CN114557296B - 一种静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的方法，属于水产遗传育种技术领域，它的步骤如下：(1)大菱鲆精液和卵子采集、保存和人工受精；(2)三倍体诱导；选择性腺发育良好未排卵的大菱鲆雌鱼，使用催产剂获得卵子；选择性成熟的大菱鲆雄鱼，人工采集精液，将精液置于4℃预冷的精子保护液中，精液与保护液稀释比为1:10，于4℃冰箱中避光保存备用；将保存的精液和卵子采用人工干法受精，在受精后4.5min，将受精卵分别放入静水压压力罐中进行静水压休克处理，静水压压力分别设置为60MPa，处理持续时间为4‑6min，泄压后取出受精卵，置于海水中继续孵化；本发明方法能够批量获得大菱鲆三倍体，诱导效率100％。

Description

一种静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的方法

技术领域

本发明属于水产遗传育种技术领域，具体地涉及静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的生产方法，即通过静水压法批量化诱导大菱鲆三倍体。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是世界性鲆鲽类养殖良种，养殖范围遍及欧、美、亚洲十几个沿海国家。中国是大菱鲆养殖大国，年总产量超过6万吨，占世界养殖总产量的80％以上，是我国北方沿海重要的养殖鱼类。

大菱鲆三倍体因其不育性，比普通二倍体生长速度快、抗逆性强，尤其对于养殖大规格商品鱼(＞2.0kg)具有更为突出的优势，有研究表明，至24-48月龄，三倍体可较二倍体生长速度快约23％。实现三倍体规模化生产和产业化推广，可促进我国由养殖500g～600g的小规格成鱼向养殖2kg以上的大规格成鱼转变，适应超市、电商和冷链运输等销售和物流渠道的发展，破解目前市场拓展缓慢导致产能过剩和食品安全监管不力的困局，为大菱鲆养殖产业实现提质增效、减量增收、绿色发展的目标提供种质保障。此外，大菱鲆三倍体的培育可为我国大力发展的深远海养殖业提供最佳的适养品种，其相对完整的产业链条保障了养殖安全性和经济效益可靠性，并可消除生态污染的潜在风险。

有关大菱鲆三倍体诱导和苗种培育，Piferrer等(2000,2003)首次建立了三倍体冷诱导条件并成功获得规模化的三倍体苗种；Cal等(2006)对三倍体苗种成活、生长和性腺发育进行了研究，证实了三倍体的不育性和生长优势；Hernández-Urcera等(2012)从可量可比性状和骨骼成像，证实冷休克诱导对大菱鲆三倍体形态和骨骼无影响。与冷休克诱导方法相比，静水压法具有诱导效率更高、对受精卵损伤小的特点，目前，尚未有大菱鲆三倍体静水压法的诱导方法的报道。

在鱼类三倍体诱导中，除诱导条件对三倍体诱导效果具有显著影响外，鱼类配子质量是影响三倍体诱导效率的另一重要因素，在批量化诱导中，获取大量的优质卵子和精子尤为重要。按照卵母细胞的发育情况，大菱鲆卵巢属于非同步性成熟类型，卵巢内含有各个发育阶段的卵母细胞，繁殖周期内通常产卵数次，生殖周期长，属于多次产卵类型。

精液稀少、精子密度低是限制大菱鲆三倍体批量化诱导的另一因素。在三倍体诱导中，起始诱导时间一般都需要在受精后较短的时间完成，因此需要提前备好卵子和精子，以便在同一时刻完成受精，保证受精胚胎发育速度同步。但是，由于大菱鲆精子密度低，人工采集的精液极易因尿液、体液等污染而导致精子激活，而大菱鲆精子在激活后运动2-3min，即失去受精能力。因此，大菱鲆精子体外保存时间短暂限制了其在三倍体诱导中的批量应用。建立一种大菱鲆精子低温冷藏保存技术，延长体外保存时间，保证精子活力、受精能力正常对于大菱鲆三倍体的批量化诱导尤为重要。

发明内容

本发明公布了一种静水压批量诱导大菱鲆三倍体的方法，即建立静水压诱导受精卵染色体组加倍获得大菱鲆三倍体的技术方法，确定最佳的诱导起始时间、持续时间和处理压力，达到产业化生产三倍体的目的，以解决目前冷休克方法诱导三倍体效率低的难题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的方法，它的步骤如下：(1)大菱鲆精液和卵子采集、保存和人工受精；(2)三倍体诱导；

所述步骤(1)大菱鲆精液、卵子采集、保存和人工受精：

选择性腺发育良好未排卵的大菱鲆雌鱼，使用催产剂，48h后人工挤压腹部法采集卵子，将采集的鱼卵置于14.5℃水浴中避光保存备用；所述的催产剂为绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体激素释放激素A2(LHRH-A2)，注射剂量为HCG：500U/kg；LHRH-A2:10μg/kg；

选择性成熟的大菱鲆雄鱼，人工采集精液，将精液置于4℃预冷的精子保护液中，精液与保护液稀释比为1:10，于4℃冰箱中避光保存备用；

将保存的精液和卵子采用人工干法受精，受精时保存的精液与卵子的体积比为1mL:40-80mL，以干燥的玻璃棒轻轻搅拌5-10s，使精卵混合均匀，快速加入2倍卵子体积的新鲜海水完成受精过程，该时刻记录为受精起始时刻；受精后2-3min，以过量海水洗涤受精卵去除多余的精液和卵巢粘液，洗涤完成后向受精卵中加入2倍卵子体积的新鲜海水，使受精卵悬浮。

进一步，步骤(1)大菱鲆精子保护液营养盐组成为：氯化钠4.33g/L，氯化钾2.01g/L，氯化钙0.54g/L，六水合氯化镁0.23g/L，磷酸二氢钠0.28g/L，碳酸氢钠0.20g/L，葡萄糖1.00g/L。

进一步，步骤(1)低温冷藏保存的大菱鲆稀释精液保存备用时间不超过3h。

步骤(2)三倍体诱导

在受精后4.5min，将受精卵分别放入静水压压力罐中进行静水压休克处理，静水压压力分别设置为60MPa，处理持续时间为4-6min，泄压后取出受精卵，置于海水中继续孵化；

所述步骤(1)、步骤(2)中受精水温、压力处理水温、孵化水温均为14.5±0.5℃。

本发明与现有技术对比的有益效果：

1.本发明利用激素催产大菱鲆雌鱼，保证了单个个体和不同个体之间卵子发育成熟的一致性，与自然成熟的卵子相比，催产获得的卵子发育同步一致，使得受精后胚胎发育速度同步，提高受精卵第二极体排放的同步性，有效提升了三倍体诱导效率。

2.采用大菱鲆精子保护液稀释精液的低温冷藏保存技术，一方面通过精子保护液抑制精子活力，避免了人工采集的精液因尿液、体液等污染而导致精子激活丧失受精能力的发生，另一方面可延迟精子在体外存活时间，为批量化诱导三倍体中卵子的同步受精提供操作时间，可有效提升诱导率。

3.温度影响鱼类胚胎发育速度，进而会导致三倍体诱导中抑制第二极体释放的最佳时间有较大差异，使得诱导效果不稳定，可重复性差，本发明充分考虑到温度对受精卵胚胎发育时序的影响，根据大菱鲆受精和孵化的最佳水温条件，规定受精水温、静水压处理水温和孵化水温均为14.5±0.5℃，使大菱鲆三倍体诱导条件稳定，并使其具有较好的可重复性，可稳定获得批量化的诱导子代。

4.不同的鲆鲽类鱼种，最佳的三倍体诱导条件往往会有很大差别，国内外报道中，尚未涉及大菱鲆三倍体静水压诱导的相关参数，而静水压诱导原理与冷休克诱导原理又存在差异，不能将冷休克诱导条件简单的转化为静水压诱导条件，同时也不能简单的通过其他鱼类的三倍体静水压诱导条件推导大菱鲆三倍体静水压诱导条件，因此，本发明首次对大菱鲆三倍体诱导参数进行筛选优化，确定了三倍体静水压诱导的适宜处理压力、起始时间和持续时间，该方法操作简单，处理时间短，对受精卵的物理损伤较低，三倍体诱导率高达100％，适于产业化推广应用。

附图说明

图1为本发明不同处理压力对大菱鲆三倍体的诱导效果。

图2为本发明不同处理起始时刻对大菱鲆三倍体的诱导效果。

图3为本发明不同处理持续时间对大菱鲆三倍体的诱导效果。

图4为本发明三倍体苗种的流式细胞鉴定结果。

具体实施方式

以下结合图1、图2、图3和图4具体说明一种静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的方法，具体按以下步骤实施，其中没有交代的技术细节为本领域的普通技术常识。

实施例1

1.大菱鲆雌鱼催产剂量的确定及其效果

选择光、温调控性腺发育良好的大菱鲆雌鱼，亲鱼培育水温13.0±0.5℃，光暗周期16h:8h，雌鱼3龄，体重3.0～4.5kg，按体重分别联合注射绒毛膜促性腺激素(HCG)100、250、500U/kg，促黄体激素释放激素A2(LHRH-A2)5、10、15μg/kg，共9组实验，每组实验注射雌鱼3尾，以T型标标记，根据排卵时间和排卵量确定催产剂量。

结果如表1所示，激素催产能显著促进排卵时间提前，并提升排卵量，其中HCG500U/kg、LHRH-A2 10μg/kg组合排卵时间确定、排卵量大，表明该剂量催产下卵子发育同步性较好，用于后续三倍体诱导实验。

表1大菱鲆雌鱼人工催产效果

2.大菱鲆精液、卵子采集、保存和人工受精

本实施例受精水温、静水压处理水温和孵化水温均严格控制在14.5±0.5℃，所用海水为经紫外消毒、砂滤的新鲜海水。

选择性腺发育良好未排卵的大菱鲆雌鱼，注射催产剂绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体激素释放激素A2(LHRH-A2)，注射剂量为HCG：500U/kg；LHRH-A2:10μg/kg，48h后人工挤压腹部法采集卵子，人工挤卵前以干燥的毛巾擦拭体表及其生殖孔周围水和污物，获得未受精卵经显微镜观察，选用卵子透明、油球单一、卵径大小均一的未受精卵，将采集的鱼卵置于14.5℃水浴中避光保存备用。

选择性成熟的大菱鲆雄鱼，人工采集精液，采集精液前以精子保护液冲洗雄鱼体表，以干燥的毛巾擦拭体表及其生殖孔周围水和污物，将精液置于4℃预冷的精子保护液中，精子保护液营养盐组成为氯化钠4.33g/L、氯化钾2.01g/L、氯化钙0.54g/L、六水合氯化镁0.23g/L、磷酸二氢钠0.28g/L、碳酸氢钠0.20g/L、葡萄糖1.00g/L，精液与保护液稀释比为1:10，于4℃冰箱中避光保存备用；受精前显微镜检测精子活力，选择精子活力高、运动时间长的受精。

将采集的精液和卵子采用人工干法受精，受精时稀释精液与卵子的体积比为1mL:40-80mL，以干燥的玻璃棒轻轻搅拌5-10s，是精卵混合均匀，快速加入2倍卵子体积的新鲜海水完成受精过程，该时刻记录为受精起始时刻。受精后2-3min，以过量海水洗涤受精卵去除多余的精液和卵巢粘液，洗涤完成后向受精卵中加入2倍卵子体积的新鲜海水，使受精卵悬浮。

3.大菱鲆精子低温冷藏保存技术效果

选择1尾精液质量较好的大菱鲆雄鱼，分别采用不稀释低温冷藏(4℃)和稀释液保护低温冷藏，在冷藏的5min、15min、30min、1h、2h、3h和4h显微镜镜检精子活力，镜检方法为：干净的载玻片滴加100μL新鲜海水形成液滴，向海水液滴中加入20μL精液(不稀释和稀释精液均为20μL)，在显微镜下同一视野下快速估算游泳精子数量占总精子数量的比例，为精子存活百分比。

结果如表2所示，不适用精子保护液的非稀释低温保存组在体外保存15min后精子存活率仅为20％，不能完成正常受精操作；而精子保护液可显著延长精子在低温冷藏保存条件下的体外存活时间，3h精子活力仍高于60％，此时进行受精操作仍可获得良好的受精效果。采用精子保护液稀释精液的低温冷藏保存技术避免了人工采集的精液因尿液、体液等污染而导致精子激活丧失受精能力的发生，并且延迟精子在体外存活时间，为批量化诱导三倍体中卵子的同步受精提供操作时间，可有效提升诱导率。

表2大菱鲆精子保护液对精子低温冷藏保存的保护效果

精子来源

0min

15min

30min

1h

2h

3h

4h

非稀释冷藏

100％

20％

-

-

-

-

-

保护液稀释冷藏

100％

100％

95％

90％

80％

60％

30％

4.三倍体诱导条件的确定：本发明采用静水压处理抑制第二极体释放，从而使染色体组加倍的方法进行三倍体的诱导。

1)三倍体诱导处理压力的确定

在受精后6.5min，将受精卵分别放入静水压压力罐中进行静水压休克处理，静水压压力分别设置为55、60、65、70、75MPa，处理持续时间为6min，泄压后取出受精卵，置于海水中继续孵化。通过统计孵化率和三倍体诱导率，所有测试压力组(55-75MPa)均可获得一定数量的形态正常的初孵仔鱼，其中60MPa组正常仔鱼孵化率(13.04±1.98％)显著高于其他各处理组，初孵仔鱼三倍体率达100％(见图1)。确定大菱鲆三倍体诱导的最佳处理压力为60MPa。

2)三倍体诱导起始时间的确定

在受精后不同时间(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5min)将受精卵分别放入静水压机的压力罐中进行静水压休克处理，静水压压力为60MPa，处理持续时间为6min，泄压后取出受精卵，置于海水中继续孵化。统计孵化率和三倍体诱导率，受精后4.5min处理组孵化率最高，可达18.91±6.60％，初孵仔鱼三倍体率可达97.78±1.92％(见图2)。确定大菱鲆三倍体诱导的最佳起始时间为受精后4.5min。

3)三倍体诱导处理持续时间的确定

在受精后4.5min，将受精卵分别放入静水压压力罐中进行静水压休克处理，静水压压力为60MPa，处理持续时间分别为4、6、8、10、12min，泄压后取出受精卵，置于海水中继续孵化。统计孵化率和三倍体诱导率，持续时间为4min处理组孵化率稍高于6min处理组，两者间无显著性差异，三倍体诱导率均高于95％(见图3)。确定大菱鲆三倍体诱导的最佳处理持续时间为4-6min。

5.三倍体苗种的倍性鉴定

通过三倍体诱导实验，随机选择各实验组孵化出膜2-5天的鱼苗30尾，将所有鱼苗转移至蒸馏水中短暂冲洗，随后将每尾鱼苗放入1个1.5mL的离心管中，滴加1滴蒸馏水，检测前，向每个离心管中加入1mL从Partec公司购买的一步染色试剂，用研磨棒将鱼苗碾碎制作单细胞悬液，滤膜过滤后，将滤液转入仪器配套的5mL试管中，再加入1.5mL染色试剂，轻轻吹打，使细胞悬液混合均匀，然后将试管置于Partec倍性检测仪(CyFlow PA)进样管中进行测定。用普通二倍体胚胎作为对照，再分析三倍体诱导组。普通二倍体DNA吸光峰值对应的荧光强度设为100，检测的诱导鱼苗DNA吸光峰值对应荧光强度为150的为三倍体。采用倍性分析仪主要是证明本发明方法诱导的大菱鲆三倍体的可行性和有效性，而在今后采用本发明方法进行大菱鲆三倍体诱导实验中，不必每次都进行倍性的鉴定。

实施例2大菱鲆三倍体的批量化诱导

本实施例受精水温、静水压处理水温和孵化水温均严格控制在14.5±0.5℃，所用海水为经紫外消毒、砂滤的新鲜海水。

选择4尾性腺发育良好未排卵的大菱鲆雌鱼，注射催产剂绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体激素释放激素A2(LHRH-A2)，注射剂量为HCG：500U/kg；LHRH-A2:10μg/kg，48h后人工挤压腹部法采集卵子，人工挤卵前以干燥的毛巾擦拭体表及其生殖孔周围水和污物，获得未受精卵经显微镜观察，选用卵子透明、油球单一、卵径大小均一的未受精卵，共获得大菱鲆优质未受精卵800mL，将采集的鱼卵置于14.5℃水浴中避光保存备用。

选择3-4尾性成熟的大菱鲆雄鱼，人工采集精液，采集精液前以精子保护液冲洗雄鱼体表，以干燥的毛巾擦拭体表及其生殖孔周围水和污物，采集原始精液2.5mL，将精液与4℃预冷的精子保护液混合，置于4℃冰箱中避光保存备用；精子保护液营养盐组成为氯化钠4.33g/L、氯化钾2.01g/L、氯化钙0.54g/L、六水合氯化镁0.23g/L、磷酸二氢钠0.28g/L、碳酸氢钠0.20g/L、葡萄糖1.00g/L，精液与保护液稀释比为1:10。

将采集的精液和卵子采用人工干法受精，受精时稀释精液与卵子的体积比为1mL:40-80mL，以干燥的玻璃棒轻轻搅拌5-10s，是精卵混合均匀，快速加入2倍卵子体积的新鲜海水完成受精过程，该时刻记录为受精起始时刻。受精后2-3min，以过量海水洗涤受精卵去除多余的精液和卵巢粘液，洗涤完成后向受精卵中加入2倍卵子体积的新鲜海水，使受精卵悬浮。

收集上浮的受精卵，将受精卵置于静水压机压力罐中，在受精后4.5min，以60MPa的压力持续处理6min，泄压后将受精卵置于海水中孵化。

本实施例中，三倍体批量化诱导组孵化率为38.36％，共获得初孵仔鱼32.7万尾，5日龄仔鱼检测的三倍体率高达100％。

由上述结果表明，本发明结果稳定，可重复性好，适用大菱鲆三倍体苗种的批量化诱导生产。

Claims (4)

1.一种静水压法批量诱导大菱鲆三倍体的方法，其特征在于所述方法的步骤如下：（1）大菱鲆精液和卵子采集、保存和人工受精；（2）三倍体诱导；

所述步骤（1）大菱鲆精液、卵子采集、保存和人工受精：

选择性腺发育良好未排卵的大菱鲆雌鱼，所述大菱鲆雌鱼培育水温13.0±0.5℃，光暗周期16h:8h，使用催产剂，48h后人工挤压腹部法采集卵子，将采集的鱼卵置于14.5℃水浴中避光保存备用；所述的催产剂为绒毛膜促性腺激素和促黄体激素释放激素A2，使用剂量为绒毛膜促性腺激素：500U/kg，促黄体激素释放激素A2:10μg/kg；

选择性成熟的大菱鲆雄鱼，人工采集精液，将精液置于4℃预冷的精子保护液中，精液与保护液稀释比为1:10，于4℃冰箱中避光保存备用；

将保存的精液和卵子采用人工干法受精，受精时保存的精液与卵子的体积比为1mL:40-80mL，以干燥的玻璃棒轻轻搅拌5-10s，使精卵混合均匀，快速加入2倍卵子体积的新鲜海水完成受精过程，该时刻记录为受精起始时刻；受精后2-3min，以过量海水洗涤受精卵去除多余的精液和卵巢粘液，洗涤完成后向受精卵中加入2倍卵子体积的新鲜海水，使受精卵悬浮；

所述步骤（2）三倍体诱导：在受精后4.5min，将受精卵分别放入静水压压力罐中进行静水压休克处理，静水压压力分别设置为60MPa，处理持续时间为4-6min，泄压后取出受精卵，置于海水中继续孵化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）大菱鲆精子保护液营养盐组成为：氯化钠4.33 g/L，氯化钾 2.01 g/L，氯化钙0.54 g/L，六水合氯化镁0.23 g/L，磷酸二氢钠0.28 g/L，碳酸氢钠0.20 g/L，葡萄糖1.00 g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）低温冷藏保存的大菱鲆稀释精液保存备用时间不超过3h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）、步骤（2）中受精水温、静水压休克处理水温、孵化水温均为14.5±0.5℃。

Images