CN101940169A

CN101940169A - 一种虹鳟四倍体育种方法

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Publication number: CN101940169A
Application number: CN2010102158971A
Authority: CN
Inventors: 白宝海
Original assignee: BEIJING WOFO MOUNTAIN VILLA CULTURE Co Ltd
Current assignee: BEIJING WOFO MOUNTAIN VILLA CULTURE Co Ltd
Priority date: 2010-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2030-07-02
Also published as: CN101940169B

Abstract

本发明提供一种虹鳟四倍体育种方法，该方法利用虹鳟和红点鲑进行属间杂交，得到可育的四倍体虹鳟。所述的虹鳟和红点鲑分别属于大麻哈鱼属和鲑属；所述的虹鳟为性成熟雌性，所述的红点鲑为性成熟雄性。本发明利用虹鳟和红点鲑的属间杂交，受精卵孵化、培育幼鱼、养殖2-3年至性成熟；经检测，杂交后代中存在部分可育的四倍体；该方法为大规模生产三倍体虹鳟鱼提供了可行的途径。本发明的孵化、培育步骤中各个参数设置合理，有利于稚幼鱼和幼鱼的生长；检测方法采取微观水平的细胞学检测和染色体检测和宏观水平的性腺发育状况检测相结合，严谨有序，有利于准确判断是否有四倍体杂交后代产生；各个操作方法简便易行，适配性好。

Description

一种虹鳟四倍体育种方法

技术领域

本发明属于鱼类的人工繁殖领域，具体涉及一种虹鳟四倍体育种方法，该方法利用虹鳟和红点鲑进行属间杂交，得到可育的四倍体虹鳟。

背景技术

在鱼类多倍体的研究中，最早为Svardson于1945发现鲑科中存在多倍体类型。至今为止，已在11目25科40种以上的硬骨鱼中成功诱导多倍体鱼。鱼类多倍体、主要为三倍体和四倍体的育种研究一直受到人们的高度重视，是因其具有广阔的应用前景，例如一些不育的三倍体鱼，具有长速度快、肉质好、抗逆性强、不干扰鱼类资源等优点，是一种具有推广前景的经济鱼类。目前，鱼类多倍体的诱导方法有生物学、物理学和化学方法。

A.生物学方法，主要为远缘杂交。Rasch等（1965）首先证明了三倍体脊椎动物可通过杂交产生。后来，草鱼（♀，2n=48）与三角鲂（♂，2n=48）的属间杂交，获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。刘筠等（1976）在鲤科鱼类的属间的远源杂交中，分别获得三倍体和四倍体群体。

B.物理学方法，主要包括温度休克法、静水压法和化学方法等。温度休克法廉价，易操作，是诱导鱼类多倍体的常用手段，也适合大规模生产使用。但由于鱼类的遗传背景及有些鱼的卵子不同步成熟，以及温度对受精卵造成损伤等缺点，限制了这一技术的广泛使用。静水压法，具有诱导率高、处理时间短、对受精卵损伤小，成活率高等优点，因而受到青睐。但实验中需要的静水压设备价格昂贵，为一般的科研单位所不能承受。

C.化学方法，主要化学试剂有细胞松弛素B和秋水仙素，能抑制细胞质分裂，阻止第二极体的排出或受精卵的第一次有丝分裂，从而产生三倍体或四倍体。但这种方法主要用于诱导植物多倍体。

鉴于鱼类三倍体的不育性和成活率高、生长快等特点，国内外已采用上述的理化方法直接诱导出很多种类的三倍体鱼，且有些三倍体鱼已进入产业化。尽管如此，诱导三倍体鱼的技术毕竟不是一劳永逸的方法。理想的方法是首先获得四倍体鱼，再与二倍体鱼杂交生产三倍体鱼，为大规模生产鱼类三倍体提供一条行之有效的捷径。诱导四倍体条件相对苛刻，虽然已在鲤科、鳅科、鲑科、丽鱼科及鲇科鱼类中进行广泛实验，但成功的实例较少。目前国内外仅见利用物理学方法在虹鳟、泥鳅、琵琶湖鳅、南方鲇、四倍体罗非鱼、鳙鱼、水晶彩鲫等鱼类中获得四倍体鱼。Cherfas 等（1994）报道了银鲫×鲤杂交中，成功获得存活的四倍体鱼。国内学者在草×鲤、兴国红鲤×红鲫、白鲫♀×红鲫♂、红鲫♀×湘江野鲤、鲫鱼×团头鲂杂交中，获得存活的四倍体鱼。但是，目前还没有利用生物学方法获得虹鳟四倍体鱼的报道，市场上需要利用生物学方法获得虹鳟四倍体的培养方法。

发明内容

[0003] 发明内容

本发明的目的是提供一种利用虹鳟和红点鲑进行属间杂交，得到可育的四倍体虹鳟的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种虹鳟四倍体育种方法，利用虹鳟和红点鲑进行属间杂交，得到可育的异源杂交四倍体虹鳟鱼。所述的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和红点鲑(Salvelinus fontinalis)这两种鲑科鱼类，它们分别隶属于大麻哈鱼属(Oncorhynchus)和鲑属(Salvelinus)；所述的虹鳟为性成熟的雌性，所述的红点鲑为性成熟的雄性。

该方法依次包括以下步骤：

A.取虹鳟的卵子和红点鲑的精子，进行受精处理，得到受精卵；

B.将所述的受精卵进行孵化处理，得到稚幼鱼；

所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为8～12℃的微流水中进行，DO值大于5mg/l，PH值为6.5～9.0；

C.当所述的稚幼鱼上浮后，进行分池培育，得到幼鱼；所述的培育中，养殖密度为600～1000尾/m2；

D.当所述的幼鱼长到长度为8～12cm时，移到室外养殖池养殖2～3年至性成熟，得到成体鱼；

E.将所述的成体鱼进行检测，得到所述的可育的四倍体虹鳟。

本发明可为大规模地生产三倍体虹鳟鱼提供一条可行的途径。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

1. 本发明的孵化、培育步骤中各个参数设置合理，有利于稚幼鱼和幼鱼的生长；

2. 本发明的检测方法采取微观水平的细胞学检测和染色体检测和宏观水平的性腺发育状况检测相结合，严谨有序，有利于准确判断是否有四倍体杂交后代产生；

3. 本发明的各个操作方法简便易行，适配性好。

具体实施方式：

实施例1：

本实施例为利用虹鳟和红点鲑进行属间杂交，得到可育的四倍体虹鳟的方法。

该方法依次包括以下步骤：

所述的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和红点鲑(Salvelinus fontinalis)这两种鲑科鱼类，它们分别隶属于大麻哈鱼属(Oncorhynchus)和鲑属(Salvelinus)；所述的虹鳟为性成熟的雌性，所述的红点鲑为性成熟的雄性；

所述的虹鳟和红点鲑均取自北京卧佛山庄养殖有限公司养殖基地，也可以取自市场上其他养殖场；

所述的受精处理为人工干法受精，具体的操作为：将所述的虹鳟的卵子从鱼体挤入干燥的塑料盆内，然后将所述的红点鲑的精子从鱼体挤入同一盆内，搅拌均匀，使卵子与精子充分混合得到受精混合物；

再将所述的受精混合物静置8～12分钟，进行清洗处理，洗去多余的精液，得到受精卵；

B.将所述的受精卵进行孵化处理，得到稚幼鱼；

所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为8～12℃的微流水中进行，DO值（dissolved oxygen，溶解氧）大于5mg/l，PH值为6.5～9.0；

在该孵化处理的过程中，要定期挑出发白、发霉的死卵，以免影响正常的受精卵发育；

所述的受精卵经15天左右，卵的一端出现两个黑眼点，即为发眼卵，从这一时期再经历15天左右时间，卵膜破裂，孵化出小鱼为所述的稚幼鱼；所述的稚幼鱼潜伏在水底，贴着水底运动；

C.当所述的稚幼鱼上浮后，进行分池培育，得到幼鱼；

所述的培育中，养殖密度为600～1500尾/m2；

当所述的稚幼鱼上浮后，及时清除孵化池中的死卵及废物；

在所述的幼鱼的培育中，应定期用“水霉清”等渔药清除养殖水体中的水霉，防止鱼苗感染水霉病而引起伤亡；

D.当所述的幼鱼长到长度为8～12cm时，移到室外养殖池养殖2～3年至性成熟，得到杂交后代；

E.将所述的杂交后代进行检测，得到所述的可育的四倍体虹鳟。

所述的检测的项目为细胞水平的初步筛选检测、DNA平均含量检测、染色体成分检测、性腺发育状况检测。

所述的细胞水平初步检测采用血涂片检测，所述的DNA平均含量检测采用流式细胞仪技术检测，所述的染色体成分检测采用染色体滴片检测，所述的性腺发育状况检测采用组织解剖检测。

a. 细胞水平的初步筛选检测：

当所述的杂交后代的长度为18～22 cm，体重为30～80g 时，进行所述的细胞水平的初步筛选检测，检测方法为血涂片检测；

该检测的目的为：

根据在显微镜下，四倍体血细胞体积大于二、三倍体的原理，初步、快速地从杂交后代中初步筛选四倍体鱼；

具体的操作方法为：

抽取所述的杂交后代的尾柄动脉血液，并在该血液中加入1%肝素钠溶液防止凝固，制作血细胞涂片；

b. DNA平均含量检测：

待以上初步筛选出的四倍体鱼伤口愈合、体质恢复后，再抽取尾柄动脉血液，处理后得到待测样品，进行所述的DNA平均含量检测，检测方法为流式细胞技术检测；该检测采用FACS Vantage 型流式细胞仪送专门检测机构进行检测。

该检测的目的为：

根据四倍体血细胞中DNA含量应为二倍体的2倍，从初步筛选出杂交后代中进一步筛选四倍体鱼；

c. 染色体成分检测：

将上述进一步筛选出的四倍体鱼杂交后代继续养殖2～3年，待性成熟时，在繁殖季节（9～12月份）进行所述的染色体来源检测，检测方法为染色体滴片检测；

该检测的目的为：

根据二倍体和四倍体的血细胞中染色体条数的差异，进一步筛选四倍体鱼；

具体的操作方法为：

从水中把鱼捞起，用手轻轻挤压鱼体腹部，一部分有少量卵子流出，另一部分有少量精液流出，还有一部分既无精液也无卵子流出；从上述有少量卵子流出的鱼和上述有少量精液流出的鱼中各随机抽取2尾作为试验组，普通虹鳟和红点鲑各取2尾作为对照组，制作染色体滴片；

所述的染色体滴片的制作方法为：

取出试验组和对照组的肾脏放入盛有0.8%NaCl的生理盐水的培养皿中，用剪刀剪碎，得到肾脏碎片；再将所述的肾脏碎片和少量生理盐水，移于离心管中，吹打成悬浊液A；再将所述的悬浊液A进行离心处理，转速为1000rpm ，时间为5分钟，弃上清液，得到细胞沉淀物；将所述的细胞沉淀物在0.075 MKCl低渗液中浸泡低渗2～5h，其间吹打多次，得到悬浊液B；将所述的悬浊液B进行离心处理，收集沉淀物；将所述的沉淀物在甲醇和冰醋酸（3:1）混合液中进行固定、离心处理，重复该固定、离心处理2～3次，得到滴片悬浊液；将所述的滴片悬浊液在冷冻的玻片上进行滴片、火焰干燥、Giemsa染料染色，最后在显微镜下观察并计数，每个玻片选取20个染色体分裂相好的细胞用于计数。

d. 性腺发育状况检测：

该检测的目的为：

将上述杂交四倍体鱼进行所述的性腺发育状况检测，检测方法为解剖检测；

根据二倍体鱼和四倍体鱼的生殖腺的差异，进一步筛选可育的四倍体鱼；

将用于上述染色体成分检测中少量卵子流出的鱼中的2尾、有少量精液流出的鱼中的2尾、和既无精液也无卵子流出的鱼种的5尾一同作为试验组；将普通二倍体虹鳟鱼作为对照组；将上述试验组和对照组均进行解剖。

本实施例的方法为大规模地生产三倍体虹鳟鱼提供一条可行的途径。

实施例2：

本实施例是在实施例1基础上的优选方案。本实施例中，杂交和培养方法中的部分参数进一步优化。

本实施例的操作方法和注意事项与实施例1相同，区别在于：

B步骤中，所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为8～12℃的微流水中进行，DO值为5～12 mg/l，PH值为6.5～7.5；

C.当所述的稚幼鱼上浮后，进行分池培育，得到幼鱼；所述的培育中，养殖密度为1000尾/m2；

本实施例中所述的虹鳟的数量为10尾，红点鲑的数量为3尾，最后得到杂交后代5000尾；

a. 细胞水平的初步筛选检测：

该检测的目的为：

根据在显微镜下，四倍体血细胞体积大于二、三倍体的原理，初步快速从杂交后代中初步筛选四倍体鱼；

具体的操作方法为：

检测结果为：

所述的杂交后代的总数为5000尾，其血细胞长轴在目镜内测微尺上的观察结果是：152尾为10～12个长度单位（25 ～30μm），4848尾体为7～9个长度单位（17.5～ 22.5 μ m），而对照组的二倍体虹鳟为5～6个长度单位（12.5 ～15μm）。细胞长轴区分明显，据此可初步分辨出杂交后代具有2种不同倍性的鱼；以上表明，上述152尾杂交后代为初步筛选出的四倍体鱼；

b. DNA平均含量检测：

待上述152尾杂交后代伤口愈合、体质恢复后，再抽取尾柄动脉血液，处理后得到待测样品，进行所述的DNA平均含量检测，检测方法为流式细胞技术检测；该检测采用FACS Vantage 型流式细胞仪送专门检测机构进行检测。

该检测的目的为：

检测结果为：

从DNA检测峰值上可见，以上的待测样品中，129尾杂交后代的DNA平均含量为100，23尾杂交后代的DNA含量为75，对照组的二倍体的DNA平均含量为50。两组DNA平均含量为100与50中，比值为2.1；两组DNA平均含量为75与50中，比值为1.5。经卡平方检验，与2：1或1.5：1理论比值无显著差异（P>0.5），表明以上待测样品中有129份四倍体，23份三倍体；以上表明，上述129尾杂交后代为进一步筛选出的四倍体鱼。

c. 染色体成分检测：

将上述129尾杂交后代继续养殖2～3年，待性成熟时，在繁殖季节（9～12月份）进行所述的染色体来源检测，检测方法为染色体滴片检测；

该检测的目的为：

具体的操作方法为：

从水中把鱼捞起，用手轻轻挤压鱼体腹部，8尾有少量卵子流出，12尾有少量精液流出，109尾既无精液也无卵子流出；从产卵子的8尾和产精液的12尾中各随机抽取2尾作为试验组，普通虹鳟和红点鲑各取2尾作为对照组，制作染色体滴片；

所述的染色体滴片的制作方法为：

检测结果为：

普通虹鳟一套染色体为60条，红点鲑一套染色体为82条，可育的四倍体虹鳟一套染色体为142条。因为四倍体虹鳟的染色体是由一套普通虹鳟染色体加上一套红点鲑的染色体而成。以上表明，上述试验组中的杂交后代确为由普通虹鳟和红点鲑杂交而成的杂交四倍体鱼；

d. 性腺发育状况检测：

该检测的目的为：

将用于上述染色体成分检测中有精液流出的杂交后代中的2尾、有卵子流出的杂交后代中的2尾、和既无精液也无卵子流出的杂交后代中的5尾一同作为试验组；将普通二倍体虹鳟鱼作为对照组；将上述试验组和对照组均进行解剖。

检测结果为：

上述有精液流出的杂交后代中的2尾的精巢内充满乳白粘稠状液体，精巢形态与普通二倍体虹鳟无明显差别；在显微镜下观察精子活力，四倍体虹鳟所产精子的活力明显要弱于二倍体虹鳟精子；

上述有卵子流出的杂交后代中的2尾的卵巢内充满了大小不等的卵子，呈桔黄色；大卵子直径约为24mm，手轻挤压便能分开；小卵子直径约为26mm，手压不能散开；而普通二倍体虹鳟卵子大小较为均等，直径约为12mm。

上述既无精液也无卵子流出的杂交后代中的5尾精巢的或卵巢严重畸形，或无输精管（卵管），或者同一鱼体内存在精巢和卵巢，但两者发育不完善，卵巢中的卵子直径大约1mm。

以上证明，上述有精液流出的杂交后代中的2尾和上述有卵子流出的杂交后代中的2尾确为可育的四倍体虹鳟；所以，虹鳟与红点鲑的杂交后代中存在部分可育的四倍体。

由此可知，本实施例中，由10尾所述的虹鳟和3尾所述的红点鲑进行杂交，得到杂交后代5000尾，其中的2尾为可育的雄性四倍体虹鳟鱼，2尾为可育的雌性四倍体虹鳟鱼。

实施例3：

本实施例的操作方法和注意事项与实施例1相同，区别在于：

B步骤中，所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为10℃的微流水中进行，DO值为5 mg/l，PH值为7.5；

E.将所述的杂交后代进行检测，得到所述的可育的四倍体虹鳟；

所述的检测方法详见实施例1。

本实施例中，由12尾所述的虹鳟和3尾所述的红点鲑进行杂交，得到杂交后代8000尾，其中的3尾为可育的雄性四倍体虹鳟鱼，2尾为可育的雌性四倍体虹鳟鱼。

实施例4：

本实施例的操作方法和注意事项与实施例1相同，区别在于：

B步骤中，所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为8℃的微流水中进行，DO值为5 mg/l，PH值为7.0；

C.当所述的稚幼鱼上浮后，进行分池培育，得到幼鱼；所述的培育中，养殖密度为600尾/m2；

所述的检测方法详见实施例1。

本实施例中，由10尾所述的虹鳟和4尾所述的红点鲑进行杂交，得到杂交后代6000尾，其中的3尾为可育的雄性四倍体虹鳟鱼，4尾为可育的雌性四倍体虹鳟鱼。

实施例5：

本实施例的操作方法和注意事项与实施例1相同，区别在于：

B步骤中，所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为12℃的微流水中进行，DO值为8 mg/l，PH值为9.0；

所述的检测方法详见实施例1。

本实施例中，由11尾所述的虹鳟和4尾所述的红点鲑进行杂交，得到杂交后代7500尾，其中的5尾为可育的雄性四倍体虹鳟鱼，2尾为可育的雌性四倍体虹鳟鱼。

实施例6：

本实施例的操作方法和注意事项与实施例1相同，区别在于：

B步骤中，所述的孵化处理在室内遮光的条件下，水温为13℃的微流水中进行，DO值为12 mg/l，PH值为8.0；

C.当所述的稚幼鱼上浮后，进行分池培育，得到幼鱼；所述的培育中，养殖密度为800尾/m2；

所述的检测方法详见实施例1。

本实施例中，由10尾所述的虹鳟和4尾所述的红点鲑进行杂交，得到杂交后代6500尾，其中的4尾为可育的雄性四倍体虹鳟鱼，3尾为可育的雌性四倍体虹鳟鱼。

Claims

1.一种虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：利用虹鳟和红点鲑进行属间远缘杂交的方法，得到可育的四倍体虹鳟鱼。

2.根据权利要求1所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：所述的虹鳟为性成熟的雌性，所述的红点鲑为性成熟的雄性。

3.根据权利要求1或2所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：

该方法依次包括以下步骤：

B.将所述的受精卵进行孵化处理，得到稚幼鱼；

C.当所述的稚幼鱼上浮后，进行分池培育，得到幼鱼；所述的培育中，养殖密度为600～1000尾/m²；

4.根据权利要求3所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：

C步骤中，所述的培育中，养殖密度为1000尾/m²。

5.根据权利要求3所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：

C步骤中，所述的培育中，养殖密度为1000尾/m²。

6.根据权利要求3所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：

C步骤中，所述的培育中，养殖密度为600尾/m²。

7.根据权利要求3所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：

C步骤中，所述的培育中，养殖密度为600尾/m²。

8.根据权利要求3所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：

C步骤中，所述的培育中，养殖密度为800尾/m²。

9.根据权利要求3所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：所述的检测的项目为细胞水平的初步筛选检测、DNA平均含量检测、染色体成分检测、性腺发育状况检测。

10.根据权利要求4所述的虹鳟四倍体育种方法，其特征在于：所述的细胞水平初步检测采用血涂片检测，所述的DNA平均含量检测采用流式细胞仪技术检测，所述的染色体成分检测采用染色体滴片检测，所述的性腺发育状况检测采用组织解剖检测。