CN104273101A - 一种微型裸腹溞或角突网纹溞的人工培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于浮游动物培养技术领域，具体涉及一种浮游动物微型裸腹溞或角突网纹溞的人工培育方法。本发明的技术方案是通过野外采集溞种，经过室内洗涤、驯化和扩大培养等步骤人工大规模培养实验用微型裸腹溞或角突网纹溞。本发明提高了驯化野外微型裸腹溞或角突网纹溞的成功率，缩短了驯化时间，驯化后的个体繁殖潜力大，且培育获得的微型裸腹溞或角突网纹溞能够满足实验用浮游动物对基因型一致的要求，培养获得的微型裸腹溞能够用于有害藻类水华的治理，而培养得到的角突网纹溞能够作为反应水体理化性质的指示生物，本发明操作方法简单，成本低，易于掌握。
Description
技术领域
本发明属于浮游动物培养技术领域，具体涉及一种微型裸腹溞或角突网纹溞的人工培养方法。
背景技术
浮游动物是悬浮于水中微小动物的总称，是水生食物链的关键环节，在水体生态系统结构和功能过程中起着重要作用。一方面，浮游动物主要以浮游植物作为食物，利用浮游动物成为治理有害藻类水华的重要手段；另一方面，浮游动物自身蛋白质含量较高，是一些鱼类的优良食物，因此，如何驯化培养浮游动物以满足渔业生产的需要对经济发展有重要意义；更为重要的是，一些浮游动物对环境污染及水文因子的变化极为敏感,常被作为环境变化的指示生物而备受生态学家和环境学专家的关注。以浮游动物为研究对象，通过实验模拟的方法探讨浮游动物与其它生物因子、环境因子等之间的关系是当前人们认识世界和改造世界的重要手段。经过不断努力，人们已经成功的培养了一些典型的浮游动物材料用于实验。例如，枝角目中的大型溞是国际上使用最广的标准试验生物，被广泛应用于水生生物试验，试验型大型溞的培育技术已非常成熟，但相比浮游动物纷繁复杂的生物多样性而言，对其它浮游动物的培育技术还远不成熟。
微型裸腹溞(Moina micrura Kurz)和角突网纹溞(Ceriodaphnia cornuta Sars)均隶属于节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)枝角目(Cladocera)。其中裸腹溞遍布于我国各个省区(黑龙江、宁夏、西藏、新疆除外)，广泛分布在各地的池塘、湖泊、水库等各类水域中，喜栖富营养水体，对高温、缺氧、污染等不良环境条件的抗耐力较强，因此是一种治理富营养水体的重要生物资源，对其进行驯化培养在环境治理上意义重大。而角突网纹溞对环境变化非常敏感，是实验室测试环境污染物毒性和反应水体状况的重要指示生物。然而，目前有关微型裸腹溞和角突网纹溞的人工培养技术尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有科学实验研究应用的微型裸腹溞和角突网纹溞材料不足，提供一种微型裸腹溞或角突网纹溞驯化和培养的方法，通过科学培育可以大量获得试验用的微型裸腹溞或角突网纹溞，并可以保证培养得到的微型裸腹溞或者角突网纹溞来源于同一共同雌性个体，基因型一致。
本发明的技术方案是通过野外采集溞种，经过室内洗涤、驯化和扩大培养等步骤人工大规模培养实验用微型裸腹溞和角突网纹溞。
上述溞种是指微型裸腹溞或角突网纹溞。
上述洗涤要求，将采集的微型裸腹溞或角突网纹溞分别反复置于灭菌后的原水中静止培养，以清除野外溞种身体表面及肠道内的藻类和微生物等，每次4小时，该过程中溞培养密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx，水体溶解氧含量为6-8mg/l。
上述驯化要求，用含80％消毒过滤原水和20％培养基的混合溶液对洗涤后的微型裸腹溞或角突网纹溞进行驯化。培养基组成包括CaCl22H2O36.76mg l-1,MgSO47H2O36.97mg l-1,K2HPO48.71mg l-1,NaNO385.01mg l-1,NaHCO312.60mg l-1,Na2SiO39H2O28.42mg l-1,H3BO324.00mg l-1,KCl7.45mg l-1，LiCl0.31mg l-1，RbCl0.07mg l-1，SrCl26H2O0.15mg l-1，NaBr0.016mg l-1,KI0.0033mg l-1,B120.00055mg l-1，Biotin0.0005mg l-1,Thiamin0.1mg l-1。每两天更换一次混合溶液并不断提高混合溶液中培养基比例至100％为止，使微型裸腹溞或角突网纹溞逐渐适应室内培育浮游动植物的物理化学环境，该过程中溞培养密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx,光周期为D:L＝12:12，水体溶解氧含量为6-8mg/l，温度为15-20℃，每天用无菌培养的蛋白小球藻(1×105cell/ml)投喂。
上述培养要求，挑选健康活跃的两种雌溞为种溞，分别单个放入容器中用培养基培养，产生后代后选择繁殖率最高的一组继续扩大培养，当培养溞密度超过1000ind/L时，进行采收。
本发明所述微型裸腹溞或角突网纹溞的培育方法，由以下步骤构成：
(1)调配培养基：取曝气后的自来水，加入以下营养盐和维生素进行配置：CaCl22H2O36.76mg l-1,MgSO47H2O36.97mg l-1,K2HPO48.71mg l-1,NaNO385.01mg l-1,NaHCO312.60mg l-1,Na2SiO39H2O28.42mg l-1,H3BO324.00mg l-1,KCl7.45mg l-1，LiCl0.31mg l-1，RbCl0.07mg l-1，SrCl26H2O0.15mg l-1，NaBr0.016mg l-1,KI0.0033mg l-1,B120.00055mg l-1，Biotin0.0005mg l-1,Thiamin0.1mg l-1，调配后进行灭菌处理；
(2)野外采集微型裸腹溞或角突网纹溞及原水，对原水溶液进行过滤和灭菌处理；
(3)洗涤:将采集的微型裸腹溞或角突网纹溞反复置于过滤、灭菌后的原水中培养，每次4小时，溞培养密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx，水体溶解氧含量为6-8mg/l；
(4)驯化:用含消毒过滤原水和(1)步骤所述培养基的混合溶液对微型裸腹溞或角突网纹溞进行驯化，逐步提高混合溶液中(1)步骤所述培养液比例，反复驯化，直至微型裸腹溞和角突网纹溞在含100％(1)步骤所述培养液中能够正常生长繁殖为止，溞密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，水体溶解氧含量为6-8mg/l，温度为15-20℃，每日用1×105cell/ml的蛋白小球藻进行喂食；
(5)扩大培养:选择已产过1-2窝幼溞、健康活跃的两种雌溞为种溞分别单个放入容器中用(1)步骤所述培养液培养，产生后代后选择繁殖率最高的一组继续扩大培养，饵料为1×105cell/ml的蛋白小球藻，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，溶解氧含量6-8mg/l，当溞密度超过1000ind/L时，进行采收。
本发明与现有技术相比其有益效果是：
(1)提高了驯化野外微型裸腹溞或角突网纹溞的成功率，缩短了驯化时间，驯化后的个体繁殖潜力大，且培育获得的微型裸腹溞或角突网纹溞能够满足实验用浮游动物对基因型一致的要求；(2)培养获得的微型裸腹溞能够用于有害藻类水华的治理，而培养得到的角突网纹溞能够作为反应水体理化性质的指示生物；(3)本发明操作方法简单、成本低，易于掌握。
附图说明
图1为驯化后微型裸腹溞在培养基中扩大培养曲线；
图2为驯化后角突网纹溞在培养基中扩大培养曲线；
具体实施方式
本发明通过以下技术方案实现：
(1)配置培养基；
(2)用25号浮游生物网(64μm)采集微型裸腹溞或角突网纹溞及原水；
(3)将采集的微型裸腹溞或角突网纹溞反复至于过滤、灭菌后的原水中静置培养，以清洗微型裸腹溞或角突网纹溞身体表面及肠道内的藻类和微生物等，每次静置时间为4小时，溞培养密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx，水体溶解氧含量为6-8mg/l；
(4)驯化：用含80％消毒过滤原水和20％培养基的混合溶液对微型裸腹溞或角突网纹溞进行驯化，每两天更换一次混合溶液并不断提高混合溶液中培养基的比例至100％为止，溞培养密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，溶解氧含量6-8mg/l，温度为15-20℃，每日用1×105cell/ml无菌培养的蛋白小球藻进行喂食，反复驯化，至微型裸腹溞和角突网纹溞在实验环境下能够正常生长繁殖为止；
(5)培养：选择已产过1-2窝幼溞，健康活跃的两种雌溞为种溞，分别单个放入容器中用培养基培养，产生后代后选择繁殖率最高的一组继续扩大培养，培养基体积为容器体积的1/5-1/4，培养用饵料为灭菌培养的蛋白小球藻(1×105cell/ml)，光照强度为2000-4000Lx,光周期为D:L＝12:12，水体溶解氧含量为6-8mg/l，接种初期每4-5天换一次培养液，当密度到达200ind/L时2-3天换一次培养基；当培养溞密度超过1000ind/L时，进行采收；
实施例
2013年8月，在南京玄武湖和江苏太湖分别采集了微型裸腹溞和角突网纹溞及相应的原水。采集方法使用8L的桶状采水器，采集0-1.5m水层的水样，全部倒入25号(网孔64μm)浮游生物网中，浓缩后的浮游动物带回实验室进行分离，挑选目标溞种进行驯化和扩大培养，滤出的原水用收集瓶带回实验室后用325目标准筛进行过滤，最后在125℃下灭菌15分钟，冷却备用。转移400ml灭菌后的原水及40只健壮的微型裸腹溞或角突网纹溞至2L大烧杯中，在实验室内静置4小时，反复3次用以清洗微型裸腹溞或角突网纹溞身体表面及肠道内的藻类和微生物，室内光照强度为2000-4000Lx，温度为15-20℃，水体溶解氧含量6-8mg/l，溶液氧不足的情况下用充气泵缓慢曝气补充。洗涤后，挑选健康活跃的个体，用含80％灭菌过滤原水和20％培养基的混合溶液分别对微型裸腹溞和角突网纹溞进行驯化，每两天更换一次混合溶液并逐步提高混合溶液中培养基比例至100％为止，溞培养密度100ind/L，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，水体溶解氧含量6-8mg/l，温度为15-20℃，每日用无菌培养的蛋白小球藻(1×105cell/ml)进行喂食，反复驯化，20天后微型裸腹溞或角突网纹溞在溶液中都能够正常生长和繁殖。2012年9月，分别挑选单个微型裸腹溞或者角突网纹溞放入100ml小烧杯内培养，小烧杯内含25ml培养基，饵料为灭菌培养的蛋白小球藻(1×105cell/ml)，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，水体溶解氧含量6-8mg/l，7天后，微型裸腹溞或角突网纹溞均产生后代，选择繁殖率最高的一组转入2L大烧杯内继续扩大培养，烧杯盛400ml培养基，在微型裸腹溞或角突网纹溞密度达到200ind/L之前，每4-5天换水一次，微型裸腹溞和角突网纹溞分别于扩大培养的第7天和第15天达到200ind/L,此后每2天换水一次，扩大培养13天后，微型裸腹溞超过1000ind/L，可以进行收取，而角突网纹溞于扩大培养的第23天达到1000ind/L，进行收取(见图1和图2)。
以上实验结果表明本发明提供的驯化、培育微型裸腹溞或角突网纹溞的方法是快速、有效的。
Claims (4)
1.一种微型裸腹溞或角突网纹溞的培育方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)调配培养基：取曝气后的自来水，加入以下营养盐和维生素进行配置，CaCl22H2O 36.76mg l-1,MgSO47H2O 36.97mg l-1,K2HPO48.71mg l-1,NaNO385.01mg l-1,NaHCO312.60mg l-1,Na2SiO39H2O 28.42mg l-1,H3BO324.00mg l-1,KCl 7.45mg l-1，LiCl 0.31mg l-1，RbCl 0.07mg l-1，SrCl26H2O 0.15mg l-1，NaBr0.016mg l-1,KI 0.0033mg l-1,B120.00055mg l-1，Biotin 0.0005mg l-1,Thiamin 0.1mg l-1，调配后进行灭菌处理；
(2)野外采集微型裸腹溞或角突网纹溞及原水，对原水溶液进行过滤和灭菌处理；
(3)洗涤:将采集的微型裸腹溞或角突网纹溞反复置于过滤、灭菌后的原水中培养，每次4小时，溞培养密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx，水体溶解氧含量为6-8mg/l；
(4)驯化:用含消毒过滤原水和(1)步骤所述培养基的混合溶液对微型裸腹溞或角突网纹溞进行驯化，逐步提高混合溶液中(1)步骤所述培养液比例，反复驯化，直至微型裸腹溞和角突网纹溞在含100％(1)步骤所述培养液中能够正常生长繁殖为止，溞密度50-100ind/L，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，水体溶解氧含量为6-8mg/l，温度为15-20℃，每日用1×105cell/ml的蛋白小球藻进行喂食；
(5)扩大培养:选择已产过1-2窝幼溞、健康活跃的两种雌溞为种溞分别单个放入容器中用(1)步骤所述培养液培养，产生后代后选择繁殖率最高的一组继续扩大培养，饵料为1×105cell/ml的蛋白小球藻，光照强度为2000-4000Lx,光周期D:L＝12:12，溶解氧含量6-8mg/l，当溞密度超过1000ind/L时，进行采收。
2.根据权利要求1所述方法生产的微型裸腹溞或角突网纹溞，其特征是能够满足实验用微型裸腹溞或角突网纹溞对基因型一致的要求。
3.根据权利要求1所述方法生产的微型裸腹溞在富营养水体中有害藻类水华治理中的应用。
4.根据权利要求1所述方法生产的角突网纹溞能够作为反应水体理化性质的指示生物在实验室测试环境污染物毒性或反应水体状况中的应用。
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