CN104855321A - 一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，包括：(1)蛤仔亲贝的选择及促熟：(2)亲贝处理及配子排放；(3)卵液选择及处理；(4)精液选择及处理；(5)同步受精，镜检及分组；(6)在处理组的受精卵中加入细胞松弛素B；(7)去除受精卵溶液中的细胞松弛素B及孵化，获得三倍体菲律宾蛤仔胚胎。本发明利用菲律宾蛤仔受精卵的结构和发育特点，采用单一个体催产，优选精卵进行受精，有效的消除了以往双壳类三倍体诱导过程中混合精卵发育同步性差的缺陷，有效提高了三倍体诱导率。本发明适用于高效诱导菲律宾蛤仔三倍体，具有诱导率高、稳定性强的优点，诱导率稳定在85％以上。
Description
技术领域
本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，特别是一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法。
背景技术
菲律宾蛤仔Ruditapes philippenarum俗称花蛤、蚬子，属双壳纲，帘蛤科，蛤仔属，为广温、广盐性种类，宜养面积广，是我国四大养殖贝类之一，其产量占海水贝类总产量的31％。2010年，我国蛤仔养殖产量约300万吨，约占世界总产量的90％。菲律宾蛤仔养殖风险小、投资少、相对成本低、产量高，产业地位十分重要。
目前我国海水养殖的菲律宾蛤仔基本上都是野生型的，难以适应逐渐恶化的养殖环境。因此，利用生物技术培育优良的养殖品种，是当前乃至未来发展海水贝类养殖亟待解决的关键问题之一。以多倍体诱发技术为主的贝类细胞遗传技术是目前贝类遗传育种中最活跃和最具应用价值的一个领域。由于三倍体贝类可育性较差，消耗极少能量用于繁殖，而更多的能量用于生长，导致三倍体贝类比正常二倍体生长速度快、成活率高、产量高。因此，通过染色体操作，诱导蛤仔三倍体，对蛤仔产业发展具有重要意义。
20世纪80年代以来，海水贝类的染色体操作得到广泛研究，主要通过两种方法诱导三倍体，第一，应用物理或化学的方法，阻遏PB2的排出，使PB2的一组染色单体留在受精卵内，形成三倍体；另外，通过四倍体个体与二倍体杂交，可以得到100％三倍体，已经用雄性四倍体与雌性二倍体杂交培育出全三倍体长牡蛎。
根据上述三倍体诱导机理，发展出多种多倍体诱导方法，通过抑制PB1释放可诱导四倍体和三倍体，抑制PB2的释放可得到三倍体。人工诱导多倍体的方法可分为物理学、化学、生物学三个方面。
物理学方法
在受精卵的细胞周期中施加物理因子处理，影响和干预细胞有丝分裂器的正常运作，以达到染色体加倍的方法。包括温度休克和静水压休克等。
化学方法
应用一些特殊的化学物质，阻遏细胞正常分裂，从而达到染色体加倍的目的。例如应用细胞松弛素B(CB)、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素、聚乙二醇、氰化钙等试剂。
生物学方法
在贝类培育上比较常用的方法就是用可育的四倍体与正常二倍体杂交，产生三倍体，三倍体率达到100％，并且操作方便，适用于大规模产业化水产养殖的需要，但目前，仅在牡蛎开发出可供繁育的四倍体成贝。
根据以上方法，已在30余种海水贝类中进行了多倍体的诱导，但仅牡蛎类实现了多倍体的产业化。国外曾研究菲律宾蛤仔的多倍体诱发，但诱导率较低，且不稳定，未能形成成熟的菲律宾蛤仔三倍体诱导技术。本发明通过大量科学试验，加强对精卵的选择，大幅度改进对受精卵的处理方法，建立了稳定、高效的菲律宾蛤仔三倍体诱导方法。
对菲律宾蛤仔的三倍体诱导有以下几个关键点：精卵充分发育，同步受精，提高受精阶段及胚胎发育阶段的同步性，对提高三倍体诱导率尤为重要；对受精卵处理时间、处理时长和处理强度的精确控制；外界因素，尤其是温度，对胚胎发育速度具有显著影响，因此有必要通过对极体的观察确定药物处理的时间节点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，实现对菲律宾蛤仔稳定、高效的三倍体诱导。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，包括步骤如下：
(1)蛤仔亲贝的选择及促熟：选取滩涂采捕亲贝，在室内升温促熟，达到性腺充分成熟；
(2)亲贝处理及配子排放；将亲贝置入砂滤海水中进行催产，然后将开始排放配子的亲贝选出，单个置于烧杯中排放配子，获得多杯卵液和多杯精液；
(3)卵液选择及处理；镜检上述步骤(2)获得多杯卵液中的每杯卵液，选择发育良好的多杯卵液进行合并，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入塑料烧杯备用；
(4)精液选择及处理；镜检上述步骤(2)获得多杯精液中的每杯精液，选取活力良好的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；
(5)同步受精，镜检及分组；取上述备用精子加入到上述步骤(3)的卵子悬浮液中，精卵比为3:1-5:1，然后将受精卵分成处理组和对照组；
(6)在处理组的受精卵中加入细胞松弛素B；观察对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的80％时，迅速向处理组加入细胞松弛素B至终浓度为0.5mg/L；
(7)去除受精卵溶液中的细胞松弛素B及孵化；观察对照组中80％至90％的第一极体下方出现第二极体时，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗，去除细胞松弛素B，然后孵化发育至担轮幼虫或D形幼虫。
而且，所述步骤(1)中亲贝为3龄蛤仔，壳长大于40mm。
而且，所述步骤(2)中的砂滤海水为经紫外线照射处理30min至60min的砂滤海水。
而且，所述步骤(3)中发育良好的卵液为卵子的卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好；所述步骤(4)中活力良好的精子是指镜下检查，大于90％的精子具有正常活动能力，且分散度良好。
而且，所述步骤(6)加入的细胞松弛素B具体配制方法为：将细胞松弛素B溶于二甲基亚砜，配制成0.5mg/mL的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至体积比1:1000。
而且，所述步骤(6)中的观察具体为，取受精卵悬浮液1滴滴于载玻片上，轻弹载玻片使极体转至卵球侧面，然后进行观察。
而且，所述步骤(7)中的孵化密度为10-30粒/mL。
而且，所述步骤(7)中发育至担轮幼虫或D形幼虫是通过流式细胞术测定。
而且，所有所述的砂滤海水的温度为23-26℃，盐度为20-30。
本发明的优点和积极效果是：
本发明首次公开了一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，具有稳定、高效、操作简单等优点。对比以往的海水双壳类三倍体化学诱导方法，本发明有如下特点：
1、受精策略不同：以往双壳类三倍体诱导过程中，采用混合精卵进行受精，胚胎发育同步性差，诱导率不高，本发明采用单一个体催产，可对精卵进行严格的人工选择，有效提高发育同步性和三倍体诱导率；
2、处理时机不同：以往的化学诱导方法一般规定在受精后特定时间加入CB，本发明以显微观察为基础，在卵子出现PB1的比例达80％时加入CB，第一极体有效释放，有效降低四倍体及非整倍体胚胎的出现几率；
2、处理持续时间的判断方法不同：其他海水双壳类处理持续时间为15-20min，本发明以对照组中出现PB2的受精卵比例达到80％作为去除CB的时间节点，处理时间以受精卵发育进度作为生物学指标，有效回避了温度、水质等外界因素的影响，使第二极体被有效抑制在合子内，有效降低二倍体胚胎的出现几率；
3、对于PB2出现比例的判定方式不同：以往的判定方式为出现PB2的卵子占总卵数的百分比，本发明所述为出现PB2的受精卵与出现PB1的受精卵之比，更为精确、科学；
4、获得结果不同：以往在其他双壳类的三倍体诱导率在50-70％间变化，而本发明三倍体诱导率稳定在85％以上。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其主要内容为对雌雄亲贝进行催产，人工授精，以一定浓度的细胞松弛素B在受精的一定时间段进行处理，获得三倍体胚胎；下面以几个具体实例进行说明，
实施例1
1)2013年5月底，在某水产生态及养殖实验室，利用本地滩涂采捕的3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长44-47mm，已在室内升温促熟，性腺充分成熟；
2)置入经紫外线照射45min的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于1000ml烧杯排放配子，约20min后，配子基本排放完毕，获得卵液14杯，精液8杯；
3)镜检每杯卵液，选择卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液3杯合并，得卵子约300万枚，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料烧杯；
4)镜检每杯精液，其中2杯中90％以上的精子具有正常活动能力，且分散度良好，选择浓度较高的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；
5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-8个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积2000mL，对照组体积200mL；
6)为方便观察，取受精卵悬浮液1滴滴于载玻片上，轻弹载玻片使极体转至卵球侧面，受精后19min，观察对照组受精卵出现PB1的比例达到80％，迅速向处理组加入2mL CB储备液(CB首先溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL溶液)，同时搅动卵液使药物分散均匀；
7)受精后37min，观察对照组中81％的PB1下方出现PB2，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗3次，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度30粒/mL，22.5h后发育至D形幼虫；
8)幼虫倍性检测：对于步骤7中获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，三倍体诱导率为89.2％。
9)所用海水温度为25℃，盐度为24。
实施例2
1)2013年6月初，在国家某贝类产业技术体系综合试验站，利用渤海湾滩涂采捕的3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长43-48mm，性腺充分成熟；
2)置入经紫外线照射30min的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水冲洗后，单个置于1000ml烧杯排放配子，约30min配子基本排放完毕，获得卵液12杯，精液8杯；
3)镜检每杯卵液，选择卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液4杯合并，得卵子约500万枚，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料烧杯；
4)镜检每杯精液，其中3杯中90％以上的精子具有正常活动能力，且分散度良好，选择浓度较高的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；
5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-5个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积2000mL，对照组体积300mL；
6)为方便观察，取卵液1滴滴于载玻片上，轻弹载玻片使极体转至卵球侧面，受精后18min，观察对照组受精卵出现PB1的比例达到80％，向处理组加入2mL CB储备液(CB首先溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL溶液)，及时搅动卵液使药物分散均匀；
7)受精后35min，观察对照组中82％的PB1下方出现PB2，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗3次，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度25粒/mL，22h后发育至D形幼虫；
8)幼虫倍性检测：对于步骤7中获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，三倍体诱导率为89.4％。
9)所用海水温度为25.5℃，盐度为26。
实施例3
1)2014年6月初，在天津市某水产生态及养殖实验室，利用渤海湾浅海采捕的3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长43-45mm，性腺自然成熟；
2)置入经紫外线照射60min的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于1000ml烧杯继续排放配子，约20min后，配子基本排放完毕，获得卵液15杯，精液13杯；
3)镜检每杯卵液，选择卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液6杯合并，得卵子约700万枚，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料烧杯；
4)镜检每杯精液，其中7杯中90％以上的精子具有正常活动能力，且分散度良好，选择浓度较高的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；
5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-6个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积2000mL，对照组体积500mL；
6)为方便观察，取对照组受精卵悬浮液1滴滴于载玻片上，轻弹载玻片使极体转至卵球侧面，受精后20min，观察对照组受精卵出现PB1的比例达到80％，迅速向处理组加入2mL CB储备液(CB首先溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL溶液)，同时搅动卵液使药物分散均匀；
7)受精后40min，观察对照组中86％的PB1下方出现PB2，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗3次，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度30粒/mL，25h后发育至D形幼虫；
8)幼虫倍性检测：对于步骤7中获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，三倍体诱导率为94.2％。
9)所用海水温度为23.5℃，盐度为22。
实施例4
1)2015年5月底，在天津某水产养殖公司苗种繁育车间，利用碱河口滩涂采捕的3龄蛤仔作为亲贝，亲贝壳长42-44mm，性腺自然成熟；
2)置入经紫外线照射60min的砂滤海水催产。将开始排放配子的亲贝选出，淡水反复冲洗后，单个置于1000ml烧杯继续排放配子，约20min后，配子基本排放完毕，获得卵液14杯，精液15杯；
3)镜检每杯卵液，选择卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好的卵液6杯合并，得卵子约650万枚，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入5000mL塑料烧杯；
4)镜检每杯精液，其中5杯中90％以上的精子具有正常活动能力，且分散度良好，选择浓度较高的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；
5)取适量精子，加入卵子悬浮液中，及时搅动卵液使卵子同步受精，镜检每个卵子周围附上3-7个精子。受精后的卵子分成2组，即处理组和对照组，处理组体积2000mL，对照组体积400mL；
6)为方便观察，取对照组受精卵悬浮液1滴滴于载玻片上，轻弹载玻片使极体转至卵球侧面，受精后18min，观察对照组受精卵出现PB1的比例达到80％，迅速向处理组加入2mLCB储备液(CB首先溶于二甲基亚砜配制的0.5mg/mL溶液)，同时搅动卵液使药物分散均匀；
7)受精后37min，观察对照组中84.5％的PB1下方出现PB2，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗3次，去除CB，受精卵重新悬浮于新鲜的砂滤海水中，孵化密度25粒/mL，23h后发育至D形幼虫；
8)幼虫倍性检测：对于步骤7中获得的初孵D形幼虫，采用流式细胞术进行倍性检测，三倍体诱导率为93.6％。
9)所用海水温度为24.5℃，盐度为23。
Claims (9)
1.一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：包括步骤如下：
(1)蛤仔亲贝的选择及促熟：选取滩涂采捕亲贝，在室内升温促熟，达到性腺充分成熟；
(2)亲贝处理及配子排放；将亲贝置入砂滤海水中进行催产，然后将开始排放配子的亲贝选出，单个置于烧杯中排放配子，获得多杯卵液和多杯精液；
(3)卵液选择及处理；镜检上述步骤(2)获得多杯卵液中的每杯卵液，选择发育良好的多杯卵液进行合并，卵子悬浮液以90μm筛绢过滤去除组织碎片，以30μm筛绢清洗3次，收集卵子，置入塑料烧杯备用；
(4)精液选择及处理；镜检上述步骤(2)获得多杯精液中的每杯精液，选取活力良好的一杯，用30μm筛绢滤除组织碎片，作为备用精子；
(5)同步受精，镜检及分组；取上述备用精子加入到上述步骤(3)的卵子悬浮液中，精卵比为3:1-5:1，然后将受精卵分成处理组和对照组；
(6)在处理组的受精卵中加入细胞松弛素B；观察对照组受精卵出现第一极体的比例达到总卵数的80％时，迅速向处理组加入细胞松弛素B至终浓度为0.5mg/L；
(7)去除受精卵溶液中的细胞松弛素B及孵化；观察对照组中80％至90％的第一极体下方出现第二极体时，以30μm筛绢洗卵，砂滤海水清洗，去除细胞松弛素B，然后孵化发育至担轮幼虫或D形幼虫。
2.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(1)中亲贝为3龄蛤仔，壳长大于40mm。
3.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(2)中的砂滤海水为经紫外线照射处理30min至60min的砂滤海水。
4.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(3)中发育良好的卵液为卵子的卵膜完整、规格一致、形状呈规则球形、分散度良好；所述步骤(4)中活力良好的精子是指镜下检查，大于90％的精子具有正常活动能力，且分散度良好。
5.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(6)加入的细胞松弛素B具体配制方法为：将细胞松弛素B溶于二甲基亚砜，配制成0.5mg/mL的溶液，然后加入到受精卵溶液中，至体积比1:1000。
6.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(6)中的观察具体为，取受精卵悬浮液1滴滴于载玻片上，轻弹载玻片使极体转至卵球侧面，然后进行观察。
7.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(7)中的孵化密度为10-30粒/mL。
8.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所述步骤(7)中发育至担轮幼虫或D形幼虫是通过流式细胞术测定。
9.根据权利要求1所述的适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法，其特征在于：所有所述的砂滤海水的温度为23-26℃，盐度为20-30。
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