CN116814525B - 一种用于东风螺胚胎培养的培养基及东风螺胚胎囊外培养的方法 - Google Patents
一种用于东风螺胚胎培养的培养基及东风螺胚胎囊外培养的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于东风螺胚胎培养的培养基及东风螺胚胎囊外培养的方法。按质量份计，所述培养基包括5～15份竹叶提取物、0.5～4份二甲基‑β‑丙酸噻亭、5～15份脯氨酸、1～3份抗坏血酸、1～3份溶血磷脂酸、60～120份MEMα、2～5份牛磺酸、0.5～3份水产复合维生素、20～50份东风螺胚乳液、900～1100份灭菌海水。本发明首次提出东风螺胚胎或膜内幼虫囊外培育的方法及所用的培养基，解决了东风螺囊外培育困难的问题，所述方法不仅有效、经济、简便；且东风螺胚胎的感染率和幼虫的死亡率可降至0.8％以下，成功变态成为早期面盘幼虫的几率可达98％以上。
Description
技术领域
本发明属于螺培育的技术领域，更具体地，涉及一种用于东风螺胚胎培养的培养基及东风螺胚胎囊外培养的方法。
背景技术
东风螺俗称花螺、旺螺、黄螺，又称凤螺，隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、新腹足目(Neogastropoda)、蛾螺科(Buccinidae)、东风螺属(Babylonia)，分布于热带、亚热带地区，是肉食性浅海底栖贝类，其味道鲜美，是一类符合现代营养需求的高蛋白、低脂肪的名贵海鲜。
世界上现有东风螺种类11种，均为可食种类，目前投入养殖生产的仅有方斑东风螺、泥东风螺和东风螺3种。我国是世界东风螺养殖最主要的国家，目前东风螺在国内的养殖主要分布在福建以南沿海地区，其中海南因得天独厚的地理环境和气候条件优势，成为我国东风螺种苗培育和养殖的最适宜地区。目前东风螺的培养是在培养池或者海水水体中进行培养。
中国专利《一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法》提供了一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法，该方法将罗氏沼虾的受精胚胎进行离体孵化，使之前由母虾直接抱卵孵化的带来的缺点减低，增加了罗氏沼虾离体培养的孵化率。
但是目前在现有的东风螺养殖过程中，东风螺的囊外培养和孵化技术不够成熟。现有的东风螺卵囊体外孵化存在存活率低、容易受细菌感染、无合适培养基等问题，因此如何提供一种适用于东风螺体外孵化的培养基及孵化方法称为亟需解决的技术问题。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明的首要目的在于提供一种用于东风螺胚胎培养的培养基，所述培养基不仅适合东风螺胚胎的囊外培养，解决了东风螺胚胎的囊外培育困难，且所述培养基能够有效促进胚胎或幼虫生长发育，极大地降低了东风螺培养的感染率，提高了东风螺胚胎的体外成活率。
本发明的第二个目的在于提供上述用于东风螺胚胎培养的培养基的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述用于东风螺胚胎培养的培养基在东风螺胚胎囊外培养中的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种东风螺胚胎囊外培养的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种用于东风螺胚胎培养的培养基，按质量份计，所述培养基包括5～15份竹叶提取物、0.5～4份二甲基-β-丙酸噻亭、5～15份脯氨酸、1～3份抗坏血酸、1～3份溶血磷脂酸、60～120份MEMα、2～5份牛磺酸、0.5～3份水产复合维生素、20～50份东风螺胚乳液、900～1100份灭菌海水。
本发明提供了一种适用于东风螺胚胎培养的培养基，其以MEMα组分作为基础培养基，在此基础上添加抗坏血酸和二甲基-β-丙酸噻亭相辅相成，发挥协同功效以提高培养基的抗应激、抗氧化、抗渗透压能力。进一步地，发明人采用脯氨酸、溶血磷脂酸和水产复合维生素进行搭配，起到补充营养、促进生长，促进细胞的生长、增殖、分化的作用。而牛磺酸的加入能够显著提高培养培育细胞的免疫力，并配以竹叶提取物以抗菌抑菌，不仅温和不伤胚胎，且极大地降低了培养过程中，东风螺胚胎或幼虫的细菌感染几率。最后通过加入东风螺胚乳液，补充其他成分所缺乏的营养元素。本发明提供的培养基适合东风螺胚胎的囊外培养，解决了东风螺胚胎的囊外培育困难的问题，且所述培养基能够有效促进胚胎或幼虫生长发育，降低了培育时间(现有的东风螺体外培育时间一般为7～9天，且往往难以培育成功)，极大地降低了东风螺培养的感染率，提高了东风螺胚胎的体外成活率。
优选地，按质量份计，所述培养基包括8～12份竹叶提取物、1.5～2.5份二甲基-β-丙酸噻亭、8～12份脯氨酸、1～2份抗坏血酸、1～2份溶血磷脂酸、80～120份MEMα、3～4份牛磺酸、2～3份水产复合维生素、40～50份东风螺胚乳液、900～1100份灭菌海水。
优选地，按质量份计，所述培养基包括9～11份竹叶提取物、1.8～3份二甲基-β-丙酸噻亭、8.5～13份脯氨酸、1.5～2.5份抗坏血酸、1.5～2.5份溶血磷脂酸、95～110份MEMα、3.5～4.5份牛磺酸、2～2.5份水产复合维生素、40～47份东风螺胚乳液、900～1000份灭菌海水。
进一步地，本发明还请求保护一种用于东风螺胚胎培养的培养基的制备方法，将竹叶提取物、二甲基-β-丙酸噻亭、脯氨酸、抗坏血酸、溶血磷脂酸、MEMα、牛磺酸、水产复合维生素、东风螺胚乳液溶解在灭菌海水中，即得所述用于东风螺胚胎培养的培养基。
进一步地，本发明还请求保护上述用于东风螺胚胎培养的培养基在东风螺胚胎囊外培养中的应用。
进一步地，本发明还请求保护一种东风螺胚胎囊外培养的方法，包括以下步骤：
S1.取东风螺卵囊，剔除坏掉、死掉的胚胎或幼虫后，采用消毒剂浸泡，随后洗去残留消毒剂后再用灭菌海水冲洗干净；
S2.切开东风螺卵囊，将胚胎或幼虫、胚乳液从卵囊切口挤出，用滤网进行过滤，过滤出的胚乳液进行保存；将滤网上的胚胎或幼虫倒入消毒剂中浸泡；随后采用洗卵液清洗浸泡胚体或幼虫；
S3.洗卵液清洗后的胚胎或幼虫放入上述用于东风螺胚胎培养的培养基中进行培养。
本发明提供了一种东风螺胚胎囊外培养的方法，首先通过消毒剂对东风螺卵囊进行消毒处理，随后切开并过滤出东风螺胚胎或幼虫进行二次消毒处理。消毒后的东风螺胚胎或幼虫采用洗卵液浸泡处理，最后采用上述培养基进行培养。本发明提供的东风螺胚胎囊外培养的方法解决了东风螺胚胎的囊外培育困难的问题。且在所述消毒剂、洗卵液和培养基三者的协同作用下，能够有效促进东风螺胚胎或幼虫生长发育，降低了培育时间和东风螺培养的感染率，提高了东风螺胚胎的体外成活率。基于本发明提供的东风螺胚胎囊外培养方法，使得东风螺的培育时间最高缩短至4天左右，成活率≥98％，且感染率极低(≤0.8％)。培育获得的东风螺幼虫强壮，且能够正常生长。
优选地，所述步骤S1中，按重量份数计，所述消毒剂包括0.01～0.05份聚维酮碘、0.01～0.05份戊二醛苯扎溴铵、0.006～0.01份纳米银离子、0.002～0.004份右旋肉碱、0.01～0.03份乙二胺四乙酸、900～1100份灭菌海水。
进一步优选地，按重量份数计，所述消毒剂包括0.04份聚维酮碘、0.045份戊二醛苯扎溴铵、0.008份纳米银离子、0.003份右旋肉碱、0.02份乙二胺四乙酸、1000份灭菌海水。本发明采用的消毒剂组合能够多层次全方位对东风螺胚胎或幼虫进行消毒，消毒更加彻底，且因为浓度低、药性比较温和，不会对胚胎或幼虫造成影响。
进一步地，所述消毒剂的制备方法为：按照相应的比例量取聚维酮碘、戊二醛苯扎溴铵、纳米银离子、右旋肉碱、乙二胺四乙酸依次加入一定量的灭菌海水中，搅拌均匀后加上剩余的灭菌海水，即得消毒剂。所述消毒剂密封在黑色发酵罐内，保存在阴暗、通风处。
优选地，所述步骤S2中，所述胚胎为处于卵裂期、囊胚期、原肠期中的任一期；所述幼虫为担轮幼虫期、膜内面盘幼虫期中的任一期。
优选地，所述步骤S2中，所述滤网的孔径为100～300目。
优选地，所述步骤S2中，将滤网上的胚胎或幼虫倒入消毒剂中浸泡5～20s。
优选地，所述步骤S2中，所述洗卵液中，每1升蒸馏水中含有5～9克氯化钠、0.3～0.5克葡萄糖、0.15～0.25克碳酸氢钠、0.1～0.15克氯化钾、0.01～0.02克磷酸二氢钠和0.1～0.2克泛酸钙。本发明采用洗卵液清洗干净卵囊的同时，又能够避免细胞破裂，所述洗卵液的渗透压和胚胎外的一致，能够避免细胞脱水或者过度吸水。
优选地，所述步骤S2中，所述洗卵液中，每1升蒸馏水中含有6.5克氯化钠、0.4克葡萄糖、0.2克碳酸氢钠、0.14克氯化钾、0.015克磷酸二氢钠和0.1克泛酸钙。
进一步地，所述洗卵液的制备方法为：将氯化钠、葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钾、磷酸二氢钠、泛酸钙依次溶解在一定量的蒸馏水中，每溶解一种成分均要搅拌均匀后再添加下一种成分，待所有成分充分溶解后加入剩余的蒸馏水，即得所述洗卵液。
优选地，所述步骤S3中，放入培养基后，期间控制水温为26～30℃，溶解氧≥5mg/L。
优选地，所述步骤S2中，过滤出的胚乳液在低温下进行保存。所述低温为2～8℃，进一步地，所述低温为4℃。
优选地，所述东风螺选自方斑东风螺、泥东风螺、东风螺中的一种或多种。
优选地，所述灭菌海水为煮沸后的海水，盐度为20～38ppt。
具体地，本发明所述囊外培养是指将东风螺卵囊内的胚胎或幼虫取出在人工控制条件下培育。本发明所述东风螺卵囊为乳白色半透明，里面可见卵粒或幼虫。更具体而言，方斑东风螺的卵囊呈高脚酒杯状，泥东风螺的卵囊呈梯形，东风螺的卵囊呈长方形。本发明所述胚乳液为卵囊胶质膜包围的除胚体或幼虫外的一切半透明、胶状、黏稠液体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次提出东风螺胚胎或膜内幼虫囊外培育技术及所用培养基的制备方法，解决了东风螺囊外培育困难的问题，有助于研究东风螺胚胎的发育进程，为东风螺生物学研究、遗传改良育种研究、分类与进化、营养价值与需求、DNA分子标记开发和利用、基因编辑等方面研究提供技术支撑，适用于水产生物工程领域。该方法有效、经济、简便。采用本发明的方法，东风螺胚胎的感染率和幼虫的死亡率可降至0.8％以下，成功变态成为早期面盘幼虫的几率可达98％以上。
附图说明
图1为实施例1中东风螺亲螺交配产卵的状态图。
图2为实施例1中收集的东风螺卵囊的状态图。
图3为实施例1中刚产出的受精卵的状态图。
图4为实施例1中东风螺卵囊卵裂期出现第一极体的状态图。
图5为实施例1中东风螺卵囊卵裂期出现第二极体的状态图。
图6为实施例1中东风螺卵囊卵裂期中的细胞期的状态图。
图7为实施例1中东风螺卵囊囊胚期的状态图。
图8为实施例1中东风螺卵囊担轮幼虫期的状态图。
图9为实施例1中东风螺卵囊膜内面盘幼虫的状态图。
图10为实施例1中东风螺卵囊早期面盘幼虫的状态图。
图11、图12为对比例1中东风螺胚胎体外常规培育感染坏死的状态图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
短语“卵裂期”是指东风螺卵囊内胚胎是黄褐色，呈圆球形或椭圆形，悬浮于黏稠状胚乳液中，陆续出现第一极体和第二极体，胚胎不断分裂直至多细胞。
短语“囊胚期”是指东风螺卵囊内胚胎的动物极细胞分裂在上方形成一条白色透明带；植物极细胞随着细胞的分裂，分裂球变小，胚胎形态由扁平状向圆球形变化，胚胎进入囊胚期。
短语“原肠期”是指东风螺卵囊内胚胎形状椭圆形，有内胚层和原肠胚，这时胚体借助纤毛的摆动可在卵囊内转动。
短语“担轮幼虫期”是指东风螺卵囊内胚胎发育成膜内幼虫，该期幼虫长有纤毛的顶板、纤毛环、肾原基、心囊、壳腺、平衡囊、后足、厣、幼虫壳等。
短语“膜内面盘幼虫期”是指东风螺卵囊内幼虫长有两个对称相连的亚椭圆形的面盘，头部出现一对黑色无柄的眼点，幼虫壳生长为螺旋形，已形成食道和直肠，胚体大部分空间被卵黄块占据。
短语“早期面盘幼虫”是指东风螺幼虫体内明显可见两个残留的卵黄块，有两个面盘呈椭圆形，左右对称，边缘密生纤毛的发育时期。
实施例1一种用于东风螺胚胎培养的培养基制备
将10份竹叶提取物(选购自BEST百特店，批号为20220110)、2份二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)、10份脯氨酸、2份抗坏血酸、2份溶血磷脂酸、100份MEMα(选购自MERCK)、4份牛磺酸、2.5份水产复合维生素(富得虾元，批号20220215，厦门惠盈动物科技有限公司)、45份东风螺胚乳液按照比例溶解在500毫升灭菌海水中，每溶解一种成分均搅拌均匀后再添加下一种成分，待所有成分充分溶解后加入剩余500毫升的灭菌海水，即得到用于东风螺胚胎培养的培养基。
实施例2一种用于东风螺胚胎培养的培养基制备
将11份竹叶提取物(选购自BEST百特店，批号为20220110)、3份二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)、13份脯氨酸、2.5份抗坏血酸、2.5份溶血磷脂酸、110份MEMα(选购自MERCK)、4.5份牛磺酸、2.5份水产复合维生素(富得虾元，批号20220215，厦门惠盈动物科技有限公司)、47份东风螺胚乳液按照比例溶解在500毫升灭菌海水中，每溶解一种成分均搅拌均匀后再添加下一种成分，待所有成分充分溶解后加入剩余400毫升的灭菌海水，即得到用于东风螺胚胎培养的培养基。
实施例3一种用于东风螺胚胎培养的培养基制备
将9份竹叶提取物(选购自BEST百特店，批号为20220110)、1.8份二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)、8.5份脯氨酸、1.5份抗坏血酸、1.5份溶血磷脂酸、95份MEMα(选购自MERCK)、3.5份牛磺酸、2份水产复合维生素(富得虾元，批号20220215，厦门惠盈动物科技有限公司)、50份东风螺胚乳液按照比例溶解在500毫升灭菌海水中，每溶解一种成分均搅拌均匀后再添加下一种成分，待所有成分充分溶解后加入剩余600毫升的灭菌海水，即得到用于东风螺胚胎培养的培养基。
实施例4一种东风螺胚胎囊外培养的方法
(1)提前配置好消毒剂、洗卵液、培养基和灭菌海水，密封在黑色罐内，保存在阴暗、通风处。消毒好实验需要的工具。
①消毒剂的配置为：按下述成分及其重量份，将0.04份聚维酮碘、0.045份戊二醛苯扎溴铵、0.008份纳米银离子、0.003份右旋肉碱、0.02份乙二胺四乙酸依次加入400ml灭菌海水中，搅拌均匀后加上600ml灭菌海水，即为配置好的消毒剂。
②洗卵液的配置为：按下述成分及其重量份，将6.5克氯化钠、0.4克葡萄糖、0.2克碳酸氢钠、0.14克氯化钾、0.015克磷酸二氢钠、0.1克泛酸钙，溶解在500ml蒸馏水中，每溶解一种成分均搅拌均匀后再添加下一种成分，待所有成分充分溶解后加入600ml蒸馏水，即得洗卵液。
③培养基的配置为：参照实施例1的制备方法制备获得用于东风螺胚胎培养的培养基。
④灭菌海水的制备为：30ppt的海水煮沸后纳凉，即得灭菌海水。
⑤工具消毒的操作为：所有实验工具均煮沸5～15分钟，再用紫外线照射消毒，高温烘干。
(2)观察方斑东风螺亲螺，等待亲螺交配产卵，收集产在沙面的东风螺卵囊。
(3)取步骤(2)中的东风螺卵囊，采用消毒剂浸泡20～60s，随后用蒸馏水洗去残留消毒剂后，再用灭菌海水反复冲洗干净。
(4)取步骤(3)中消毒好的东风螺卵囊，剪刀剪掉卵柄末端以去掉沙砾，用小针挑破卵囊，用小手术刀对着小孔沿着卵囊边缘剪出一切口。用夹子将胚胎或幼虫、胚乳液从卵囊切口挤出，用150目滤网进行过滤，过滤出的胚乳液收集并在6℃下保存；将滤网反面放在消毒剂中，亲亲拍打直至胚胎脱离滤网落入消毒剂中，轻轻搅动打散粘在一块的胚体，浸泡5～20s，用洗卵液浸泡清洗干净胚体或幼虫，剔除坏掉、死掉的胚胎或幼虫。
(5)洗卵液清洗后的胚胎或幼虫放入上述培养基中进行培养，期间控制水温27.5～28.5℃，溶解氧5mg/L，即得东风螺早期面盘幼虫。
实施例5一种东风螺胚胎囊外培养的方法
本实施例和实施例4的区别在于：
①消毒剂的成分及其重量份为：0.045份聚维酮碘、0.05份戊二醛苯扎溴铵、0.009份纳米银离子、0.0035份右旋肉碱、0.025份乙二胺四乙酸、1000ml灭菌海水。
②洗卵液的成分及其重量份为：7克氯化钠、0.45克葡萄糖、0.3克碳酸氢钠、0.15克氯化钾、0.018克磷酸二氢钠、0.15克泛酸钙、1100ml蒸馏水。
③培养基的配置为：参照实施例2的制备方法制备获得用于东风螺胚胎培养的培养基。
培育期间控制水温28.5～29.5℃。
实施例6一种东风螺胚胎囊外培养的方法
本实施例和实施例4的区别在于：
①消毒剂的成分及其重量份为：0.035份聚维酮碘、0.04份戊二醛苯扎溴铵、0.007份纳米银离子、0.002份右旋肉碱、0.02份乙二胺四乙酸、1000ml灭菌海水。
②洗卵液的成分及其重量份为：6.5克氯化钠、0.3克葡萄糖、0.15克碳酸氢钠、0.13克氯化钾、0.014克磷酸二氢钠、0.15克泛酸钙、1100ml蒸馏水。
③培养基的配置为：参照实施例3的制备方法制备获得用于东风螺胚胎培养的培养基。
培育期间控制水温29～30℃。
对比例1
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基为灭菌海水，取刚产的卵囊，解剖后进行胚胎培育，4天后胚胎全部感染死亡。胚胎感染坏死状态如图11、图12。
对比例2
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基中无添加胚乳液，培育结果如表1。
对比例3
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基中无添加竹叶提取物，培育结果如表1。
对比例4
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基中无添加MEMα，培育结果如表1。
对比例5
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基中无添加脯氨酸和溶血磷脂酸，培育结果如表1。
对比例6
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基中无添加二甲基-β-丙酸噻亭和抗坏血酸，培育结果如表1。
对比例7
本对比例和实施例4的区别在于：
培养基中无添加牛磺酸和水产复合维生素，培育结果如表1。
测试例1
在实验期间，对实施例4～6和对比例1～7每天观察一次，并在显微镜下用手机拍照记录。实施例4～6和对比例1～7的培育结果如表1所示。实施例4～6中方斑东风螺的胚胎和幼虫发育时间的变化依次如表2～4所示。胚胎发育各个阶段图见图1～10。其中，图1为实施例1中东风螺亲螺交配产卵的状态图。图2为实施例1中收集的东风螺卵囊的状态图。图3为实施例1中刚产出的受精卵的状态图。图4为实施例1中东风螺卵囊卵裂期出现第一极体的状态图。图5为实施例1中东风螺卵囊卵裂期出现第二极体的状态图。图6为实施例1中东风螺卵囊卵裂期中的细胞期的状态图。图7为实施例1中东风螺卵囊囊胚期的状态图。图8为实施例1中东风螺卵囊担轮幼虫期的状态图。图9为实施例1中东风螺卵囊膜内面盘幼虫的状态图。图10为实施例1中东风螺卵囊早期面盘幼虫的状态图。
表1
| 组别 | 胚胎/幼虫时期 | 培育时间/d | 成活率％ | 感染率％ |
| 实施例4 | 卵裂期 | 6.5 | 98.2 | 0.7 |
| 实施例5 | 囊胚期 | 5.5 | 98.5 | 0.5 |
| 实施例6 | 担轮幼虫期 | 4 | 99.3 | 0.2 |
| 对比例1 | 卵裂期 | 7 | 0 | 100 |
| 对比例2 | 卵裂期 | 7 | 65.6 | 1.2 |
| 对比例3 | 囊胚期 | 6 | 30.4 | 67.9 |
| 对比例4 | 囊胚期 | 6 | 12.3 | 9.6 |
| 对比例5 | 卵裂期 | 7.5 | 82.4 | 0.55 |
| 对比例6 | 卵裂期 | 7 | 86.2 | 0.65 |
| 对比例7 | 囊胚期 | 6.5 | 79.5 | 0.5 |
表2
表3
| 序号 | 发育阶段 | 水温(℃) | 发育时间(h) |
| 1 | 囊胚期 | 28.5 | 0：00 |
| 2 | 原肠期 | 28.9 | 8：30 |
| 3 | 担轮幼虫期 | 29.4 | 29：50 |
| 4 | 膜内面盘幼虫期 | 29.2 | 113：20 |
| 5 | 早期面盘幼虫 | 29.3 | 132：10 |
表4
| 序号 | 发育阶段 | 水温(℃) | 发育时间(h) |
| 1 | 担轮幼虫期 | 29.8 | 0：00 |
| 2 | 膜内面盘幼虫期 | 29.7 | 79：55 |
| 3 | 早期面盘幼虫 | 29.6 | 96：10 |
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例为申请人真实试验结果加以论证。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (8)
1.一种用于东风螺胚胎培养的培养基，其特征在于，按质量份计，所述培养基由以下组分组成：5～15份竹叶提取物、0.5～4份二甲基-β-丙酸噻亭、5～15份脯氨酸、1～3份抗坏血酸、1～3份溶血磷脂酸、60～120份MEM α、2～5份牛磺酸、0.5～3份水产复合维生素、20～50份东风螺胚乳液、900～1100份灭菌海水。
2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，按质量份计，所述培养基由以下组分组成：9～11份竹叶提取物、1.8～3份二甲基-β-丙酸噻亭、8.5～13份脯氨酸、1.5～2.5份抗坏血酸、1.5～2.5份溶血磷脂酸、95～110份MEM α、3.5～4.5份牛磺酸、2～2.5份水产复合维生素、40～47份东风螺胚乳液、900～1000份灭菌海水。
3.权利要求1～2任一项用于东风螺胚胎培养的培养基的制备方法，其特征在于，将竹叶提取物、二甲基-β-丙酸噻亭、脯氨酸、抗坏血酸、溶血磷脂酸、MEM α、牛磺酸、水产复合维生素、东风螺胚乳液溶解在灭菌海水中，即得所述用于东风螺胚胎培养的培养基。
4.权利要求1～2任一项用于东风螺胚胎培养的培养基在东风螺胚胎囊外培养中的应用。
5.一种东风螺胚胎囊外培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取东风螺卵囊，剔除坏掉、死掉的胚胎或幼虫后，采用消毒剂浸泡，随后洗去残留消毒剂后再用灭菌海水冲洗干净；
S2.切开东风螺卵囊，将胚胎或幼虫、胚乳液从卵囊切口挤出，用滤网进行过滤，过滤出的胚乳液进行保存；将滤网上的胚胎或幼虫倒入消毒剂中浸泡；随后采用洗卵液清洗浸泡胚体或幼虫；
S3.洗卵液清洗后的胚胎或幼虫放入权利要求1～2任一项所述用于东风螺胚胎培养的培养基中进行培养，期间控制水温为26～30℃；
按重量份数计，所述消毒剂包括0.01～0.05份聚维酮碘、0.01～0.05份戊二醛苯扎溴铵、0.006～0.01份纳米银离子、0.002～0.004份右旋肉碱、0.01～0.03份乙二胺四乙酸、900～1100份灭菌海水；
所述洗卵液中，每1升蒸馏水中含有5～9克氯化钠、0.3～0.5克葡萄糖、0.15～0.25克碳酸氢钠、0.1～0.15克氯化钾、0.01～0.02克磷酸二氢钠和0.1～0.2克泛酸钙。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述滤网的孔径为100～300目。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，放入培养基后，溶解氧≥5mg/L，胚胎的培育时间为4～7天，幼虫的培育时间为1～4天，即可变态成为东风螺早期面盘幼虫。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述消毒剂、洗卵液和用于东风螺胚胎培养的培养基的保质期为20天。
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| CN111073848A (zh) * | 2020-01-02 | 2020-04-28 | 广州裕康生物科技有限公司 | 一种卵裂期胚胎培养组合物及卵裂期胚胎培养液 |
| CN111304145A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-06-19 | 天津农学院 | 一种提高罗氏沼虾胚胎离体培养孵化率的方法 |
| CN114304011A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-04-12 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种法螺稚贝培育方法 |
-
2023
- 2023-06-09 CN CN202310687783.4A patent/CN116814525B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 方斑东风螺繁育、营养及疾病的研究进展;陈萌;仲恺农业工程学院学报;20220930;第35卷(第03期);第57-61页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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