CN111704673B

CN111704673B - 标记微丝骨架的融合蛋白及编码基因、转基因豆科植株的构建方法

Info

Publication number: CN111704673B
Application number: CN202010627524.9A
Authority: CN
Inventors: 王显玲; 邱天麒; 郭南南; 康宗利; 岳剑茹; 赫云建; 韩雪萍; 张少斌
Original assignee: Shenyang Agricultural University
Current assignee: Shenyang Agricultural University
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: CN111704673A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及标记微丝骨架的融合蛋白及编码基因、转基因豆科植株的构建方法，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，同时，本发明还涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列、含有所述序列的植物表达载体、重组农杆菌以及转基因豆科植株的构建方法，将所述重组农杆菌转化豆科植物，能够筛选获得标记豆科植物体内微丝骨架的转基因豆科植物，同时，双mCherry标签能够使红色荧光信号更强。

Description

标记微丝骨架的融合蛋白及编码基因、转基因豆科植株的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及标记微丝骨架的融合蛋白及编码基因、转基因豆科植株的构建方法。

背景技术

植物微丝骨架是由肌动蛋白组成的螺旋纤维，在细胞内很容易聚合解聚。微丝在维持细胞形状、细胞质流动、染色体运动、胞质分裂、物质运输等方面发挥着至关重要的作用。细胞内的微丝是高度动态的，它在很多细胞学过程中起作用也依赖于其动态的骨架结构与许多调节蛋白和马达蛋白的相互作用，因此，想要了解微丝骨架是如何在各种细胞学过程中起作用的，就需要对植物细胞中的微丝组织动态变化进行观察。与微管骨架不同，微丝骨架无法利用传统的嵌入技术去标记，利用显微注射技术将荧光标记的phalloidin(鬼笔环肽，一共稳定微丝的药剂)注射到植物细胞内可以观察到微丝的动态特点，但大部分的细胞类型无法用这种方法标记，即使可以标记的细胞，微丝骨架也大都处于稳定的状态，并不能真实的反应细胞内微丝骨架的状态。因此研究者开始利用不同的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)与微丝骨架融合后来观察植物活细胞中的微丝，最早广泛使用的是小鼠的talin(GFP-mTalin)或者人的talin(GF P-hTalin)转入植物中标记微丝骨架，但是由于是异源表达，所以植物细胞中的很多微丝都不能被标记出来，而且很多被标记出来的微丝骨架也导致了微丝聚合的状态，因此，GFP-mTalin转入到植物体内并不能准确地标记植物细胞中微丝骨架的组织动态变化。

目前没有豆科植物内源基因来标记植物体内微丝骨架的材料，多利用将拟南芥基因转入苜蓿中来标记微丝，另外，目前的苜蓿中微丝骨架的标记利用35S启动子，造成其在植物体内过表达程度较高，并不能完全真实的反映植物体内微丝骨架的组织动态。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种融合蛋白及编码基因、转基因豆科植株的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的目的之一是提供一种标记微丝骨架的融合蛋白，所述融合蛋白为mCherry-MedtrfABD2-mCherry，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；构建编码所述融合蛋白基因的表达载体，转化豆科植物，能够获得标记豆科植物体内微丝骨架的转基因豆科植物。

本发明的目的之二是提供一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2301-4760位所示。

本发明的目的之三是提供一种植物表达载体，包含所述的核苷酸序列。

本发明的目的之四是提供一种重组农杆菌，包含所述的植物表达载体，

进一步的，所述重组农杆菌构建方法，如下：

将根癌农杆菌EHA105感受态细胞与所述植物表达载体混合，置于冰上孵育30min，液氮速冻2min，37℃恢复3-5min，加入1mL液体YEB培养基，28℃180rpm震荡培养4h，收集菌体，在含有终浓度为50mg/L壮观霉素和100mg/L利福平的YEB固体培养基上，28℃培养36h。挑取单克隆摇菌，利用PCR和酶切检测鉴定阳性克隆，获得重组农杆菌。

本发明的目的之五是提供一种转基因豆科植株的构建方法，包括如下步骤：

S1、利用所述重组农杆菌转化豆科植株，记作T0代，其种子记作T1代；

S2、T1代种子经卡那霉素筛选得到抗性苗，记作T2代；

S3、T2代种子经卡那霉素筛选，出现全存活比例时，得到的存活植株为纯合T3代转基因植株，即转基因豆科植株。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、目前没有豆科植物内源基因来标记植物体内微丝骨架的材料，多利用将拟南芥基因转入苜蓿中来标记微丝，另外，目前的苜蓿中微丝骨架的标记利用35S启动子，造成其在植物体内过表达程度较高，并不能完全真实的反映植物体内微丝骨架的组织动态。本发明通过克隆豆科模式植物蒺藜苜蓿R108植株中fimbrin基因的启动子及其actin bindingdomain2结构域，构建连接双mChe rry标签的双元表达载体转化到蒺藜苜蓿、百脉根和大豆等豆科植物中来标记豆科植物体内微丝骨架的真实状态，同时，双mCherry标签能够使红色荧光信号更强。

2、本发明利用豆科模式植物蒺藜苜蓿R108内源fimbrin基因、同时由基因自身启动子启动的过表达程度较弱的植物来尽可能真实的标记出植物体内微丝骨架的状态，同时为了增强荧光信号的强度，本发明在MedtrfABD2的N末端和C末端分别各连接一个mCherry荧光蛋白，构建好的载体转化豆科植物，获得的纯合体可以更准确的标记豆科植物中的微丝骨架进而方便对共生固氮过程中侵染线形成的机理进行研究。

附图说明

图1为PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry/EHA105载体的图谱示意图。

图2为转基因苜蓿不同细胞表达表达mCherry-MedtrfABD2-mCherry结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的蒺藜苜蓿R108公众可从沈阳农业大学生物科学技术学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

根癌农杆菌EHA105(CraneC，WrightE，DixonRA，&WangZY.(2006).Trans genicmedicagotruncatulaplantsobtainedfromagrobacteriumtumefaciens-transformedrootsandagrobacteriumrhizogenes-transformedhairyroots.Planta，223(6)，1344-1354.)

mCherry-PUC和mCherry-PZP211载体根据东北师范大学王树才教授课题组赠送的PUCHA和PZP211GFP载体改造获得。

克隆mCherry基因序列，连接T载体，利用NcoI/NdeI酶切PUCHA载体、利用SacI/EcoRI酶切PZPGFP载体，将载体中的HA标签和GFP标签切掉替换为mCherry序列，得到mCherry-PUC和mCherry-PZP211载体，公众可从沈阳农业大学生物科学技术学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1

一种植物表达载体

其构建方法包括如下步骤：

人工合成SEQ ID NO.1所示的名称为fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry的DNA分子。SEQ ID NO.1中，第1-2300位是fimbrin基因的启动子；SEQ ID NO.1的第2301-4760位是mCherry-MedtrfABD2-mCherry融合基因，该融合基因的编码序列编码SEQID NO.2所示的融合蛋白mCherry-MedtrfAB D2-mCherry；SEQ ID NO.1的第2301-3008位是N端mCherry的编码基因，其编码SEQ ID NO.2的第1-236位所示的mCherry；SEQ ID NO.1的第3009-4052位是苜蓿微丝结合蛋白fimibrin的微丝结合域2(MedtrfABD2)的编码基因，其编码SEQ ID NO.2的第237-582位所示的苜蓿MedtrfABD2蛋白；SEQ ID NO.1的第4053-4760位是C端mCherry的编码基因，其编码SEQ ID NO.2的第583-818位所示的mCherry。

具体步骤如下：

(1)构建中间载体MedtrfABD2-T

以苜蓿R108野生型cDNA为模板，克隆MedtrfABD2基因序列，经过琼脂糖凝胶电泳后，切回具有MedtrfABD2片段的胶块。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，回收纯化MedtrfABD2目的片段。使用PGM-T试剂盒(天根)将名称为MedtrfABD2与克隆载体T载体连接，得到中间载体MedtrfABD2-T。

取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约10min)；加入中间载体MedtrfABD2-T，在冰上放置30min；42℃热激90s迅速置于冰上冷却2min；加入LB培养基，37℃200rpm培养1h；收集菌体，在终浓度为50mg/L羧苄的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落于3mLLB培养基中，200rpm培养过夜。以菌液为模板，利用PCR检测阳性克隆。选取阳性菌株用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提出质粒MedtrfABD2-T，送公司测序(上海生工)，测序结果表明MedtrfABD2-T中含有MedtrfABD2的DNA分子。

(2)构建mCherry-PUC载体

mCherry-PUC载体是将PUCHA载体中的HA标签用限制性内切酶NcoI和NdeI酶切掉替换为mCherry得到的，具体方法如下：

克隆mCherry基因序列，经过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收mCherry片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)，回收纯化mCherry目的片段。使用PGM-T试剂盒将名称为mCherry的DNA分子连接于T载体，得到名称为中间载体mCherry-T。取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约10min)；加入载体mCherry-T，在冰上放置30min；42℃热激90s迅速放冰上冷却2min；加入LB培养基，37℃200rpm培养1h；收集菌体，在终浓度为50mg/L羧苄的LB固体培养基上，37℃培养12小时。挑取菌落于3mLLB培养基中，200rpm培养过夜。以菌液为模板，利用PCR检测阳性克隆。选取阳性菌株用质粒提取试剂盒(SanPrep)提出质粒mCherry-T，限制性内切酶NcoI和NdeI酶切mCherry-T质粒，琼脂糖凝胶电泳后观察mCherry条带大小。选取阳性菌株用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提出质粒mCherry-T，送上海生工公司测序，测序结果表明mCherry-T中含有mCherry的DNA分子。

利用限制性内切酶NcoI和NdeI(Takara)对mCherry-T和PUCHA载体进行双酶切，37℃酶切反应4h，回收mCherry片段和PUC载体，利用T4DNA连接酶(Takara)将mCherry与PUC载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，利用PCR和酶切检测鉴定阳性克隆，获得mCherr y-PUC载体。

(3)利用限制性内切酶NcoI和NdeI(Takara)对mCherry-T和PUCHA载体进行双酶切，37℃酶切反应4h，回收mCherry片段和PUC载体，利用T₄-D NA连接酶(Takara)将mCherry与PUC载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞，挑取单克隆，利用PCR和酶切检测鉴定阳性克隆，获得mC herry-PUC载体。

将MedtrfABD2-T与mCherry-PUC用限制性内切酶NdeI和SacI进行双酶切，回收含有MedtrfABD2的片段与mCherry-PUC载体，利用T₄-DNALigase将MedtrfABD2片段与mCherry-PUC载体连接。

取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约10min)；加入载体PUCmCherry-MedtrfABD2，在冰上放置30min；42℃热激90s迅速放冰上冷却2min；加入LB培养基，37℃200rpm培养1h；收集菌体，在终浓度为50mg/L羧苄的LB固体培养基上，37℃培养12小时。挑取菌落于3mL LB培养基中，200rpm培养过夜。以菌液为模板，利用PCR检测阳性克隆。选取阳性菌株用质粒提取试剂盒(SanPrep)提出质粒MedtrfABD2-PUCmCherry，用限制性内切酶NdeⅠ、SacⅠ酶切PUCmCherry质粒，琼脂糖凝胶电泳后观察MedtrfABD2条带大小与PUCmCherry条带大小。将MedtrfABD2-PUCmCherry送公司测序(上海生工)，测序结果表明PUCmCherry载体中含有MedtrfABD2的DNA分子。

(4)将构建好的MedtrfABD2-PUCmCherry载体中的35S启动子替换为蒺藜苜蓿fimbrin的启动子，构建为fimbrinPro::mCherry-PUC载体，具体方法如下：

提取蒺藜苜蓿R108植株基因组DNA，克隆fimbrin基因的启动子，即fimbrin基因ATG上游2300bp，克隆得到的序列经过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收fimbrinPro片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)，回收纯化fimbrinPro目的片段。利用PstI和NcoI双酶切MedtrfABD2-PUCmCherry载体，经过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收MedtrfABD2-PUCmCherry载体，将回收纯化的fimbrinPro片段与PUCmCherry载体利用T₄-DNALigase连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，利用PCR和酶切检测鉴定阳性克隆，获得fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-PUC载体。

(5)构建mCherry-PZP211表达载体

克隆mCherry基因序列，经过琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收mCherry片段，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)，回收纯化mCherry目的片段。使用PGM-T试剂盒将名称为mCherry的DNA分子连接于T载体，得到名称为中间载体mCherry-T。取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约10min)；加入载体mCherry-T，在冰上放置30min；42℃热激90s迅速放冰上冷却2min；加入LB培养基，37℃200rpm培养1h，收集菌体，在终浓度为50mg/L羧苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时。挑取菌落于3mLLB培养基中，200rpm培养过夜。以菌液为模板，利用PCR检测阳性克隆。选取阳性菌株用质粒提取试剂盒(SanPrep)提出质粒mCherry-T，限制性内切酶SacI和EcoRI(Takara)酶切mCherry-T质粒，琼脂糖凝胶电泳后观察m Cherry条带大小。选取阳性菌株用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提出质粒mCherry-T，送上海生工公司测序，测序结果表明mCherry-T中含有m Cherry的DNA分子。

利用限制性内切酶SacI和EcoRI对mCherry-T及PZP211GFP载体进行双酶切，37℃酶切反应4h，回收mCherry片段及PZP211载体，利用T4DNA连接酶(Takara)将mCherry与PZP211进行连接。取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约10min)；加入载体mCherry-PZP211，在冰上放置30min；42℃热激90s迅速放冰上冷却2min；加入LB培养基，37℃200rpm培养1h，收集菌体，在终浓度为50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时。挑取菌落于3mL LB培养基中，200rpm培养过夜。以菌液为模板，利用PCR检测阳性克隆。选取阳性菌株用质粒提取试剂盒(SanPrep)提出质粒mCherry-PZP211，限制性内切酶SacI和EcoRI酶切mCherry-T质粒，琼脂糖凝胶电泳后观察mCherry条带大小。选取阳性菌株用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提出质粒mCherry-PZP211，送上海生工公司测序，测序结果表明mCherry-PZP211中含有mCherry的DNA分子。获得mCherry-PZP211载体。

将fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-PUC和mCherry-PZP211载体用限制性内切酶PstI和SacI进行双酶切，37℃酶切反应4h，回收fimbrinPro::mCherr y-MedtrfABD2片段和mCherry-PZP211载体，利用T₄-DNA连接酶(Takara)将f imbrinPro::mCherry-MedtrfABD2与mCherry-PZP211进行连接。取出-80℃冻存的DH5α大肠杆菌感受态细胞，置冰上使其缓慢融化(约10min)；加入质粒P ZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry，在冰上放置30min；42℃热激90s迅速放冰上冷却2min；加入LB培养基，37℃200rpm培养1h，收集菌体，在终浓度为50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时。挑取菌落于3mL LB培养基中，200rpm培养过夜。以菌液为模板，利用PCR和双酶切检测阳性克隆，获得PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry载体。

实施例2

一种重组农杆菌

其构建方法如下：

将根癌农杆菌EHA105感受态细胞与PZP211-fimbrinPro::mCherry-Medtrf ABD2-mCherry质粒混合，置于冰上孵育30min，液氮速冻2min，37℃恢复3-5min，加入1mL液体YEB培养基，28℃180rpm震荡培养4h，收集菌体，在含有终浓度为50mg/L壮观霉素和100mg/L利福平的YEB固体培养基上，28℃培养36h。挑取单克隆摇菌，利用PCR和酶切检测鉴定阳性克隆，获得含有P ZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry表达载体的重组农杆菌，命名为PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry/EHA105，图谱示意见图1，得到用来遗传转化豆科植物的侵染细菌。

实施例3

一种转基因豆科植株-转基因苜蓿

其构建方法如下：

苜蓿的遗传转化采用叶盘转化法。将活化的PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry/EHA105在终浓度50mg/L壮观霉素和终浓度100mg/L利福平2mLYEB液体培养基中30℃(200rpm)摇瓶培养过夜；1-2mL过夜的菌液转移至盛有30mLYEB液体培养基的200ml锥形瓶中扩增培养后，OD600nm应达到0.6。3000g离心2min收集菌体，用50mL无菌的SH3a培养基重悬。转化时选择4到6周龄离体培养或者温室中培养的植物的叶子。温室生长的叶子放入50mL的离心管中(20-30片叶子一管)第一遍清洗叶子用加入离子去垢剂(Teepol)的水冲洗2-3遍。将管颠倒数次，保证叶子全部浸没，用自来水冲洗。用次氯酸钠溶液代替水，轻轻混合，并且在试管架上盖上管口放置7min，将管放回工作台再等待7min。无菌条件下，用无菌水冲洗叶片三次在相同的50mL离心管管中。将叶子放入盛有30ml无菌水的培养皿中，用无菌的刀将叶子边缘去掉，切割成方形。将切好的叶子放入农杆菌菌液中，在无菌的空间中操作(20-30片叶子放入50mL的农杆菌菌液中)，摇动管，将叶子在菌液中均匀散落。用农杆菌在SH3a溶液中的叶外植体在650psi下施加20分钟的真空。释放真空后，将真空烧瓶置于室温下的摇动(50-60rpm)台上1-2小时，以允许组织从输注过程中恢复。在超净工作台中，将外植体转移至空的9cm培养皿中，用移液枪最大程度的吸取菌液。在无抗生素的情况下将叶外植体转移到固体SH3a培养基中。叶外植体的下侧(AB轴向)应与培养基接触。然后用医用的胶带密封平板，并在植物生长培养室(24℃)黑暗条件培养2天。将叶片外植体从培养基中取出，在新鲜固体(SH3a或SH9)培养基上轻轻擦拭，以去除外植体上生长的多余细菌。叶外植体转移到具有800mg/L安灭菌(以根除农杆菌)的新的SH3a培养基中。用塑料板密封，置于黑暗中(24℃)，持续5～6周，定期查看是否染菌。在侵染的2周后出现愈伤组织材料。这些愈伤组织每2-3周转入新的S H3a培养基。然后每3周将愈伤组织转移到新的SH9培养基中，直到预胚胎出现(在该培养基中3-6周之间)。从愈伤组织中，预胚将在20-30天内在SH9培养基上发育成真胚。胚胎形成后2-3周左右，植株从胚胎开始发育。将其移入1/SH9培养基，诱导生根。开始生根时，植株转移到1/2SH9培养皿中。它将垂直放置(或45°倾斜)在生长室，琼脂的量提高到9g/L，以更好地固化培养基。在此培养基上生根需要2-6周。从体外条件转移到温室的植物材料对湿度条件的变化非常敏感。在水分饱和的条件下，保持植物生长，然后逐步适应正常的温室条件。在1/2SH9培养基上开发了几叶和根的小植株被移植到含有被透明盖覆盖的已灭菌(或清洁)的托盘中。在前两周期间，用自来水冲洗植物，随后用培养基液对植物浇水。在盆下放一个托盘，使其保持在水中。土壤保持潮湿的。在盆中生长的前5天，盖子保持关闭，以将植物保持在充满湿润气体的环境中。然后逐渐打开盖子以缓慢地减少湿度。在第二周结束时，盖子可以完全移除。然后用培养液和水交替浇水。当这些植物在温室条件下长出新的叶子时，它们可以移入土壤和沙子混合的盆栽中。我们称这些植物为T0代植物。如果它们发育正常，应该在2-3个月后播种。培养室温度24度，光照16h，黑暗8h。T0代转基因植株的种子为T1代种子，将T1代种子种在具有卡那霉素与潮霉素抗性的培养基上，会得到3:1分离比的T2代植株，将存活的植株移到土中正常条件培养，单株收取种子，收取的种子为T2代种子。当把每株T2代种子种在具有抗性的培养基上，出现全存活的比例时，得到的存活植株为纯合T3代转基因豆科植株。

实施例4

转基因豆科植株表型研究

转基因苜蓿植株的生长状态与野生型蒺藜苜蓿R108植株并没有明显的区别，说明转化PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry表达载体并不影响植株的生长，可以用于标记豆科植物细胞内微丝骨架。

对获得的8个T3代纯合的转PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-m Cherry苜蓿株系，每个株系选取3株进行以下观察

在激光共聚焦显微镜(LeicaA1，Leica公司)(激发光561nm)下观察植株的叶表皮细胞、下胚轴细胞、根尖伸长区细胞和根毛细胞。结果如图2所示，结果发现8个T3代纯合的转PZP211-fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry苜蓿R108株系的所有植株的所有叶表皮细胞、下胚轴细胞、根尖伸长区细胞和根毛细胞中都表达了mCherry-MedtrfABD2-mCherry融合蛋白，且荧光信号较强。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 标记微丝骨架的融合蛋白及编码基因、转基因豆科植株的构建方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4760

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagattgat tgaagtcgtc atattaagaa aaagtcttag agtttcgtgt cctgtctttg 60

ttatttgtat acctctttat gttgcttaga tgcatagagc tggtttgttt agttgaattg 120

tattattgtc atttgtacac cgctttagtg catgttgcaa gagttggttt gtttattgga 180

gttgttttcc tattttgatt gtaattgtga ttgagccaat agttggggat aaaggttgag 240

aaaaagtgag acgagatctc atatctaggt gtcaaagtag tgaacaatgt ttgttcacgt 300

aagactacag agcaatacta taagagtgtt ttcctttctt ggtatggata cccccagatg 360

taggtgacat tgcaccgaac tggattacca aatctcatgt gtttttttct ttattgcact 420

ttactttaat tgtttattgt ttattgtgat gcattgtcgt acatgttgtc taggacttca 480

ttcttgtcga acctgttgtc taggatattt gtccagtgag cgccataatt tcaattggca 540

tcagagcaga cactctgtta tgtttttggg tgagctccaa ggttagatga attctggtca 600

tatggacaac tcgaagaaag gaggatatat taatatacca tcgattttag atggtaccaa 660

ctatgactat tagaaggctc gcatggtggt ttttctcata tccatggata gcaagacatg 720

gaaagctatc atgaaaggtt gacaacatcc tgcgattatt gataaagatg gaaatactac 780

atttacctca aaaccagaag aagactggcc taaagatgag gacgaactag ctcttggaaa 840

ttctaaagca tcaaatgcct tattcaatgg tgttgacaag aacatgttta gattgataaa 900

cacttgcatt gtggcaaaag atgtgggaga aatccccaaa actactcatg aaagcaccgc 960

taaagtgcgt atgtcaaggc tccaactcct tactaccaag tatgaaaacc ttagaatgaa 1020

tgatgatgaa accattcatg actttcacat gagtattata aatattgcta atactttccg 1080

tgccttggga gaaacgatgt cagaagaaaa actggttaag aaaatcctaa tatctttact 1140

taagaagtat ggcatgaaag tcacaacaat tgaggaagcc aaaaacttaa gcaacatgaa 1200

ggtagatgaa ctcattgggt taattagata aacttaatat taaataataa gttttatcga 1260

gtgtgcattt aattcaaagg atatttttat actgttcaac acaacaacat ttttttttat 1320

ttctctcttc ttctatttct attgtactaa ataatacatt aaatttaggg ttaattatgt 1380

ctctggtctt tataaaattt tcaaatttca agttttagtc tttataagtt ttttcatcaa 1440

tttttggtcc ctaaaaaatt ttccgtcaca acttttgatc tctacattta aataaaatca 1500

tgtgtatcat tcaaaatttt gtattatttt ttatggtcat gtttagtata gaaatctctc 1560

ttgtaaaagt ttaatttttt ttttaacaag tgatgattta aatatgaatt ttttaagttt 1620

taagcgctta aaattcatat ttaattaatt catatcttgt taaaaaattc aaattttatg 1680

tagaagagat tgtttgtcaa aaaaaatgta gaagaaattg ttataatatt gtaaacatct 1740

tgataaaaat tcatttaaaa atatgaagga tacacatgat ttgatttaaa gaccgcaaca 1800

ataaatgacg atagattttc tttaaagaaa ttatgtacca tatttaaccc ttaaatctat 1860

tatatttttc acatacttcc atcttctcaa aatctctcac gctttccctc ttcacaccca 1920

aacacatcat taatgtgttt atgggacatt tattaaaata attgttgctt aatcatcatc 1980

acttggttcc aaatccaatc cgaggcctag ctgttgcaag gtccaggatc atgatgttga 2040

taagtgtatt tttgtgagat gacaacattc aattcaagtc acaactcaac atttcaacct 2100

tttataacac aaatcaaacg taataagata tgagaaatct tgtccaaaaa ataaaaagat 2160

aataagagaa ataaaagtcg gttgtagaaa agaaaagaac aaaattgtta tagaccaaag 2220

agaatgacgt gtgtgaacca taaagctagc ttagttattc aacatgtcac gcgcgcaaca 2280

acaacaacaa caacgtggga atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca 2340

aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga 2400

tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga 2460

ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct 2520

ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg 2580

agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc 2640

aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact 2700

tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc 2760

ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg 2820

acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc 2880

tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca 2940

ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc 3000

tgtacaagat ggacattacc gagggcacct caaatcttaa tcttgcattt gtcgcacaat 3060

tatttcatca caggagtggc ctatcgaccg atactaaaaa gatgtcatat gctgagatga 3120

taacagaaga tgtgcaaaca tgtagagaag agagatgctt taggatgtgg atcaatagtc 3180

ttggaatttc tactcgtgta aataatctat ttgaggatgt cagaaacgga tggatacttc 3240

tagaagttct agacaagatt tttcctgaat cagttaactg gaaacaggca acaaggcctc 3300

caattagaat gccatttaga aaagtagaga actgcaatca agtcataaga gtcggtaaac 3360

aactaaaatt ctcactagtc aatgtagctg gcaatgatat tgtgcaagga aataagaagc 3420

tcattcttgc tttattgtgg cagttgatga gattcacaat gcttcaactg ttgagaaatt 3480

tgagatctca ttcccaagga aaggagataa gtgatgctga tattcttaaa tgggcaaaca 3540

gaaaagtgaa tagcattgga agaacgtctc gcattcagag tttcaaggat aagagcttgt 3600

caagtggact cttcttcctg gagcttctca gtgcagtaga gccaagggtt gtcaactgga 3660

acctagtgac aaagggtcaa agtgatgatg agaagaagtt gaacgccact tacataatca 3720

gtgtcgcacg aaagcttggt tgttccatat atctgttacc tgaggatatt atggaggtta 3780

atcagaagat gattctgact cttgcagcca gtataatgta ttggagtctc caacaacaga 3840

ccgaagacga agattcattt ccttcacctg ctagcactct cactaccaac acacctgaag 3900

cttcccctgc cccttccgtt tgcggtgaag atgaaagtta ttcatccctt aatggtgatt 3960

tatccaactt gagtgttgac gataccactt ctgatacaac agtctcttca caacttgaat 4020

ttgatggcgt tgctgtcggt gatgagttat atatggtgag caagggcgag gaggataaca 4080

tggccatcat caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc 4140

acgagttcga gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca 4200

agctgaaggt gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt 4260

tcatgtacgg ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc 4320

tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg 4380

tgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc 4440

gcggcaccaa cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg 4500

cctcctccga gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc 4560

tgaagctgaa ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga 4620

agcccgtgca gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca 4680

acgaggacta caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg 4740

gcatggacga gctgtacaag 4760

<210> 2

<211> 818

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

MET Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn MET Ala Ile Ile Lys Glu Phe MET Arg

1 5 10 15

Phe Lys Val His MET Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly

20 25 30 35

Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr

40 45 50

Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe MET Tyr

55 60 65 70

Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu

75 80 85 90

Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val MET Asn Phe Glu Asp Gly Gly

95 100 105

Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys

110 115 120 125

Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val MET Gln Lys Lys

130 135 140

Thr MET Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg MET Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu

145 150 155 160

Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala

165 170 175 180

Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr

185 190 195

Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val

200 205 210 215

Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly MET Asp Glu Leu

220 225 230

Tyr Lys MET Asp Ile Thr Glu Gly Thr Ser Asn Leu Asn Leu Ala Phe Val Ala

235 240 245 250

Gln Leu Phe His His Arg Ser Gly Leu Ser Thr Asp Thr Lys Lys MET Ser Tyr

255 260 265 270

Ala Glu MET Ile Thr Glu Asp Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu Arg Cys Phe Arg

275 280 285

MET Trp Ile Asn Ser Leu Gly Ile Ser Thr Arg Val Asn Asn Leu Phe Glu Asp

290 295 300 305

Val Arg Asn Gly Trp Ile Leu Leu Glu Val Leu Asp Lys Ile Phe Pro Glu Ser

310 315 320

Val Asn Trp Lys Gln Ala Thr Arg Pro Pro Ile Arg MET Pro Phe Arg Lys Val

325 330 335 340

Glu Asn Cys Asn Gln Val Ile Arg Val Gly Lys Gln Leu Lys Phe Ser Leu Val

345 350 355 360

Asn Val Ala Gly Asn Asp Ile Val Gln Gly Asn Lys Lys Leu Ile Leu Ala Leu

365 370 375

Leu Trp Gln Leu MET Arg Phe Thr MET Leu Gln Leu Leu Arg Asn Leu Arg Ser

380 385 390 395

His Ser Gln Gly Lys Glu Ile Ser Asp Ala Asp Ile Leu Lys Trp Ala Asn Arg

400 405 410

Lys Val Asn Ser Ile Gly Arg Thr Ser Arg Ile Gln Ser Phe Lys Asp Lys Ser

415 420 425 430

Leu Ser Ser Gly Leu Phe Phe Leu Glu Leu Leu Ser Ala Val Glu Pro Arg Val

435 440 445 450

Val Asn Trp Asn Leu Val Thr Lys Gly Gln Ser Asp Asp Glu Lys Lys Leu Asn

455 460 465

Ala Thr Tyr Ile Ile Ser Val Ala Arg Lys Leu Gly Cys Ser Ile Tyr Leu Leu

470 475 480 485

Pro Glu Asp Ile MET Glu Val Asn Gln Lys MET Ile Leu Thr Leu Ala Ala Ser

490 495 500

Ile MET Tyr Trp Ser Leu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Asp Ser Phe Pro Ser

505 510 515 520

Pro Ala Ser Thr Leu Thr Thr Asn Thr Pro Glu Ala Ser Pro Ala Pro Ser Val

525 530 535 540

Cys Gly Glu Asp Glu Ser Tyr Ser Ser Leu Asn Gly Asp Leu Ser Asn Leu Ser

545 550 555

Val Asp Asp Thr Thr Ser Asp Thr Thr Val Ser Ser Gln Leu Glu Phe Asp Gly

560 565 570 575

Val Ala Val Gly Asp Glu Leu Tyr MET Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn MET

580 585 590

Ala Ile Ile Lys Glu Phe MET Arg Phe Lys Val His MET Glu Gly Ser Val Asn

595 600 605 610

Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr

615 620 625 630

Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

635 640 645

Ile Leu Ser Pro Gln Phe MET Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala

650 655 660 665

Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg

670 675 680

Val MET Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu

685 690 695 700

Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser

705 710 715 720

Asp Gly Pro Val MET Gln Lys Lys Thr MET Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg

725 730 735

MET Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu

740 745 750 755

Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys

760 765 770

Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

775 780 785 790

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg His

795 800 805 810

Ser Thr Gly Gly MET Asp Glu Leu Tyr Lys

815 820

Claims

1.一种融合基因在构建转基因苜蓿植株中的用途，其特征在于，所述融合基因为fimbrinPro::mCherry-MedtrfABD2-mCherry，具有如SEQ ID NO.1所示的序列，SEQ IDNO.1中，第1-2300位是fimbrin基因的启动子，第2301-4760位是mCherry-MedtrfABD2-mCherry融合基因，第2301-3008位是N端mCherry的编码基因，第3009-4052位是苜蓿微丝结合蛋白fimibrin的微丝结合域2的编码基因，第4053-4760位是C端mCherry的编码基因；

所述转基因苜蓿植株的所有叶表皮细胞、下胚轴细胞、根尖伸长区细胞和根毛细胞均表达SEQ ID NO.2所示mCherry-MedtrfABD2-mCherry融合蛋白，且发射荧光信号。

2.一种植物表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的SEQ ID NO.1所示的序列。

3.一种重组农杆菌，其特征在于，包含权利要求2所述的植物表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组农杆菌的构建方法，其特征在于，如下：

将根癌农杆菌EHA105感受态细胞与权利要求2所述植物表达载体混合，置于冰上孵育30min，液氮速冻2min，37℃恢复3-5min，加入1mL液体YEB培养基，28℃180rpm震荡培养4h，收集菌体，在含有终浓度为50mg/L壮观霉素和100mg/L利福平的YEB固体培养基上，28℃培养36h；挑取单克隆摇菌，利用PCR和酶切检测鉴定阳性克隆，获得重组农杆菌。

5.一种转基因苜蓿植株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、利用权利要求4构建的重组农杆菌转化苜蓿植株，记作T₀代，其种子记作T₁代；

S2、T₁代种子经卡那霉素筛选得到抗性苗，记作T₂代；

S3、T₂代种子经卡那霉素筛选，出现全存活比例时，得到的存活植株为纯合T₃代转基因植株，即转基因苜蓿植株。