CN112760324B

CN112760324B - 一种提高家蚕产丝量的方法

Info

Publication number: CN112760324B
Application number: CN202110130028.7A
Authority: CN
Inventors: 赵萍; 唐新; 夏庆友
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112760324A

Abstract

本发明公开了提高家蚕产丝量的方法，通过亮氨酸处理家蚕或在家蚕后部丝腺过量表达BmSLC7A5基因，激活mTORC1信号通路，调节蛋白质翻译过程，促进蚕丝蛋白合成，该方法处理的家蚕或转基因家蚕具有很好的经济性状，吐丝量提高，蚕茧和蚕蛹体重增加，茧层重和茧层率显著提高，具有更高的经济价值。

Description

一种提高家蚕产丝量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及提高家蚕产丝量的方法，通过亮氨酸处理家蚕幼虫或在家蚕后部丝腺过量表达BmSLC7A5基因。

背景技术

随着学科交叉和科学技术的发展，蚕丝显示出了更为广阔的应用前景，在医药、化工、物理等领域已经有了初步的功能开发和利用。然而，所有这些对蚕丝的利用，都建立在蚕丝的产量基础上，只有蚕丝供应量充足，才能真正推动蚕桑产业的发展。影响蚕丝产量的因素主要有两个，其一，产业的生产规模；其二，蚕种自身的丝蛋白合成效率。作为劳动密集型产业，蚕桑产业的生产规模受到了一定的限制，因此，提高家蚕合成蚕丝蛋白的能力与效率，就成了蚕桑行业技术进步最重要的追求目标，也从整体上决定了蚕农的收益水平。业界一般用“茧层率”——茧层重占全茧重的百分比，来衡量家蚕产丝效率。家蚕的茧层率越高，相对的丝蛋白量就越多，其经济价值也就越大。因此，茧层率作为重要的育种目标性状，其高低已经成为家蚕品种进步史上的重要标志之一。百余年育种努力的结果，让茧层率得到了大幅度提高。据统计，野蚕茧层率在13％左右，而现行家蚕实用品种，茧层率保持在25％左右。然而，由于蚕业科技工作者对茧层率的内在分子决定机制知之甚少，通过传统育种想要较大幅度提高茧层率已难以实现。在过去几十年，家蚕品种选育工作在茧层率性状上几乎没有大的进步，无法突破30％的上限，这已成为制约行业发展的科学难题与技术瓶颈。因此，有必要重新认识丝蛋白的合成过程，从新的角度去思考和探索提高家蚕丝蛋白合成效率的方法，以达到增加茧层率的目的。

前期的研究，通过激素处理来增加家蚕的丝蛋白合成量，激素处理家蚕后产丝能力提高幅度不大，并且该方法不便于生产上的推广应用，不能够选育到具有稳定遗传特性的家蚕品系。因此，亟需一种其他提高家蚕吐丝量和茧层率的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高家蚕产丝量的方法；本发明的目的之二在于提供亮氨酸在提高家蚕经济性状中的应用；本发明的目的之三在于提供过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5在提高家蚕经济性状中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、提高家蚕产丝量或茧层率的方法，通过激活家蚕mTORC1信号通路，诱导丝蛋白基因和相关转录因子上调表达，得到产丝量提高的家蚕品系。

本发明发现亮氨酸能够通过mTORC1信号通路促进家蚕丝蛋白合成，增加家蚕的吐丝量；SLC7A5(solute carrier 7-A5)基因，能够将胞外的亮氨酸转运进入细胞质中，进而参与mTORC1信号的激活，从而调节蛋白质的合成。因此可以通过激活家蚕mTORC1信号通路，得到产丝量提高的家蚕品系。

优选的，所述丝蛋白基因为BmFibH、BmFibL或BmP25；所述转录因子为Bmdimm或BmSGF1或BmSage。

优选的，所述激活家蚕mTORC1信号通路的方法为家蚕添食亮氨酸或在家蚕中过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5，所述家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的核苷酸序列如SEQID NO.17所示。

优选的，所述家蚕添食亮氨酸的方法为在5龄期按桑叶与亮氨酸的质量比为100：0.8对家蚕进行亮氨酸添食处理；更优选的，在5龄期第1、3、5天分别按桑叶与亮氨酸质量比100：0.8对家蚕亮氨酸添食处理3次。

优选的，所述家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5由家蚕后部丝腺特异的启动子调控表达。

优选的，所述家蚕后部丝腺特异的启动子为BmFibhP，所述启动子BmFibhP的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

优选的，所述在家蚕中过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的方法是将含有家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的重组表达载体转入家蚕产卵后2小时内的胚胎中，催青至孵化，孵化的幼虫饲育至成虫后进行自交制种，获得的G1代蚕卵，筛选转基因阳性个体。

优选的，所述含有家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的重组表达载体构建过程如下：将家蚕后部丝腺特异的启动子BmFibhP连入LBS的5’端，然后将BmSLC7A5基因连入启动子BmFibhP与LBS之间，获得表达框BmFibhP-BmSLC7A5-LBS，将获得的表达框连入经AscⅠ酶切的pBac[3xP3-dsRed]载体，重组载体pBac[3xP3-dsRed，BmFibhP-BmSLC7A5-LBS]，所述LBS的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

2、亮氨酸在提高家蚕经济性状中的应用，所述经济性状为蚕茧重量、蚕蛹重量、茧层重和茧层率。

3、过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5在提高家蚕经济性状中的应用，所述经济性状为蚕茧重量、蚕蛹重量、茧层重和茧层率；所述家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

本发明的有益效果在于：本发明公开了提高家蚕产丝量的方法，利用亮氨酸能够激活mTORC1信号通路促进家蚕丝蛋白合成，提高吐丝量；还利用在家蚕中过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5，获得的转基因家蚕；BmSLC7A5基因在mRNA和蛋白水平上都得到了过量表达，利用western blot检测发现mTORC1信号通路靶蛋白磷酸化上调，丝蛋白合成增加，后部丝腺细胞体积变大。转基因家蚕阳性个体的经济性状统计分析显示，其吐丝量和茧层率得到显著提高，获得了产丝量提高的种质资源和素材，同时对家蚕丝蛋白合成的机制研究有重大意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为亮氨酸对丝蛋白基因及相关转录因子表达的影响(CK：水；Basic AA：碱性氨基酸；Leu：亮氨酸；Gln：谷氨酰胺；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图2为添食亮氨酸对家蚕经济性状的影响(A：雄蚕蚕茧和蚕蛹大小；B：雄蚕茧重、茧层重、蛹重和茧层率；C：雌蚕蚕茧和蚕蛹大小；D：雌蚕茧重、茧层重、蛹重和茧层率)。

图3为转基因家蚕的获得。

图4为转基因家蚕表型变化及分子检测(A：上蔟期丝腺；B：DAPI染色发现转基因家蚕后部丝腺的细胞；C：家蚕前中部丝腺和后部丝腺的重量；D：丝腺的长度；E：丝蛋白基因转录水平表达量；F：丝蛋白基因蛋白水平表达量)。

图5为转基因家蚕经济性状统计分析(A：雌蚕蚕茧和蚕蛹大小；B：雄蚕的蚕茧和蚕蛹大小；C：茧重、茧层重、蛹重和茧层率)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例中使用的家蚕品种为D9L，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。

实施例1、亮氨酸诱导丝蛋白基因及相关转录因子上调增加家蚕吐丝量

根据NCBI数据库中以及SILKDB3.0数据库中BmFibH、BmFibL、BmP25、Bmdimm、BmSGF1基因CDS序列，设计如下引物：

BmFibH-F：5’-tatccaggacgaagtaagaaacaa-3’(SEQ ID NO.1)；

BmFibH-R：5’-tctgtgtcatctgcttcatctcg-3’(SEQ ID NO.2)；

BmFibL-F：5’-cggaggtggaagaatctatga-3’(SEQ ID NO.3)；

BmFibL-R：5’-gatgttgttgctttggctgtt-3’(SEQ ID NO.4)；

BmP25-F：5’-agccgctgtggcagttttg-3’(SEQ ID NO.5)；

BmP25-R：5’-taggtggcgttgaagtatgg-3’(SEQ ID NO.6)；

Bmdimm-F：5’-cgtggaacccgcatttgta-3’(SEQ ID NO.7)；

Bmdimm-R：5’-aacctcggcaatccagtcg-3’(SEQ ID NO.8)；

BmSGF1-F：5’-cctttctacagacaaaaccagc-3’(SEQ ID NO.9)；

BmSGF1-R：5’-gtcaggatgtagcgtccaaaa-3’(SEQ ID NO.10)；

选择5龄起蚕期幼虫对其进行亮氨酸(150μg/头)注射，同时选择谷氨酰胺(150μg/头)、碱性氨基酸(200μg/头)作为阳性对照进行注射。然后荧光定量PCR检测BmFibH(SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2)、BmFibL(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)、BmP25(SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6)、Bmdimm(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)、BmSGF1(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)的表达量，结果如图1所示。结果显示，从注射亮氨酸6h-18h能够持续的激活BmFibH和Bmdimm基因的表达，而18h后开始上调BmFibL和BmP25基因的表达，但其对BmSGF1基因的表达没有明显影响；此外，谷氨酰胺、碱性氨基酸从注射6h-18h也能够持续的激活BmFibH和Bmdimm基因的表达，18h开始能够上调BmFibL的表达，但它们对BmP25和BmSGF1基因的表达没有明显影响。相比之下，亮氨酸对丝蛋白及其转录因子的上调作用更为明显。在亮氨酸处理18h后，mTORC1信号通路靶蛋白4EBP磷酸化上调，表明mTORC1信号增强，同时丝蛋白BmFibL、BmP25及其转录因子Bmdimm、BmSage都出现了明显的增加。

为研究亮氨酸对家蚕经济性状得影响，在5龄期第1、3、5天分别对家蚕进行了亮氨酸添食处理，共计3次(桑叶：Leu＝100：0.8，质量比)，然后统计家蚕的经济性状，结果如图2所示。结果显示，添食亮氨酸后，家蚕的经济性状明显的提高，雌蚕和雄蚕的蚕茧变大、茧层重和茧层率显著提高，且雄蛹个头也明显变大，但雌蛹个头无明显变化。进一步的分析显示，雄蚕的茧层重增加了22％，雌蚕的茧层重增加了20％。

实施例2、家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的克隆

根据NCBI数据库中XP_004930975.1基因CDS序列以及SILKDB3.0数据库中FibH基因组数据，设计3对上下游引物。设计的引物委托生工生物工程(上海)有限公司进行合成。引物序列如下(下划线部分为酶切位点)：

Sal Ⅰ-Asc Ⅰ-BmFibHP-F：5’-gcgtcgacttggcgcgccttcgcttaaatgagcagc-3’(SEQID NO.11)；

BamH Ⅰ-BmFibHP-R：5’-cgggatcccttgagagttggaaccgaa-3’(SEQ ID NO.12)；

Bgl Ⅱ-BmSLC7A5-F：5’-gaagatctatggctaaagttgccgacgta-3’(SEQ ID NO.13)；

Not Ⅰ-BmSLC7A5-R：5’-atttgcggccgctcataattctttgcagtcctcgg-3’(SEQ IDNO.14)；

Sal Ⅰ-BamH Ⅰ-Not Ⅰ-LBS-F：5’-gcgtcgaccgggatccatttgcggccgcagttacggagctggcag-3’(SEQ ID NO.15)；

Asc Ⅰ-LBS-R：5’-ttggcgcgcctagtacattcaaataaaatgcatac-3’(SEQ ID NO.16)；

以家蚕幼虫丝腺为模板，利用扩增得到BmSLC7A5(SEQ ID NO.17)，PCR程序反应条件：94℃预变性4min；94℃变性40s；65℃退火40s；72℃延伸1min 45s，27个循环；72℃延伸10min，4℃保存，同时以家蚕基因组为模板扩增后部丝腺特异的启动子BmFibHP(SEQ IDNO.18)和BmFibH基因3’UTR(LBS)(SEQ ID NO.19)。产物电泳后切胶回收，连接到pMD19T载体上，转化涂板后，挑取阳性克隆送测序；分别得到pMD19T-BmFibhP、pMD19T-BmSLC7A5、pMD19T-LBS。

实施例3、含有家蚕BmSLC7A5基因的重组表达载体的构建

将重组载体pMD19T-BmFibhP用SalⅠ和BamHⅠ双酶切，回收BmFibhP。pMD19T-BmSLC7A5用BglⅡ(BamHⅠ同尾酶)和Not I双酶切，回收BmSLC7A5基因的CDS片段。将pMD19T-LBS载体用SalⅠ和BamHⅠ双酶切，然后将回收的BmFibhP片段连接到pMD19T-LBS载体上，得到pMD19T[BmFibhP-LBS]，接着用BamHⅠ和Not I双酶切pMD19T[BmFibhP-LBS]载体，最后将BmSLC7A5的CDS片段连接到pMD19T[BmFibhP-LBS]载体上，得到pMD19T[BmFibhP-BmSLC7A5-LBS]。

将重组载体pMD19T[BmFibhP-BmSLC7A5-LBS]用AscⅠ和FspⅠ双酶切，回收BmFibhP-BmSLC7A5-LBS片段，再与经AscⅠ酶切的载体pBac[3xP3-dsRed]进行连接，获得重组载体pBac[3xP3-dsRed，BmFibhP-BmSLC7A5-LBS]。所述载体pBac[3xP3-dsRed]系参照文献方法(Horn and Wimmer,2000)构建而得。

实施例4、家蚕后部丝腺过量表达BmSLC7A5转基因家蚕的获得

将重组载体piggyBac[3×P3-Red,BmFibhP-BmSLC7A5-LBS]与编码piggyBac转座酶的转基因辅助载体pHA3PIG按照质量比1:1混合，通过显微注射仪注入D9L的早期胚胎(产卵后2小时内，G0代)中，注射后的蚕卵用无毒胶水封口，25℃催青至孵化。孵化的幼虫采用桑叶饲育，至成虫后进行自交制种，获得的蚕卵(G1代)于胚胎发育第6-7天在宏观体视荧光显微镜(Olympus MVX10)下利用波长为460～490nm的激发光检测红色荧光，筛选出在眼睛或神经特异激发红色荧光的转基因阳性个体，即获得过量表达BmSLC7A5的转基因家蚕。对筛选到的3个转基因家蚕品系的丝腺进行Q-PCR检测。分别取五龄第三天转基因家蚕和非转基因家蚕后部丝腺样品，在液氮中快速研磨并提取总RNA，反转录成cDNA，并采用BmSLC7A5特异引物[qPCR-F：5'-cggtgccaggaacggacat-3'(SEQ ID NO.20)；qPCR-R：5'-ccgagcagagggtgaacaa-3'(SEQ ID NO.21)进行荧光定量PCR检测，以sw作为内参[sw-F：5'-ttcgtactggctcttctcgt-3'(SEQ ID NO.22)；sw-R：5'-caaagttgatagcaattccct-3'(SEQ IDNO.23)，反应仪器为ABI 7500Fast(美国)。反应条件为：95℃预变性30s，之后进行40个循环，每个循环为95℃(3s)，60℃(30s)，其中每个组织进行3次重复实验，收集目的基因ΔCt值和内参ΔCt mean进行数据分析，结果如图3所示。结果显示，与WT家蚕相比转基因家蚕BmSLC7A5基因在后部丝腺的表达量都显著的提高，其中编号1的品系表达量提高了3倍。

实施例5、转基因家蚕丝腺mTORC1信号增强丝蛋白合成增加丝腺变大

随后，记录过量表达BmSLC7A5转基因家蚕5龄第4天至上蔟期丝腺大小的变化，结果发现转基因家蚕的丝腺明显大于野生型的家蚕(图4，A)。同时，通过DAPI染色发现，转基因家蚕后部丝腺的细胞体积略微的大于野生型家蚕(图4，B)。此外，5龄第4天转基因家蚕前中部丝腺和后部丝腺的重量都显著的大于野生型，其重量分别增加了81％和60％(图4，C)。当进入上蔟期后，进一步统计了丝腺的长度，结果显示转基因家蚕中部丝腺中部的长度增加了0.5cm，后部丝腺的长度增加了2cm(图4，D)。分子检测结果显示，当丝腺内BmSLC7A5表达量增加以后，mTORC1信号通路的靶蛋白S6K1和4EBP1磷酸化水平出现了明显的增加；丝蛋白BmFibH、BmFibL、BmP25表达量明显的提高，且Bmdimm和BmSage在蛋白水平也出现了显著的增加(图4，F)；此外，丝蛋白基因在转录水平也出现明显的上调表达(图4，E)。这些结果表明mTORC1信号增强后，能够促进丝蛋白及其转录因子的合成。

实施例6、转基因家蚕经济性状增加，吐丝量和茧层率显著提高

在获得稳定遗传的转基因品系后，对所关注的经济性状进行了连续三代的统计。结果发现，转基因家蚕雌蚕和雄蚕的蚕茧尺寸明显大于野生型(图5，A和B)；转基因蚕蛹也有着略微的变大(图5，A和B)；转基因雌蚕和雄蚕的茧层重都增加了25％(图5，C)；同时，转基因蚕的茧层率提高了约2个百分点(图5，C)。此外，与野生型家蚕相比，转基因家蚕的生长周期和食桑量未有明显差异。这表明，在后部丝腺过量表达BmSLC7A5基因后，家蚕在同样的生长周期内，其丝蛋白的合成量明显增加，其茧层重、茧层率也明显提高，转基因家蚕的经济价值得到了较大的提升。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种提高家蚕产丝量的方法

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatccaggac gaagtaagaa acaa 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgtgtcat ctgcttcatc tcg 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaggtgga agaatctatg a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgttgttg ctttggctgt t 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agccgctgtg gcagttttg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taggtggcgt tgaagtatgg 20

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgtggaaccc gcatttgta 19

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aacctcggca atccagtcg 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctttctaca gacaaaacca gc 22

<210> 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtcaggatgt agcgtccaaa a 21

<210> 11

<211> 36

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgtcgactt ggcgcgcctt cgcttaaatg agcagc 36

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgggatccct tgagagttgg aaccgaa 27

<210> 13

<211> 29

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaagatctat ggctaaagtt gccgacgta 29

<210> 14

<211> 35

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atttgcggcc gctcataatt ctttgcagtc ctcgg 35

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcgtcgaccg ggatccattt gcggccgcag ttacggagct ggcag 45

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttggcgcgcc tagtacattc aaataaaatg catac 35

<210> 17

<211> 1494

<212> DNA

<213> 家蚕(Bombyx mori L)

<400> 17

atggctaaag ttgccgacgt agatggatta gctcccaagg ctatcgaaaa tgaagttgaa 60

agcagtgatg gtgtcgaaaa aggatctggt ggaggtgtgc gattgaaaaa agagttgagt 120

ctaatgaacg gtgtggcaat aattgtgggt gtaatagtcg gatcaggaat attcgtttct 180

ccaagtttgg cgctaaaaca tgcaggttct aaaggaatgg ctctcatcgt gtgggtttta 240

tcaggattct tgtccatgat aggagcgctc tgttatgcag agctaggtac gatgatcccg 300

aaatctggtg gggattacgc gtatatcggt gaagcgtttg gttctctacc ggcttttctc 360

tatctgtggg ttgcgctctt catccttgta ccgacgggaa acgcaatcac agccctgacc 420

ttcgctgaaa acatcctgaa gccgttatgg ccagtttgca atcctccggt cgtagcagtc 480

aaccttattg cagccagcat tacctgtttc ctgacaataa ttaactgtta taacgtgaaa 540

tgggtgacgc gagttcaaga ctcgtttacc gctgcgaaag tactggcgct actcgtgaca 600

ttcttcgcga gcttggtcta cttattctcc ggacacacgg aaaacctgca gtacatgatg 660

gagaaaacaa caacggatcc aggggagatc gctatagcat tttataccgg cctattttcg 720

tattctggct ggaattacct gaactttgtt actgaagaac tgaaggatcc ctacaagaat 780

cttccacgag ctatctgcat atctatgccg gtcgtgacct tggtctacac gctaaccaac 840

gtcgcctatt tcgctgtatt gtccagtgac gaaatccttt cgtcctccgc cgtcgctgtt 900

acgttcagcg agaaaattct caaaatgatg tcttggataa tgccgctctt cgtggctctg 960

tgtacatttg gatccctcaa cggcgccata tacacttcct cgcgactttt cttcgtcggt 1020

gccaggaacg gacatttacc tttggcgatt tcactcatag acatcaagag gttgaccccg 1080

gtgccttcac tcatatttat gtgcctggtc accctgctgc tactgctgtc gaacgacatc 1140

gaagctctga tggtgtacgt gactgctgtc gaagcgttgt tcaccctctg ctcggtgacc 1200

ggcttgctgt ggatgcgcta cacgcgacca cgcctccagc gaccgatccg cgtcagtctc 1260

gtcctgcccg ctatcttcct gataacctgc acatttattg tcatatgctc gtgctttaaa 1320

tacccgaagc acgtcggcat cggggtcgcc ttcatagcgc tgggcgtccc catatacatg 1380

atattcatca aatggcagaa taaacccaat tggatattaa cagcgtgcaa tagcttcaat 1440

ttggcgtgtt ccaagctgtt tttgtgttta cccgaggact gcaaagaatt atga 1494

<210> 18

<211> 1049

<212> DNA

<213>家蚕( Bombyx mori L)

<400> 18

ttcgcttaaa tgagcagcta ttacttaatc tcgtagtggt ttttgacaaa atcagcttct 60

ttagaactaa aatatcattt ttttcgtaat ttttttaatg aaaaatgctc tagtgttata 120

cctttccaaa atcaccatta attaggtagt gtttaagctt gttgtacaaa actgccacac 180

gcattttttt ctccactgta ggttgtagtt acgcgaaaac aaaatcgttc tgtgaaaatt 240

caaacaaaaa tattttttcg taaaaacact tatcaatgag taaagtaaca attcatgaat 300

aatttcatgt aaaaaaaaaa tactagaaaa ggaatttttc attacgagat gcttaaaaat 360

ctgtttcaag gtagagattt ttcgatattt cggaaaattt tgtaaaactg taaatccgta 420

aaattttgct aaacatatat tgtgttgttt tggtaagtat tgacccaagc tatcacctcc 480

tgcagtatgt cgtgctaatt actggacaca ttgtataaca gttccactgt attgacaata 540

ataaaacctc ttcattgact tgagaatgtc tggacagatt tggctttgta tttttgattt 600

acaaatgttt ttttggtgat ttacccatcc aaggcattct ccaggatggt tgtggcatca 660

cgccgattgg caaacaaaaa ctaaaatgaa actaaaaaga aacagtttcc gctgtcccgt 720

tcctctagtg ggagaaagca tgaagtaagt tctttaaata ttacaaaaaa attgaacgat 780

attataaaat tctttaaaat attaaaagta agaacaataa gatcaattaa atcataatta 840

atcacattgt tcatgatcac aatttaattt acttcatacg ttgtattgtt atgttaaata 900

aaaagattaa tttctatgta attgtatctg tacaatacaa tgtgtagatg tttattctat 960

cgaaagtaaa tacgtcaaaa ctcgaaaatt ttcagtataa aaaggttcaa ctttttcaaa 1020

tcagcatcag ttcggttcca actctcaag 1049

<210> 19

<211> 333

<212> DNA

<213> 家蚕( Bombyx mori L)

<400> 19

agttacggag ctggcagggg atacggacaa ggtgcaggaa gtgcagcttc ctctgtgtca 60

tctgcttcat ctcgcagtta cgactattct cgtcgtaacg tccgcaaaaa ctgtggaatt 120

cctagaagac aactagttgt taaattcaga gcactgcctt gtgtgaattg ctaattttta 180

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gattttttgt atgcatttta tttgaatgta cta 333

<210> 20

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caaagttgat agcaattccc t 21

Claims

1.一种提高家蚕产丝量的方法，其特征在于：通过激活家蚕mTORC1信号通路，诱导丝蛋白基因和相关转录因子上调表达，得到产丝量提高的家蚕品系；所述激活家蚕mTORC1信号通路的方法为在家蚕丝腺中过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5，所述家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述丝蛋白基因为BmFibH，BmFibL和BmP25；所述转录因子为Bmdimm和BmSage。

2.根据权利要求1所述提高家蚕产丝量的方法，其特征在于：所述家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5由家蚕后部丝腺特异启动子调控表达；所述家蚕后部丝腺特异的启动子为BmFibhP，所述启动子BmFibhP的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

3.根据权利要求1所述提高家蚕产丝量的方法，其特征在于：所述在家蚕中过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的方法是将含有家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的重组表达载体转入家蚕产卵后2小时内的胚胎中，催青至孵化，孵化的幼虫饲育至成虫后进行自交制种，获得的G1代蚕卵，筛选转基因阳性个体。

4.根据权利要求3所述提高家蚕产丝量的方法，其特征在于：含有家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的所述重组表达载体构建过程如下：将家蚕后部丝腺特异的启动子BmFibhP连入LBS的5’端，然后将BmSLC7A5基因连入启动子BmFibhP与LBS之间，获得表达框BmFibhP-BmSLC7A5-LBS，将获得的表达框连入经Asc Ⅰ酶切的pBac[3xP3-dsRed]载体，重组载体pBac[3xP3-dsRed，BmFibhP-BmSLC7A5-LBS]；所述LBS的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

5.过表达家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5在提高家蚕经济性状中的应用，其特征在于：所述经济性状为蚕茧重量、蚕蛹重量、茧层重和茧层率；所述家蚕亮氨酸转运蛋白BmSLC7A5的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。