CN106417989A - 用于水产动物饲料的益生菌组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

用于水产动物饲料的益生菌组合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于水产动物饲料的益生菌组合物及其制备方法与应用，该益生菌组合物包含如下质量百分比计的组分：益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％。有益菌和寡聚糖是两类国际公认的益生物质，两者作用机理一脉相通，在具体使用过程中也能完美互补，共同发挥优势。本发明将益生菌与寡聚糖完美结合，利用寡聚糖的增菌作用，促进益生菌增殖，调节肠内微生态平衡，能够促进水产动物生长，提高饵料利用率，增强免疫机能，降低死亡率等，并且对环境无污染。

Description

用于水产动物饲料的益生菌组合物及其制备方法与应用
【技术领域】
本发明属于动物饲料领域，具体涉及一种用于水产动物饲料的益生菌组合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
水产养殖业发展过程中存在片面追求产量，不重视质量、安全、环境和持续发展等问题，导致出现滥用和错用水产饲料添加剂情况，引起一系列消费者关注的水产品安全事件。另外，我国规模化’高密度水产养殖业的迅速发展，工业废水和生活污水的大量排放，使养殖生态环境遭到严重破坏，导致养殖病害频繁发生。目前最主要的疾病防治方法是使用化学药物，但使用不当会使病原微生物产生抗药性，并会导致动物体的免疫功能降低，产品中的药物残留和养殖水体的药物污染也严重威胁着水产品消费者——人类的健康与安全。这也提示水产饲料从业者，可以考虑从营养学的角度，使用改善鱼体肠道菌群功能的添加剂代替无序使用化学药物，来解决类似药残和水产品安全问题。
大量试验证实，益生菌组合物添加剂能够促进水产动物摄食和生长，提高饵料转化率，增强水产动物体质，降低发病率和死亡率等。并且益生菌组合物添加剂作为绿色饲料添加剂具备无毒副作用，无药物和有害物质在畜产品中残留，对人类生存环境不构成潜在污染危害以及其能为养殖业生产绿色水产品带来巨大的经济效益的优点。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于水产动物饲料的益生菌组合物，该组合物能够有效促进水产动物摄食和生长，提高饵料转化率，增强水产动物体质，降低发病率和死亡率等。
为实现上述目的，本发明提供的用于水产动物饲料的益生菌组合物，其特征在于：包含如下按质量百分比计的组分：益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％。
作为优选方案，该益生菌组合物包含如下按质量百分比计的组分：益生菌干粉65％，低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉15％。
进一步地，所述益生菌干粉由枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌按质量比为1:1:1的比例组成。
本发明的另一目的在于提供上述用于水产动物饲料的益生菌组合物的制备方法。
为实现该目的，本发明提供的制备用于水产动物饲料的益生菌组合物的方法，其特征在于：它包含如下步骤：
(1)选料：选取含有枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌的益生菌干粉，低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉；
(2)过筛：将选好的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉分别过80～100目筛；
(3)配料：将过筛后的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉称量备用；所述各组分质量百分比为益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％；
(4)混合：将配好的原料于三维混合机中混合至色泽均匀一致，无色差，即得到用于水产动物饲料的益生菌组合物。
进一步地，所述益生菌干粉制备方法步骤如下：
1)分别将枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌经培养基活化后，接种于发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×109cfu/ml；
2)将步骤1)中各菌种发酵液混合后离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，灭菌，得菌泥；
3)配制干粉保护剂；所述干粉保护剂的配方组成为：β-环状糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖0.5-2g、酵母膏0.5-2g、维生素E0.05-0.1g、蒸馏水100mL；
4)将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉。
本发明的再一目的在于提供上述用于水产动物饲料的益生菌组合物在制备水产动物饲料中的应用。
本发明所述的水产动物饲料，它包含上述的用于水产动物饲料的益生菌组合物。
低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。100克干重菊芋中约有60—70克菊粉，菊粉是通过线性的β—2，1—糖苷链连接的果聚糖，其末端为一蔗糖基。故以菊芋粉为原料用菊糖内切酶水解作用，经精制最终可得低聚果糖浆。是具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质。
低聚木糖又称木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而成的功能性聚合糖。与通常人们所用的大豆低聚糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖等相比具有独特的优势，它可以选择性地促进肠道双歧杆菌的增殖活性。其双歧因子功能是其它聚合糖类的10-20倍。低聚木糖是聚合糖类中增殖双歧杆菌功能最强的品种之一，它的功效性是其他聚合糖类的近20倍，促进双歧杆菌增殖同时产生多种有机酸。降低肠道PH值，抑制有害菌生长，使益生菌在肠道大量增殖。
大豆低聚糖是指其分子结构由2～10个单糖分子以糖苷键相连接而形成的糖类总称。分子量300～2000，界于单糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)和多糖(纤维、淀粉)之间，又有二糖、三糖、四糖之分。作为"特定保健用食品"的低聚糖是指具有特殊生物学功能，特别有益于胃肠健康的一类低聚糖，故又称"功能性低聚糖"。大豆低聚糖是大豆中可溶性糖质的总称。主要成分是指单糖数为3～4的蔗糖(双糖)、棉子糖(三糖)和水苏糖(四糖)等。其主要功效是将糖类分解为乙酸、乳酸和一些抗生素类物质，从而抑制有害菌的生长。大豆低聚糖是双歧杆菌增殖的食料，而其他有害菌几乎不能利用低聚糖，因此，可以阻止致病菌的定居和繁殖。
本发明中使用的低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉均已在市场上广泛应用，各种寡聚糖的制备是已有的技术，得到的产品只是在物质浓度上有所差别，其各种产品均可在本发明中实施应用。
低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖这些寡聚糖的作用机理，主要表现在3个方面：促进机体肠道内健康菌相的形成；结合、吸收外源性病原菌；调节机体的免疫系统；因寡聚糖耐高温、耐胃酸等，使其应用性更为广泛，在粉料、颗粒料和膨化料中均可使用。
寡聚糖中的有效成分在进入肠道之后不可避免地与肠道菌群发生关联，某些成分经相应细菌的作用发生生物转化后被吸收，因此，体内环境中肠道菌群是完成寡聚糖有效成分生物转化的重要因素之一。有益菌和寡聚糖是两类国际公认的益生物质，两者在基本理论观点上极为相似、一脉相通；在作用机理上显示极大的统一性；在具体使用过程中也能完美互补，共同发挥优势。因而寡聚糖对于有益菌而言，是绝佳的益生元。本发明将益生菌与寡聚糖完美结合，找出了可以用于水产动物饲料的益生菌组合物配方。
本发明的有益效果在于：本发明的益生菌组合物以益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉为原料直接投料，按重量科学配比而成。其含有维生素K，维生素B12、吡哆醇、生物素、叶酸、烟酸和硫胺素等营养成分，制备工艺简单，避免了提取时造成的药物损失和由于原药材质量差异造成的不同产品质量差异较大的缺点，使产品纯度更高，杂质少，安全性更高，且不同批次间质量差异小，质量更均匀稳定。通过寡聚糖与益生菌合理配比，经实验证明，用于水产动物饲料的效果优于单独使用任何一种原料。
【具体实施方式】
为了更好地理解本发明，以下将结合具体实例对本发明进行详细的说明。
本发明中益生菌干粉可以通过购买上市的原料或自行摸索制备工艺的方式获得，本发明对所选的益生菌干粉的制备工艺进行了优选；所述的益生菌干粉制备方法步骤优选如下：
1)分别将枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌经培养基活化后，接种于发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×109cfu/ml；
2)将各菌种发酵液混合后离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，灭菌，得菌泥；
3)配制干粉保护剂；
4)将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后，将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉；
其中，步骤1)所述的乳杆菌为保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种和嗜酸乳杆菌中的至少两种等比例混合菌，优选保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌两种等比例混合菌。
其中，步骤3)所述的干粉保护剂的配方组成为：β-环状糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖0.5-2g、酵母膏0.5-2g、维生素E0.05-0.1g、蒸馏水100mL。
芽孢杆菌种子液的制备：取出菌种保藏管，用LB固体培养基划平板进行复苏，37度培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种50毫升LB培养基中，在培养箱中37度震荡培养24小时。种子采用5％的接种量，接种至5L大三角瓶中(装液量为2L)，37度震荡培养小时，检测其菌液浓度，芽孢含量超过60亿/毫升，即可作为纳豆芽孢杆菌液体菌种接种。其中所述LB培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2％。其中所述纳豆芽孢杆菌液体菌种培养基：葡萄糖10g/L，玉米粉8g/L，豆粕粉25g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钠0.5g/L，磷酸氢二钠2.3g/L，pH7.2。各培养基灭菌的条件为：121℃灭菌30分钟。
乳杆菌种子液的制备：取出菌种保藏管，用MRS固体培养基划平板进行复苏，37度厌氧培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种250毫升MRS培养基中，在培养箱中37度厌氧培养24小时。种子采用5％的接种量，接种至10L大三角瓶中(装液量为9L)，37度厌氧培养20-28小时，检测其菌液浓度，菌含量超过100亿/毫升，即可作为乳杆菌液体菌种接种。其中所述的MRS培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，牛肉膏10g/L，葡萄糖20g/L，醋酸钠5g/L，柠檬酸二铵2g/L，吐温-801ml/L，硫酸镁0.6g/L，硫酸锰0.05g/L，磷酸氢二钾2g/L，琼脂20g/L，碳酸钙20g/L，固体培养基中加入琼脂2％。其中所述的乳酸菌种子培养基：葡萄糖5％，蛋白胨1.5％，牛肉膏0.75％，氯化钠0.1％，硫酸锰0.001％，硫酸镁0.02％，醋酸钠0.05％，碳酸钙1％，pH6.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
具体实施例如下：
实施例1
(1)选料
制备益生菌干粉：
1)分别将枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌经培养基活化后，接种于发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×109cfu/ml；
2)将各菌种发酵液混合后离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，灭菌，得菌泥；
3)配制干粉保护剂；
4)将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后，将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉；
低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉均购自西安天一生物技术有限公司。
(2)过筛
将步骤(1)中的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉分别过80～100目筛。
(3)配料
称量过筛后的原料，按益生菌干粉65％、低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉15％配料，以上含量均为重量百分比含量。
(4)混合
将配好的益生菌干粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉于三维混合机中混合至色泽均匀一致，无色差，即得到用于水产动物饲料的益生菌组合物。
实施例2
具体步骤同实施例1，不同之处在于：步骤(3)中配料：称量过筛后的原料，按益生菌干粉55％、低聚果糖粉15％、低聚木糖粉15％、大豆低聚糖粉15％配料，以上含量均为重量百分比含量。
实施例3
具体步骤同实施例1，不同之处在于：步骤(3)中配料：称量过筛后的原料，按益生菌干粉60％、低聚果糖粉10％、低聚木糖粉15％、大豆低聚糖粉15％配料，以上含量均为重量百分比含量。
实施例4
具体步骤同实施例1，不同之处在于：步骤(3)中配料：称量过筛后的原料，按益生菌干粉70％、低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉10％配料，以上含量均为重量百分比含量。
实施例5
具体步骤同实施例1，不同之处在于：步骤(3)中配料：称量过筛后的原料，按益生菌干粉65％、低聚果糖粉11％、低聚木糖粉11％、大豆低聚糖粉13％配料，以上含量均为重量百分比含量。
实验例1用于水产动物饲料的益生菌组合物对鲫鱼生长性能的影响
(1)鲫鱼模型的建立
实验用鲫鱼购于武汉市渔场,体态正常,健康无病,每尾鲫鱼平均体重为(15士0.5)g。购后置于武汉大学水产养殖温室的12个玻璃水族箱(50cmx50cmx80cm)饲养。
(2)分组与给药
将240尾暂养后的鲫鱼随机分成空白对照A组和试验B、C、D组四个组,分别饲喂基础日粮和试验日粮,如表1所示,每组设3个重复,每个重复20尾,组间无显著性差异(P>0.05),试验持续50d。试验鲫鱼先在水族箱内暂养,以基础日粮投喂,1周后开始正式试验。每天分别在09:00－10:00、16:30－17:00投喂1次,按试验鱼体重4％－5％投喂饲料。饲养前用强氯精进行消毒。
表1实验各组益生菌组合物添加量
组别 基础日粮 益生菌粉 寡聚糖粉
对照组A 基础日粮 0 0
试验组B 基础日粮 1％ 0
试验组C 基础日粮 0 1％
试验组D 基础日粮 0.5％ 0.5％
益生菌组合物对鲫鱼生长性能的影响
实施例1组合物和益生菌干粉都能显著降低大鼠的体重，其中实施例1组合
表1益生菌组合物对肥胖大鼠体重的影响，n＝8。注：益生菌粉和寡聚糖粉按实施例1的配比。
(3)数据测量
生长试验42d,试验鱼日喂2次(09:00一10:00、16:30一17:00),饲养0d、42d称重,并以此计算增重率,公式如下:
增重率％＝(平均末质量－平均初质量)/平均初质量
(4)结果分析
试验结束后进行各组鲫鱼生长指标的测定，从表2可以看出，试验D组的鲫鱼增重率与空白试验A组(P<0.05)，其它各组之间差异不明显(P<0.05)。实验表明，不同益生菌组合物对鲫鱼生长有一定的促进作用，其中益生菌与寡聚糖配合使用效果最好。
表2不同益生菌组合对鲫鱼生长性能的影响
组别 A组 B组 C组 D组
初质量(g) 16.92±0.3 15.34±0.3 15.12±0.3 16.03±0.5
末质量(g) 40.23±1.2 44.12±2.9 45.35±3.1 49.31±1.9
增重率(％) 137.8±0.3 187.6±0.3 199.9±0.3 207.6±0.5
实验例2不同益生菌组合对凡纳滨对虾肠道蛋白酶、淀粉酶活力的影响
(1)动物饲养与管理
实验虾来自武汉水生所，初始体质量为(0.11±0.00)g，随机分为6组，每组3个重复，每水泥池放养300尾虾，养殖前期投喂1.0mm粒径的饲料，后期投喂1.5mm粒径的饲料。投饵量为体质量的5％～10％，分4次投喂，投喂时间分别为06∶00、10∶30、18∶00、22∶00，各时间点投喂量占日总投饵量的比值分别为30％、20％、30％、20％。饲养期水温(29±3)℃，盐度26±3，连续充气。前15d不换水，每天排污1次，养殖水体深度从刚开始的60cm逐渐加深到120cm。养殖后期2～5d换水1次。每次换水量为20％～30％，严格控制每次换水的深度，使每池换水量基本一致。养殖时间持续10周。
(2)肠道消化酶活力测定
养殖实验结束后，每水泥池随机取15尾对虾，取其肠道。去除肠道粪便，用去离子水冲洗后滤纸吸干，称质量，捣碎后移入电动匀浆器内冰水浴匀浆，在4℃下离心30min(10000r/min)，取上清液备用，24h分析完毕。
蛋白酶活性测定采用福林-酚试剂法，以每mg酶蛋白37℃每分钟水解生成1μg酪氨酸作为1个酶活性单位；淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法，以每mg酶蛋白在37℃与底物作用30min，水解10mg淀粉为1个酶活性单位。
肠道酶液蛋白含量以牛血清蛋白做标准，用考马斯亮蓝法测定。
(3)实验结果与分析
饲料中添加益生菌能提高肠道蛋白酶和淀粉酶活力(表3)。其中益生菌组合物组有比单一益生菌组和单一寡聚糖组更高的肠道蛋白酶和淀粉酶活力。与对照组相比，添加益生菌组合物均能显著提高肠道淀粉酶活力(P<0.05)，但单一益生菌组和单一寡聚糖组肠道蛋白酶和淀粉酶活力差异不显著(P>0.05)。
表3不同益生菌组合对凡纳滨对虾肠道蛋白酶、淀粉酶活力的影响
组合 蛋白酶 淀粉酶
对照组 19.21±0.78 4.78±1.09
单一益生菌组 24.65±0.34 8.23±0.56
单一寡聚糖组 23.91±0.98 7.58±1.90
益生菌组合物组 25.11±0.56 9.31±1.28

Claims (7)

1.一种用于水产动物饲料的益生菌组合物，其特征在于：按质量百分比计，它包含如下的组分：益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％。
2.根据权利要求1所述的用于水产动物饲料的益生菌组合物，其特征在于：按质量百分比计，包含如下的组分：益生菌干粉65％，低聚果糖粉10％、低聚木糖粉10％、大豆低聚糖粉15％。
3.根据权利要求1或2所述的用于水产动物饲料的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌干粉由枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌按质量比为1:1:1的比例组成。
4.一种制备用于水产动物饲料的益生菌组合物的方法，其特征在于：它包含如下步骤：
(1)选料：选取含有枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌的益生菌干粉，低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉；
(2)过筛：将选好的益生菌干粉，低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉分别过80～100目筛；
(3)配料：将过筛后的益生菌干粉，低聚果糖粉、低聚木糖粉、大豆低聚糖粉称量备用；所述各组分质量百分比为益生菌干粉55～70％，低聚果糖粉10～15％、低聚木糖粉10～15％、大豆低聚糖粉10～15％；
(4)混合：将配好的原料于三维混合机中混合至色泽均匀一致，无色差，即得到用于水产动物饲料的益生菌组合物。
5.根据权利要求4所述的用于水产动物饲料的益生菌组合物的制备方法，其特征在于：所述益生菌干粉制备方法步骤如下：
1)分别将枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、乳杆菌经培养基活化后，接种于发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期0.5～1.0×109cfu/ml；
2)将步骤1)中各菌种发酵液混合后离心，弃上清，菌体沉淀洗涤，离心，灭菌，得菌泥；
3)配制干粉保护剂；所述干粉保护剂的配方组成为：β-环状糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖0.5-2g、酵母膏0.5-2g、维生素E0.05-0.1g、蒸馏水100mL；
4)将干粉保护剂和菌泥混合，进行成膜反应，然后将混合物预冻，再冷冻干燥，制成具有包埋层的活性益生菌干粉。
6.一种权利要求1或2所述的用于水产动物饲料的益生菌组合物在制备水产动物饲料中的应用。
7.一种水产动物饲料，其特征在于：它包含权利要求1或2所述的用于水产动物饲料的益生菌组合物。
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