CN102106292B - 鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鲆鲽鱼类三倍体鱼苗批量化生产方法，包括有三倍体鱼苗的诱导方法，以及本发明方法生产的三倍体的鉴定方法和三倍体成鱼生长性能和性腺发育评价方法。本发明建立了采用低温休克批量化生产三倍体鲆鲽鱼类鱼苗的方法，确定了三倍体诱导的适宜起始时间和适宜的低温处理时间；并建立了三倍体鱼苗鉴定的方法；同时建立了三倍体鱼生长和性腺发育状况评价方法。本发明建立的三倍体鱼苗诱导方法可高效、批量化诱导产生三倍体鱼苗，三倍体鱼苗的诱导效率可高达100％，诱导得到的三倍体鱼生长速度比二倍体快20％以上、性腺滞育。本发明的方法操作简单、实用性强、易行、安全可靠，为牙鲆和舌鳎性别控制和多倍体育种开辟了新的技术途径。

Description

鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法

技术领域

本发明属于水产遗传育种技术领域，具体涉及一种鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，即通过染色体组操作批量化生产鲆蝶鱼类三倍体鱼。

背景技术

以牙鲆、半滑舌鳎、星鲽和大菱鲆等为主的鲆鲽鱼类是我国重要的海水养殖鱼类，目前这些鲆鲽鱼类养殖业的年产值超过100亿元；而且鲆鲽鱼类养殖业的规模越来越大，产值越来越高。不过，一些鲆鲽鱼类由于性腺发育影响了鱼体生长和肉质、并且性腺发育造成的腹部凸起降低了鱼的商品质量。因此，对这些鲆蝶鱼类开展不育技术的研究，研制出不育群体，对于提高这些鱼类的养殖产量和商品价值至关重要。另外，目前我国引进的海水鲆鲽鱼类种类也越来越多，例如，大菱鲆、漠斑牙鲆、大西洋牙鲆和大西洋庸蝶等；这些外来生物如果逃逸到自然界中，将会给我国海水鱼类种质资源造成污染。因此，研制这些鱼类的高效不育技术，培育不育群体，在海水养殖业中推广外来种类的不育苗种，这对于保护我国海洋渔业种质资源，显得非常迫切。

三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，属于不育的鱼类。研制鲆鲽鱼类三倍体批量化诱导技术、大量生产不育的三倍体鱼苗，抑制其性腺发育，将生殖腺发育消耗的能量用于生长，克服性腺发育时期的生长停滞和鱼肉质量下降等不利影响，这对于提高鲆蝶鱼类的生长速度、缩短鲆鲽鱼类养殖周期、提高养殖产量、提高养殖的经济效益，推动鲆鲽鱼类养殖产业的发展，具有重要的现实意义和重大的应用价值。同时，三倍体不育苗种的推广必将产生巨大的经济和社会、环保效益。

鉴于三倍体诱导技术在遗传育种、渔业生产、水环境保护和水生生物遗传多样性保护上的重要意义和应用价值，国际上也非常重视鱼类等水产养殖动物三倍体诱导技术的研究。国外在一些淡水鲑鳟鱼类上开展了三倍体诱导的研究。迄今已先后研究了虹鳟、银大马哈鱼、大鳞大马哈鱼、大西洋鲑等鱼类三倍体的诱导技术；除虹鳟外，日本还开展了诱导三倍体香鱼的研究与开发，发现三倍体香鱼的生长速率和抗寒能力都明显优于二倍体香鱼，很受消费者和养殖业主的欢迎，具有很大的商业价值和开发潜力。不过，上述研究获得的三倍体诱导率不高，难以满足产业化生产的需要。另外，迄今为止，有关我国海水鲆鲽鱼类三倍体鱼苗的批量化生产技术以及三倍体成鱼生长和性腺发育等方面的研究目前尚未见报道。并且，由于种类上的差异，将已报道的淡水鱼类三倍体诱导的技术参数用于海水鲆鲽鱼类三倍体诱导时，根本就诱导不出三倍体，无法在实际中得到应用。因此必须建立适合鲆鲽鱼类的三倍体批量化生产方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鲆鲽鱼类三倍体鱼苗批量化生产方法，即建立通过低温诱导受精卵染色体组加倍大量生产鲆鲽鱼类三倍体鱼苗的技术方法，确定最佳的诱导条件，达到产业化生产不育三倍体的目的，以弥补现有技术的不足。

本发明其技术内容包括三个方面：一、三倍体鱼苗的批量化诱导技术；二、三倍体鱼苗的鉴定技术；三、三倍体鱼的生长性能和性腺发育状况评价技术。

一、三倍体鱼苗的批量化诱导技术：

三倍体鱼苗的批量化诱导包括有：1)精、卵采集及人工授精和2)三倍体诱导步骤。

1)精、卵采集和人工授精：

选择性成熟鲆鲽鱼的雌鱼和雄鱼，采集成熟卵和精子，将采集的卵放入适当温度的干燥烧杯中；再将精液加入到未受精卵中，精液和卵的授精最小体积比为500～1000μL∶100～400ml，采用干法受精，轻轻摇动精卵混合混匀，然后加入2倍于卵量体积的适当温度的海水完成授精过程；

其中牙鲆卵置于15～19℃的干燥烧杯中，加入的海水温度为15～19℃；

半滑舌鳎卵置于20～24℃的干燥烧杯中，加入的海水温度为20～24℃；

条斑星鲽卵置于8～9℃的干燥烧杯中，加入的海水温度为8～9℃；

2)三倍体鱼苗批量化诱导：

在授精3～9min后将受精卵放入-2～6℃的海水中进行低温休克处理诱导三倍体，处理时间为15～80min，处理完成后将受精卵移入海水中培育成三倍体鱼苗；

其中牙鲆在授精后3～4min，将授精卵放入2～4℃冰海水中进行低温休克处理，处理时间为25～30min；低温处理后将受精卵移入15～19℃海水中培养；

半滑舌鳎在授精5～6min后，将授精卵置于4～6℃冰海水中进行冷休克处理，处理时间为20～23min；低温处理后将受精卵移入20～24℃海水中培养；

条斑星鲽在授精7～9min后，将授精卵置于-2～1℃冰海水中进行冷休克处理，处理时间为50～80min；低温处理后将受精卵移入8～9℃海水中发育。

其中，三倍体诱导起始时间的确定如下：

褐牙鲆：在授精后不同时间(3min和4min)，将褐牙鲆授精卵分别放入冰海水浴中进行低温休克处理；处理水温为2～4℃，处理时间15～65min；低温处理后将受精卵移入15～19℃海水中培养。结果表明，在授精后3min，在3℃冰水浴中冷休克处理15～65min均可产生近100％的三倍体鱼苗，且处理15～35min时，处理后三倍体鱼苗的成活率都很高，达78～90％，这个成活率明显高于在授精后4分钟冷休克处理15～35min的各组。因此确定褐牙鲆三倍体诱导的最佳起始时间为授精后3min左右。

半滑舌鳎：在授精后不同时间(3，4，5，6，7，8，9min)，将舌鳎授精卵分别放入3～6℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为15～35min，冷休克处理完毕后将卵移入20～24℃海水中培养。统计受精率和三倍体率。发现在授精后4～7min进行冷休克处理都能够诱导产生三倍体，且以授精后5～6min的诱导率最高，三倍体比率达95％左右。因此确定褐牙鲆三倍体诱导的最佳起始时间为授精后5～6min。

条斑星鲽：在授精后不同时间(3，4，5，6，7，8，9，11min)，将星鲽授精卵放入-2～1℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为30～100min，冷休克处理完毕后将卵移入8～9℃海水中培养。统计受精率和三倍体率。发现在授精后5～11min进行冷休克处理能够使染色体加倍，可以产生三倍体，且以授精后7～9min的诱导率最高，达95％左右。因此确定条斑星鲽三倍体诱导的最佳起始时间为授精后7～9min。

诱导三倍体冷休克处理持续时间的确定：

褐牙鲆：在授精3～4min后，将受精卵置于2.5～3.5℃的海水中分别处理15，25，35，45，65min后，分别移入15～19℃海水中培养，根据成活率和三倍体诱导率的高低，确定三倍体褐牙鲆诱导的最佳低温休克时间为25～30min。

综上，褐牙鲆三倍体诱导的的最佳条件是在授精后3min，将受精卵在3℃冰水浴中进行低温休克处理，处理时间为25～30min，最佳为25min。

半滑舌鳎：在授精5～6min后，将舌鳎受精卵置于4～6℃的海水中分别处理10，15，18，20，23和26分钟后，分别移入20～24℃海水中培养，根据三倍体诱导率和成活率的高低，确定适宜的冷休克处理时间。发现随着冷休克处理时间的延长，三倍体比率逐渐增加，至26min达最高，但在26min后，鱼苗成活率又急剧下降，综合考虑三倍体比率和鱼苗的成活率，确定三倍体舌鳎诱导的最佳低温休克处理时间为20～23min。

综上，半滑舌鳎三倍体的最佳诱导条件是在授精5～6min时将受精卵放置在4～6℃冰海水中低温休克处理20～23min。

条斑星鲽：在授精7-9min后，将星鲽授精卵放入-2～1℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为30～110min，冷休克处理完毕后将卵移入8～9℃海水中培养。统计受精率和三倍体率。发现冷休克处理50-80min能够使染色体加倍，可以产生三倍体。因此确定条斑星鲽三倍体诱导的冷休克处理时间为50～80min。

综上，条斑星鲽三倍体鱼苗的最佳诱导条件是在授精后7-9min时将受精卵放置在-2～1℃冰海水中低温休克处理50～80min。

二、三倍体鱼苗的鉴定

三倍体鲆鲽鱼的鉴定方法，包括：1)通过DNA含量鉴定三倍体；2)通过染色体数量鉴定三倍体：

1)通过DNA含量鉴定三倍体

采用商业上可获得的PARTEC倍性测定仪(PA)及一步法染色试剂进行三倍体鱼苗和/或成鱼的倍性鉴定。采用正常二倍体鱼苗作对照，通过分析鱼苗或成鱼细胞DNA的相对含量确定倍性。

牙鲆二倍体鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在34处，而三倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在55～59处，是二倍体鱼苗的1.6倍左右，从而确定细胞DNA含量在55～59的牙鲆鱼苗为三倍体。

半滑舌鳎二倍体鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在25～27处，而三倍体鱼苗中95％以上的个体的DNA含量在38～40处，是二倍体鱼苗的1.5倍左右，从而确定细胞DNA含量在38～40的舌鳎鱼苗为三倍体。

2)通过染色体数量鉴定三倍体

褐牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝48条；而三倍体鱼苗的染色体数目应该为3n＝72，在授精后3min，将受精卵置于3℃低温下处理30～35分钟，产生的鱼苗都含有72条染色体，即这些鱼苗为三倍体牙鲆鱼苗。

半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝42条，而三倍体鱼苗的染色体数目应该为63条；在授精后5～6min，将受精卵置于4～6℃的海水中冷休克处理20～25min，产生的鱼苗都含有63条染色体，即这些鱼苗为三倍体舌鳎鱼苗。

三、三倍体鱼的生长性能和性腺发育状况评价：

它的技术内容包括：1)生长性能评价；和2)性腺发育状况评价；

1、三倍体鱼的生长性能评价；

当三倍体鱼苗和二倍体鱼苗生长至10厘米左右时，进行荧光标记后混养在同一个水泥池中，养殖1年多以后，随机采样各30尾以上，进行全长和体重测量，计算三倍体和二倍体鱼的全长和体重平均数，并进行差异显著性分析，当P＜0.05时，认为差异显著，由此比较三倍体和二倍体鱼的生长性能。采用这种方法发现养殖630天的褐牙鲆三倍体鱼的全长为39.5±3.1厘米，而二倍体对照鱼的全长为34.7±4.0厘米，三倍体全长比二倍体大13.8％，差异极显著(P＜0.01)；褐牙鲆三倍体鱼体重为634.2±149.1克，而二倍体鱼体重为490.0±159.8克，三倍体鱼体重比二倍体高出29.4％，差异极显著(P＜0.01)。

2、三倍体鱼性腺发育状况评价；

当三倍体和二倍体鱼养殖1年多以后，随机采样15尾以上个体测量全长和体重，并解剖取出性腺后称重，按照公式：性腺-体重指数(％)＝(性腺重量/鱼体重)×100％计算性腺-体重指数，性腺-体重指数越大，表明性腺发育越好，反之，性腺-体重指数越小，表明性腺发育越差，从而评价三倍体鱼的性腺发育状况。

本发明中测量了养殖630天的二倍体褐牙鲆和三倍体褐牙鲆鱼的体重和全长，并解剖和称量了性腺重，测定结果表明，二倍体雌鱼的性腺-体重指数为0.938±0.140，而三倍体雌鱼的性腺-体重指数为0.282±0.060；二倍体雄鱼的性腺-体重指数为0.512±0.155，而三倍体雄鱼的性腺-体重指数为0.163±0.028；雌性和雄性二倍体的性腺～体重指数分别是三倍体的3.3倍和3.1倍，差异极显著(P＜.01)，三倍体牙鲆性腺明显小于二倍体牙鲆性腺，性腺发育不良；同时在显微镜下观察发现，二倍体牙鲆雄鱼性腺含有大量成熟的精子，用海水激活后可以观察到大量精子游动，而三倍体雄鱼性腺中则无成熟的精子，用水激活后也无精子游动。

本发明建立了采用低温休克批量化生产鲆鲽鱼类三倍体的方法，确定了三倍体诱导的适宜起始时间和适宜的低温处理时间；并建立了三倍体鱼苗鉴定的方法；同时建立了三倍体鱼生长和性腺发育状况评价方法。本发明建立的三倍体鱼苗诱导方法可高效、批量化诱导产生三倍体鱼苗，三倍体鱼苗的诱导效率可高达100％，每次可生产5-15万三倍体鱼苗，诱导得到的三倍体鱼生长速度比二倍体快20％以上、性腺滞育。通过本方法诱导出的三倍体鱼苗倍性整齐、不含二倍体和四倍体，并且本发明的方法操作简单、实用性强、易行、安全可靠，为牙鲆和舌鳎性别控制和多倍体育种开辟了新的技术途径，可推广应用于几乎所有海水鱼类，对鱼类性别控制具有重要意义。

附图说明

图1：褐牙鲆三倍体诱导适宜起始时间和冷休克处理持续时间的确定

A：褐牙鲆卵授精后3min，3℃低温休克处理；

B：褐牙鲆卵授精后4min，3℃低温休克处理

图2：褐牙鲆三倍体鱼苗和二倍体鱼苗细胞DNA含量比较：

A：正常二倍体鱼苗细胞DNA含量；B：三倍体鱼苗DNA含量。

图3：褐牙鲆三倍体鱼苗和二倍体鱼苗染色体比较：

A：正常二倍体鱼苗染色体；B：三倍体鱼苗染色体。

图4：生长630天的牙鲆三倍体成鱼和二倍体成鱼的性腺比较：

A：左边为590g二倍体牙鲆雌性性腺，右边为600g三倍体牙鲆雌性性腺；B：左边为480g二倍体牙鲆雄性性腺，右边为810g三倍体牙鲆雄性性腺。

图5：半滑舌鳎三倍体鱼苗和二倍体鱼苗细胞DNA含量比较：

A：正常二倍体鱼苗细胞DNA含量；B：三倍体鱼苗DNA含量。

图6：半滑舌鳎三倍体鱼苗和二倍体鱼苗染色体比较：

A：正常二倍体鱼苗染色体；B：三倍体鱼苗染色体。

具体实施方式

采用同源精子与卵子受精，在授精后一定时间，采用可降温的恒温水浴箱对受精卵进行低温休克处理，抑制受精卵第二极体的释放，可以大批量诱导鲆鲽鱼类三倍体鱼苗的产生。建立鲆鲽鱼类三倍体鱼苗高效诱导技术，对于鲆鲽鱼类的性别控制，进行不育苗种生产，提高鲆鲽鱼类生长速度、养殖产量、产品质量和经济效益，具有重要的现实意义和巨大的推广应用潜力。

下面以褐牙鲆和舌鳎为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明：

实施例一、三倍体牙鲆批量化生产：

包括三个方面：一)、三倍体褐牙鲆鱼苗的批量化生产；二)、三倍体褐牙鲆鱼苗的鉴定；三)、三倍体褐牙鲆的生长性能和性腺发育状况评价。

一)、三倍体褐牙鲆鱼苗的批量化生产：

它的技术内容包括：1)精、卵采集及人工授精和2)三倍体诱导步骤。

1)精、卵采集及人工授精：

选择自然发育性成熟或人工催产后达到性成熟的褐牙鲆雌鱼和雄鱼，采用人工挤压腹部法采卵和采精，将采集的牙鲆卵置于室温为15～19℃的干燥烧杯中；将采集的牙鲆新鲜精液加入未受精卵中，精液和卵的受精最小体积比为500～1000μL∶100～400ml，干法授精，轻轻摇动混匀，后加入2倍于卵量体积的海冰，海水温度褐牙鲆为15～19℃，完成授精过程；

2)三倍体诱导步骤

包括有三倍体诱导起始时间的确定和三倍体冷休克处理持续时间确定两个主要方面。

本发明采用Huber生产的Polystat CC系列可降温的恒温水浴箱产生不同温度的冷海水，对授精卵进行低温处理，抑制受精卵第二极体排出，从而使染色体加倍的方法进行三倍体诱导。首先通过不同温度实验，初步确定了适宜褐牙鲆染色体加倍的冷休克处理水温为2～4℃，然后再进行如下实验。在授精后不同时间(3min和4min)，将牙鲆授精卵分别放入2～4℃冷海水浴中进行低温休克处理，每次可处理100～400毫升卵；处理时间15～65min，低温处理后将受精卵移入15～19℃海水中培养，再统计成活率、畸形率和三倍体比率。结果表明，在授精后3min，在3℃冰水浴中冷休克处理15～65min均可产生近100％的三倍体鱼苗，且处理15～35min时，处理后三倍体鱼苗的成活率都很高，达78～90％，这个成活率明显高于在授精后4分钟冷休克处理15～35min的各组，因此确定牙鲆三倍体诱导的最佳起始时间为授精后3min(见图1)。

低温诱导褐牙鲆三倍体处理时间的确定：

确定低温休克起始时间后，设定低温休克温度为3℃，处理时间为15，25，35，45，65min进行低温休克处理，统计成活率、畸形率和三倍体比率。根据成活率和三倍体诱导率的高低，确定适宜的低温休克处理时间，实验结果表明，牙鲆受精卵在3℃低温下休克处理15～65分钟，三倍体鱼苗诱导率差异不大，均为100％左右，但随着低温休克处理时间的延长，鱼苗成活率逐渐下降，只有在处理25min时三倍体鱼苗的成活率最高，达90％左右，畸形率最低，故确定牙鲆低温休克处理时间为25min左右(见图1)。

褐牙鲆三倍体鱼苗批量化生产结果汇总：

采用上面建立的方法，我们进行了褐牙鲆三倍体鱼苗的批量化生产，在多次规模化诱导实验中获得大量三倍体鱼苗，现将牙鲆三倍体诱导结果汇总如下表1：

表1：褐牙鲆三倍体鱼苗诱导结果汇总(室温15-17℃)

二)、三倍体褐牙鲆鱼苗的鉴定：

它的技术内容包括：1、DNA含量鉴定牙鲆三倍体鱼苗；2、染色体分析鉴定三倍体鱼苗。

1、通过DNA含量鉴定牙鲆三倍体鱼苗：

在牙鲆三倍体鱼苗诱导实验中，抽检孵化出膜后2～5天的鱼苗20～30尾。将每尾鱼苗放入1个1.5ml的离心管中，用蒸馏水清洗鱼苗1次，随后向每个离心管加入0.2ml PBS，用碾磨棒将鱼苗碾碎成单细胞，制成单细胞悬液；全部磨好后，向每个管中加入1～2ml从PARTEC公司购买的一步法染色试剂，用滤膜过滤后，将滤液转入仪器配套的5ml试管中，轻弹试管，使细胞悬液混合均匀，然后将试管置于PARTEC倍性测定仪(PA)进行测定。测试样品，用正常二倍体胚胎作对照，再分析三倍体诱导组。

通过细胞DNA含量分析，得知二倍体鱼苗细胞中的DNA含量绝大多数集中在34处，而三倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在55～59(表2)，是二倍体鱼苗的1.6倍左右(见图2：A、B)，因此证明我们诱导出的鱼苗为三倍体鱼苗。采用倍性测定仪主要是证明本发明方法诱导牙鲆三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行牙鲆三倍体生产时，则不必要每次都进行三倍体鱼苗的检测。

表2：流式细胞仪测定三倍体鱼苗DNA相对含量汇总(三倍体率100％)

2、通过染色体分析鉴定三倍体鱼苗：

褐牙鲆二倍体的染色体数目为2n＝48条；而三倍体鱼苗的染色体数目为3n＝72，因此通过染色体分析即可鉴定诱导出的鱼苗是否为三倍体鱼苗。如果诱导出的鱼苗的染色体数目为72条，则证明这些鱼苗是三倍体。本发明采用鱼苗染色体制片方法，对人工诱导的褐牙鲆三倍体鱼苗进行染色体分析。主要步骤包括：将1～15日龄的鱼苗置于海水配置的0.02％的秋水仙素中，在室温下处理2个小时。然后把鱼苗放入0.075mol/L的KCL中，低渗25～35分钟。用新配制的预冷卡诺氏液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)连续固定3次，每次20分钟。再取单个鱼苗放入50％的冰醋酸中，使细胞游离。热滴片法滴片。10％吉姆萨染液染色20～30分钟，镜检。每次三倍体诱导实验抽检10～20尾鱼苗进行染色体分析，发现在优化的低温休克条件下产生的鱼苗都含有72条染色体，正常二倍体鱼苗的染色体数为48条，因此，含有72条染色体的鱼苗就是三倍体鱼苗(见图3：A、B)。由此证明本方法诱导的鱼苗的三倍体比例高达100％。采用染色体分析主要是证明本发明方法诱导牙鲆三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行牙鲆三倍体诱导时，则不必要每次都进行三倍体鱼苗的染色体分析。

三)、三倍体褐牙鲆生长性能和性腺发育状况评价：

它的技术内容包括：1、三倍体鱼的生长性能评价；2、三倍体鱼性腺发育状况评价

1、三倍体鱼的生长性能评价；

当三倍体鱼苗和二倍体鱼苗生长至10厘米左右时，进行荧光标记后混养在同一个水泥池中，养殖1年多以后，随机采样各30尾以上，进行全长和体重测量，计算三倍体和二倍体鱼的全长和体重平均数，并进行差异显著性分析，当P＜0.05时，认为差异显著，由此比较三倍体和二倍体鱼的生长性能。

本实施例中，当2009年4～5月份生产的三倍体和二倍体褐牙鲆鱼苗生长至10厘米左右时，进行了荧光标记后饲养在同一个水泥池中，按照常规方法进行养殖，生长比较主要是通过测量全长和体重进行。当养殖到日龄为630天时，随机采样各30尾以上，进行全长和体重测量，计算三倍体和二倍体鱼的全长和体重平均数，以分析三倍体牙鲆和二倍体牙鲆的生长性能。每组随机测量36尾以上个体，发现二倍体牙鲆平均全长为34.7±4.0厘米，三倍体牙鲆平均全长为39.5±3.1厘米；二倍体牙鲆平均体重为490.0±159.8克，三倍体牙鲆平均体重为634.2±149.1克。分析表明，三倍体牙鲆全长比二倍体大13.8％，差异极显著(P＜0.01)；在体重方面，三倍体鱼体重比二倍体高出29.4％，差异极显著(P＜0.01)。由此可见，三倍体牙鲆比二倍体牙鲆生长快约29％，不到两年即可达到商品鱼规格。

2、三倍体鱼性腺发育状况评价：

当三倍体和二倍体鱼养殖1年多以后，随机采样15尾以上个体测量全长和体重，并解剖取出性腺后称重，按照公式：性腺-体重指数(％)＝(性腺重量/鱼体重)×100％计算性腺-体重指数，性腺-体重指数越大，表明性腺发育越好，反之，性腺-体重指数越小，表明性腺发育越差，从而评价三倍体鱼的性腺发育状况。

本发明中测量了养殖630天的二倍体褐牙鲆和三倍体褐牙鲆鱼的体重和全长，并解剖和称量了性腺重，分别取15尾二倍体和15尾三倍体褐牙鲆进行解剖，在解剖前称量体重，取出性腺后称量性腺重量。按照如下公式：性腺-体重指数(GSI)(％)＝(性腺重量/鱼体重量)×100，计算其性腺-体重(GSL)指数，性腺-体重指数越大，表明性腺发育越好，反之，性腺-体重指数越小，表明性腺发育越差。测定结果表明，二倍体雌鱼的性腺-体重指数为0.938±0.140，而三倍体雌鱼的性腺-体重指数为0.282±0.060；二倍体雄鱼的性腺-体重指数为0.512±0.155，而三倍体雄鱼的性腺-体重指数为0.163±0.028；雌性和雄性二倍体的性腺-体重指数分别是三倍体的3.3倍和3.1倍，差异极显著(P＜0.01)，由此表明三倍体牙鲆性腺发育不良，性腺明显小于二倍体牙鲆性腺(表3)(图4)。同时，在显微镜下观察发现，二倍体牙鲆雄鱼性腺含有大量成熟的精子，用海水激活后可以观察到大量精子游动，而三倍体雄鱼性腺中则无成熟的精子，用水激活后也无精子游动。

表3褐牙鲆二倍体和三倍体的性腺-体重指数比较

上述的三倍体诱导方法可以用于其他牙鲆类鱼的三倍体诱导，例如漠斑牙鲆和大西洋牙鲆，并且诱导效果同褐牙鲆的相近，每次诱导可生产5-15万三倍体鱼苗。

实施例二、三倍体半滑舌鳎批量化生产

包括二个方面内容：一)、三倍体鱼苗的批量化生产；二)、三倍体鱼苗的鉴定；三)、三倍体生长和性腺发育评价

一)、三倍体鱼苗的批量化生产：

它的技术内容包括：1)精、卵采集及人工授精和2)三倍体诱导步骤。

1)精、卵采集及人工授精：

半滑舌鳎亲鱼为山东海阳黄海水产有限公司和莱州明波水产有限公司人工培育的半滑舌鳎亲鱼，多倍体诱导实验也是在上述两个公司进行。选择体表无损伤的半滑舌鳎雌性和雄性成鱼作为亲鱼，雌鱼体重应在为2～4kg/尾；雄鱼体重为200～450g/尾，按每平方米一雌二雄的密度进行室内流水养殖，投喂贝类、野杂虾和活沙蚕等新鲜活饵料，每天的投饵量为鱼体重的2～4％。对达到性成熟年龄(雌性3年、雄性2年)的亲鱼，共选择了500尾亲鱼，进行控温控光；在此期间，水温按每10天升高0.5～1℃从17～19℃逐步升高到22～23℃，并维持在此温度；光照时间按每10天延长1小时由每天8小时逐渐延长到16小时，并维持在16小时。通过观察和手摸检查选择性腺明显隆起、用手轻压性腺上下两侧有明显的充实感且性腺前端有一定的柔软度的雌鱼，用于人工挤卵或人工催产。雄性亲鱼要选择轻挤性腺部位，可以看到精液流出者用于采精。采用人工挤压腹部法采卵和采精，将采集的舌鳎卵置于20～24℃的干燥烧杯中；将采集的舌鳎新鲜精液加入到未受精卵中，精液和卵的受精最小体积比为500～1000μL∶100～400ml，干法受精，轻轻摇动混匀，后加入2倍于卵量体积的海水，海水温度为20～24℃，完成授精过程。

2)三倍体诱导步骤

1、三倍体诱导起始时间的确定：

首先采用Polystat CC系列可降温的恒温水浴箱，进行不同温度实验，初步确定了适宜半滑舌鳎染色体加倍的冷休克处理水温为3～6℃，然后再进行如下实验。在舌鳎卵授精后不同时间(3，4，5，6，7，8，9min)，将卵放入3～6℃海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为15～35min，冷休克处理完毕后将卵移入20～24℃海水中培养。原肠中期统计受精率，鱼苗出膜后测定三倍体鱼苗比率。结果表明在授精后4～7min进行冷休克处理都能够诱导产生一定比例的三倍体，且以授精后5～6min进行低温休克处理产生的三倍体诱导率最高，三倍体比率达95％左右，并且鱼苗的成活率也高于其它时间点，因此，确定舌鳎三倍体诱导最佳起始时间为授精后5～6min.

2、诱导舌鳎三倍体冷休克处理持续时间的确定：

在授精后5～6min，将舌鳎受精卵置于4～6℃的海水中分别处理10，15，18，20，23和26分钟后，分别移入20～24℃海水中培养，根据三倍体诱导率和成活率的高低，确定适宜的冷休克处理时间。发现随着冷休克处理时间的延长，三倍体比率逐渐增加，至26min达最高，但在26min时，鱼苗成活率又急剧下降，综合考虑三倍体比率和鱼苗的成活率，确定三倍体舌鳎诱导的最佳低温休克处理时间为20～23min(表4)。

表4：舌鳎三倍体诱导冷休克处理持续时间的筛选

冷休克处理持续时间(min)	成活率(孵出鱼苗的百分率，％)	三倍体率(％)
			10	53±3	41.2±13.4
15	50±5	62.6±13.8
			18	52.5±2.5	77.6±12.6
20	49.0±5	85.4±10.2
			23	50.1±5	93.2±5.8
26	10.5±4	95.0±13

二)、三倍体舌鳎鱼苗的鉴定：

它的技术内容包括：1、DNA含量鉴定三倍体鱼苗；2.通过染色体分析鉴定三倍体鱼苗。

1、通过DNA含量鉴定三倍体鱼苗：

采用商业上可获得的PARTEC倍性测定仪(PA)及一步法染色试剂进行三倍体鱼苗和成鱼的倍性鉴定。测定方法与前面描述的牙鲆三倍体细胞DNA含量测定方法相同。采用正常二倍体舌鳎鱼苗作对照，通过分析舌鳎鱼苗细胞DNA的含量确定倍性，二倍体舌鳎鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在25～27处，而三倍体鱼苗中约95％的个体的DNA含量在38～40处，是二倍体鱼苗的1.5倍，从而确定细胞DNA含量在38～40的舌鳎鱼苗为三倍体(图5)。

采用DNA含量鉴定三倍体鱼苗染色体倍性主要是证明本发明方法诱导舌鳎三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行舌鳎三倍体鱼苗批量化生产时，则不必要每次都进行三倍体鱼苗的染色体倍性分析。

2、通过染色体分析鉴定三倍体鱼苗：

半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝42条，而三倍体鱼苗的染色体数目应该为63条；因此，通过染色体分析也可以鉴定鱼苗的染色体倍性，舌鳎鱼苗染色体分析方法与前面描述的牙鲆鱼苗染色体制备方法相同。在授精后5～6min，将受精卵置于4～6℃的海水中冷休克处理20～30min，产生的鱼苗都含有63条染色体，即这些鱼苗为三倍体半滑舌鳎鱼苗(图6)。

采用染色体分析主要是证明本发明方法诱导舌鳎三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行舌鳎三倍体批量化生产时，则不必要每次都进行三倍体鱼苗的染色体分析。

三)、三倍体舌鳎生长性能和性腺发育状况评价：

技术内容包括：1、三倍体鱼的生长性能评价；2、三倍体鱼性腺发育状况评价

1、三倍体鱼的生长性能评价：参照褐牙鲆的评价方法对三倍体舌鳎鱼苗进行了生长性能评价，结果表明，在同样的养殖条件下，三倍体半滑舌鳎鱼苗的体重高出二倍体半滑舌鳎20％；即三倍体比二倍体生长快20％以上。

2、三倍体鱼性腺发育状况评价：参照褐牙鲆的评价方法对三倍体舌鳎鱼苗进行了性腺发育状况评价，结果表明，三倍体舌鳎性腺发育不好，性腺-体重指数仅为二倍体的1/3。

本实施例的方法也可用于舌鳎属的其他种类，例如塞内加尔鳎、三线舌鳎等，诱导的效果同本实施例的半滑舌鳎。

实施例三、三倍体星鲽鱼苗批量化诱导

包括二方面内容：一)、条斑星鲽三倍体鱼苗的批量化诱导；二)、条斑星鲽三倍体鱼苗的鉴定；

一)、条斑星鲽三倍体鱼苗的批量化诱导；

采用类似于褐牙鲆和舌鳎三倍体鱼苗批量化诱导参数的筛选方法进行了条斑星鲽三倍体鱼苗的批量化诱导，摸索出适合条斑星鲽三倍体诱导等技术条件，获得条斑星鲽三倍体鱼苗。即先选择性成熟的条斑星鲽雌鱼和雄鱼，采用人工挤压腹部法采卵和精，将卵采入干燥的烧杯中，放在8～9℃室温存放；首先采用Polystat CC系列可降温的恒温水浴箱，进行不同温度实验，初步确定了适宜条斑星鲽染色体加倍的冷休克处理水温为-2～1℃，然后再进行下面的实验。将条斑星鲽精子加入到条斑星鲽未受精卵中，轻轻摇动混匀，精卵的比例参照牙鲆和舌鳎的参数，混均后加入温度为8～9℃，2倍于卵量的海水完成授精过程，精液和卵的比例同褐牙鲆。授精过程在1000ml烧杯中进行；在授精后不同时间，对受精卵进行染色体加倍诱导；通过大量实验确定适合于条斑星鲽卵染色体加倍的诱导条件为：卵子授精后7～9分钟，将授精卵放在-2～1℃的水浴中进行冷休克处理，处理时间为50～80min，冷休克处理后将授精卵置于8～9℃左右的海水中进行孵化，随后转到育苗池中进行苗种培育。在此条件下能够大量获得三倍体条斑星鲽鱼苗，三倍体诱导鱼苗的成活率为50-70％。

二)、条斑星鲽三倍体鱼苗的鉴定；

借鉴褐牙鲆和舌鳎三倍体鱼苗的鉴定方法，对诱导获得的条斑星鲽三倍体鱼苗进行了鉴定，当采用商业上可获得的PARTEC倍性测定仪(PA)及一步法染色试剂进行三倍体鱼苗倍性鉴定时，与褐牙鲆和舌鳎类似，条斑星鲽二倍体鱼苗细胞DNA含量在33-35左右，三倍体鱼苗的DNA含量在54～60左右；因此，当某条鱼苗的DNA含量为二倍体对照鱼DNA含量的1.5倍时，认为这条鱼为三倍体。采用这种方法鉴定表明条斑星鲽三倍体鱼苗的诱导率为95％以上。

当采用染色体分析方法鉴定三倍体鱼苗时，因为条斑星鲽二倍体鱼苗的染色体为46条，如果某条鱼苗的染色体为69条时，即可认为这条鱼苗为三倍体鱼苗。通过这种方法就可以大量诱导和鉴定条斑星鲽三倍体鱼苗。

本实施例的方法也可用于鲽科的其他经济种类，例如圆斑星鲽等，诱导的效果同本实施例的条斑星鲽。

由此可见，采用上述方法和参数可以大量生产鲆鲽鱼类三倍体鱼苗，三倍体鱼苗的比率达到95％-100％；一次可生产三倍体鱼苗5-15万尾；同时，三倍体鲆鲽鱼由于性腺的退化，更多的能量用于生长，因此具有更快的生长速率，能够明显提高鲆蝶鱼类的养殖产量和经济效益，具有产业化推广应用价值。

Claims (3)

1.一种鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，其特征在于批量化诱导方法，包括有1)精、卵采集和人工授精；2)三倍体鱼苗批量化诱导步骤：

1)精、卵采集和人工授精：

选择性成熟牙鲆鱼的雌鱼和雄鱼，采集成熟卵和精子，将采集的卵放入15～19℃的干燥烧杯中；再将精液加入到未受精卵中，精液和卵的授精最小体积比为500-1000μL∶100～400ml，采用干法授精，轻轻摇动精卵混合混匀，然后加入2倍于卵量体积的15～19℃的海水完成授精过程；

2)三倍体鱼苗批量化诱导：

在授精3～4min后将受精卵放入2～4℃的海水中进行低温休克处理诱导三倍体，处理时间为25～30min，处理完成后将受精卵移入15～19℃的海水中培育成三倍体鱼苗。

2.权利要求1所述的鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，其特征在于还包括三倍体鱼苗的鉴定：

1)通过DNA含量鉴定三倍体

采用PARTEC倍性测定仪和一步法染色试剂进行三倍体鱼的倍性鉴定，采用正常二倍体鱼作对照，通过分析鱼细胞DNA的相对含量确定倍性；

牙鲆二倍体鱼苗细胞DNA含量在34左右，三倍体鱼苗的DNA含量在55～59处；或三倍体鱼苗的DNA含量为二倍体的1.5倍左右；

2)通过染色体数量鉴定三倍体

牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝48条；三倍体鱼苗的染色体数目为3n＝72条。

3.权利要求1所述的鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，其特征在于还包括三倍体鱼的生长性能和性腺发育状况评阶方法：

1)、三倍体鱼的生长性能评价方法：

当三倍体鱼苗和二倍体鱼苗生长至10厘米左右时，进行荧光标记后混养在同一个水泥池中，养殖1年多以后，随机采样各30尾以上，进行全长和体重测量，计算三倍体和二倍体鱼的全长和体重平均数，并进行差异显著性分析，当P＜0.05时，认为差异显著，由此比较三倍体和二倍体鱼的生长性能；

2)、三倍体鱼性腺发育状况评价方法：

当三倍体和二倍体鱼养殖1年多以后，随机采样15尾鱼以上测量全长和体重，并解剖取出性腺后称重，按照公式：性腺-体重指数％＝性腺重量/鱼体重×100％来计算性腺-体重指数，性腺-体重指数越大，表明性腺发育越好，反之，性腺-体重指数越小，表明性腺发育越差，从而评价三倍体鱼的性腺发育状况。 

Images