgg cgagaaatac ttctggctcg 180

attttttact ggtcttggac taagcctcaa gctgaagtga agagctaccc agtggaacca 240

ataaaggctc ttgcagcaaa caatgaagga acttacttag ttggtggtgg aatctctgga 300

gatatttacc tttgggaggt tgcgactggg aagttgctta agaagtggca tggtcattat 360

cgttcagtaa catgtttggt gttctctgga gatgattctt tgttggtttc tggatctcaa 420

gatgggtcta ttagagtttg gtctcttata aggctatttg atgatttcca gaggcagcaa 480

gggaacactc tttatgaaca caattttaat gagcatacaa tgtctgtaac tgatattgtt 540

atagactatg gaggctgcaa tgctgtgata atttcctctt cagaagatcg gacttgcaag 600

gtttggagct tgtcaagagg gaaattgttg aaaaatatca tttttccttc agtcatcaat 660

gcactcgcat tggaccctgg agggtgtgtg ttctatgctg gtgccagaga cagcaaaatc 720

tatatcggtg ccattaatgc cacaagtgaa tacgggacac aagttcttgg ttcagtatct 780

gaaaaaggca aagctattac ttgcttagca tattgtgcag acggaaacct tttgatatct 840

ggatcagaag atggtgtggt ttgtgtttgg gatcccaaat cacttcgcca tgttcgtact 900

ctcatccatg caaaaggttc tagaaaaggt cctgtgaaca atattcaaat tgttagaaaa 960

acgattgttg ctaattccaa caaaacccaa gtttcctgga aaagtcgtgg ggctttaatc 1020

ccaccgcctt tggaaaaata tgaaagacca gtagaagata ctatggatgg tatcgttacg 1080

gttgatccgc cgccattttc tgatgttcct gtttactctt ctttcctcag tgctgacctt 1140

attgacgagc aagttaaaga acttcagcaa caaggctctg cagcaacaga gatggaaatg 1200

gaaagactga aacttgaata caaaagatct ttacagatga atgaacaatg gcagaagaac 1260

tatgagaatt tgcttcaagt ggttatggaa gaagaacaaa tcggtggtac caattga 1317

<210> 2

<211> 438

<212> PRT

<213> RID3基因编码蛋白

<400> 2

Met Glu Ile Thr Val Ile Ala Ser Ser Ser Ile Asp Glu Gly Ile Gly

1 5 10 15

Ser Trp Asp Leu Lys Thr Gly Thr Glu Gln Leu Gln Phe Lys Pro Cys

20 25 30

Ala Ser Pro Ala His Gly Leu Thr Ala Val Gly Glu Lys Phe Leu Ala

35 40 45

Ser Ser Gln Leu Ser Ala Arg Asn Thr Ser Gly Ser Ile Phe Tyr Trp

50 55 60

Ser Trp Thr Lys Pro Gln Ala Glu Val Lys Ser Tyr Pro Val Glu Pro

65 70 75 80

Ile Lys Ala Leu Ala Ala Asn Asn Glu Gly Thr Tyr Leu Val Gly Gly

85 90 95

Gly Ile Ser Gly Asp Ile Tyr Leu Trp Glu Val Ala Thr Gly Lys Leu

100 105 110

Leu Lys Lys Trp His Gly His Tyr Arg Ser Val Thr Cys Leu Val Phe

115 120 125

Ser Gly Asp Asp Ser Leu Leu Val Ser Gly Ser Gln Asp Gly Ser Ile

130 135 140

Arg Val Trp Ser Leu Ile Arg Leu Phe Asp Asp Phe Gln Arg Gln Gln

145 150 155 160

Gly Asn Thr Leu Tyr Glu His Asn Phe Asn Glu His Thr Met Ser Val

165 170 175

Thr Asp Ile Val Ile Asp Tyr Gly Gly Cys Asn Ala Val Ile Ile Ser

180 185 190

Ser Ser Glu Asp Arg Thr Cys Lys Val Trp Ser Leu Ser Arg Gly Lys

195 200 205

Leu Leu Lys Asn Ile Ile Phe Pro Ser Val Ile Asn Ala Leu Ala Leu

210 215 220

Asp Pro Gly Gly Cys Val Phe Tyr Ala Gly Ala Arg Asp Ser Lys Ile

225 230 235 240

Tyr Ile Gly Ala Ile Asn Ala Thr Ser Glu Tyr Gly Thr Gln Val Leu

245 250 255

Gly Ser Val Ser Glu Lys Gly Lys Ala Ile Thr Cys Leu Ala Tyr Cys

260 265 270

Ala Asp Gly Asn Leu Leu Ile Ser Gly Ser Glu Asp Gly Val Val Cys

275 280 285

Val Trp Asp Pro Lys Ser Leu Arg His Val Arg Thr Leu Ile His Ala

290 295 300

Lys Gly Ser Arg Lys Gly Pro Val Asn Asn Ile Gln Ile Val Arg Lys

305 310 315 320

Thr Ile Val Ala Asn Ser Asn Lys Thr Gln Val Ser Trp Lys Ser Arg

325 330 335

Gly Ala Leu Ile Pro Pro Pro Leu Glu Lys Tyr Glu Arg Pro Val Glu

340 345 350

Asp Thr Met Asp Gly Ile Val Thr Val Asp Pro Pro Pro Phe Ser Asp

355 360 365

Val Pro Val Tyr Ser Ser Phe Leu Ser Ala Asp Leu Ile Asp Glu Gln

370 375 380

Val Lys Glu Leu Gln Gln Gln Gly Ser Ala Ala Thr Glu Met Glu Met

385 390 395 400

Glu Arg Leu Lys Leu Glu Tyr Lys Arg Ser Leu Gln Met Asn Glu Gln

405 410 415

Trp Gln Lys Asn Tyr Glu Asn Leu Leu Gln Val Val Met Glu Glu Glu

420 425 430

Gln Ile Gly Gly Thr Asn

435

<210> 3

<211> 2124

<212> DNA

<213> YUC10基因

<400> 3

caagaaatgg agaccgtagt ggtgattgtg ggagctggac cggccggttt agcaacatcg 60

gtttgtctaa accaacactc aatcccaaac gtgatcctcg agaaagaaga catctatgca 120

tccctttgga agaaacgagc gtacgatcgt ctcaaacttc acttagccaa agaattttgc 180

cagcttcctt tcatgccaca cggtcgtgag gttccaacct ttatgtccaa agagcttttc 240

gtcaactacc ttgacgctta cgttgcccgt ttcgacatca accctaggta caaccgtacc 300

gtgaagtcct caacgttcga tgagtccaat aacaagtgga gggtcgtggc cgaaaacacg 360

gtaaccggag aaaccgaggt gtattggtcg gagtttctgg tggttgcgac cggggagaac 420

ggagatggga atattccgat ggtggagggg attgacactt ttgggggaga gattatgcac 480

tcgagtgagt acaagtccgg tcgtgatttt aaagataaaa atgttcttgt ggtcggaggt 540

ggaaattccg gtatggagat tagttttgat ctttgcaact tcggagctaa tacgaccatt 600

ctaattagaa ctccagtaag taattaatgt tgttttgtct cttttaatta ttataatttg 660

tctgcatgaa agcttaagat gcacacttgt cttgcatgtg tgattttttt ctccgttgta 720

cacaattact aagacgtccc taaggcctta acaataactg atctttggtc aattcatgga 780

tacaaactca ttgtgattta tgagatccaa aagatagatg atggcttggc ttgtaaaata 840

tcaattggca cccatatcct tcattgagtt ctaatgtaat ctaaaatttt cattccataa 900

ccatatgtag atggtgtgtg tatatacatt agggttttct tttgtagaaa ataacacatc 960

aaataatgtt ctttctctaa atctgtgcag agacacgtgg tgactaaaga agtgatacac 1020

ttggggatga cacttctgaa gtatgctcca gtggcgatgg tcgacacatt ggtgacgact 1080

atggcaaaaa ttttgtacgg agatctctcc aagtacggac tcttccgacc aaaacaaggt 1140

cctttcgcca ccaaactctt taccggaaaa gctcctgtca ttgatgttgg aactgtcgag 1200

aagattcgcg atggcgagat tcaggtacct tcacttgtcc atcaaatttc atcttcatct 1260

ttattttatt ttttaaagga tttttattgg tttcttacta atgtataaaa ctgtcggtct 1320

atttttctgt tttgtggtca aacagtgtca gtcttttaaa ttttggttta tatgaaaagg 1380

ataagcaatt aaagtataaa cagttgtaaa ggaggataac gttagtaatt tctgcacgac 1440

tccaaaataa cccttgattt tagatgtttc aaacctcaat ttttttttca tatatcctac 1500

tgatttcaca caaattaatg aagatataac ctcataagca tttattgttc aaagcttctt 1560

gaggacttag ttaaatgata agtggtaact tcgattaaat ggaaacacta ttaactaact 1620

aataatgcaa tgttaggtta tcaatggtgg gattggaagc atcaacggga agaccttgac 1680

gttcgaaaac ggacataaac aagatttcga tgcgattgtg tttgctactg gttacaaaag 1740

ctccgtttgc aattggttag aggtatttta acatgagtac cctattggac aacgatatat 1800

gttaagtata gatttgatct tatcaagtga aaatgaaatc ctaacgagta acgagactag 1860

gaaatactct tgtgcataaa tacttgtata atgatgtgtt tttgtgatat tatacaggac 1920

tatgaatacg tgatgaagaa ggatggattc cccaaagcac cgatgccaaa acattggaaa 1980

ggagagaaga atctttactg tgccggattt tcaagaaaag gaatcgccgg aggtgctgag 2040

gatgctatgt ctgtagccga cgacatcaga tctatcttgg ctaccttaaa aaataattga 2100

agctgtattc attaacctgc aaga 2124

<210> 4

<211> 383

<212> PRT

<213> YUC10基因编码蛋白

<400> 4

Met Glu Thr Val Val Val Ile Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Ala

1 5 10 15

Thr Ser Val Cys Leu Asn Gln His Ser Ile Pro Asn Val Ile Leu Glu

20 25 30

Lys Glu Asp Ile Tyr Ala Ser Leu Trp Lys Lys Arg Ala Tyr Asp Arg

35 40 45

Leu Lys Leu His Leu Ala Lys Glu Phe Cys Gln Leu Pro Phe Met Pro

50 55 60

His Gly Arg Glu Val Pro Thr Phe Met Ser Lys Glu Leu Phe Val Asn

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Ala Tyr Val Ala Arg Phe Asp Ile Asn Pro Arg Tyr Asn

85 90 95

Arg Thr Val Lys Ser Ser Thr Phe Asp Glu Ser Asn Asn Lys Trp Arg

100 105 110

Val Val Ala Glu Asn Thr Val Thr Gly Glu Thr Glu Val Tyr Trp Ser

115 120 125

Glu Phe Leu Val Val Ala Thr Gly Glu Asn Gly Asp Gly Asn Ile Pro

130 135 140

Met Val Glu Gly Ile Asp Thr Phe Gly Gly Glu Ile Met His Ser Ser

145 150 155 160

Glu Tyr Lys Ser Gly Arg Asp Phe Lys Asp Lys Asn Val Leu Val Val

165 170 175

Gly Gly Gly Asn Ser Gly Met Glu Ile Ser Phe Asp Leu Cys Asn Phe

180 185 190

Gly Ala Asn Thr Thr Ile Leu Ile Arg Thr Pro Arg His Val Val Thr

195 200 205

Lys Glu Val Ile His Leu Gly Met Thr Leu Leu Lys Tyr Ala Pro Val

210 215 220

Ala Met Val Asp Thr Leu Val Thr Thr Met Ala Lys Ile Leu Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Leu Ser Lys Tyr Gly Leu Phe Arg Pro Lys Gln Gly Pro Phe Ala

245 250 255

Thr Lys Leu Phe Thr Gly Lys Ala Pro Val Ile Asp Val Gly Thr Val

260 265 270

Glu Lys Ile Arg Asp Gly Glu Ile Gln Val Ile Asn Gly Gly Ile Gly

275 280 285

Ser Ile Asn Gly Lys Thr Leu Thr Phe Glu Asn Gly His Lys Gln Asp

290 295 300

Phe Asp Ala Ile Val Phe Ala Thr Gly Tyr Lys Ser Ser Val Cys Asn

305 310 315 320

Trp Leu Glu Asp Tyr Glu Tyr Val Met Lys Lys Asp Gly Phe Pro Lys

325 330 335

Ala Pro Met Pro Lys His Trp Lys Gly Glu Lys Asn Leu Tyr Cys Ala

340 345 350

Gly Phe Ser Arg Lys Gly Ile Ala Gly Gly Ala Glu Asp Ala Met Ser

355 360 365

Val Ala Asp Asp Ile Arg Ser Ile Leu Ala Thr Leu Lys Asn Asn

370 375 380

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggtcgacat ggagattact gtaatcgctt c 31

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcactagttc aattggtacc accgatttgt tc 32

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggactagtca agaaatggag accgtagtgg tga 33

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctctagatc ttgcaggtta atgaatacag cttcaa 36

<210> 9

<211> 5130

<212> DNA

<213> SERK1启动子

<400> 9

gcttccaaag gatctatgtg gcgaaaactc acttaatctg taaaacagcg ttcagcgttt 60

gcgtccgtaa ctgcttttct agttgagatg atgttctttc tccaaattat ggcgtttgcg 120

tccatgtctt ctttttcttt gcatggtatc tttcctctgt aaattctgtg ttttctcttg 180

ttttgttctt tttcttacct ttattcctgg atttgaaagt tgaaacgctc ggtggccact 240

tgcactagga tattatcccg ttgtatttag gaggcgtatt tttttgtcgc aaattttaat 300

tctactgttt catttaattt tgatacaatc ttcttaaagt tcgtttctct ttcataacaa 360

ggtagctctt attgttttta gaattatttc tgatttgtga aattttgaat ttgaagcata 420

tttttatcat gaatataaaa aatgttgggg attataaaaa agtttgtaaa ttcactcatt 480

ggcagctgat ttagccactc acaatatcta aataaataat tgtaagcatt atcttgaaat 540

attttctgaa atgactgttt cttttttact ttaattaaat tttgttctag aaaccttttg 600

atcataatga aaataaagag tccatccacc acatggggta agcataatgt gtgatattta 660

aagggtaaca aatgtaatct gctttttatt ttacttttta cctctactca aattgtatgg 720

gcagtttttt tttttttttt aaatgataag acaagtatct gtttaatggt attgtgatga 780

aacagtagta aagtcatatc gggcacgcca tactacttcc acagtggaac ttggccaaat 840

tttgtctttg ccgtctctac agtttcttcc accaaatttt ttgttgacaa aactcaaatc 900

tttcaatctc atctctgcca aagttgggtt tagaaagaat atcagcaaac actaatatct 960

ttattgttgc atggtttatc aatcacaaaa ttcacaacca ttgtaaaaaa aaattcacat 1020

ttttggtatg agattgctca catgatagtg aacctcttta acattttaac tttactttca 1080

taaatacggg attacgaatc ttacttgcat taaaaattta gaaaaggttt ttctacttaa 1140

agaaaaaagg gacccaacag agagaggttt gaccaggaga aacgggtgca tagccttaag 1200

agctttcaac tactttaccc caaacccaaa gcgatgtcac tttcaaccat ctcttctctc 1260

ccccgaaccc gtttttttga ccggtcagtt cgggcagcag caccgttacg ggcagcttat 1320

attcctcgtc ttcctcctct acaccactgc atgcccataa ataaagcccg ttgagatctt 1380

taaaaatatt aaataatata tcaacgaaaa agctatttta ttcataagaa gaaaaagaga 1440

ggaacaacaa caacacacta atcatagttt ctctggcagg cttgttgttg cggcttaata 1500

aaaagctctt ttgttattat tacttcacgt agattttccc caaaaagctc ttattttttt 1560

gtttaaaaaa aaaagtttca tctttattca acttttgttt tacagtgtgt gtgtgagaga 1620

gagagtgtgg tttgattgag gaaagacgac gacgagaacg ccggagaatt aggattttga 1680

ttttattttt tactctttgt ttgttttaat gctaatgggt ttttaaaagg gttatcgaaa 1740

aaatgagtga gtttgtgttg aggttgtctc tgtaaagtgt taatggtggt gattttcgga 1800

agttagggtt ttctcggatc tgaagagatc aaatcaagat tcgaaattta gcattgttgt 1860

ttgaaatgga gtcgagttat gtggtgttta tcttactttc actgatctta cttccgaatc 1920

attcactgtg gcttgcttct gctaatttgg aaggttcgtg gttactcaat tactcagctt 1980

tactcgtttc tcaattactt tctcgattct tttttatttg gaggtgaatc gctatcttta 2040

gtgtctgcat tttgatttat gaaaattgtt gttgttcttt gtatttgtaa gatttagtgg 2100

ctagtacttt gaatacactg ttttgctttt cttgttcaga tcaactttgt atattgtaaa 2160

ggcatgttct ttgggttgaa aagctgggtt atttgatatc ttaagattga tgttgttgat 2220

ccaaacattc tctgaaagac ttcatttgtt tttggttttg taaagaattt gtttaattat 2280

tagcctctaa tctcagagag gcctgtttga atagttctct cttgaaatta gacttttcac 2340

caattgatgc taattgtgta gatttgttgt tcttgttata ggtgatgctt tgcatacttt 2400

gagggttact ctagttgatc caaacaatgt cttgcagagc tgggatccta cgctagtgaa 2460

tccttgcaca tggttccatg tcacttgcaa caacgagaac agtgtcataa gagtgtaaag 2520

ctttcttcta ctaatcccac tttttaaact ttgacctcag cgtggttacc gacatttttg 2580

tttcttttgt caaatacagt gatttgggga atgcagagtt atctggccat ttagttccag 2640

agcttggtgt gctcaagaat ttgcagtatt tgtaagttcc acttatgcat catgctttaa 2700

caaaacaaat ccaagatttg acagaagaag cactggagtt accttttgta attgaaatct 2760

ttttaacaag tttcttattt tcttacaggg agctttacag taacaacata actggcccga 2820

ttcctagtaa tcttggaaat ctgacaaact tagtgagttt ggatctttac ttaaacagct 2880

tctccggtcc tattccggaa tcattgggaa agctttcaaa gctgagattt ctgtgagtat 2940

acatatgctt taccggctca gttacagtct ttgtttaatc ttaggttttg ttccaatttt 3000

tgactctttg ctgaaaattt tacatgcaag aatagccggc ttaacaacaa cagtctcact 3060

gggtcaattc ctatgtcact gaccaatatt actacccttc aagtgttgtg agtcctctca 3120

ttaactttca tttatgtcta cttcattctc cctcagttga tttgttgagt taatgcactt 3180

aaccttgatg gatgcaacac agagatctat caaataacag actctctggt tcagttcctg 3240

acaatggctc cttctcactc ttcacaccca tcaggttcta tgatttatcc tcttcagtta 3300

tttcagttgt tgtgtcagtg tctgaactta ttctgaaact ttcatttcct tgtgcagttt 3360

tgctaataac ttagacctat gtggacctgt tacaagtcac ccatgtcctg gatctccccc 3420

gttttctcct ccaccacctt ttattcaacc tcccccagtt tccaccccga gtaagcctcc 3480

tctttttagt ttacattata ggaaacagaa gatgaaatct ttgcttctct gtcaatcctt 3540

tttctcatat aactcatctt gccaataagg caataaccaa atgatctaat ttgatttcag 3600

gtgggtatgg tataactgga gcaatagctg gtggagttgc tgcaggtgct gctttgctct 3660

ttgctgctcc tgcaatagcc tttgcttggt ggcgacgaag aaagccacta gatattttct 3720

tcgatgtccc tggtgagttt attattcgca ttagtttctg ttcttagcca gcaattttgt 3780

tttgcagaaa agtattggaa caactgttaa tgaaaatcaa tacataagtc attgtttttt 3840

aagttacaaa ctcttttgag taaaatctcg attgcaaaat ctctttgcag ccgaagaaga 3900

tccagaagtt catctgggac agctcaagag gttttctttg cgggagctac aagtggcgag 3960

tgatgggttt agtaacaaga acattttggg cagaggtggg tttgggaaag tctacaaggg 4020

acgcttggca gacggaactc ttgttgctgt caagagactg aaggaagagc gaactccagg 4080

tggagagctc cagtttcaaa cagaagtaga gatgataagt atggcagttc atcgaaacct 4140

gttgagatta cgaggtttct gtatgacacc gaccgagaga ttgcttgtgt atccttacat 4200

ggccaatgga agtgttgctt cgtgtctcag aggtaaaaac taaacatctt gtgctctctc 4260

tcaattactt tgacgtgaag tgttttttca tgttttcctt tatgggttca taattgttgg 4320

ttacactaat gacacagaga ggccaccgtc acaacctccg cttgattggc caacgcggaa 4380

gagaatcgcg ctaggctcag ctcgaggttt gtcttaccta catgatcact gcgatccgaa 4440

gatcattcac cgtgacgtaa aagcagcaaa catcctctta gacgaagaat tcgaagcggt 4500

tgttggagat ttcgggttgg caaagctaat ggactataaa gacactcacg tgacaacagc 4560

agtccgtggc accatcggtc acatcgctcc agaatatctc tcaaccggaa aatcttcaga 4620

gaaaaccgac gttttcggat acggaatcat gcttctagaa ctaatcacag gacaaagagc 4680

tttcgatctc gctcggctag ctaacgacga cgacgtcatg ttacttgact gggtaataac 4740

aacataaaac ttccatttga ccccaacaaa aaccattgaa acgagaatct aatctcaaat 4800

acttgtttgt tggtttaggt gaaaggattg ttgaaggaga agaagctaga gatgttagtg 4860

gatccagatc ttcaaacaaa ctacgaggag agagaactgg aacaagtgat acaagtggcg 4920

ttgctatgca cgcaaggatc accaatggaa agaccaaaga tgtctgaagt tgtaaggatg 4980

ctggaaggag atgggcttgc ggagaaatgg gacgaatggc aaaaagttga gattttgagg 5040

gaagagattg atttgagtcc taatcctaac tctgattgga ttcttgattc tacttacaat 5100

ttgcacgccg ttgagttatc tggtccaagg 5130

<210> 10

<211> 2634

<212> DNA

<213> RID3启动子

<400> 10

ctccttctcc gcctcatcat tctcctcctc tagcttgtga agaacaagat ccgtatcagg 60

aacatatccg cagcgtttta tttctgtaat taaccgatcc aattcatcat atatttggtg 120

agcattcggg tgagctgtat cacctacgta gaacttatga attttatctc ccacttctat 180

ccaactgcaa cctccttctt taaccaagtt tctctctttc atcttcctcc tcatctccgt 240

agattcttcc catttcccta catagaaata ttcaacaaag tgtcactttc acacaaggta 300

gatcagtaga agaaagagtt ttatctgatt gtgtttgaat tatatagata cctgcacaag 360

cgtatatgtt tgagagctgt atataagctg caggctcatt cggatcaagt tctaagatct 420

tcctcgcagc caactttccg agttctgtgt tactgtgaac tctgcaagct ccaagaaacg 480

tacgccatac taaaacatcg gcttggaagg gcattgtgtt aatgaactca aatgcgtctg 540

tgagaagccc ggctcgacat agaagatcaa ccatacaagc atagtgttcc atcttaggtt 600

tgatcttgtg gtcttcatac attgaattga aatgtctcca tccttcggag accaaaccaa 660

catggctgca tgccgataag attgcaacat aagtgacctc atttggcttc accccttctt 720

ctatcatttg gttgaatgtt tcgagtaccc ttatagcgaa tccgtgttta gcgaaacctg 780

tgatcattga agtccacgag atgacattac gattttccat aaaattgaag actcgggaag 840

ctgtgtcaat gcttccacat ttggaataca tagagatcaa agcattgcag acgggttgat 900

tgcacgagag cccgagttta accacctgag aatggatttg ctcgcctttt cttattgaac 960

caacatttgc aactccactc aacaagctag caaatgtgaa agcgctaaca cctaattctc 1020

tctcagtgat ctcacttaaa agcttaaatg cttgctcaaa attcaagttc ctgcatgttc 1080

cgtcaagaaa tgtattatac gaaaccaagt tcttctcaga aagtgactca aaagctctct 1140

gagcatcttc catcctgtca gatttaacaa acatgctgat aaccgagttt gcaacactgc 1200

tattcgaagc aagccctctt ttgaaagctt gaccaagaac ctgtttacct acccgtggat 1260

ccgaaagatt tccacacgcc ttgaatgcac tcgagaaagt gaaatgattt ggctcaacat 1320

gaccttgcgt tatcatttca ctaaagagat taatagcctc tgtagcgaga ttacagtttt 1380

tcatataacc agtgatcaat gccgtccacg acataacact atgatcctcc attctatcaa 1440

acaccttcct gcaatcatct accgaaccat ccgcagaaca tttcgcatac atatcaacta 1500

aactacattc aacatcatcc acaagccctg atctaatagc ccaagaatgc aactgctttc 1560

ccaaagacaa gttctccaac tcagcacaag ccgaaaacac agagcttagt gtgaacttat 1620

ctgattcaaa tccacttaaa accatatcca agaaaaacct aatcgcttcc ctaggaaacc 1680

ccatctgcat acaccgagta atcatcaaag tccaagtaac aacatttagt tcagacattt 1740

tatcaaacac cttatacgca ttctcaaagc tattctctcc tttcacaaac atgtcaatca 1800

aagaacaacc cacacacaca tcagattcaa aatgcccagt cttcatcaaa aaccctaaag 1860

tcactctccc aactccaaca aaatccgaat tcgaacaagc tcgtatcacc gccgtgtaac 1920

aataatcatt aggcaccaaa cctaactcca gaaactcaac aaaaacctta attgcatcta 1980

attctcttcc gttgttaccg taacaagcca tcatcgcact ccacgaaaca acatctcgct 2040

taccaaatct tctcatagtc tcaaacacat cttcagcttt cgccgaatct ccagatttcg 2100

aatacaagct aatcaacgaa ttgtagagaa ccgaatcagg ctcgatatca aactcgatta 2160

atcgagcgtg tacgagtttc ccgagacgaa aatcgcgtgc tcggatacaa gatttgagaa 2220

gtgaagagaa agtgactgag tccataggac gaatcccatc acgagccatg agatcaagag 2280

ctgaaaccgc tccacgaaga tctccggcat tgagatgacg gagaatcaaa cggtcggcga 2340

cgttgatccg atttgaaacg gacggttgag atttaatcgg aagtttggcg ggagatggaa 2400

acgaaaagct tatcatcgcc attgttctcc aatctaaacg atccgttact gttaattatc 2460

aatatcacac aaaatttaca ttatagtccc ttaagtttgt ggaaattatc aataagacac 2520

aaaactatta atttatcaaa ttacatacat agttcataaa ccctaattta tagatatcac 2580

aaaacccaga cttggaatca gtttctcttt acttccctct ttctctgagc tatg 2634

<210> 11

<211> 2667

<212> DNA

<213> YUC10启动子

<400> 11

ccgccactga gttgtgcttg cttgattcag aatttttact tcaatcaatg tgtatctctt 60

cttttcaaat gttattagta gcttagaatt tacaggatct atgtgaaata aacttttctt 120

attattttga ctaccatata gtccatatgt atattggttc tctagggcat gtcgctaaag 180

acagttacaa gtgattggat aaaaaattta atttgaattt catagttgtt ctatactgac 240

gcatgaatac tgattttgaa gtttcgcttc ccaaaatccc acattttgta gacttgtttc 300

gagtaataat cctatgtgaa gtttttcttg aggtcctcga caatattttg agggattatg 360

acaaaggtag agctttcact tacctaaaca gagttgtgtt tttgttggct tccaaaacta 420

gatcaataga gaataattac cctaaaaata aatagtagaa taagaaagat atgtctgaga 480

gatccactag cggaaaggga ggcttccctt gaattttctt gtcataaggc tcctcacgac 540

cacgaaggag cgatgtcttg acattgacca aaaaaaacaa aatatttgag agagtttaga 600

gttttcttta ttttccattt aaaaatatac aaatcgtgta ttataaagtg atctattttt 660

gaaaataata gttttgtttt attttgtgta accatagaga tggtataatg tcattgatta 720

gaaaatgctt ttatattatc attatttcat gtgttttaat tgttgttttt atattaatgc 780

gttcatcgat aatatctttc taactttttg gtcatgcaac aaaaagattt atgcgaaaac 840

taaaatcgtt aaatctacga taattagtaa ctttccgtaa aactgcattt ggatatttag 900

aggaaaatgt taacttataa gggaaccctt gccgttttat tttttttatg aaacaatata 960

ttagaaaaca tttatacatt gtcgttatgt caggtgttat tgtattattg tcgttcttac 1020

attaatgcgt ttgttgataa tattatctac atttttggtc aacgcgacaa aaagattcat 1080

gcgataacta taatcgtgga atctacgatc gtatataacg tttccacaaa aatcgcattt 1140

ggatatttag gcgataattt taacttttaa aggaatcgtt gttttgttcg aagttttaca 1200

actaaatata ttagtttttc cttttagtta ttatctttca ttcgtctttt cttgttattt 1260

attctttttt cttgctcata tttttataca atataacata atgattgatc aatatctata 1320

gagaaggatg atagaattta aatatattat atatataatt tatgttatta gttcttaaat 1380

aatatttaca acacattgtc gagaaatttt tgttattgat tgttttgtta attgataact 1440

aaaaatcatt ataaatttta cataaaaaaa gttttgtcgg aaataaaaca aataaattta 1500

attatttaaa agcattatcg agaatagagt gagttaataa tatgtgtcac tcaactatgg 1560

atcattttcc atttaactta agagttaata gtcgacgata aaatgaaaga tattaaaaac 1620

atatctataa atttggaaat attaattacg taatatgtat gtgaaattat atagttgtct 1680

tcaaaattgt cagatacaaa gaatatagtt tattcatcaa aaaaaatcga aaatatagag 1740

aatcacaatg tttaattagt aatacaatta taatgtcaga tttttaaaaa gacgattgca 1800

ctaaattcat tacaaatttg acactaaatt tttttaaaaa agtatagttc aacaaacaca 1860

ataaatagtt cactgaaaaa aaatcaaaaa caaaaacaaa tattggtgtt tataatgtac 1920

tctctaagaa attgaaatgg ctatttccaa attatttgta attagtagtt tcagttttat 1980

attacttgat atatatctga atataattct tttcataata tgataacata tttgagattt 2040

ttagacacat gtcatatcta atctgataaa ttctaccatc aaatttaata tctaagcaat 2100

tatagtatta tcatatacca aatactgtaa tctctcatag tcaaatatat tcaaaatgac 2160

tcatcaatta attccatata ttaaaattca tagtaaagac agaattatat gaccgtacat 2220

cgtctctata gtctctgcca agtgccaatt taccatttga agaagacacg tgggtcataa 2280

tctaggagac gttatatatg gttacgtttt ttaccctaat ttgtttcaat attatgatga 2340

tctgtattca aaccccattc ttcttgatgt gcatcacttt aattaaatag atccaaaata 2400

gcaaacaaaa tctagcacaa ataaatacca tttaccaacg gctaacaaat ggtgaaaata 2460

tatgaagatt ccatatttga tcgtttttgg tatatctaca tacgtgttca cattttcaag 2520

attgctaaaa acttctcact gatacacatc tccatttccg gatatgagta tataaataca 2580

aatcaccatc gaaaccaaga acatcacaat taaacacaca ccagagagaa tctatcaaac 2640

taaacacaag aaatggagac cgtagtg 2667

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggaagcttgc ttccaaagga tctatgtggc g 31

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcggatcccc acataactcg actccatttc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggatcgatct ccttctccgc ctcatcattc 30

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctctagaat agctcagaga aagagggaag taaa 34

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggaagcttcc gccactgagt tgtgcttg 28

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcctcgagca ctacggtctc catttcttgt gtttag 36

Claims (10)

1.如下a)-d)中任一项所述的DNA片段在促进拟南芥体细胞胚直接发生中的应用；所述体细胞胚直接发生是指直接在拟南芥的子叶上生成体细胞胚；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

d)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过上调a)-d)中任一项所述的DNA片段的表达，以促进植物体细胞胚的直接发生。

3.如下1)-4)中任一项所述的蛋白在促进拟南芥体细胞胚直接发生中的应用；所述体细胞胚直接发生是指直接在拟南芥的子叶上生成体细胞胚；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

3)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

4)在SEQ ID NO.4所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过上调1)-4)中任一项所述的蛋白的表达量和/或活性，以促进植物体细胞胚的直接发生。

5.携带权利要求1所述的DNA片段的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在促进拟南芥体细胞胚发生中的应用；所述体细胞胚直接发生是指直接在拟南芥的子叶上生成体细胞胚。

6.一种诱导体细胞胚直接发生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求1所述的a)-d)中任一项所述的DNA片段导入到出发植株拟南芥中，筛选出转基因阳性植株后进行体细胞胚的诱导培养，直接在拟南芥的子叶上生成体细胞胚。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的方法为：将转基因阳性植株的种子置于含有雌二醇的1/2MS培养基上，春化处理打破休眠，春化结束后进行光照培养；种子萌发后4-6天，将幼苗移至新的含有雌二醇的1/2MS培养基上，继续培养至在幼苗的子叶上生成体细胞胚。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述1/2MS培养基中含有雌二醇的浓度为10μmol/mL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述春化处理的条件为：4℃春化处理3天。

10.一种人工种子的生产方法，将权利要求1所述的a)-d)中任一项所述的DNA片段导入到拟南芥细胞、组织、器官或拟南芥植株中，获得体细胞胚，利用获得的体细胞胚生产人工种子。