CN111937783A - 一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法 - Google Patents

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汪波
徐冬冬
陈睿毅
竺奇慧
谭朋
王立改
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    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
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Abstract

本发明涉及多倍体育种方法，针对现有技术的黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导技术空白的问题，公开了一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，包括如下步骤：（1）培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼；（2）采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精；（3）三倍体全雌鱼鱼苗诱导和取样检测。本发明涉及一种安全高效新颖且操作简单，具有较强的实用性的诱导方法，该方法为黄姑鱼等石首科鱼类的性别控制育种及多倍体育种开辟了新的技术途径；本发明建立的黄姑鱼三倍体全雌鱼诱导方法可批量、高效的诱导产生黄姑鱼三倍体全雌鱼鱼苗。该诱导方法新颖且操作简单，具有较强的实用性，安全性高。

Description

一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法
技术领域
本发明涉及多倍体育种方法，尤其涉及一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法。
背景技术
在水产养殖中，由于鱼类三倍体较之二倍体在生长、出肉率等方面具有明显的优势，所以培育三倍体成为鱼类育种的有效方法之一。另外，部分鱼类具有性别二态性，表现为雌/雄鱼比另一性别生长快、体重大等特点。人工诱导三倍体已经广泛应用于国内外多种鱼类遗传育种的研究与实践中，成为鱼类品种改良的有效手段。三倍体鱼类可提高鱼类生长速度和改善鱼肉品质等，在水产养殖中显示出重大应用价值，使鱼类三倍体育种的研究备受国内外众多科研工作者的青睐。部分种类己经形成了可稳定获得三倍体的遗传群体，实现生产应用化阶段，取得了良好的经济效益。三倍体鱼肌肉营养分析显示，三倍体鱼肌肉的营养价值比二倍体高，且具有更好的口感，更受消费者欢迎。另外，有研究表明黄姑鱼雌性个体生长快，成熟后雌性个体约是雄性个体的1.5倍，这一特性使得其全雌化养殖倍受重视。因此，开展黄姑鱼三倍体全雌鱼诱导技术研究，培育出优质、高产的新品种，对于黄姑鱼苗种的推广及其养殖业的发展具有重要意义。
专利号CN201310336273.9，专利名称“黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法”，该发明公开了一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，其技术方案要点包括黄姑鱼精子的遗传失活和卵子的二倍体化；主要途径首先用紫外线照射黄姑鱼精液使精子遗传失活，然后与黄姑鱼卵子混合后，用海水激活，启动黄姑鱼卵子的雌核发育，再用冷休克抑制第二极体排放，使卵子的染色体组加倍，诱导出黄姑鱼雌核发育二倍体。
其不足之处在于，黄姑鱼雌核发育二倍体的生长速度及鱼肉品质都有所欠佳。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导技术空白的问题，提供一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，涉及一种安全高效新颖且操作简单，具有较强的实用性的诱导方法，该方法为黄姑鱼等石首科鱼类的性别控制育种及多倍体育种开辟了新的技术途径；本发明建立的黄姑鱼三倍体全雌鱼诱导方法可批量、高效的诱导产生黄姑鱼三倍体全雌鱼鱼苗。该诱导方法新颖且操作简单，具有较强的实用性，安全性高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，包括如下步骤：
(1)培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼；
(2)采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精；
(3)三倍体全雌鱼鱼苗诱导和取样检测。
本发明通过培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼，并且采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精，最后在进行三倍体诱导培育，得到黄姑鱼三倍体全雌鱼，此类鱼具有极高的经济价值。其诱导原理在于，鱼类卵子的第二极体在受精完成以后才排出，三倍体诱导是利用外界条件抑制第二极体从受精卵排出诱导产生三倍体，而雌核发育诱导产生全雌鱼是通过应用灭活精子授精后，抑制第二极体排出或单倍体加倍。本发明就是在利用这两大特性的基础上诱导产生三倍体全雌鱼的，以充分应用三倍体黄姑鱼雌鱼生长快及肉质鲜美的优势，来极大提升其在养殖业中的发展地位。
作为优选，步骤(1)中获得雌核发育黄姑鱼具体方法：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于1300-1400μW/cm2的紫外线下灭活，随后将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子按照体积比1：10-12混合，加入海水混匀授精2-3min，将受精卵浸入3～4℃的海水中进行冷休克处理10-15min，然后在18～20℃海水中孵化34-38h至出膜，得到雌核发育黄姑鱼苗。
此步骤中条石鲷精液用紫外线灭活后，用于在保证黄姑鱼卵子能够正常发育的情况下，不会引入外鱼种的遗传物质，保证黄姑鱼的纯正性，之后经过冷休克处理，将其诱导为二倍体。
作为优选，骤(1)中培育伪雄黄姑鱼具体方法：配制含有来曲唑的饲料，将来曲唑溶于94-96％的酒精中，再将溶液倒入饲料中，配制成含有来曲唑10-12mg/kg的配合饲料，将鉴定出的雌核发育黄姑鱼苗在30日龄起开始投喂所述配合饲料，投喂至120日龄，然后培养至性成熟备用。
作为优选，步骤(2)中精子卵子的采集过程为：选择性成熟的雌核发育雌黄姑鱼和伪雄黄姑鱼，分别通过人工挤压腹部采集成熟卵和精子，将获得的卵子和精子避光放放在干燥容器，待用。
作为优选，步骤(2)所述人工授精过程为：
A、将采集的伪雄黄姑鱼精子使用精子稀释液按体积比稀释20～40倍；
B、将所采集的雌核发育雌黄姑鱼卵子加入稀释好的精子液中混合均匀30-40s后，往混合液中加入混合液体积3/4的18～20℃海水中完成授精过程。
作为优选，步骤(3)中的三倍体诱导过程为：在步骤(2)人工授精完成2-3min后，将授精卵在3～4℃的低温海水中冷休克诱导处理12-14min，再将冷休克诱导处理后授精卵放入网袋中用18～20℃海水冲洗除去多余精子和其它杂质等，将分离得到的上浮卵进行孵化34-38h至出膜。
作为优选，三倍体鱼苗出膜之后的饲养方式为：鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；投喂方法为：鱼苗1～2日龄不投饵，3～14日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时以上；15～20日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，20～30日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定。
作为优选，所述饲养过程中所用海水均经过沙滤处理，每天换水量不少于200％，18～20℃恒温培育，溶解氧≥7.5±0.4mg/L。
作为优选，步骤(3)中取样检测为检测三倍体全雌鱼鱼苗诱导过程中的受精率、孵化率以及三倍体率。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)提供一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，涉及一种安全高效新颖且操作简单，具有较强的实用性的诱导方法，该方法为黄姑鱼等石首科鱼类的性别控制育种及多倍体育种开辟了新的技术途径；
(2)本发明建立的黄姑鱼三倍体全雌鱼诱导方法可批量、高效的诱导产生黄姑鱼三倍体全雌鱼鱼苗，三倍体诱导率可达94.5％；
(3)本发明的方法充分利用了三倍体比普通二倍体以及雌鱼比雄鱼生长的快两大优势，方法新颖且操作简单，具有较强的实用性，安全性高。
附图说明
图1是性腺切片结果图(A图为普通雄鱼精巢切片结果，B图为伪雄鱼精巢切片结果，C图为普通雌鱼卵巢切片结果，D图为雌核卵巢切片结果)。
图2是染色体核型分析图(左图为普通二倍体染色体核型分析结果；右图为全雌三倍体染色体核型分析结果)。
图3是流式细胞仪的倍性分析图(上部分为普通二倍体倍性分析结果；下部分为全雌三倍体倍性分析结果)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1
一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，包括如下步骤：
(1)培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼；
获得雌核发育黄姑鱼具体方法：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于1350μW/cm2的紫外线下灭活，随后将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子按照体积比1：11混合，加入海水混匀授精2.5min，将受精卵浸入3.5℃的海水中进行冷休克处理13min，然后在19℃海水中孵化36h至出膜，得到雌核发育黄姑鱼苗；
培育伪雄黄姑鱼具体方法：配制含有来曲唑的饲料，将来曲唑溶于95％的酒精中，再将溶液倒入饲料中，配制成含有来曲唑11mg/kg的配合饲料，将鉴定出的雌核发育黄姑鱼苗在30日龄起开始投喂所述配合饲料，投喂至120日龄，然后培养至性成熟备用。
(2)采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精；
精子卵子的采集过程为：选择性成熟的雌核发育雌黄姑鱼和伪雄黄姑鱼，分别通过人工挤压腹部采集成熟卵和精子，将获得的卵子和精子避光放放在干燥容器，待用；
人工授精过程为：
A、将采集的伪雄黄姑鱼精子使用精子稀释液按体积比稀释30倍；
B、将所采集的雌核发育雌黄姑鱼卵子加入稀释好的精子液中混合均匀35s后，往混合液中加入混合液体积3/4的19℃海水中完成授精过程。
(3)三倍体全雌鱼鱼苗诱导和取样检测；
三倍体诱导过程为：在步骤(2)人工授精完成2.5min后，将授精卵在3.5℃的低温海水中冷休克诱导处理13min，再将冷休克诱导处理后授精卵放入网袋中用19℃海水冲洗除去多余精子和其它杂质等，将分离得到的上浮卵进行孵化36h至出膜；
三倍体鱼苗出膜之后的饲养方式为：鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；投喂方法为：鱼苗1.5日龄不投饵，8日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化16小时；18日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，25日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定；饲养过程中所用海水均经过沙滤处理，每天换水量250％，19℃恒温培育，溶解氧为8±0.4mg/L；取样检测为检测三倍体全雌鱼鱼苗诱导过程中的受精率、孵化率以及三倍体率。
实施例2
一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，包括如下步骤：
(1)培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼；
获得雌核发育黄姑鱼具体方法：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于1300μW/cm2的紫外线下灭活，随后将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子按照体积比1：10混合，加入海水混匀授精2min，将受精卵浸入3℃的海水中进行冷休克处理10min，然后在18℃海水中孵化34h至出膜，得到雌核发育黄姑鱼苗；
培育伪雄黄姑鱼具体方法：配制含有来曲唑的饲料，将来曲唑溶于94％的酒精中，再将溶液倒入饲料中，配制成含有来曲唑10mg/kg的配合饲料，将鉴定出的雌核发育黄姑鱼苗在30日龄起开始投喂所述配合饲料，投喂至120日龄，然后培养至性成熟备用。
(2)采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精；
精子卵子的采集过程为：选择性成熟的雌核发育雌黄姑鱼和伪雄黄姑鱼，分别通过人工挤压腹部采集成熟卵和精子，将获得的卵子和精子避光放放在干燥容器，待用；
人工授精过程为：
A、将采集的伪雄黄姑鱼精子使用精子稀释液按体积比稀释20倍；
B、将所采集的雌核发育雌黄姑鱼卵子加入稀释好的精子液中混合均匀30s后，往混合液中加入混合液体积3/4的18℃海水中完成授精过程。
(3)三倍体全雌鱼鱼苗诱导和取样检测；
三倍体诱导过程为：在步骤(2)人工授精完成2min后，将授精卵在3℃的低温海水中冷休克诱导处理12min，再将冷休克诱导处理后授精卵放入网袋中用18℃海水冲洗除去多余精子和其它杂质等，将分离得到的上浮卵进行孵化34h至出膜；
三倍体鱼苗出膜之后的饲养方式为：鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；投喂方法为：鱼苗1日龄不投饵，3日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时；15日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，20日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定；饲养过程中所用海水均经过沙滤处理，每天换水量200％，18℃恒温培育，溶解氧为7.5±0.4mg/L；取样检测为检测三倍体全雌鱼鱼苗诱导过程中的受精率、孵化率以及三倍体率。
实施例3
一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，包括如下步骤：
(1)培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼；
获得雌核发育黄姑鱼具体方法：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于1400μW/cm2的紫外线下灭活，随后将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子按照体积比1：12混合，加入海水混匀授精3min，将受精卵浸入4℃的海水中进行冷休克处理15min，然后在20℃海水中孵化38h至出膜，得到雌核发育黄姑鱼苗；
培育伪雄黄姑鱼具体方法：配制含有来曲唑的饲料，将来曲唑溶于96％的酒精中，再将溶液倒入饲料中，配制成含有来曲唑12mg/kg的配合饲料，将鉴定出的雌核发育黄姑鱼苗在30日龄起开始投喂所述配合饲料，投喂至120日龄，然后培养至性成熟备用。
(2)采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精；
精子卵子的采集过程为：选择性成熟的雌核发育雌黄姑鱼和伪雄黄姑鱼，分别通过人工挤压腹部采集成熟卵和精子，将获得的卵子和精子避光放放在干燥容器，待用；
人工授精过程为：
A、将采集的伪雄黄姑鱼精子使用精子稀释液按体积比稀释40倍；
B、将所采集的雌核发育雌黄姑鱼卵子加入稀释好的精子液中混合均匀40s后，往混合液中加入混合液体积3/4的20℃海水中完成授精过程。
(3)三倍体全雌鱼鱼苗诱导和取样检测；
三倍体诱导过程为：在步骤(2)人工授精完成3min后，将授精卵在4℃的低温海水中冷休克诱导处理14min，再将冷休克诱导处理后授精卵放入网袋中用20℃海水冲洗除去多余精子和其它杂质等，将分离得到的上浮卵进行孵化38h至出膜；
三倍体鱼苗出膜之后的饲养方式为：鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；投喂方法为：鱼苗2日龄不投饵，14日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时以上；20日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，20～30日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定；饲养过程中所用海水均经过沙滤处理，每天换水量为350％，20℃恒温培育，溶解氧为9±0.2mg/L；
取样检测为检测三倍体全雌鱼鱼苗诱导过程中的受精率、孵化率以及三倍体率。
实施例1-3高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法的相关性能评价参数指标见表1。
表1各项目的三倍体全雌鱼鱼苗诱导过程中的相关性能评价指标
Figure BDA0002598728910000061
Figure BDA0002598728910000071
结论：实施例1-4中所添加的各成分及成分含量只有在本发明范围内的时候才能够制备出高受精率、高孵化率及高三倍体率的三倍体黄姑鱼全雌鱼。
图1是性腺切片结果：A图为普通雄鱼精巢切片结果，B图为伪雄鱼精巢切片结果，C图为普通雌鱼卵巢切片结果，D图为雌核卵巢切片结果。结果显示伪雄鱼精巢可以正常发育并产生可以精子，雌核卵巢和普通雌鱼发育同步且正常。
图2是染色体核型分析：左图为普通二倍体染色体核型分析结果，统计结果显示48条染色体；右图为全雌三倍体染色体核型分析结果跑，统计结果显示72条染色体，为普通二倍体的1.5倍。
图3是流式细胞仪的倍性分析：上部分为普通二倍体倍性分析结果，峰值在1024，下部分为全雌三倍体倍性分析结果，峰值在1536，下部分是上部分是的1.5倍。
本发明中所用元件、设备，若无特别说明，均为本领域的常用元件、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）培育雌核发育黄姑鱼和伪雄黄姑鱼；
（2）采集伪雄黄姑鱼精子、雌核发育雌鱼卵子进行人工授精；
（3）三倍体全雌鱼鱼苗诱导和取样检测。
2.根据权利要求1所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，步骤（1）中获得雌核发育黄姑鱼具体方法：将条石鲷精液用精子稀释液稀释，置于1300-1400μW/cm2的紫外线下灭活，随后将紫外照射的灭活的条石鲷精液与成熟的黄姑鱼卵子按照体积比1:10-12混合，加入海水混匀授精2-3min，将受精卵浸入3～4℃的海水中进行冷休克处理10-15min，然后在18～20℃海水中孵化34-38h至出膜，得到雌核发育黄姑鱼苗。
3.根据权利要求1所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，骤（1）中培育伪雄黄姑鱼具体方法：配制含有来曲唑的饲料，将来曲唑溶于94-96%的酒精中，再将溶液倒入饲料中，配制成含有来曲唑10-12mg/kg的配合饲料，将鉴定出的雌核发育黄姑鱼苗在30日龄起开始投喂所述配合饲料，投喂至120日龄，然后培养至性成熟备用。
4.根据权利要求1所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，步骤（2）中精子卵子的采集过程为：选择性成熟的雌核发育雌黄姑鱼和伪雄黄姑鱼，分别通过人工挤压腹部采集成熟卵和精子，将获得的卵子和精子避光放放在干燥容器，待用。
5.根据权利要求1所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，步骤（2）所述人工授精过程为：
A、将采集的伪雄黄姑鱼精子使用精子稀释液按体积比稀释20～40倍；
B、将所采集的雌核发育雌黄姑鱼卵子加入稀释好的精子液中混合均匀30-40s后，往混合液中加入混合液体积3/4的18～20℃海水中完成授精过程。
6.根据权利要求1所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，步骤（3）中的三倍体诱导过程为：在步骤（2）人工授精完成2-3min后，将授精卵在3～4℃的低温海水中冷休克诱导处理12-13min，再将冷休克诱导处理后授精卵放入网袋中用18～20℃海水冲洗除去多余精子和其它杂质等，将分离得到的上浮卵进行孵化34-38h至出膜。
7.根据权利要求6所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，三倍体鱼苗出膜之后的饲养方式为：鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；投喂方法为：鱼苗1~2日龄不投饵，3~14日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时以上；15~20日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，20~30日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定。
8.根据权利要求7所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，所述饲养过程中所用海水均经过沙滤处理，每天换水量不少于200%，18～20℃恒温培育，溶解氧≥7.5 ±0.4 mg/L。
9.根据权利要求1所述的一种高效生产黄姑鱼三倍体全雌鱼的诱导方法，其特征在于，步骤（3）中取样检测为检测三倍体全雌鱼鱼苗诱导过程中的受精率、孵化率以及三倍体率。
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