CN110684709B - 一种皱纹盘鲍细胞培养基及细胞系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种皱纹盘鲍细胞培养基，是以L‑15培养基为基础，并添加无机盐、生长因子、L‑谷氨酰胺、虾青素、γ‑氨基丁酸、羧甲基葡聚糖、牛磺酸、氢化可的松、皱纹盘鲍贝壳水提物、胎牛血清以及抗生素等组分。本发明还提供了一种皱纹盘鲍细胞系的构建方法，是以皱纹盘鲍心脏组织为材料，采用机械解离法获得单细胞，重悬于上述细胞培养基中进行原代培养，继而成功构建皱纹盘鲍心脏细胞系。本发明培养基及方法可以很好地维持皱纹盘鲍心脏细胞在体外的存活和生长，构建的细胞系具有连续传代的能力。本发明显著提高了皱纹盘鲍心脏细胞体外培养的存活率，延长了其体外培养的时长，具有快速易操作、稳定易重复的特点。

Description

一种皱纹盘鲍细胞培养基及细胞系的构建方法

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种皱纹盘鲍细胞培养基及细胞系的构建方法。

背景技术

鲍鱼（Abalone）又名海耳、鳆鱼、镜面鱼，属软体动物门，腹足纲，原始腹足目，鲍科，鲍属，为藻食性贝类，通常生长在水温较低的海底，足迹遍及太平洋、大西洋和印度洋。鲍鱼属狭温狭盐性贝类，其生活海域的环境，要求水质清澈，潮流通畅，海水的盐度常年保持在3%以上。鲍鱼自古被誉为海味珍品之冠，素有“一口鲍鱼一口金”之说，其肉质细嫩，味道鲜美，具有极高的营养价值。鲍鱼中蛋白质含量丰富，其中30%~50%为胶原蛋白，远远高于其他鱼贝类。此外鲍鱼还富含氨基酸以及多种维生素和微量元素，但脂肪和胆固醇的含量很低，是一种对人体非常有利的高蛋白、低脂肪食物。鲍鱼具有极高的药用价值。《本草纲目》中记载，鲍鱼性平，味甘，咸，可明目补虚、清热滋阴、养血益胃、补肝肾，故有“明目鱼”之称。《药典》中记载，鲍壳又称石决明，是著名的中药材，可平肝潜阳、除热明目，对头痛眩晕、目赤翳障、视物昏花、青盲雀目等症具治疗功效。现代研究发现，从鲍肉中提取的鲍灵素能够抑制癌细胞生长，有显著的抗癌效果。

世界上鲍鱼主要产地有澳大利亚、中国、日本、美国、墨西哥、南非等国家。由于鲍鱼的经济价值很高，各产鲍国十分重视鲍鱼的人工育苗和养殖。我国的鲍鱼养殖研究从1960年代末开始，1970年代杂色鲍和皱纹盘鲍人工育苗先后取得成功，同时开展了养成实验。目前中国已成为世界第一养鲍大国，2017年我国养殖鲍鱼产量达14.85万吨，占世界养殖总产量的86%，这主要是由于我国拥有巨大的鲍鱼市场和优良的养殖自然条件，也归功于水产科技工作者及养殖业者的智慧和不懈努力。从养殖种类看，全世界已命名的216种鲍鱼中，分布在我国沿海的鲍鱼有7种，其中又以北部渤海湾出产的皱纹盘鲍和东南沿海的杂色鲍最为多见。随着鲍鱼养殖业的迅速发展，鲍鱼养殖规模不断扩大，养殖密度也不断增加，导致近海水域环境恶化，各种病害亦随之而来。先是细菌病害居多，近几年又出现病毒性疾病，引起鲍鱼大规模死亡，严重影响着鲍鱼养殖业的健康稳定发展。

细胞培养是将有机体内的某一组织取出，使其分散成单个细胞，在人工条件下使其存活、生长和繁殖的技术。细胞培养技术是病毒学、生理学、免疫学、遗传学等研究的基础，正在日益发挥着重要的作用。发展至今，脊椎动物的细胞培养技术己经发展得相当成熟，积累了大量的研究成果，己成为生物、医学研究及应用领域广泛采用的技术方法。随着对海洋无脊椎动物病害防治、免疫、发育以及细胞生物学等方面研究的需要，海洋无脊椎动物细胞培养日益受到关注。然而，由于海洋无脊椎动物的细胞代谢途径以及生长特性与陆生哺乳动物有很大差异，细胞培养难度较大，至今尚未有连续的细胞系建立。究其原因，主要是目前为止还没有找到相应的最佳培养体系（培养基、各种添加物、温度和 pH 等培养条件）。

海洋无脊椎动物种类繁多，生物学特性迥异，在细胞培养的方法上既体现出了其特殊性，也有共性可循。软体动物是细胞培养研究开展得较多的一类海洋无脊椎动物，培养的对象主要是一些养殖的双壳类和腹足类，包括贻贝、珍珠贝、扇贝、牡蛎、蛤蜊、螺等。所培养的组织细胞主要来源于胚胎、鳃、外套膜、神经细胞、血细胞、消化腺和心肌等。19世纪80年代之后，人们对海洋软体动物的细胞培养条件，包括细胞冻存、培养基添加物、培养基质和细胞分散方法等，做了大量的探索，积累了丰富经验，但仍然没有解决海洋软体动物细胞的体外长期存活和成功传代建系的问题，即使是培养贝类的肿瘤组织也不例外。在细胞培养过程中，培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。海洋无脊椎动物细胞培养目前没有专用的培养基，大部分研究者利用哺乳动物和昆虫的商品化人工培养基为基础培养基，同时添加某些成分配成完全培养基。添加的成分通常为胎牛血清、水解乳蛋白以及酵母提取物等，目的是配合不同无脊椎动物细胞原代培养的要求。尽管许多学者在培养基选择和优化方面做了大量的工作，但除部分昆虫细胞外，大多数无脊椎动物细胞体外培养仍缺少理想的培养基。

目前关于皱纹盘鲍组织和细胞培养的研究还不多，李霞等对皱纹盘鲍外套膜、鳃、足肌、肝胰腺和鳃下腺的体外培养做了研究，其中外套膜和鳃细胞分别传代培养了10代和11代；崔龙波等对皱纹盘鲍的血细胞、鳃、外套膜、肾脏和足肌进行了组织培养研究，其中血细胞以及外套膜细胞在体外维持时间比较短，不能进行传代培养，仅有鳃细胞传代培养成功。鉴于皱纹盘鲍细胞培养存在着细胞形态差、存活率低、存活时间短、不易传代等诸多问题，严重影响了皱纹盘鲍的细胞免疫学、病毒学、发育生物学以及遗传育种学等方面的深入研究，因此建立和优化皱纹盘鲍细胞体外培养方法和条件是具有重要的科研意义和现实价值的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种皱纹盘鲍细胞培养基及细胞系的构建方法，为今后继续深入开展皱纹盘鲍细胞培养研究奠定基础。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种皱纹盘鲍细胞培养基，其特征在于，所述培养基以L-15培养基为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 10.0-14.0g/L，KCl 0.3-0.6g/L，ZnSO₄ 0.2-0.4g/L，MgCl₂0.8-1.2g/L，CaCl₂ 0.1-0.2g/L，KH₂PO₄ 50-70mg/L，葡萄糖0.8-1.2g/L，碱性成纤维生长因子15-20ng/mL，表皮生长因子3-5ng/mL，L-谷氨酰胺0.25-0.35g/L，虾青素20-30μmol/L，γ-氨基丁酸16-20mg/L，羧甲基葡聚糖45-55mg/L，牛磺酸37-43mmol/L，氢化可的松1.7-2.3mg/L，皱纹盘鲍贝壳水提物50-70mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL。

所述培养基的pH值为7.0-7.4。

所述培养基的渗透压为900-1100mOsm/kg。

所述培养基配制完成后，采用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏备用。

所述皱纹盘鲍贝壳水提物的制备方法为：取200g贝壳粉碎后，装入透析袋（MD25），在5%的醋酸溶液中进行透析，溶解除去贝壳中的碳酸钙；再用去离子水透析，除去醋酸，然后收集透析袋中的成分以3500r/min离心5min，取上清液进行浓缩并冷冻干燥，得到皱纹盘鲍贝壳水提物。

包括以下步骤：

（1）取样消毒：选择健康皱纹盘鲍个体，去除附着物、刷净外壳表面，取样前先用75%酒精擦拭外壳表面，于超净工作台中打开贝壳，切取心脏组织；将心脏组织先用灭菌海水清洗 3~5遍，移入组织消毒液中浸泡20~30min，最后再用灭菌海水清洗2~3遍；

（2）细胞解离：将消毒后的心脏组织块放置在无菌300目筛绢中央，迅速放到己预装有细胞培养基的平皿中，用无菌眼科镊将筛绢对折，然后将组织碾碎，形成单细胞悬液；将此细胞悬液用300目筛网过滤，除去未解离的组织等；将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清液，再用细胞培养基洗涤3次，1000r/min离心10min，以尽量除去细胞碎片；

（3）细胞原代培养：将上述步骤收集的细胞重悬于细胞培养基，以2×10⁵个/mL的密度接种于25cm²培养瓶中，置于培养箱中培养，12h后吸除旧培养液，用改良PBS缓冲液清洗，再加入新鲜培养基继续培养，每隔1-2d半量更换培养基1次；

（4）细胞传代培养：待培养瓶内细胞丰度达到80%~90%时，吸出培养瓶中的培养液，用改良PBS缓冲液清洗2遍，加入0.25%的胰蛋白酶静置消化，用吸管轻轻吹打至大部分细胞脱壁，收集细胞，l000r/min离心5min，将细胞重悬于细胞培养基中，按1:2比例进行传代培养。

所述组织消毒液为灭菌海水中添加抗生素：青霉素500IU/mL、链霉素500μg/mL、庆大霉素100IU/mL、制霉菌素2μg/mL。

所述步骤（3）和（4）的培养温度为25-27℃。

所述改良PBS缓冲液的配方为：NaCl 25.5g/L，KCl 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，Na₂HPO₄ 0.9g/L，葡萄糖1.0g/L，pH值为7.0-7.4。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明通过基础培养基筛选和添加物优化，确定了适用于培养皱纹盘鲍心脏细胞的培养基。该培养基以L-15为基础培养基，并添加除了无机盐、生长因子、胎牛血清等以外的非常规物质，如L-谷氨酰胺、虾青素、γ-氨基丁酸、羧甲基葡聚糖、牛磺酸、氢化可的松、皱纹盘鲍贝壳水提物，能够很好地维持皱纹盘鲍心脏细胞在体外的存活和生长，细胞贴壁紧，外形舒展，存活率高，体外培养时间长。

2、本发明是在现有模式动物细胞培养技术的基础上，针对皱纹盘鲍生长特性建立的细胞原代和传代培养技术。本发明以皱纹盘鲍心脏组织为材料，心脏组织细胞容易获取和解离，与外套膜、鳃组织相比微生物污染程度低；采用机械解离法获得单细胞，重悬于本发明的细胞培养基中进行原代培养，继而成功构建皱纹盘鲍心脏细胞系，构建的细胞系生长状态良好，可连续传代。本发明方法操作方便，工艺简单，提高了皱纹盘鲍细胞培养的效果，有利于推广和普及。

附图说明

图1：不同基础培养基对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响；

图2：不同浓度花青素对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响；

图3：不同浓度羧甲基葡聚糖对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响；

图4：不同浓度皱纹盘鲍贝壳水提物对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响；

图5：不同培养时间对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。

实施例1

按照以下配方制备皱纹盘鲍细胞培养基：以L-15培养基为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 12.0g/L，KCl 0.45g/L，ZnSO₄ 0.3g/L，MgCl₂ 1.0g/L，CaCl₂ 0.15g/L，KH₂PO₄ 60mg/L，葡萄糖1.0g/L，碱性成纤维生长因子17.5ng/mL，表皮生长因子4ng/mL，L-谷氨酰胺0.3g/L，虾青素25μmol/L，γ-氨基丁酸18mg/L，羧甲基葡聚糖50mg/L，牛磺酸40mmol/L，氢化可的松2.0mg/L，皱纹盘鲍贝壳水提物60mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL。将培养基pH值调节为7.2，渗透压调节为1000mOsm/kg，配制完成后，采用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏备用。

皱纹盘鲍贝壳水提物的制备方法为：取200g贝壳粉碎后，装入透析袋（MD25），在5%的醋酸溶液中进行透析，溶解除去贝壳中的碳酸钙；再用去离子水透析，除去醋酸，然后收集透析袋中的成分以3500r/min离心5min，取上清液进行浓缩并冷冻干燥，得到皱纹盘鲍贝壳水提物。

皱纹盘鲍细胞系的构建方法，包括以下步骤：

（1）取样消毒：选择健康皱纹盘鲍个体，去除附着物、刷净外壳表面，取样前先用75%酒精擦拭外壳表面，于超净工作台中打开贝壳，切取心脏组织；将心脏组织先用灭菌海水清洗 3~5遍，移入组织消毒液（灭菌海水中添加抗生素：青霉素500IU/mL、链霉素500μg/mL、庆大霉素100IU/mL、制霉菌素2μg/mL）中浸泡20~30min，最后再用灭菌海水清洗2~3遍；

（2）细胞解离：将消毒后的心脏组织块放置在无菌300目筛绢中央，迅速放到己预装有细胞培养基的平皿中，用无菌眼科镊将筛绢对折，然后将组织碾碎，形成单细胞悬液；将此细胞悬液用300目筛网过滤，除去未解离的组织等；将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清液，再用细胞培养基洗涤3次，1000r/min离心10min，以尽量除去细胞碎片；

（3）细胞原代培养：将上述步骤收集的细胞重悬于细胞培养基，以2×10⁵个/mL的密度接种于25cm²培养瓶中，置于培养箱中培养，12h后吸除旧培养液，用改良PBS缓冲液（配方为：NaCl 25.5g/L，KCl 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，Na₂HPO₄ 0.9g/L，葡萄糖1.0g/L，pH值7.2）清洗，再加入新鲜培养基继续培养，每隔1-2d半量更换培养基1次；培养温度为26℃；

（4）细胞传代培养：待培养瓶内细胞丰度达到80%~90%时，吸出培养瓶中的培养液，用改良PBS缓冲液清洗2遍，加入0.25%的胰蛋白酶静置消化，用吸管轻轻吹打至大部分细胞脱壁，收集细胞，l000r/min离心5min，将细胞重悬于细胞培养基中，按1:2比例进行传代培养；培养温度为26℃；

细胞存活率评定：用台盼蓝染色法进行活细胞检测，用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞（镜下观察死细胞为淡蓝色，活细胞拒染），细胞存活率＝活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。

试验例1

1、不同基础培养基对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响

试验分为5组，每组分别以L-15、M199、TC-100、RMPI-1640、MEM为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 12.0g/L，KCl 0.45g/L，ZnSO₄ 0.3g/L，MgCl₂ 1.0g/L，CaCl₂0.15g/L，KH₂PO₄ 60mg/L，葡萄糖1.0g/L，碱性成纤维生长因子17.5ng/mL，表皮生长因子4ng/mL，L-谷氨酰胺0.3g/L，虾青素25μmol/L，γ-氨基丁酸18mg/L，羧甲基葡聚糖50mg/L，牛磺酸40mmol/L，氢化可的松2.0mg/L，皱纹盘鲍贝壳水提物60mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL。将解离的皱纹盘鲍心脏细胞随机分成5份，重悬于以上5组培养基中进行原代培养，72h后统计细胞存活率，重复3次，结果如说明书附图1所示。

从附图1可以看出，在5组试验中，采用L-15为基础培养基的细胞存活率最高，为91.78%，采用TC-100、RMPI-1640、MEM为基础培养基的细胞存活率均在80%以上，而采用M199为基础培养基的细胞存活率最低，为76.45%，可见L-15培养基更适于皱纹盘鲍心脏细胞的体外培养。

2、不同浓度花青素对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响

试验分为6组，第1组为对照组，以L-15为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 12.0g/L，KCl 0.45g/L，ZnSO₄ 0.3g/L，MgCl₂ 1.0g/L，CaCl₂ 0.15g/L，KH₂PO₄ 60mg/L，葡萄糖1.0g/L，碱性成纤维生长因子17.5ng/mL，表皮生长因子4ng/mL，L-谷氨酰胺0.3g/L，γ-氨基丁酸18mg/L，羧甲基葡聚糖50mg/L，牛磺酸40mmol/L，氢化可的松2.0mg/L，皱纹盘鲍贝壳水提物60mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL，即不添加花青素；第2、3、4、5、6组分别添加12.5、25、50、100、200μmol/L的花青素。将解离的皱纹盘鲍心脏细胞随机分成6份，重悬于以上6组培养基中进行原代培养，72h后统计细胞存活率，重复3次，结果如说明书附图2所示。

从附图2可以看出，当花青素浓度从12.5μmol/L增加到 25μmol/L 时，平均细胞存活率达到最大，为91.33%，极显著高于对照组（58.46%）；随着花青素浓度的继续增加，平均细胞存活率逐渐下降，到200μmol/L时，平均细胞存活率为67.09%，仍然高于对照组。花青素是一种很强的抗氧化剂和自由基清除剂，可以保护细胞膜上的多不饱和脂肪不被氧化，清除细胞内的过氧化物，减少细胞毒性的作用，从而促进细胞增殖和生长，本试验得出培养基中花青素的最佳浓度为25μmol/L。

3、不同浓度羧甲基葡聚糖对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响

试验分为6组，第1组为对照组，以L-15为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 12.0g/L，KCl 0.45g/L，ZnSO₄ 0.3g/L，MgCl₂ 1.0g/L，CaCl₂ 0.15g/L，KH₂PO₄ 60mg/L，葡萄糖1.0g/L，碱性成纤维生长因子17.5ng/mL，表皮生长因子4ng/mL，L-谷氨酰胺0.3g/L，虾青素25μmol/L，γ-氨基丁酸18mg/L，牛磺酸40mmol/L，氢化可的松2.0mg/L，皱纹盘鲍贝壳水提物60mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL，即不添加羧甲基葡聚糖；第2、3、4、5、6组分别添加5、10、20、50、100mg/L的羧甲基葡聚糖。将解离的皱纹盘鲍心脏细胞随机分成6份，重悬于以上6组培养基中进行原代培养，72h后统计细胞存活率，重复3次，结果如说明书附图3所示。

从附图3可以看出，所有添加羧甲基葡聚糖的试验组，其平均细胞存活率均高于对照组，并且随着羧甲基葡聚糖浓度的升高，平均细胞存活率也逐渐提高，当羧甲基葡聚糖浓度为50mg/L时，细胞存活率达到最大，为92.62%，当羧甲基葡聚糖浓度升高至100mg/L时，细胞存活率为93.40%，没有显著提高，因此本试验得出培养基中羧甲基葡聚糖的最佳浓度为50mg/L。羧甲基葡聚糖是一种溶解性较高的酵母葡聚糖衍生物，酵母葡聚糖是水产养殖中使用广泛的免疫增强剂，可以提高水产动物机体的抵抗力。我们在试验中发现添加适量的羧甲基葡聚糖可以提高皱纹盘鲍心脏细胞的体外存活率，推测羧甲基葡聚糖可以提高细胞抵制不良环境的能力，增强细胞耐受性。

4、不同浓度皱纹盘鲍贝壳水提物对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响

试验分为6组，第1组为对照组，以L-15为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 12.0g/L，KCl 0.45g/L，ZnSO₄ 0.3g/L，MgCl₂ 1.0g/L，CaCl₂ 0.15g/L，KH₂PO₄ 60mg/L，葡萄糖1.0g/L，碱性成纤维生长因子17.5ng/mL，表皮生长因子4ng/mL，L-谷氨酰胺0.3g/L，虾青素25μmol/L，γ-氨基丁酸18mg/L，羧甲基葡聚糖50mg/L，牛磺酸40mmol/L，氢化可的松2.0mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL，即细胞培养基中不添加皱纹盘鲍贝壳水提物；第2、3、4、5、6组分别添加30、60、90、120、150mg/L的皱纹盘鲍贝壳水提物。将解离的皱纹盘鲍心脏细胞随机分成6份，重悬于以上6组培养基中进行原代培养，72h后统计细胞存活率，重复3次，结果如说明书附图4所示。

从附图4可以看出，所有添加皱纹盘鲍贝壳水提物的试验组，其平均细胞存活率均高于对照组，当皱纹盘鲍贝壳水提物浓度为60mg/L时，平均细胞存活率达到最大，为92.29%，极显著高于对照组（63.80%），也显著高于其它试验组，因此本试验得出培养基中皱纹盘鲍贝壳水提物的最佳浓度为60mg/L。我们在试验中发现添加适量的皱纹盘鲍贝壳水提物可以提高皱纹盘鲍心脏细胞的体外存活率，推测皱纹盘鲍贝壳水提物中存在一些活性成分能够促进细胞的增殖和生长。

5、不同培养时间对皱纹盘鲍心脏细胞存活率的影响

采用实施例1的培养基对皱纹盘鲍心脏细胞进行长期培养，同时采用《皱纹盘鲍鳃细胞培养适宜条件的研究》中提供的培养基（以RPMI-1640为基本培养基，添加20%小牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1%的0.351g/ml NaCl）作为对照培养基，统计细胞存活率，结果如说明书附图5所示。

从附图5可以看出，采用本发明的培养基培养至第30d，细胞存活率为54.20%，而采用对照培养基培养至第20d时，细胞存活率仅为11.74%，继续培养细胞均退化死亡，由此说明本发明的培养基可提高皱纹盘鲍心脏细胞体外培养的存活率，并延长细胞体外培养的时长。本发明通过大量试验筛选到了适合皱纹盘鲍心脏细胞生长的培养基，并成功的进行了原代培养和传代培养，目前已成功将皱纹盘鲍心脏细胞传代到第32代，而且细胞贴壁较紧，增殖较快，为今后继续深入开展皱纹盘鲍细胞培养研究奠定了基础。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种皱纹盘鲍细胞培养基，其特征在于，所述培养基以L-15培养基为基础培养基，并添加如下终浓度的组分：NaCl 10.0-14.0g/L，KCl 0.3-0.6g/L，ZnSO₄ 0.2-0.4g/L，MgCl₂0.8-1.2g/L，CaCl₂ 0.1-0.2g/L，KH₂PO₄ 50-70mg/L，葡萄糖0.8-1.2g/L，碱性成纤维生长因子15-20ng/mL，表皮生长因子3-5ng/mL，L-谷氨酰胺0.25-0.35g/L，虾青素20-30μmol/L，γ-氨基丁酸16-20mg/L，羧甲基葡聚糖45-55mg/L，牛磺酸37-43mmol/L，氢化可的松1.7-2.3mg/L，皱纹盘鲍贝壳水提物50-70mg/L，胎牛血清10%，青霉素钠100IU/mL，硫酸链霉素100μg/mL，亚胺培南10μg/mL；所述皱纹盘鲍贝壳水提物的制备方法为：取200g贝壳粉碎后，装入MD25透析袋，在5%的醋酸溶液中进行透析，溶解除去贝壳中的碳酸钙；再用去离子水透析，除去醋酸，然后收集透析袋中的成分以3500r/min离心5min，取上清液进行浓缩并冷冻干燥，得到皱纹盘鲍贝壳水提物。

2.根据权利要求1所述的一种皱纹盘鲍细胞培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为7.0-7.4。

3.根据权利要求1所述的一种皱纹盘鲍细胞培养基，其特征在于，所述培养基的渗透压为900-1100mOsm/kg。

4.根据权利要求1所述的一种皱纹盘鲍细胞培养基，其特征在于，所述培养基配制完成后，采用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冷藏备用。

5.一种皱纹盘鲍细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取样消毒：选择健康皱纹盘鲍个体，去除附着物、刷净外壳表面，取样前先用75%酒精擦拭外壳表面，于超净工作台中打开贝壳，切取心脏组织；将心脏组织先用灭菌海水清洗3~5遍，移入组织消毒液中浸泡20~30min，最后再用灭菌海水清洗2~3遍；所述组织消毒液为灭菌海水中添加抗生素：青霉素500IU/mL、链霉素500μg/mL、庆大霉素100IU/mL、制霉菌素2μg/mL；

（2）细胞解离：将消毒后的心脏组织块放置在无菌300目筛绢中央，迅速放到已 预装有权利要求1所述皱纹盘鲍细胞培养基的平皿中，用无菌眼科镊将筛绢对折，然后将组织碾碎，形成单细胞悬液；将此细胞悬液用300目筛网过滤，除去未解离的组织；将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清液，再用权利要求1所述皱纹盘鲍细胞培养基洗涤3次，1000r/min离心10min，以尽量除去细胞碎片；

（3）细胞原代培养：将上述步骤收集的细胞重悬于权利要求1所述皱纹盘鲍细胞培养基，以2×10⁵个/mL的密度接种于25cm²培养瓶中，置于培养箱中培养，12h后吸除旧培养液，用改良PBS缓冲液清洗，再加入新鲜权利要求1所述皱纹盘鲍细胞培养基继续培养，每隔1-2d半量更换培养基1次；

（4）细胞传代培养：待培养瓶内细胞丰度达到80%~90%时，吸出培养瓶中的培养液，用改良PBS缓冲液清洗2遍，加入0.25%的胰蛋白酶静置消化，用吸管轻轻吹打至大部分细胞脱壁，收集细胞，l000r/min离心5min，将细胞重悬于权利要求1所述皱纹盘鲍细胞培养基中，按1:2比例进行传代培养；

所述改良PBS缓冲液的配方为：NaCl 25.5g/L，KCl 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，Na₂HPO₄ 0.9g/L，葡萄糖1.0g/L，pH值为7.0-7.4。

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