CN109971700B - 一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，包括以下步骤：(1)取暗纹东方鲀鳃组织，利用含有双抗青霉素和链霉素的浸泡液浸泡，清洗液清洗后，切割鳃丝；(2)使用胰蛋白酶消化鳃丝，过滤，离心，取沉淀；随后使用红细胞裂解液去除红细胞，离心，得细胞沉淀；(3)细胞沉淀中加完全培养液，吹打细胞，补足完全培养液，进行培养。相对于现有技术，应用本发明方法进行暗纹东方鲀原代鳃细胞培养，能有效分离组织，且鱼鳃消化处理后细胞得率高，培养的细胞生长良好、生理状态稳定，达到实验研究标准，能够从根本上提供暗纹东方鲀养殖生产中可能出现各种病害问题的研究途径，突破暗纹东方鲀研究瓶颈。

Description

一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法

技术领域

本发明涉及一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

鱼鳃是硬骨鱼重要的呼吸器官，鳃中血液流动方向与水流的方向相反，大大促进了鱼类进行气体交换的速率。同时，鱼鳃也是维持体内稳态平衡重要的器官之一，包括酸碱平衡、渗透压调节、代谢废物的排泄等。在水中，鳃丝完全展开，水体温度、pH值、盐度、金属离子等都直接或间接影响鳃丝的生理状态。通过观察鳃丝、鳃弓的受损情况，可以初步反应鱼体的生理状态。许多研究已经证实，在受到外界刺激时，鳃细胞内某些蛋白会参与机体稳态调节。因此，作为鱼体重要的组织器官，鱼鳃具有重要的研究价值。

暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)属硬骨鱼纲、鲀形(Tetrodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、东方鲀属(Takifugu)的一种海淡水生殖洄游性鱼类，广泛分布在中国近海(东、黄、渤海)和长江中下游水域，其肉质鲜美，深受广大消费者喜爱。此外，河鲀毒素是一种局部选择性特高的高级麻醉药物，在医疗上具有重要用途，国际市场售价极高。近年来，暗纹东方鲀的需求量在逐年增长。然而，随着环境变化以及人类活动的影响，暗纹东方鲀养殖业面临着巨大的挑战(包括种质资源短缺、病害频发等)。因此，对暗纹东方鲀进行研究对水产养殖业的发展具有重大意义。

原代鳃细胞培养作为生物学研究水生生物个体细胞水平的重要手段之一，广泛应用于水生生物研究的各个领域。在对水产养殖动物病理学方面的预防和治疗研究中，国内外学者一致认为只有通过培养细胞，在细胞层面研究各种病害对养殖动物细胞的损害机理，才能在根本上预防和解决养殖过程中出现的问题。在暗纹东方鲀中，至今还没有通过培养相应的细胞来研究病害损伤机理的成功报道。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明目的提供一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，能够简便、有效地实现鳃细胞培养。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，包括以下步骤：

(1)取暗纹东方鲀鳃组织，利用含有双抗青霉素和链霉素的浸泡液浸泡，清洗液清洗后，切割鳃丝；

(2)使用胰蛋白酶消化鳃丝，过滤，离心，取沉淀；随后使用红细胞裂解液去除红细胞，离心，得细胞沉淀；

(3)细胞沉淀中加完全培养液，吹打细胞，补足完全培养液，进行培养。

作为优选：

所述暗纹东方鲀，取鳃组织前饲养在盐度为5～10的水环境中3～5天。

步骤(1)中所述浸泡液配制方法为：纯净水中加NaCl至盐度为5～10，并于100ml浸泡液中加入40～60μl双抗溶液(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

步骤(1)中所述清洗液的配方如下：

并且，上述100ml清洗液中加入90～110μl(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)双抗溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。

步骤(2)中使用胰蛋白酶消化鳃丝的方法如下：于37℃，CO₂细胞培养箱中消化15～20min，其间每5min摇晃培养皿一次。

步骤(2)中所述红细胞裂解液为Solarbio。

步骤(3)中完全培养液成分包括：DMEM基础培养基中加入胎牛血清，DMEM基础培养基与胎牛血清体积比为3～5:1，每100ml培养液中加入90～110μl双抗溶液(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)和0.5～1.5ml L-谷氨酰胺溶液(20m mol/L)，并使调pH至为7.6～7.8之间。

步骤(3)中培养的方法为：26℃细胞培养箱中培养12-24h，之后倒掉培养瓶中培养液，加入DMEM基础培养基(无血清)，清洗，倒掉清洗液后加入新的完全培养液，继续扩大培养。

技术效果：相对于现有技术，本发明暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，能有效清洗和分离鳃组织并保持细胞活性，细胞得率高，培养的细胞生长良好、生理状态稳定，达到实验研究标准，能够从根本上提供暗纹东方鲀养殖生产中可能出现各种病害问题的研究途径，突破暗纹东方鲀研究瓶颈。

附图说明

图1是浸泡液及清洗液处理后的暗纹东方鲀鱼鳃组织；

图2是消化处理后暗纹东方鲀原代鳃细胞(400×)；

图3是24h培养后暗纹东方鲀原代鳃细胞(400×)。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明鳃原代细胞培养情况，对本发明作进一步的详细描述，包括操作步骤及后续细胞生长计数。

实施例

一、细胞培养

a、暗纹东方鲀鳃组织破碎

抓取暗纹东方鲀(饲养条件是盐度为5～10的水环境中3～5天)，75％酒精擦拭鱼体，取出鱼鳃放入含浸泡液的细胞培养皿中，浸泡3～5min；将鱼鳃转移至含有清洗液的培养皿中，反复清洗5～10次；最后所得鱼鳃组织见图1，从图中可看出清洗液清洗后的鳃组织清晰整齐，生理状态良好，无血渍残留。

浸泡液的配制方法为：纯净水中加NaCl至盐度为5～10，并于100ml浸泡液中加入50μl双抗溶液(青霉素Penicillin 100Units/ml、链霉素Streptomycin 100μg/ml)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

清洗液配方，：CaCl₂(无水)0.14g；KCl 0.5g；KH₂PO₄ 0.06g；MgCl₂·6H₂O 0.10g；MgSO₄·7H₂O 0.10g；NaCl 11.0g；NaHCO₃ 0.35g；Na₂HPO₄·7H₂O 0.06g；D-葡萄糖1.0g；酚红0.02g；超纯水定容至1升。并于100ml清洗液中加入100μl双抗溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双抗溶液中青霉素为100Units/ml、链霉素为100μg/ml；

b、暗纹东方鲀鳃组织消化、纯化

将清洗好的鱼鳃放入事先准备好的0.25％胰蛋白酶消化液中，横向切割鳃丝，长度约1～3μm，切完后取出鳃弓。将鳃丝连同胰蛋白酶消化液放入细胞培养皿中，于37℃CO²细胞培养箱中消化15～20min，其间每5分钟一次摇晃培养皿，将消化下的鳃细胞与组织初步分离；

消化的组织悬液经过80目筛网过滤，过滤液放入新的离心管中，1500rpm10min，弃掉液体；

在沉淀中加入红细胞裂解液(Solarbio)，10ml离心管中约加入4ml，1000rpm5min，倒掉液体，取沉淀；

c、暗纹东方鲀鳃细胞培养

往沉淀中加3～5ml完全培养液，在离心管中反复吹打15～20次，将液体转移至细胞培养瓶(7ml，25cm²)中，补足完全培养基体至8ml，细胞密度保持在1×10⁴/ml～1×10⁵/ml之间，于倒置显微镜下观察细胞见图2，从图中可以看出细胞分散均匀，形态及生理状态良好，密度可观。观察后放入26℃细胞培养箱中培养12-24h；

完全培养液的配制方法：DMEM基础培养基，加入胎牛血清,DMEM基础培养基与胎牛血清体积比为4:1，然后每100ml培养液中加入100μl双抗溶液(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)和1ml L-谷氨酰胺溶液(20m mol/L)，使用3.7％NaHCO₃溶液调pH至为7.6～7.8之间。

12～24h后，倒掉培养瓶中培养液，加入DMEM基础培养基(无血清)约5ml，清洗两次，倒掉清洗液后加入新的完全培养液8ml，继续扩大培养。

24h培养后的暗纹东方鲀原代鳃细胞见图3，从图中可看出绝大部分鳃细胞形态发生改变，且贴壁生长，已达到原代细胞培养要求。

二、暗纹东方鲀鳃原代细胞计数

台盼蓝染色与细胞计数

随机选取四瓶培养瓶中的细胞进行胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，加入台盼蓝进行染色(细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀)，在3min内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞(镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状)，最后统计细胞活力。每个实验组进行四组平行重复实验。

细胞活力：活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％

细胞计数结果显示，本发明方法培养暗纹东方鲀原代鳃细胞过程，细胞培养结果中活细胞数目可观，活细胞率稳定在80％以上，并且细胞生理状态稳定，细胞形态良好，均已达到原代细胞培养要求，实验证明本发明方法可行。(参见表1、表2)

表1台盼蓝染色后血球计数板计数暗纹东方鲀原代鳃细胞活细胞数目(个/3min)

表2台盼蓝染色后血球计数板计数暗纹东方鲀原代鳃细胞活细胞率(个/3min)

实施例2

与实施例1基本相同，不同之处仅在于如下：

浸泡液的配制方法为：纯净水中加NaCl至盐度为5～10，并于100ml浸泡液中加入40μl双抗溶液(青霉素Penicillin 100Units/ml、链霉素Streptomycin 100μg/ml)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

清洗液配方：CaCl₂(无水)0.14g；KCl 0.4g；KH₂PO₄ 0.06g；MgCl₂·6H₂O 0.10g；MgSO₄·7H₂O 0.10g；NaCl 10.0g；NaHCO₃ 0.35g；Na₂HPO₄·7H₂O 0.06g；D-葡萄糖1.0g；酚红0.02g；超纯水定容至1升。并于100ml清洗液中加入90μl双抗溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双抗溶液中青霉素为100Units/ml、链霉素为100μg/ml；

完全培养液的配制方法：DMEM基础培养基，加入胎牛血清,DMEM基础培养基与胎牛血清体积比为3：1，然后每100ml培养液中加入90μl双抗溶液(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)和0.5ml L-谷氨酰胺溶液(20m mol/L)，使用3.7％NaHCO₃溶液调pH至为7.6～7.8之间。

经过显微观察，并且最后进行细胞计数，结果与实施例1基本相同。

实施例3

与实施例1基本相同，不同之处仅在于如下：

浸泡液的配制方法为：纯净水中加NaCl至盐度为5～10，并于100ml浸泡液中加入60μl双抗溶液(青霉素Penicillin 100Units/ml、链霉素Streptomycin 100μg/ml)，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

清洗液配方：CaCl₂(无水)0.14g；KCl 0.6g；KH₂PO₄ 0.06g；MgCl₂·6H₂O 0.10g；MgSO₄·7H₂O 0.10g；NaCl 12.0g；NaHCO₃ 0.35g；Na₂HPO₄·7H₂O 0.06g；D-葡萄糖1.0g；酚红0.02g；超纯水定容至1升。并于100ml清洗液中加入110μl双抗溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双抗溶液中青霉素为100Units/ml、链霉素为100μg/ml；

完全培养液的配制方法：DMEM基础培养基，加入胎牛血清,DMEM基础培养基与胎牛血清体积比为5：1，然后每100ml培养液中加入110μl双抗溶液(青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml)和1.5ml L-谷氨酰胺溶液(20m mol/L)，使用3.7％NaHCO₃溶液调pH至为7.6～7.8之间。

经过显微观察，并且最后进行细胞计数，结果与实施例1基本相同。

Claims (2)

1.一种暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取暗纹东方鲀鳃组织，利用含有双抗青霉素和链霉素的浸泡液浸泡，清洗液清洗后，切割鳃丝；

(2)使用胰蛋白酶消化鳃丝，过滤，离心，取沉淀；随后使用红细胞裂解液去除红细胞，离心，得细胞沉淀；

(3)细胞沉淀中加完全培养液，吹打细胞，补足完全培养液，进行培养；

步骤(1)中所述浸泡液配制方法为：纯净水中加NaCl至盐度为5～10，并于100ml浸泡液中加入40～60μl双抗溶液，双抗溶液中含有青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml，微孔滤膜过滤除菌；

步骤(1)中所述清洗液的配方如下：

并且，上述100ml清洗液中加入90～110μl双抗溶液，双抗溶液中含有青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml，微孔滤膜过滤除菌，即得；

步骤(2)中使用胰蛋白酶消化鳃丝的方法如下：于37℃，CO2细胞培养箱中消化15～20min，其间每5min摇晃培养皿一次；所述胰蛋白酶的浓度为0.25％；

步骤(3)中完全培养液成分包括：DMEM基础培养基中加入胎牛血清，DMEM基础培养基与胎牛血清体积比为3～5：1，每100ml培养液中加入90～110μl双抗溶液和0.5～1.5ml L-谷氨酰胺溶液，其中双抗溶液中含有青霉素100Units/ml、链霉素100μg/ml，谷氨酰胺溶液为20mmol/L，并使调pH至为7.6～7.8之间；

步骤(3)中培养的方法为：26℃细胞培养箱中培养12-24h，之后倒掉培养瓶中培养液，加入无血清的DMEM基础培养基，清洗，倒掉清洗液后加入新的完全培养液，继续扩大培养；

所述暗纹东方鲀，取鳃组织前饲养在盐度为5～10的水环境中3～5天。

2.根据权利要求1所述的暗纹东方鲀原代鳃细胞培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述红细胞裂解液为Solarbio。

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