CN108267435A - 基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法 - Google Patents

Abstract

细胞骨架蛋白在细胞的生命活动中起到非常重要的支撑作用，是细胞运动和分裂的基础。对于微丝骨架的标记和长时间观察可以获得细胞微丝骨架的亚细胞分布和动态行为，帮助我们理解微丝骨架的结构和功能。现存的各种标记方法无法同时实现活细胞、高分辨、长时程、无侵入、高特异、高稳定等特点，限制了其在活细胞微丝骨架标记和追踪中的应用。本发明使用一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，利用微丝骨架结合短肽LifeAct融合分裂的蛋白，在该融合蛋白不结合纤维状微丝骨架时不发荧光，在其结合时发光，实现活细胞内无荧光背景的微丝蛋白的标记和成像。新的微丝骨架的标记方法在正常以及病理和药理条件下哺乳动物细胞中有着广泛的应用。

Description

基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法

技术领域

本发明涉及一种新的细胞内微丝骨架F-actin的探针开发和标记方法，及其在细胞生物学和细胞力学中的应用。属于细胞生物学领域。

背景技术

哺乳细胞中含有大量的细胞骨架蛋白用以支撑细胞的刚性结构。细胞各种生命活动的进行离不开细胞骨架的支持作用。细胞骨架是由丰富的蛋白纤维网络结构构成，贯穿细胞的每一个角落，不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动。如:在细胞分裂中细胞骨架牵引姐妹染色单体的分离，在细胞物质运输中，各类囊泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运，细胞外基质刺激细胞的信号传递。在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统。在白细胞的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架还可以指导细胞壁的合成。细胞骨架主要包括微管，微丝和中间纤维，广义的细胞骨架还包括核基质、核纤层和细胞外基质，形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。细胞在病理情况下常常会出现细胞骨架系统异常。微管减少、解聚、细胞骨架异常等可增强癌细胞的运动能力，会导致肿瘤的恶性转移和转化。在脑神经元中有大量扭曲变形的微管和大量受损的中间纤维，则会导致阿尔茨海默症。微丝束及其末端黏着斑的破坏以及肌动蛋白小体的形成，常常伴随肿瘤细胞的浸润和转移。此外，中间纤维的分布具有严格的组织特异性，绝大多数肿瘤细胞在发生转移后仍表现其原发肿瘤的中间纤维类型，可用来辅助判断肿瘤类型。

微丝是细胞骨架的一种，普遍存在于所有真核细胞中，是一个实心状的纤维，直径为4nm-7nm。一般细胞中含量约占细胞内总蛋白质的1％-2％，但在活动较强的细胞中可占20％-30％。微丝具有多种功能，在不同细胞中表现不同，在肌细胞组成粗肌丝、细肌丝，可以收缩，在非肌细胞中主要起支撑作用、非肌性运动和信息传导作用。微丝主要由肌动蛋白(actin)构成，和分子马达蛋白肌球蛋白(myosin)一起作用，使细胞运动。它们参与细胞的变形虫运动、植物细胞的细胞质流动与肌肉细胞的收缩等细胞生物学过程。

虽然细胞骨架是刚性的结构，但是并不表示细胞骨架是一成不变的。相反，细胞骨架同时是一个高度动态的结构，在细胞生命活动中，细胞骨架必须不断的重塑，聚合，解聚才能正常的发挥功能。细胞内的微丝蛋白主要以两种形式存在，单体化(G-actin)和聚合化(F-actin)。这两种形式的比例在时间和空间上被一系列信号转导蛋白高度调控，以适应细胞在不同条件下的生命活动的需要。所以发展活细胞细胞微丝骨架的标记技术和方法对理解细胞骨架的结构和功能的关系非常重要。

传统的微丝骨架的标记方法主要有如下四种。(1)Actin的融合蛋白。将Actin蛋白融合上荧光蛋白并在细胞内表达，就可以实现活细胞内actin蛋白的定位及动态研究。但这个方法容易影响actin的聚合解聚过程，干扰细胞内actin骨架的动态过程。同时该方法将单体和聚合的肌动蛋白都标记上，无法区别二者。(2)使用针对actin蛋白的免疫荧光。将荧光标记的一抗或者二抗送入固定并通透化的细胞中。但这个方法只能针对固定细胞操作，无法观察活细胞内的微丝蛋白的动态过程。同时该方法将单体和聚合的肌动蛋白都标记上，无法区别二者。(3)使用小分子染料鬼笔环肽(phalloidin)标记。鬼笔环肽只结合纤维状的聚合微丝蛋白，不结合单体的微丝蛋白，可以用之观测聚合微管的形态和分布。但是该方法只适用于固定细胞，无法实现活细胞的观察。同时，鬼笔环肽是一种剧毒生物碱，操作需要非常谨慎小心。(4)使用actin的结合蛋白标记。将actin的结合蛋白融合上荧光蛋白就可以观察活细胞内的actin分布。利用这种方法也可以区分单体和聚合的微丝蛋白。但是如果过表达actin的结合蛋白，存在较多的未结合actin的蛋白游离在细胞中，容易造成假阳性。

有鉴于此，目前需要开发可以实现活细胞内微丝蛋白骨架的新标记方法。本发明使用基于双分子荧光互补的HaloTag技术，结合小分子的actin蛋白结合多肽LifeAct，发展了新的活细胞微丝骨架标记技术。LifeAct是一个17氨基酸短肽链，来源于酵母菌蛋白，作为一个新型actin结合标记蛋白，它只结合纤维状的微丝蛋白，不结合单体的微丝蛋白。它独特的特性使之成为最好用的聚合状微丝蛋白的标记物。与已有的其他方法相比，LifeAct不仅可以对活细胞和固定细胞的聚合状微丝蛋白进行染色，而且无细胞毒性，不会影响活细胞的生物活动过程。直接在LifeAct上融合荧光蛋白，过多的Lifeact不结合微丝蛋白骨架，会游离在细胞质中，造成很高的背景荧光，干扰对活细胞内微丝骨架的观察过程。与直接在LifeAct上融合荧光蛋白不同，本发明使用分裂的HaloTag融合LifeAct，即每一个LifeAct只融合一个HaloTag的一端(LifeAct-HaloTag N或者LifeAct-HaloTag C)。而分裂后的HaloTag是没有酶活性，无法结合荧光染料，因此单个的未结合纤维状微丝蛋白骨架的LifeAct没有荧光产生。利用聚合状的微丝蛋白的周期性组成结构，当两个不同的LifeAct结合纤维状的聚合微丝时会把与之融合的两个分裂的HaloTag两端融合到一起去，形成一个完整的有酶活的HaloTag。HaloTag可以结合荧光染料，进而可以在活细胞内标记出纤维状的微丝蛋白。因为是通过actin的结合蛋白实现actin的标记，所以不会干扰actin的聚合解聚过程。而且所使用的标记方法为有机染料，不同于荧光蛋白，有机染料在一次激发过程中能释放出更多的光子，更亮。同时有机染料更稳定，能一定程度上抵抗光漂白，可以实现更长时间的观察过程。

综上所述，本发明所提供的基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法可以用于活细胞和固定细胞的微丝骨架的长时程无干扰成像观测。具有非常广阔的应用前景(说明书附图1)。

发明内容

本发明的技术目的是发展基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，可以实现活细胞内长时间无背景的标记和追踪细胞微丝骨架的目的，用以解决活细胞内难以稳健的标记纤维状的微丝骨架和动态观测的问题。利用双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，可以实现正常细胞和病理或者药理条件下的细胞中微丝骨架的标记和成像。

本发明公开一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，利用微丝骨架结合短肽LifeAct融合双分子荧光互补的蛋白，在该融合蛋白不结合纤维状微丝骨架时不发荧光，在其结合纤维状微丝骨架时发出荧光，从而实现活细胞内无荧光背景的微丝蛋白骨架的稳定标记和长时程成像。

本发明公开一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，所使用的体系可以是活细胞，也可以是固定细胞。当在活细胞中使用时可以观测细胞内纤维状微管骨架的结构，亚细胞定位，动态调控过程等。当在固定细胞中使用时，可以用来观测纤维状微管骨架的结构，亚细胞定位。

本发明公开一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，在具体实施过程中，可以根据需要灵活调整所用的双分子荧光互补蛋白。使用分裂的荧光蛋白可以简化操作过程，不需要向培养基中加入染料，可以在转染完后直接在显微镜下观察。同时可选的荧光蛋白较多，光谱很宽。使用分裂的自连接标签可以灵活更换不同的小分子透膜染料，同时荧光染料抵抗光漂白的特性可以长时间观察。

本发明所公开的一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，包括以下步骤(1)首先确定自连接标签或荧光蛋白的分裂位点。

(2)通过PCR扩增出分裂的两段蛋白。

(3)将分裂的蛋白的DNA扩增片段分别融合微丝骨架结合短肽LifeAct，连入具有表达框的载体，构建成质粒。

(4)将所构建的质粒转染哺乳动物细胞。

(5)加入染料(自连接标签)或直接(荧光蛋白)在显微镜下观察细胞微丝骨架的结构和动态。

附图说明

图1双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法示意图。以分裂的自连接标签HaloTag为例进行说明。在分裂的HaloTag蛋白融合LifeAct不结合纤维状微丝骨架时不发荧光，在其结合纤维状微丝骨架时发出荧光，从而降低成像背景。右上角虚线框内为图中间小虚线框的放大，表示一对分裂的HaloTag融合LifeAct结合纤维状的微丝骨架上的两个相邻的单体蛋白单元时可以组成完整的HaloTag，可以结合荧光染料，发出荧光。

图2双分子荧光互补标记细胞微丝骨架效果对比图。左图(A)为使用双分子荧光互补分裂的HaloTag蛋白融合LifeAct在活的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中标记纤维状微丝骨架的荧光图。右图(B)为使用完整的HaloTag蛋白融合LifeAct在活的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中标记纤维状微丝骨架的荧光图。所使用的染料为小分子透膜染料Janelia 549(JF549)。从图中可以看出，使用双分子荧光互补分裂的HaloTag蛋白融合LifeAct，不但可以看到较粗较长的纤维状微丝骨架，因为整个图像荧光背景的降低，较短的分支状的微丝骨架也可以明显被分辨。而使用完整HaloTag由于背景较高，只能看到较粗较长的微丝骨架，较短的分支状的微丝骨架无法被分辨出。

图3双分子荧光互补标记细胞微丝骨架与使用鬼笔环肽标记的微丝骨架完全共定位。左图(A)为使用双分子荧光互补分裂的HaloTag蛋白融合LifeAct在固定的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中标记纤维状微丝骨架的荧光图，所使用的染料为小分子透膜染料Janelia549(JF549)。中图(B)为使用鬼笔环肽在同一个固定的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中标记纤维状微丝骨架的荧光图，所使用的染料为Alexa Fluor 488(Alexa488)。右图(C)为A和B两个通道的叠加荧光图从图中可以看出A和B两个通道完全共定位，这表明使用双分子荧光互补标记细胞微丝骨架的新方法所标记的结构确实为纤维状微丝骨架。

图4使用双分子荧光互补标记细胞微丝骨架在正常或者加药处理的活的人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的动态过程。图(A)为正常细胞中微丝骨架在95分钟内的动态过程，可以看到在正常细胞生命活动中伴随的细胞微丝骨架的动态重塑过程，某些地方的细胞微丝骨架会解体，而某些地方会重新形成微丝骨架。图(B)为10μM Latrunculin B处理的细胞中微丝骨架在9.5分钟内的动态过程，微丝骨架迅速解体。

具体实施方式

本发明的技术目的是发展基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，其特征在于，可以实现活细胞内长时间无背景的标记和追踪细胞微丝骨架，可以解决活细胞内难以稳健的标记纤维状的微丝骨架和动态观测的问题。利用双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，可以实现正常细胞和病理或者药理条件下的细胞中微丝骨架的标记和成像。下面结合具体实施例进行说明。为了更清楚的阐述本发明的方法内容，现将本发明所涉及的产品和方法更进一步的总结如下，所涉及的实验数据、步骤或者合成方法等，属于本领域的常规技术，其并不对本专利的保护范围造成限制。这些具体的实施例只用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。

实施例一：一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，以所用的分裂的HaloTag为例进行说明，所使用的探针由以下步骤制备：

(1)先通过PCR从含有HaloTag的质粒上扩增出相应的HaloTag分裂片段，所使用分分裂位点为第58位氨基酸。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段，得到HaloTag N58和HaloTag C58。所使用的PCR扩增体系如下：

(2)将上步回收的HaloTag N58和HaloTag C58和真核生物表达载体pcDNA3.1(+)分别使用限制酶双酶切过夜，通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。所使用的酶切体系如下：

(3)将经过酶切回收的HaloTag N58和HaloTag C58分别连入已经使用相同的酶切的载体pcDNA3.1(+)，得到载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N58和pcDNA3.1(+)-HaloTag C58。所使用的连接体系如下：

(4)将上步所得的pcDNA3.1(+)-HaloTag N58和pcDNA3.1(+)-HaloTag C58分别酶切，步骤参照(2)。

(5)将合成的LifeAct短肽的两条引物退火。正链5'端所带有的4碱基突出与互补，负链5'端所带有的4碱基突出与载体酶切后的另一个粘性末端互补。正负链各100μM在10μl反应体系中按照如下步骤进行反应：95℃2min，降温速率-5℃/min至16℃2min。

(6)将退火的LifeAct短DNA链与酶切后的载体pcDNA3.1(+)-HaloTag N58和pcDNA3.1(+)-HaloTag C58分别连接，得到质粒pcDNA3.1(+)-HaloTag N58-LifeAct和pcDNA3.1(+)-LifeAct-HaloTag C58。反应步骤参照步骤(3)。

(7)将上述所得的反应液转化大肠杆菌DH5α。经测序验证，所得质粒序列正确即可。

实施例二：一种基于基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，以所用的分裂的HaloTag为例进行说明，在活细胞内标记正常生理状况下以及加入相应药物条件下细胞微丝骨架的动态行为。

(1)将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在两盘成像专用的35mm Petri-Dish里，培养24小时。

(2)对上述细胞分别使用脂质体Lipo-2000转染各1μg的pcDNA3.1(+)-HaloTagN58-LifeAct和pcDNA3.1(+)-LifeAct-HaloTag C58。转染所用的培养基为不含血清的Opti-MEM。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。

(3)成像之前，先在培养基中加入HaloTag的结合底物染料JF549，终浓度为10nM。在培养箱中继续培养20分钟，使HaloTag充分与染料反应。

(4)使用1×PBS清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。

(5)使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察正常生理状况下的细胞内的微丝在长时间尺度下的形态和动态行为。

(6)对于加药处理的细胞，在成像之前加入终浓度为10μM Latrunculin B的，立即放在带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞微丝骨架的解聚过程的动态。实验结果见说明书附图4。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val

1 5 10 15

Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp

20 25 30

Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val

35 40 45

Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Phe

65 70 75 80

Met Gly Val Ala Asp Leu Ile Lys Lys Phe Glu Ser Ile Ser Lys Glu

85 90 95

Glu

<210> 2

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Val Ala Asp Leu Ile Lys Lys Phe Glu Ser Ile Ser Lys Glu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Ser Glu Phe Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu

35 40 45

Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp

50 55 60

Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu

65 70 75 80

Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His

85 90 95

Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu

100 105 110

Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg

115 120 125

Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile

130 135 140

Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val

145 150 155 160

Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu

165 170 175

Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro

180 185 190

Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met

195 200 205

Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr

210 215 220

Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser

225 230 235 240

Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn Leu Leu

245 250 255

Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu

260 265 270

Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly

275

Claims (10)

1.一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，其特征在于，利用微丝骨架结合短肽LifeAct融合双分子荧光互补的蛋白，从而实现活细胞内无荧光背景的微丝蛋白骨架的稳定标记和长时程成像。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在该融合蛋白不结合纤维状微丝骨架时不发荧光，在其结合纤维状微丝骨架时发出荧光，从而降低成像背景。

3.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所使用的体系可以是活细胞，也可以是固定细胞。

4.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于，所使用的双分子荧光互补蛋白，可以是荧光蛋白，也可以是自连接标签。

5.根据权利要求1和2所述的方法，一种基于双分子荧光互补的新形细胞微丝骨架标记方法，其特征在于，所使用的荧光蛋白可以是，分裂的蓝色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，红色荧光蛋白等。

6.根据权利要求1和2所述的方法，一种基于双分子荧光互补的新形细胞微丝骨架标记方法，其特征在于，所使用的自连接标签可以是HaloTag，SnapTag，ClipTag等。

7.根据权利要求1，2和6所述的方法，使用基于自连接标签的双分子荧光互补的新形细胞微丝骨架标记方法，其特征在于，所使用的荧光染料为小分子透膜染料。

8.根据权利要求1和2所述的方法，一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，其特征在于，由以下步骤制备：

先确定自连接肽或荧光蛋白的分裂位点，通过PCR扩增出分裂的两段蛋白，分别融合微丝骨架结合短肽LifeAct，连入具有表达框的载体，构建成质粒，将所构建的质粒转细胞，加入染料(自连接肽)或直接(荧光蛋白)在显微镜下观察细胞微丝骨架的结构和动态。

9.权利要求1-3所述的方法在正常条件下哺乳动物细胞中微丝骨架的标记应用。

10.权利要求1-3所述的方法在病理或者加药条件下哺乳动物细胞中微丝骨架的标记应用。