ES2349411T3

ES2349411T3 - Composición farmaceutica que comprende glucano derivado de microalgas.

Info

Publication number: ES2349411T3
Application number: ES04735831T
Authority: ES
Inventors: Jorunn Skjermo; Trond Rovik Storseth
Original assignee: Sinvent AS
Current assignee: Sinvent AS
Priority date: 2003-06-03
Filing date: 2004-06-02
Publication date: 2011-01-03
Anticipated expiration: 2024-06-02
Also published as: NO320429B1; NO20032494L; WO2004105775A1; DE602004028236D1; EP1633373B1; EP1633373A1; ATE474582T1; NO20032494D0; DK1633373T3; WO2004105775A8; CL2004001348A1

Abstract

Composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora de crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades provocadas por 5 microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende glucano extraído de diatomeas.

Description

Ámbito de la invención 5

[0001] La presente invención describe una composición farmacéutica, un compuesto, alimentación y constituyente de alimentación con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y oportunistas patógenos, que comprende glucano extraído de diatomeas. Dicho compuesto se utiliza preferiblemente en pescado, marisco, aves, otros animales y mamíferos. 10

Antecedentes de la invención

[0002] Los compuestos inmunoestimulantes resultan atractivos para el tratamiento de pescado de piscifactoría y de animales de cría, con el fin de mejorar la resistencia general contra enfermedades provocadas por microorganismos patógenos. Los inmunoestimulantes activan el sistema inmunitario no 15 específico, asociándose a los macrófagos. Los efectos positivos de administrar inmunoestimulantes no específicos a animales a través de la comida o el agua conllevan una mejora en el crecimiento, en el índice de supervivencia y en la resistencia a las enfermedades. Los inmunoestimulantes no específicos también pueden ser administrados a los animales mediante inyecciones, como componentes de vacunas. D’SOUZA F.M.L. ET AL.: "Flocculated microalgae concentrates as diets for larvae of the tiger prawn 20 Penaeus monodon Fabricius" AQUACULTURE NUTRITION Vol. 8, no. 2, 2002, páginas 113-120, describe la utilización de células vivas completas de diferentes especies de diatomeas como alimentación exclusiva para larvas de gamba.

[0003] DE 196 08 563 A1 describe la utilización de una amplia gama de microalgas o derivados como aditivo en la preparación de medicinas o aditivos de nutrientes en alimentos naturales o tabletas, junto con 25 una gran variedad de plantas y otros compuestos. Los betaglucanos son mencionados como compuestos reductores del colesterol y de la presión sanguínea y anti-carcinogénicos que se encuentran en la planta Ganodema lucidum, que no es una microalga.

[0004] RAA J. ET AL.: "The use of immune-stimulants in fish and shellfish feeds" AVANCES EN NUTRICIÓN ACUÍCOLA V. MEMORIAS DEL V SIMPOSIUM INTERNACIONAL DE NUTRICIÓN 30 ACUÍCOLA 19 Noviembre 2000 – 22 Noviembre 2000, páginas 47-56, describe los efectos inmunoestimulantes de los glucanos beta-1,3/1,6 en animales y en seres humanos. El glucano inmunomodulador mejor documentado es derivado de las paredes celulares de la levadura. Macrogard ® es un glucano de levadura disponible comercialmente que se utiliza en la alimentación de pescado, etc. Las microalgas no se mencionan como fuente potencial de glucanos beta-1,3/1,6 inmunomoduladores. 35

[0005] GRANUM E.: "Metabolism and function of Beta-1,3-glucan in marine diatomeas" Enero 2002, DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY, FACULTY OF NATURAL SCIENCES AND TECHNOLOGY, NORWEGIAN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (NTNU), TRONDHEIM páginas I-VII, 1-48, PAPER 1-5 (URN:NBN: No-2101), describe que el principal producto de almacenamiento en las diatomeas (chrysolamin-aran) es un glucano beta-1,3-D con ramificaciones ocasionales a través de C-2 y 40 C-6.

[0006] Dado que los compuestos inmunoestimulantes estimulan el sistema inmunitario no específico del animal, la inmunoestimulación no específica puede utilizarse en las primeras fases de crecimiento, antes de que madure el sistema inmunitario y el animal pueda ser vacunado con vacunas adecuadas. Esto 5 puede resultar muy valioso como alternativa a los antibióticos en la producción intensiva de crías, especialmente en acuicultura y en la producción de pollo, pero también para otros animales y mamíferos, en los cuales se utilizan antibióticos con finalidades profilácticas, para la mejora del crecimiento y para reducir la aparición de enfermedades de forma regular.

[0007] En los cultivos intensivos de pescado de especies marinas, se utilizan organismos de alimentación 10 viva cultivados, como rotíferas y Artemia como alimento para las larvas durante las fases más tempranas. El cultivo de alimento vivo provoca el crecimiento de microorganismos, y cuando los rotíferas y Artemia son suministrados a las larvas, dichas bacterias y virus son transferidos a las larvas y al agua de cultivo. Las condiciones de cultivo intensivo pueden provocar una inmuno-supresión de las larvas inducida por el stress, y por lo tanto, las bacterias oportunistas pueden proliferar y afectar a las larvas. Por ejemplo, las 15 larvas de bacalao de cultivo intensivo (Gadus morhua L.) y otras especies son vulnerables al stress y a la aparición de enfermedades. Particularmente la Vibriosis puede matar grandes cantidades de larvas y alevines. El cambio de la alimentación viva a alimentación formulada también es una etapa muy crítica en la primera etapa de la alimentación. La dieta formulada puede ser de alta calidad, tanto por lo que se refiere al valor nutritivo como a la digestibilidad y a las propiedades físicas. Sin embargo, la introducción de 20 partículas de comida en el depósito de pescado y en el intestino de las larvas prepara el substrato para el crecimiento bacteriano. La carga del substrato para el crecimiento bacteriano también puede favorecer el crecimiento de bacterias oportunistas de crecimiento rápido, que pueden resultar dañinas para las larvas. Por lo tanto, las larvas pueden ser fácilmente colonizadas e infectadas por bacterias. Por consiguiente, se observan altos índices de mortalidad durante las fases de cambio de alimentación. Los métodos para 25 aumentar la resistencia de las larvas contra infecciones bacterianas mediante la estimulación no específica pueden resultar muy atractivos. Los beta-glucanos son importantes polisacáridos de estructura de las diferentes levaduras y algas, y los beta-glucanos con 1-3 enlaces y cadenas laterales enlazadas a la cadena principal en la posición 1-6 está documentado que poseen efectos inmuno-moduladores en peces y animales, tanto in vivo como in vitro. Macrogard®, ver EP 0466037, es un beta-glucano disponible 30 comercialmente, preparado a partir de levadura de panadería, Saccharomyces cerevisiae. Es el líder mundial en inmunoestimulación en el mercado de alimentación de pescado. Se utiliza como constituyente especial en la alimentación de pescado para salmónidos y para pescado marino y marisco. El glucano en las algas marrones se denomina Laminaran, y es un glucano ramificado beta-1,6 beta-1,3-D. El Laminaran de las macro algas laminaria hyperborea está documentado que tiene efectos inmunomoduladores y 35 aumenta la resistencia a las enfermedades en especies de pescado como el salmón atlántico (Dalmo, R.A. y Seljelid, R. 1995, The immunomodulatory effect of LPS, Laminaran and sulfated Laminaran [(1,3)-D-glucan] on Atlantic salmon, Salmo salar L., macrophages in vitro. Journal of Fish Disease18, 175-185.) and blue gourami (Samuel, M., Lam, T. J. and Sin, Y. M. 1996. The effect of Laminaran [(1,3)*D*Glucan] on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas hydrophila. Fish & 40

Shellfish Immunology 6, 443-454.). Sin embargo, el Laminaran no se utiliza como aditivo inmunomodulador en la alimentación de pescado comercial. Otro polisacárido de algas con propiedades inmunomoduladoras

es el Alginato de alto M, que contiene entre un 80-99% de bloques M. Los Alginatos de alto M se 5 encuentran disponibles en el mercado.

[0008] Los glucanos beta-1,3 también son importantes almacenadores de polisacáridos en muchas clases de microalgas. Estos glucanos se denominan crisoLaminaran, y tienen unas cadenas relativamente cortas (DP 20-60). Específicamente son diatomeas ( Bacillariophyceae sp.) conocidas por acumular grandes cantidades de beta-glucanos durante la fase estacionaria del crecimiento. Sin embargo, no está 10 documentado con anterioridad que el crisoLaminaran tenga propiedades inmunomoduladoras.

[0009] Tal como se ha indicado anteriormente, está perfectamente documentado que algunos grupos de algas producen β-1,3-glucanos, pero ello no es motivo para esperar que todos estos β-1,3-glucanos sean inmunomoduladores. Además, no es posible predecir cuáles de las especies de algas producen β-1,3-glucanos sin realizar pruebas. Los β-1,3-glucanos pueden variar entre los diferentes grupos, especies y 15 según la fase de crecimiento en la que se recolecten las algas y se extraiga el glucano. Las variaciones pueden producirse en la longitud de la molécula y el grado de ramificación. Por lo tanto, no puede preverse qué β-1,3-glucanos serán los más óptimos.

[0010] Las estructuras de los diferentes glucanos se describen utilizando el grado de polimerización, DP, que describe el coeficiente de unidades de glucopyranosyl en las moléculas, y el grado de ramificación, 20 DB, que describe el coeficiente de enlaces β-(1→6) a β-(1→3). El DP y el DB se calculan a partir del espectro 1H-NMR registrado de los glucanos (Kim, Y. T. et al., Structural characterization of β-(1→6) to β-(1→3)-linked glucans using NMR spectroscopy, 2000, Carbohydrate Research, 328: 331-341) a través del cual se ha determinado que Laminaran posee un coeficiente de DP/DB de 33/0.07. Macrogard es un glucano β-(1→6), β-(1→3) con un DP de 400-1500 (Patente Europea No. 0466037). El glucano aislado de 25 las microalgas Chaetoceros Mülleri y Thalassiosira weissflogii se determinó que tenía un DP/DB de 19-24/0.005-0.009 y 5-13/0, respectivamente. El número de ramificaciones β-(1→6) por molécula en Laminaran se ha calculado que es de 2.31, y por lo que respecta al glucano C. Mülleri, una ramificación por cada 5-11 cadenas. En el Laminaran las ramificaciones consisten en cadenas enlazadas β-(1→3) conectadas a la cadena principal por el punto de ramificación β-(1→6), mientras que en el glucano C. 30 Mülleri las ramificaciones consisten en una única unidad de glucopiranosa con un enlace β-(1→6), ya que no se encontraron resonancias a partir de las unidades enlazadas de β-(1→3) de la cadena lateral. De esta manera, el glucano de C. Mülleri es similar a la estructura de Laminaran en la longitud de la cadena, pero no en el grado de ramificación. La región anomérica del 1HNMR obtenido a partir de los glucanos aislados C. Mülleri, T. weissflogii y Laminaran se presenta en la Figura 14, que muestra las diferencias en 35 las estructuras. Así, la Figura 14 muestra también que los glucanos β-1,3 de dos diatomeas centrales distintos, Thalassiosira weissflogii y Chaetoceros Mülleri producen glucanos que son diferentes desde el punto de vista estructural. Además, tal como se describe más adelante en el experimento con larvas de bacalao, estos dos β -1,3-glucanos tuvieron unos efectos completamente diferentes sobre la supervivencia de las larvas. Estos resultados demuestran que la estructura del β-1,3-glucano posee un impacto alto 40 sobre las propiedades inmunomoduladoras de las moléculas, y que no queda patente que todas las diatomeas sinteticen los β-1,3-glucanos.

[0011] Laminaran, el glucano que se encuentra en las algas marrones, se extrae de algas recolectadas en el mar. Dado que la estructura de los polisacáridos de algas que crecen en el mar, tanto en las micro algas como en las macro algas, varían debido a los cambios estacionales en las condiciones de crecimiento (luz, 5 temperatura, disponibilidad de nutrientes, salinidad, corrientes), el efecto inmunomodulador de los glucanos es posible que varíe entre lotes recolectados en diferentes momentos del año, así como en lotes procedentes de localizaciones geográficas distintas. Ello, unido a la fatigante recogida de las algas de mar, es un gran inconveniente si se compara con la utilización de crisoLaminaran como inmunoestimulante comercial. Asimismo, la recolección de algas afecta al equilibrio biológico local en el lugar de recolección, 10 ya que la recolección de alga marrón ejerce un impacto ecológico muy grande sobre las poblaciones de algas, el fondo marino y se convierte en un biótopo y sobre las algas como biótopo para otras especies. Por otro lado, las microalgas pueden cultivarse de forma industrial en fotobioreactores, ajustados con precisión para conseguir una síntesis óptima del beta-glucano selecionado, De esta manera resulta posible la producción industrial de beta-glucano con una estructura química exacta y con regularidad anual, 15 asegurando una disponibilidad estable de beta-glucano de una calidad reconocida para su suministro a la industria farmacéutica y de alimentación. Por lo tanto, la utilización de crisoLaminaran a partir de microalgas cultivadas, como las diatomeas, resulta muy ventajosa en comparación con el Laminaran procedente de algas marrones recolectadas.

[0012] En este campo existe la necesidad de reducir o evitar el uso de antibióticos en la alimentación de 20 animales y mamíferos. Por tanto, uno de los objetos de esta invención es proporcionar una composición farmacéutica, un compuesto, alimento y constituyente de alimentación con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y de mejora del crecimiento, con el fin de reducir el uso profiláctico y terapéutico de los antibióticos, especialmente en cultivos acuáticos, y en la producción de pollo, pero también para otros animales y mamíferos. 25

Resumen de la invención

[0013] Así pues, la presente invención describe una composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la 5 resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y oportunistas patógenos, que comprende glucano extraído de diatomeas. En una realización dicha diatomea es, a partir de Bacillariophyta sp., una Chaetoceros Mülleri. En otra realización la composición farmacéutica comprende dichas diatomeas, y se encuentra en forma seca.

[0014] Otro aspecto de la presente invención es un compuesto para la inmunoestimulación con efectos 10 profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y oportunistas patógenos, que comprende glucano extraído de diatomeas.

[0015] También se proporciona en la presente invención una alimentación con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la 15 resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y oportunistas patógenos, que comprende glucano extraído de diatomeas. En una realización dicha alimentación comprende glucano extraído de diatomeas. Otro aspecto de la presente invención es un constituyente de alimentación con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos 20 patógenos y oportunistas patógenos, que comprende glucano extraído de diatomeas.

En otra realización dicho constituyente de alimentación comprende glucano extraído de diatomeas y / o de alimentación formulada.

[0016] Otro aspecto de la invención es la utilización de una composición que comprende glucano extraído de diatomeas para la fabricación de una composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes, 25 profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y oportunistas patógenos para el tratamiento profiláctico de pescado, marisco, aves, otros animales y mamíferos.

[0017] Otro aspecto de la invención es la utilización de una composición que comprende un glucano extraído de diatomeas para producir un alimento o constituyente de alimentación para la 30 inmunoestimulación, profilaxis y / o mejora del crecimiento.

[0018] La invención, asimismo, describe la utilización de una composición que comprende un glucano extraído de diatomeas para la fabricación de un constituyente o aditivo de alimentación para la cría de pescado, marisco, aves, otros animales y mamíferos.

35

Breve descripción de las Figuras

[0019]

La fig. 1 muestra la supervivencia de larvas de bacalao tratadas con CM Glucano, TW Glucano o 5 Macrogard® vía rotíferas, y en control, con unos porcentajes de supervivencia medios para 3 réplicas.

La fig. 2 muestra la supervivencia media de larvas de bacalao de 27 días tratadas con CM Glucano, TW Glucano o Macrogard® vía rotíferas, y en control. N = 3. * marca la diferencia estadística significativa en relación con control.

La fig. 3 muestra el porcentaje de protección relativa (RPP) del tratamiento de larvas de bacalao con CM 10 Glucano o Macrogard®.

La fig. 4 muestra el crecimiento de las larvas de bacalao tratadas con CM Glucano o Macrogard®, y en control, medido en peso en seco.

La fig. 5 presenta los coeficientes específicos de crecimiento diario (SGR) de las larvas de bacalao tratadas con CM Glucano, TW Glucano o Macrogard ® y en control durante 4 períodos del experimento. 15

La fig. 6 muestra el crecimiento de las larvas de bacalao tratadas con CM Glucano o Alginato de alto M, y en control.

La fig. 7 muestra el crecimiento de las larvas de bacalao tratadas con CM Glucano, TM Glucano o Macrogard® y en control.

La fig. 8 muestra los coeficientes de crecimiento específico diario de las larvas de bacalao en el período 20 con la primera alimentación y con el cambio a alimentación seca, en que las larvas de bacalao fueron tratadas con CM Glucano o Alginato de alto M y en control.

La fig. 9 muestra las cifras bacterianas en el intestino de las larvas de bacalao en el día 27 después del cambio de alimentación, medidas en un agar de agua de mar M65 (CFU total), agar de Pseudomonas (Pseudomonas sp.) y TCBS (Vibrio sp.), donde las larvas fueron tratadas con CM Glucano, TM Glucano o 25 Macrogard® y en control.

La fig. 10 muestra la supervivencia media de las larvas de bacalao durante el cambio a la alimentación formulada, en que las larvas fueron alimentadas con rotíferas de control entre los días 2-18, y CM Glucano o Alginato de alto M entre los días 2-3, 9-11, 15-17 y 20-22.

La fig. 11 muestra el CFU total en el intestino de las larvas de bacalao alimentadas con Alginato de alto M 30 o CM Glucano bioencapsulado en rotíferas, y en larvas de control.

La fig. 12 muestra el porcentaje de Vibrio en el intestino de las larvas medido en TCBS, el promedio de dos depósitos por tratamiento, en que las larvas de bacalao fueron tratadas con CM Glucano o Alginato de alto M o alimentadas únicamente con rotíferas de control.

La fig. 13 muestra el porcentaje de Pseudomonas marinas en el intestino de las larvas medido en agar de 35 CFC Pseudomonas, el promedio de dos depósitos por tratamiento, en que las larvas de bacalao fueron tratadas con CM Glucano o Alginato de alto M o alimentadas únicamente con rotíferas de control.

La fig. 14 muestra la región anomérica del espectro 1H-NMR de los glucanos de C. Mülleri y T. weissflogii; α-RT: la resonancia en el extremo α-reductor; BC: -(13) Resonancia de cadena de estructura; SRT: resonancia del grupo siguiente al terminal reductor; NRT: La resonancia del grupo del extremo no reductor; 40

-RT: la resonancia del grupo de extremo -reductor; SC: resonancias del grupo de cadena lateral, y TSC: resonancias de cadena de lado terminal.

La fig. 15 muestra los números bacterianos totales medidos como colonias formando unidades en agar marino, en un depósito de agua con larvas de bacalao alimentadas con Alginato de alto M o CM Glucano bioencapsulado en rotíferas, y con larvas de bacalao. 5

Descripción detallada de la invención

[0020] La presente invención describe una composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia general contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos o patógenos oportunistas, que comprende 5 glucano extraído de diatomeas.

[0021] Asimismo, el glucano puede ser encapsulado en microesferas de Alginato. No obstante, pueden utilizarse otras formas de microesferas o encapsulación. A pesar de todo, la encapsulación no es necesaria, dado que el glucano pude ser administrado como tal.

[0022] La composición farmacéutica según la presente invención, que es un agente inmunoestimulante, 10 estimula el sistema inmunitario no específico del animal o del mamífero no humano. De esta manera, puede utilizarse una inmunoestimulación no específica en las primeras fases de la juventud antes de que madure el sistema inmunitario. Así, el animal o mamífero no humano puede ser vacunado con la composición farmacéutica según la presente invención. Puede utilizarse con efectos profilácticos y / o de mejora del crecimiento, mejorando de esta manera la resistencia global frente a enfermedades causadas 15 por microorganismos patógenos o patógenos oportunistas.

[0023] Asimismo, en las piscifactorías, el cambio de alimentación de alimento vivo a una alimentación formulada resulta una fase crítica en las primeras etapas de alimentación, y a menudo se observa un bajo índice de supervivencia. La resistencia de las larvas contra las infecciones bacterianas mejora de forma significativa mediante la inmunoestimulación no específica. Los experimentos que se muestran más abajo 20 han mostrado un aumento en el índice de supervivencia superior al 30% en el período de alimentación seca. La composición farmacéutica también puede ser una parte de la alimentación formulada utilizada tanto para la alimentación en la fase de crecimiento como en la fase adulta de pescado, marisco, aves, otros animales y mamíferos. También puede utilizarse en el período de cambio de alimentación para larvas de bacalao, o para larvas de cualquier otra especie marina cultivada de pescado o marisco que 25 deba experimentar un cambio de alimento vivo a dieta seca. En el capítulo de ejemplo se utilizan larvas de bacalao, pero ello no significa que la invención deba quedar reducida a bacalao u otro tipo de pescado, ya que lo más probable es que mantenga el mismo grado de efectividad en otros animales y mamíferos.

[0024] En el ejemplo práctico de la presente invención, dicha diatomea es Bacillariophyceae sp. Sin embargo, otras diatomeas pueden ser igualmente efectivas. 30

[0025] La presente invención también se refiere a un compuesto para la inmunoestimulación con efectos profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende glucano extraído de diatomeas.

[0026] En un ejemplo práctico, el compuesto según la presente invención es encapsulado en microesferas 35 de Alginato. No obstante, también pueden utilizarse otros tipos de microesferas, con efectos satisfactorios. Asimismo, el compuesto no tiene que estar encapsulado, ya que puede ser utilizado como tal. El compuesto según la presente invención puede ser añadido al agua en la que animales y mamíferos habitan o se alimentan.

[0027] Dado que el compuesto según la presente aplicación tiene un efecto inmunomodulador, puede ser 40 utilizado como adyuvante en vacunas para el tratamiento de animales y mamíferos.

[0028] De la misma manera, el compuesto puede ser administrado a animales y mamíferos, como por ejemplo, humanos, en forma de polvo o tableta, como agente inmunomodulador o como suplemento dietético. 5

[0029] Un aspecto de la presente invención se refiere a la alimentación con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende micro-glucano extraído de diatomeas.

[0030] En un ejemplo práctico según la presente invención, la alimentación comprende glucano extraído 10 de diatomeas. Rotíferas u otros organismos de alimentación viva pueden ser alimentados o tratados con dicha alimentación. Además, las rotíferas con alimentación bioencapsulada pueden ser ofrecidas a animales u otros mamíferos.

[0031] En cultivos acuáticos, es posible administrar el glucano directamente en el agua. El glucano también puede ser administrado a través del agua potable para aves y mamíferos. 15

[0032] La presente invención también describe un elemento de alimentación con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende micro-glucano extraído de diatomeas.

[0033] La presente invención también comprende la utilización de una composición que comprende 20 glucano extraído de diatomeas para la fabricación de una composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas para el tratamiento profiláctico de pescado, marisco, aves, otros animales y mamíferos no humanos. 25

[0034] Asimismo, un glucano extraído de diatomeas puede ser utilizado para mejorar la resistencia global contra enfermedades causadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas. Una composición que comprende glucano extraído de diatomeas puede, según la invención, ser utilizada para producir un alimento o constituyente de alimentación de un alimento con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora del crecimiento, según la presente invención. 30

[0035] A continuación, se describe la invención mediante ejemplos. Los ejemplos son con finalidad ilustrativa. Así, en los ejemplos se utilizan larvas de bacalao, pero otras especies de pescado marino, como el salmón, u otros animales o mamíferos mostrarían los mismos efectos.

35

Experimentación

Ejemplo 1

Tratamiento de larvas de bacalao con crisoLaminaran a partir de un cultivo de la diatomea Chaetoceros 5 Mülleri

[0036] El crisoLaminaran se extrajo de un cultivo de la diatomea Chaetoceros Mülleri (este crisoLaminaran será denominado en adelante CM Glucano), incorporado en un alimento para larvas de pescado marino y alimentando a larvas de bacalao. Otros dos grupos fueron alimentados con Macrogard® (KS Biotec-Maczymal, Tromsø, Noruega) y alimento normal. Se midieron los efectos en el crecimiento, la 10 supervivencia y la colonización en los intestinos de las larvas, y los resultados se muestran en las cifras que se adjuntan.

[0037] El C.Mülleri fue cultivado en un medio de 200 litros f/2 (Guillard, R.RL. & Ryther, J.H. 1962. Studies of marine planktonic diatomeas. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology 8, 229-239.), a 20°C y con una luz continua de 70-90 Pmol m-2 s-1. El 15 medio de crecimiento se preparó a partir de agua de mar micro filtrada (5 Pm) además de nutrientes añadidos, y el cultivo fue aireado con aire filtrado añadido <0,1 % CO2. Cuando el cultivo de algas se encontraba en la fase de crecimiento estacionario (6 días después de la inoculación del medio), se recogieron las células por centrifugación. El beta-1,3-glucano celular se extrajo por 0.0005 M H2S04 a 60°C. El extracto fue filtrado en el filtro Whatman GF/C, el filtro se lavó con agua destilada y el extracto fue 20 dializado (1000 MWCO) con agua Milli-Q. El extracto dializado se concentró en un evaporador rotatorio y fue secado por congelación. El extracto seco se almacenó en frascos, a 4°C. La estructura del extracto se caracterizó mediante una espectroscopia 1H- y 13C-DEPT-NMR. Según el método de Kim et al. que se indica más arriba, los resultados del experimento corresponden a un beta-1,3-glucano, con un grado de polimerización de 19-24, que corresponde a un peso molecular de ~4500-5200, y un grado de ramificación 25 1-6 de 0.003-0.005. 13C- DEPT-NMR confirmada la estructura beta 1-3 del glucano.

[0038] El CM Glucano fue encapsulado en microesferas de Alginato (Skjermo, J. et al., (1995)). La inmunoestimulación de alevines de rodaballo (Scophthalmus maximus L.) utilizando un alginato con alto contenido en ácido manurónico administrado por el organismo vivo alimentario Artemia. (Fish & Shellfish Immunology 5, 531-534), mezclando 1 g de glucano y 3 g de Alginato LF 10/60 (FMC Biopolymer, 30 Drammen, Noruega) en 360 ml de agua destilada y rociando la solución a través de una boquilla en una solución acuosa de cloruro de calcio (50 mM) y metanol (5%). Las microesferas fueron recolectadas en un filtro, lavado y almacenado en agua con un contenido de 0.1% de formaldehído.

[0039] Se colocaron huevas de bacalao en depósitos de 701 con un fondo plano y salida central. La entrada de agua era a través de tubos cerca de la pared del depósito, perforada con el fin de crear una 35 corriente circular de agua en el depósito. La densidad al inicio era de 100 huevas por litro. Se añadió la pasta de algas Nanocloropsis oculata (Reed Mariculture) en el agua del depósito a partir del día siguiente de salir del huevo. Las larvas fueron alimentadas con rotíferas cultivadas con levadura y un aceite marino a partir del segundo día después de salir del huevo. A partir del día 20, las larvas recibieron alimentación seca formulada. El experimento finalizó en el día 27 después de salir del huevo. 40

[0040] Los microesferas de CM Glucano y de Macrogard® fueron bioencapsuladas en rotíferas (Brachionus plicatilis), incubando las rotíferas durante 20-30 min en densidades de 250 ind ml-1 en 0,5 gl-1

de los inmunoestimulantes con agua de mar añadida. Las rotíferas tratadas fueron proporcionadas como alimento a las larvas de bacalao tres veces al día en los días 4, 11 y 18 después de salir del huevo. El grupo de control fue alimentado con rotíferas cultivadas con levadura y aceite marino en dichas ingestas. 5 El experimento se ejecutó con 3 réplicas por tratamiento, en total nueve depósitos. El primer tratamiento con inmunoestimulantes, en el día 4 después de salir del huevo, fue elegido porque se esperaba que las larvas requiriesen un par de días para empezar a ingerir rotíferas en cantidades óptimas.

[0041] Las muestras para determinar el crecimiento de las larvas se tomaron los días 1, 6, 13, 20 y 27 después de salir del huevo. El índice de supervivencia se determinó cada segundo y tercer día, realizando 10 un sifón en el fondo y contando las larvas muertas. Después de la introducción de la alimentación formulada, el sifón se realizó diariamente. A partir del día 10 después de salir del huevo, el índice de supervivencia de las larvas de bacalao era más alto en el grupo alimentado con CM Glucano (ver Figura 1). El índice de supervivencia total del grupo de CM Glucano aumentó en un 41 y 47%, respectivamente, en comparación con los grupos alimentados con Macrogard® y el grupo del control realizado el día 27 (ver 15 Figura 2). Ello indica un Porcentaje de Protección Relativa 10 veces superior en el grupo alimentado CM Glucano en comparación con los grupos alimentados con Macrogard® (ver Figura 3). Los Coeficientes de Variación (CV) de los porcentajes de supervivencia fueron del 14, 51 y 19% para los grupos tratados con CM Glucano, Macrogard® y control, respectivamente. Ello indica que la reproducibilidad de la supervivencia dentro de los tratamientos también se vio incrementada por la alimentación de las larvas con 20 CM Glucano, en comparación con Macrogard®. La precaria reproductibilidad en el grupo de Macrogard® indica que este tratamiento no tiene ningún efecto positivo ni negativo en las larvas de bacalao en este experimento, mientras que la óptima reproductibilidad entre los depósitos controlados indica que la configuración del experimento funcionó correctamente.

[0042] Después de una semana de alimentación con la dieta formulada, tanto el grupo Macrogard® como 25 el grupo de control habían reducido el peso en seco (ver Figura 4). La pendiente negativa entre los días 20 a 27 es debida al incremento de la mortalidad de las larvas más grandes. Sin embargo, los grupos alimentados con CM Glucano siguieron creciendo incluso después del cambio de rotíferas a la dieta formulada, y alcanzó unos niveles de peso en las larvas superiores a los del grupo Macrogard®. Además, el índice de crecimiento específico en el período con una dieta formulada (días 20-27) solamente fue 30 positivo para el grupo que había sido alimentado con CM Glucano durante los períodos de alimentación con rotíferas (ver Figura 5).

[0043] Las larvas tratadas con CM Glucano tenían un número de bacterias en el intestino significativamente inferior (ver Figura 9). Las larvas de control y el grupo tratado con Macrogard® tenían respectivamente, 11 000 y 22 000 CFU totales en el intestino, que corresponden a un contenido bacteriano 35 superior en un 30 y un 156%, respectivamente, a las larvas alimentadas con CM Glucano. El grupo de CM Glucano también tenía un contenido muy bajo de bacteria Vibrio (200 por larva), medido en un agar TCBS, en comparación con los grupos de control y Macrogard®, que contenían 7000 y 4600 Vibrio CFU por larva, respectivamente. En las larvas de CM Glucano el Vibrio sp. correspondía a un 2% del CFU total, mientras que Vibrio sp. constituía un 63 y un 21% del número total de bacterias en las larvas tratadas de control y 40 tratadas con Macrogard®, respectivamente. El número de Pseudomonas sp. no era anormalmente alto en ninguno de los dos.

[0044] Se sabe que los glucanos beta-1,3 son inmunomoduladores, y los efectos positivos obtenidos del tratamiento de larvas de bacalao con glucano beta-1,3 de una diatomea marina indican que este glucano tiene unas fuertes propiedades inmunomoduladoras. De esta manera, el tratamiento inmunoestimulante 5 preparó a las larvas para que tuvieran una mejor tolerancia contra el stress bacteriano introducido por el cambio de dieta. Esto se vio confirmado por las cifras bacterianas muy inferiores que pudieron ser cuantificadas en las larvas tratadas con CM Glucano, en relación con las larvas de control y las larvas tratadas con glucano a partir de Saccharomyces cerevisiae (Macrogard®).

[0045] La resistencia muy óptima contra la colonización por Vibrio sp. en el grupo tratado con CM Glucano 10 también se considera un resultado directo de la inmunoestimulación, y constituye un efecto muy positivo. Entre los Vibrios existen muchas especies patógenas para los peces, tanto oportunistas como obligadas, y la aparición de Vibriosis posterior al stress es un problema muy conocido en la producción de alevines de bacalao. Las altas cifras de Vibrio sp. en las larvas de bacalao en el día 27 sugieren por lo tanto unas condiciones precarias de las larvas y posibles infecciones. En el grupo tratado con CM Glucano se sugiere 15 que el glucano se dirigió a receptores o macrófagos en la mucosa del intestino de la larva de bacalao. Al mismo tiempo, el sistema inmunitario no específico en el intestino de la larva recibió una estimulación para conseguir una mayor resistencia contra la colonización bacteriana e infecciones, posiblemente de Vibrio sp.

[0046] Actualmente, los primeros regímenes de alimentación para larvas de bacalao incluyen normalmente 20 la alimentación con Artemia desde aproximadamente los días 17-20 y durante un período de 2-3 semanas, antes de que las larvas pasen a la alimentación seca formulada. En este experimento se demostró que la inmunoestimulación de larvas de bacalao con CM Glucano durante el período de rotíferas permitió un cambio de alimentación de las larvas muy temprano, ya que las larvas habían adquirido una mayor tolerancia al stress bacteriano inducido por la comida formulada. 25

[0047] El glucano de diatomeas marinas posee un mayor efecto inmunomodulador sobre las larvas de bacalao que el Macrogard® con glucano de levadura que se encuentra disponible comercialmente, que no tenía ningún efecto de mejora sobre la viabilidad de las larvas. Las larvas de bacalao alimentadas con Macrogard® presentaban una colonización considerable por Vibrio en el intestino. La diferencia entre los glucanos de diatomeamarina (CM Glucano) y las paredes celulares de levadura (Macrogard®) es 30 básicamente la solubilidad en agua y el grado de ramificación. Los efectos positivos del CM Glucano sobre las larvas de bacalao pueden ser debidos a esta diferencia. La molécula de CM Glucano puede tener una estructura que la haga más adecuada para los receptores en los macrófagos, introduciendo respuestas de inmunidad no específicas como una mayor fagocitosis y producción de radicales oxidantes, más rápidamente que Macrogard®. Por lo tanto, pueden conseguirse unos beneficios enormes utilizando 35 glucano de diatomeas marinas, en lugar de glucano a partir de levadura.

Ejemplo 2

Tratamiento de larvas de bacalao con TW Glucano, CM Glucano, Macrogard® y rotíferas de control

[0048] Se produjo beta1,3-glucan a partir de la microalga T. weissflogii, TW Glucano, se aisló y se 5 administró a larvas de bacalao utilizando los mismos métodos que para el CM Glucano en el Ejemplo 1. De esta manera, se administró TW Glucano, CM Glucano y Macrogard ® a través de la alimentación de larvas de bacalao.

[0049] Tal como se muestra en la Figura 7, las larvas de bacalao tratadas con TW Glucano presentaron un alto índice de crecimiento entre los días 13-20, pero después de introducir la alimentación formulada, el 10 crecimiento se detuvo. Solamente las larvas de bacalao tratadas con CM Glucano siguieron creciendo en el período de alimentación seca. Los estudios estructurales CM Glucano y TW Glucano muestran que estas dos diatomeas céntricas diferentes producen glucanos que son estructuralmente distintos, ver Figura 14. Este experimento ha demostrado que estos dos glucanos beta-1,3 poseen dos efectos completamente distintos sobre la supervivencia de las larvas. Por lo tanto, estos resultados demuestran que la estructura 15 del glucano beta 1,3 posee un gran impacto sobre las propiedades inmunomoduladoras de las moléculas.

Ejemplo 3

Tratamiento de larvas de bacalao con CrisoLaminaran (CM Glucano) y Alginato de alto M

20

Ensayo

[0050] Se extrajo CM Glucano de un cultivo de la diatomea Chaetoceros Mülleri, añadida a la comida para pescado marino, tal como se indica en el Ejemplo 1 más arriba, y se proporcionó como alimento a larvas de bacalao. Otros dos grupos fueron alimentados con Alginato de alto M y alimento ordinario.

[0051] Se procedió a la medición de los efectos sobre el crecimiento de las larvas, la supervivencia y la 25 colonización de los intestinos.

[0052] El ensayo se llevó a cabo con 3 réplicas por tratamiento, en total nueve depósitos, con la aplicación de condiciones normales, tal como se muestra en la tabla 1. De esta manera, se utilizaron 3 triplicados para el tratamiento con Alginato de alto M, CM Glucano y control no tratado. Se colocaron 150 huevas de bacalao por litro en los tanques 3 días antes del cambio de alimentación. Desde los días 3-24 después del 30 cambio de alimentación, las larvas fueron alimentadas con rotíferas cultivadas y enriquecidas. Desde los días 18-30 después del cambio de alimentación, las larvas fueron alimentadas con alimentación seca formulada. Asimismo, también se les ofreció pasta de alga (de Nannochloropsis oculata) a partir del día 3 después del cambio de alimentación y durante el período en que las larvas fueron alimentadas con rotíferas. 35

[0053] El Alginato de alto M y el CM Glucano fueron encapsulados en rotíferas y utilizados como alimento para las larvas en los días 3-4, 9-11, 15-17 y 20-22. El grupo de control recibió únicamente rotíferas normales cultivadas y enriquecidas.

40

Tabla 1

Condiciones standard para la primera alimentación de larvas de bacalao

Huevas de bacalao Densidad inicial 100 larvas / litro-1. 5

Depósitos para los ensayos 150 litros, con desagüe central.

Calidad del agua Agua de mar captada a 90 m de profundidad, filtrado de arena, templada y aireada, 34 % de contenido en sal.

Cambio de agua Días 0-2: 1 día-1

Días 3-5: 2 día-1 10

Días 6-8: 3 día-1

Días 9-12: 4 día-1

Días 13-15: 6 día-1

Días 16-30: 8 día-1

Temperatura del agua Aumento gradual de 8°C a 12°C entre los días 3-6. 15

La temperatura se mantuvo a 12 ± 0,2°C.

Luz Continua a partir de los días 1-30.

Pasta de alga La pasta de alga se administró 1-3 veces cada 24 h entre los días 3-25

(Nanocloropsis oculata) (1,5-4 ml depósito-1). 20

Rotíferas Las rotíferas fueron cultivadas en depósitos de 300 litros

(Brachionus pilcatilis) Disolución diaria del 20% de agua con 20‰ de contenido en sal y una temperatura de 20°C. Las rotíferas fueron cultivadas en levadura, Marol E y pasta de alga. Alimentación; ver Tabla 2. 25

Inmunoestimulación Alginato de alto M y CM Glucano, ver Tabla 2.

Alimento seco Alimentación; ver Tabla 2.

Régimen de alimentación

30

[0054] En el día 3 las larvas de bacalao fueron alimentadas con 5000 rotíferas (Brachionus pilcatilis) crecidas en levadura Marol E y pasta de alga (Nanochloropsis oculata) / litro-1. En el día 4 las larvas fueron alimentadas mañana y tarde con 5000 y 3000 rotíferas / litro-1, respectivamente, y en el día 5 fueron alimentadas con 3000 rotíferas / litro-1 tanto por la mañana como por la tarde. Desde el día 6 hasta el día 20 las larvas fueron alimentadas 3 veces al día, y en los días 21 y 22 las larvas fueron alimentadas 35 únicamente por la mañana y por la tarde. La alimentación varió entre 2000-7000 rotíferas / litro-1 según las necesidades. En los días 23 y 24, cuando las larvas experimentaron el cambio de alimentación a alimento seco formulado, fueron alimentadas con 7000 rotíferas / litro-1 por la tarde. Se añadió 2-4 ml de pasta de alga (Nanochloropsis oculata) a los depósitos por la mañana y por la tarde desde el día 3 hasta el día 8, y en adelante 3 ml por la mañana y por la tarde y 5,1 ml a mediodía desde el día 9 hasta el día 20, 3 ml por 40 la mañana y por la tarde desde el día 21 hasta el día 24 y 3 ml por la mañana el día 25.

[0055] Se añadió alimentación seca formulada a los depósitos desde el día 18 al día 30. Durante el día, las larvas también fueron alimentadas con 1 g cada 24 h en los días 18 y 19 y 3 g cada 24 h desde el día 20 al día 30.

Tabla 2

imagen1

Primera alimentación de las larvas de bacalao

Análisis

[0056] Las muestras para hibridización in situ, análisis de ARN, microbiología, C/N (peso en seco e índice de crecimiento) e histolopatología se tomaron tal como se indica en la Tabla 2.

[0057] La estimación del peso en seco se realizó sobre la base de la ecuación: 5

μg de peso en seco = 2,34 μg de carbono

[0058] Las muestras para el análisis de C/N se tomaron en los días XX (10-15 larvas).

[0059] La estimación del índice de crecimiento específico (SGR, % día -1) se realizó a partir de la 10 ecuación:

SGR = ln (N/N1) x 100 h,

donde No es el peso en seco inicial y Nt es el peso en seco por tiempo h. La ecuación se utiliza para 15 realizar una estimación del crecimiento individual en diferentes partes del ensayo, y con un peso medio para cada depósito como No para cada período.

Resultados

[0060] La supervivencia se determinó contando el número de larvas muertas, tal como se indica en la 20 Figura 10.

[0061] La supervivencia de los grupos de CM Glucano y Alginato de alto M fue respectivamente del 43,9% y el 45% en el día 30 después del cambio de alimentación, y no difirió estadísticamente durante el experimento (p>0.05, t-test de Student). Sin embargo, la supervivencia del grupo de control fue únicamente del 33,8%. Entre los días 22 a 29 (el período de alimentación en seco) la mortalidad en el 25 grupo de control fue estadísticamente muy superior a la de los dos grupos estimulados (p<0.05). La diferencia en supervivencia entre los grupos inmunoestimulados y el grupo de control ya quedó registrada en el cambio de alimentación a alimento seco y, más adelante, en el período con co-alimentación reducida. La mortalidad fue especialmente alta en el grupo de control entre los días 18-20 y entre los días 23-24 en comparación con los grupos tratados con inmunoestimulantes. Entre los días 18-20 durante el 30 cambio de alimentación al alimento seco, la mortalidad en el grupo de control fue del 23,1%, mientras que fue del 10,8% y el 11,8% respectivamente en los grupos tratados con Alginato de alto M y CM Glucano. En el día 25, al finalizar el período de co-alimentación con rotíferas, la tasa de supervivencia media era del 72,1% y el 67,5% en los grupos tratados con Alginato de alto M and CM Glucano, respectivamente, mientras que el índice de supervivencia del grupo de control era únicamente de un 51,3%. 35

[0062] Asimismo, se analizó el número de bacterias en el intestino. Se tomaron muestras de todos los depósitos en los días 1, 6, 16 y 30. Las larvas tratradas con inmunoestimulantes presentaban un número de bacterias en el intestino significativamente menor al de los grupos de control en el período de alimentación seca, tal como se muestra en la Figura 11. En los grupos estimulados el incremento fue moderado entre los días 21 al 30, con un aumento del 24% en el grupo de CM Glucano y del 3% en el 40

grupo del Alginato de alto M, En el grupo de control, el contenido bacteriano aumentó en un 321% en este período, y al mismo tiempo se produjo un incremento en la cifra total bacteriana en el depósito de agua (Figura 15), provocado por la introducción de alimentación seca. De esta manera, el tratamiento 5 inmunoestimulante preparó a las larvas para una mejor tolerancia contra el stress bacteriano introducido por el cambio de dieta.

[0063] La Figura 12 muestra el porcentaje de Vibrio en el intestino de las larvas. El contenido de Vibrio varió entre 0,4-5,9%, y aumentó ligeramente durante el experimento. La Figura 13 muestra el porcentaje de Pseudomonas marino en el intestino de la larva. El porcentaje de Pseudomonas no aumentó en los 10 grupos de CM Glucano ni en los grupos de control después de la introducción de la alimentación seca, pero en el grupo de Alginato de alto M se observó un marcado aumento de Pseudomonas entre los días 21-30. Se realizó una medición del crecimiento larvario, cuyos resultados se muestran en la Figura 6.

[0064] El grupo de CM Glucano tuvo los índices de crecimiento más altos, con larvas de 531 (30) Pg. En el grupo de Alginato de alto M el peso larvario fue de 470 (54) Pg y en el grupo de control, 473 (6) Pg. Las 15 larvas presentaron el mayor índice de crecimiento entre los días 10-17, pero después de la introducción de la alimentación seca, el índice de crecimiento se redujo significativamente, tal como se muestra en la Figura 8. En el período de alimentación con rotíferas, el grupo de Alginato de alto M alcanzó el mayor índice de crecimiento, pero el grupo de CM Glucano obtuvo el mayor índice de crecimiento en el período de alimentación seca, a la vez que obtuvo unos pesos estadísticos significativamente mayores (p<0.05). 20

Ejemplo 4

Preparado de microalgas secas con un alto contenido en glucano, y producción de comida formulada.

[0065] C. Mülleri se cultiva en un medio de 200 litros f/2 y se recoge por centrifugación en la fase de crecimiento estacionario. La pasta de algas se congela inmediatamente en seco en un secador por 25 congelación en vacío. Las microalgas secas se almacenan a oscuras a -20°C. Para producir alimentación formulada para los peces, las algas secas se añaden a la mezcla de material alimentario en bruto en dos concentraciones diferentes, 5 y 50 gramos por kilo, antes de la extrusión de los gránulos del alimento, La dieta controlada se realiza a partir de la misma mezcla, pero sin adición de algas. El alimento se almacena a -20°C antes de su utilización. 30

[0066] El cambio de alimentación de rotíferas a la alimentación con alimento seco es una fase muy crítica del primer período de alimentación, y a menudo se observa un índice de supervivencia muy bajo durante el cambio de alimentación de las larvas de pescado marino. La resistencia de las larvas a las infecciones bacterianas mejora de forma sustancial gracias a la inmunoestimulación no específica. Los experimentos demostraron que la inmunoestimulación provocaba un aumento del 30% en el índice de supervivencia en 35 el período de alimentación en seco, así como un peso superior. De esta manera, se demuestra que el glucano beta-1,3 de diatomeas aumenta la supervivencia de las larvas de bacalao en la fase de stress del primer período de alimentación, y que las larvas crecen mejor y alcanzan un peso superior.

40

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citada por el solicitante es únicamente para referencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. A pesar de que se ha tenido un gran cuidado a la hora de recopilar las referencias, no puede descartarse la posibilidad de que existan errores u omisiones, y la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

• DE 19608563 A1 [0003] • EP 0466037 A [0007] [0010]

Literatura no de patentes citada en la descripción

• D’SOUZA F.M.L. et al. Flocculated microalgae concentrates as diets for larvae of the tiger prawn Penaeus monodon Fabricius. AQUACULTURE NUTRITION, 2002, vol. 8 (2), 113-120 [0002]

• RAA J. et al. The use of immune-stimulants in fish and shellfish feeds. AVANCES EN NUTRICION ACUICOLA V. MEMORIAS DEL V SIMPOSIUM INTERNACIONAL DE NUTRICION ACUICOLA, 19 November 2000, 47-56 [0004]

• GRANUM E. Metabolism and function of Beta- 1,3-glucan in marine diatomeas, January 2002, vol. I-VII, 1-48 [0005]

• Dalmo, R.A. ; Seljelid, R. The immunomodulatory effect of LPS, Laminaran and sulfated Laminaran [β- (1,3)-D-glucan] on Atlantic salmon, Salmo salar L., macrophages in vitro. Journal of Fish Disease, 1995, vol. 18, 175-185 [0007]

• Samuel, M. ; Lam, T. J. ; Sin, Y. M. The effect of Laminaran [β(1,3)*D*Glucan] on the protective immunity of blue gourami, Trichogaster trichopterus against Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology, 1996, vol. 6, 443-454 [0007]

• Kim, Y. T. et al. Structural characterization of β-D-(13, 16)-linked glucans using NMR spectroscopy. Carbohydrate Research, 2000, vol. 328, 331-341 [0010]

• Guillard, R.RL. ; Ryther, J.H. Studies of marine planktonic diatomeas. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology, 1962, vol. 8, 229-239 [0037]

• Skjermo, J. et al. Immunostimulation of juvenile turbot (Scophthalmus maximus L.) using an alginate with high mannuronic acid content administered by the live food organism Artemia. Fish & Shellfish Immunology, 1995, vol. 5, 531-534 [0038]

Claims

Reivindicaciones

1. Composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora de crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades provocadas por 5 microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende glucano extraído de diatomeas.
2. Composición farmacéutica para su utilización según la reivindicación no. 1, en la que dicha diatomea es una Bacillariophyta sp.
3. Composición farmacéutica para su utilización según la reivindicación no. 2, en la que dicha Bacillariophyta sp. es una Chaetoceros Mülleri. 10
4. Composición farmacéutica para su utilización según las reivindicaciones no. 1-3 en la que dicho glucano es un glucano beta-1,3 con una ramificación 1-6.
5. Composición farmacéutica para su utilización según las reivindicaciones no. 1-4 en la que dichas diatomeas se encuentran en forma seca.
6. Compuesto para la inmunoestimulación con efectos profilácticos y / o de mejora de crecimiento para su 15 utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades provocadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende glucano extraído de diatomeas.
7. Compuesto para su utilización según la reivindicación no. 6, en el que dicha diatomea es una Bacillariophyta sp.
8. Compuesto para su utilización según la reivindicación no. 7, en el que dicha Bacillariophyta sp. es una 20 Chaetoceros Mülleri.
9. Compuesto para su utilización según las reivindicaciones no. 6-8, en el que dicho glucano es un glucano beta-1,3 con una ramificación 1-6.
10. Compuesto para su utilización según las reivindicaciones 6-9, en el que dichas diatomeas se encuentran en forma seca. 25
11. Alimento con efectos inmunoestimulantes, profilácticos y / o de mejora de crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades provocadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende glucano extraído de diatomeas.
12. Alimento para su utilización según la reivindicación no. 11, en el que dicha diatomea es una Bacillariophyta sp. 30
13. Alimento para su utilización según la reivindicación no. 12, en el que dicha Bacillariophyta sp. es una Chaetoceros Mülleri.
14. Alimento para su utilización según las reivindicaciones no.11-13 que comprende glucano extraído de diatomeas en una cantidad que mejora el índice de crecimiento y / o de resistencia a las enfermedades.
15. Alimento para su utilización según las reivindicaciones no.11-14, en el que dichas diatomeas se 35 encuentran en forma seca.
16. Constituyente de alimentación con efectos inmunoestimulantes profilácticos y / o de mejora de crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades provocadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas, que comprende glucano extraído de diatomeas.
17. Constituyente de alimentación para su utilización según la reivindicación no. 16, en el que dicha 40 diatomea es una Bacillariophyta sp.
18. Constituyente de alimentación para su utilización según la reivindicación no. 17, en el que dicha Bacillariophyta sp. es una Chaetoceros Mülleri.
19. Constituyente de alimentación para su utilización según las reivindicaciones no. 6-18, en el que dichas 5 diatomeas se encuentran en forma seca.
20. Utilización de una composición que comprende glucano extraído de diatomeas para la fabricación de una composición farmacéutica con efectos inmunoestimulantes profilácticos y / o de mejora de crecimiento para su utilización en la mejora de la resistencia global contra enfermedades provocadas por microorganismos patógenos y patógenos oportunistas para el tratamiento profiláctico de pescado, marisco, 10 aves, otros animales y mamíferos.
21. Utilización de una composición que comprende un glucano extraído de diatomeas para producir un alimento o constituyente de alimento para la inmunoestimulación, profilaxis y / o mejora del crecimiento.
22. Utilización de una composición que comprede un glucano extraído a partir de diatomeas para la fabricación de un constituyente o aditivo de alimentación para el crecimiento de pescado, marisco, aves, 15 otros animales y mamíferos.
23. Utilización según la reivindicación no. 20, en la que dicha composición que comprende glucano se extrae a partir de diatomeas en estado seco.
24. Utilización según la reivindicación no. 23, en que dicha diatomea es una Bacillariophyta sp.
25. Utilización según la reivindicación no. 24, en que dicha Bacillariophyta sp. es una Chaetoceros Mülleri. 20