CN109430536A - 一种水产用的天然免疫增强剂及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水产用的天然免疫增强剂及用途，该天然免疫增强剂包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸8‑10份、富含虾青素红法夫酵母粉5‑10份、果寡糖10‑20份、甘露寡糖10‑20份。该天然免疫增强剂应用于水产动物的饲料中，其添加量为饲料重量的0.05‑0.3%。有益效果为：本发明天然免疫增强剂中各成分起到相互增益的作用，提高水产动物的免疫力和抗应激能力，提高对病害的抵抗力，促进水产动物生长，成本低；该天然免疫增强剂应用于水产动物饲料中，提高水产动物全周期养殖的成活率，弥补了饲料中添加抗生素问题。
Description
技术领域
本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种水产用的天然免疫增强剂及用途。
背景技术
自然生态环境的破坏和人类的野蛮掠夺使得水产动物数量和规模大幅度减少，水产自然资源遭受严重破坏，有些种类甚至无法形成自然种群或濒临灭绝。为保护自然资源和满足人类需求，我国大力发展水产养殖业。愈来愈多的水产养殖品种已形成规模化养殖。当水产养殖患病或受周边疫情威胁时，为减少经济上的进一步损失，渔民常会采用药物进行防治疾病。药物选择时，绝大多数渔民选择化学药物，尤其是其中的环境消毒药物和抗生素药物，这不仅威胁了水产品的安全，还造成了严重的水体污染。养殖病害和环境问题已成为制约我国水产养殖业发展的重要因素之一。
免疫系统是机体在长期的进化过程中逐渐形成的一套免疫防御机制，其主要功能在于识别外界异物的入侵，进而激活免疫信号通路，触发下游免疫效应，维持机体内环境的稳态，达到将危害最小化的结果。而免疫增强剂是激活机体免疫系统的一些化学物质，它们可以使生物体对多种外界微生物的感染产生抵抗能力。在长期的进化过程中，生物体获得了能够识别外源异物关键组分的能力。诸如脂多糖、葡聚糖等细菌细胞壁成分可以作为典型的免疫增强剂来活化机体的免疫系统。近年来，为了应对虾蟹养殖业的病害问题，人们开展了免疫增强剂的开发工作，如糖类、核酸类、维生素类等不同种类的物质被开发和利用。免疫增强剂以其广谱、高效、环境友好等特点，成为领域内的研究热点。
CpG寡核苷酸是指未甲基化的含有基序的寡聚核苷酸序列，主要存在于特定的细菌和病毒基因组中，也可以人工设计合成，具有激活机体免疫系统的作用。 CpG寡核苷酸的典型结构为5’-Pu-Pu-CpG-Py-Py-3’，即以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心，5’端紧接2个嘌呤，3’端紧接2个嘧啶。由于不同动物的免疫激活对寡核苷酸结构的要求有所不同(主要是CpG的两翼序列)，因此可以针对不同动物的免疫特点，通过人工合成的含有非甲基化的寡核苷酸序列，对寡核苷酸进行分子设计和改造，以产生具有最佳免疫激活效应的CpG寡核苷酸。
动物免疫系统正是通过识别寡核苷酸的特征结构来识别微生物DNA和自身 DNA，诱导产生抗菌多肽物质，从而形成针对病原体的特异免疫防护机制，起到免疫激活和抗菌作用。CpG寡核苷酸具有优良的免疫刺激活性，可直接激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，分泌多种Th1型细胞因子，如干扰素(IFN)、白细胞介素(IL-1、IL-12)等物质，促进机体产生抗原特异性的免疫反应，并能引发强的抗体反应和Th1型体液免疫应答，其显著的免疫激活效应是传统多糖药物所无法比拟的。同时，CpG寡核苷酸作为天然药物，无毒副作用，与目前广泛使用的各种抗生素等相比，无药物残留和产生抗药性等问题，不污染环境。此外，CpG寡核苷酸是一种免疫激活制剂，它能提高机体的整体防病与抗病能力，对各种细菌、病毒等病原微生物具有广谱的抵抗能力，而且在人、畜禽、鱼类、贝类、虾等动物中都具有明显的作用，使用面广，功效全面，是一种具有重大开发价值的新型生物制品。
现有技术如授权公告号为CN102090532B的中国发明专利，公开了一种大黄鱼稚鱼用的免疫增强剂，由果寡糖、半乳寡糖、甘露寡糖和酵母提取物为原料均匀混合配制而成；该免疫增强剂在饲料中添加量仅为0.1～0.2％，就明显提高大黄鱼稚鱼的免疫力和疾病抵抗力，从而提高大黄鱼鱼苗全周期养殖的成活率，成活率可提高12％以上，免疫保护率达到30％以上；且该免疫增强剂无毒副作用、无残留和无抗药性，对饲料适口性也无任何不良影响。因此该免疫增强剂具有添加量少，能明显提高大黄鱼稚鱼的免疫力和疾病抵抗力，养殖成活率可提高12％以上，免疫保护率达到30％以上的大黄鱼稚鱼用的免疫增强剂。但是该免疫增强剂中用啤酒酵母提取物的免疫增强效果不佳，且该免疫增强剂不能使水产具备广谱的抵抗能力。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种各成分起到相互增益的作用，提高水产动物的免疫力和抗应激能力，提高对病害的抵抗力，促进水产动物生长，成本低的水产用的天然免疫增强剂。
本发明的目的之二在于提供一种应用于水产饲料中，使得饲料具有促进水产动物机体的新陈代谢、提高机体免疫力、促经生长、提高产量、改善品质的作用，提高水产动物全周期养殖的成活率，弥补了饲料中添加抗生素问题的水产动物用的天然免疫增强剂的用途。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种水产用的天然免疫增强剂，该天然免疫增强剂包括CpG寡核苷酸，上述CpG寡核苷酸的制备方法为：将酵母菌体中加入STET缓冲液，在 800-1200r/min的条件下磁力搅拌20-40min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为80-120μg/mL，搅拌均匀后置于35-40℃的水浴中20-30min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热10-20min，迅速冷却至室温，然后在10000-15000r/min 的条件下离心20-40min，再将上清加入到0.5-0.8倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-6至-2℃的条件下沉降15-25min，然后在10000-15000r/min的条件下离心 10-20min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得CpG寡核苷酸，该 CpG寡核苷酸是未甲基化的含有基序的寡聚核苷酸序列，具有病原相关分子模式的特征，能够激活免疫信号级联通路，最终引起多种免疫细胞的增殖和成熟分化，然后在动物体内通过免疫信号分子间复杂的相互作用，产生强烈的型免疫应答，且使免疫反应高峰出现的时间大大提前，对各种细菌、病毒等病原微生物具有广谱的抵抗能力，促进水产动物生长和提高其抗应激能力。
作为优选，溶菌酶中含有溶菌酶重量0.3-0.36％的β-环糊精和溶菌酶重量0.012-0.018％的腺嘌呤核苷，溶菌酶的活性部位能够催化分解细菌细胞壁多糖的主要成分N-乙酰氨基葡糖-N-乙酰氨基葡糖乳酸的共聚物，溶菌酶活性部位所在的裂缝能够被6个糖残基装满，只有第四个糖残基的D环因空间原因必须由正常的椅式变为能量较高的半椅式构象，因此该处糖苷键较为脆弱，容易断裂，而组成环糊精的D型吡喃葡萄糖单元都是椅式构象，有助于把半椅式构象转变为椅式构象，提高溶菌酶的稳定性，且腺嘌呤核苷分子结合到溶菌酶表面如芳香族氨基酸等具有较强疏水尾链的氨基酸残基上，阻止溶菌酶蛋白之间的相互作用，避免溶菌酶聚合而使得活性部位被占，使得底物能够顺利进入溶菌酶蛋白的活性部位，最终提高CpG寡核苷酸的提取效率和得率，从而降低天然免疫增强剂的成本。
作为优选，STET缓冲液的成分为：80g/L蔗糖、2.0％Triton X-100、100mM EDTA、50mM Tris-Cl，STET缓冲液的pH为8.5。
作为优选，细胞裂解液的制备方法为：将15g CTAB先用600mL ddH2O加热溶解，然后加入75mL的浓度为1M、pH为8.0的Tris-HCl溶液、58.5gNaCl、 30mL的浓度为0.5M的EDTA溶液，随后定容至1000mL，混合均匀。该细胞裂解液可以破坏掉细胞膜，而对细胞核膜破坏的作用弱，释放蛋白，和溶菌酶共同作用，进而获得CpG寡核苷酸。
作为优选，天然免疫增强剂包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸8-10 份、富含虾青素红法夫酵母粉5-10份、果寡糖10-20份、甘露寡糖10-20份。该天然免疫增强剂中各成分起到相互增益的作用，能够提高水产动物的免疫力和抗应激能力，提高对病害的抵抗力，促进水产动物生长，从而提高水产动物全周期养殖的成活率，且该免疫增强剂无毒副作用、无残留和无抗药性，可作为饲料添加剂在水产动物饲料中配合使用，用以取代抗生素，对饲料适口性也无任何不良影响。
一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其具体步骤为：
菌种活化：选择含高免疫活性CpG寡核苷酸(pYES2-90CpG质粒)的酿酒酵母，将酿酒酵母工程菌接种到SC-U斜面培养基上，在25-30℃的条件下培养 45-50h，备用，由于菌种长时间保藏于温度较低的菌种库中，其新陈代谢很弱，处于一种休眠状态，因此在使用前要给它提供一个很好的生存环境和条件进行活化，获得活力旺盛的、接种数量足够的酿酒酵母工程菌；
摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种至YEPD种子培养基中，在温度为 25-30℃、转速为150-250r/min的条件下培养18-24h得一级种培养物，然后将一级种培养物按8-12％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中，在温度为25-30℃、转速为150-250r/min的条件下培养20-30h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；
发酵罐培养：将二级种按8-12％(V/V)的接种量接种到发酵罐中，调节转速和空气流量控制溶氧≥30％，发酵过程中通过流加浓度为18-22％的氨水控制发酵液的pH为4.5-5.5，在25-30℃的条件下培养，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加18-22％甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵45-50h结束，然后在4000-6000r/min的条件下离心15-25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，然后将酵母菌体分离纯化得CpG寡核苷酸，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到大量酵母菌体；
天然免疫增强剂的制备：按配方量取CpG寡核苷酸、果寡糖、甘露寡糖，混合均匀，即得天然免疫增强剂，该天然免疫增强剂所用原料来源稳定、价格低廉，制备方法简单，应用于水产动物饲料中，少量的添加就能使水产动物达到较好生长效果，提高饲料利用率，节约饲料资源，降低水产动物饲养成本，不影响饲料的口感。
一种水产用的天然免疫增强剂的用途，该天然免疫增强剂应用于水产动物的饲料中，其添加量为饲料重量的0.05-0.3％。该水产动物饲料具有促进水产动物机体的新陈代谢、提高机体免疫力、促经生长、提高产量、改善品质的作用，从而提高水产动物全周期养殖的成活率，弥补了饲料中添加抗生素的问题，安全性好，低毒高效，且口感合适，不影响水产动物的正常进食。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明天然免疫增强剂中各成分起到相互增益的作用，能够提高水产动物的免疫力和抗应激能力，提高对病害的抵抗力，促进水产动物生长，从而提高水产动物全周期养殖的成活率；
2)本发明天然免疫增强剂无毒副作用、无残留和无抗药性，少量的添加就能使水产动物达到较好生长效果，提高饲料利用率，节约饲料资源，降低水产动物饲养成本，不影响饲料的口感；
3)本发明天然免疫增强剂的制备方法简单，CpG寡核苷酸的提取效率和得率较高，所用原料来源稳定、价格低廉，易于工业化生产；
4)本发明添加剂应用于水产动物饲料中，使得饲料具有促进水产动物机体的新陈代谢、提高机体免疫力、促经生长、提高产量、改善品质的作用，从而提高水产动物全周期养殖的成活率，弥补了饲料中添加抗生素的问题。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种水产用的天然免疫增强剂，该天然免疫增强剂包括CpG寡核苷酸，上述CpG寡核苷酸的制备方法为：将酵母菌体中加入STET缓冲液，在1200r/min 的条件下磁力搅拌20min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为120μg/mL，搅拌均匀后置于35℃的水浴中30min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热 10min，迅速冷却至室温，然后在15000r/min的条件下离心20min，再将上清加入到0.8倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-6℃的条件下沉降25min，然后在 10000r/min的条件下离心20min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得CpG寡核苷酸，计算CpG寡核苷酸实际含量，该CpG寡核苷酸是未甲基化的含有基序的寡聚核苷酸序列，具有病原相关分子模式的特征，能够激活免疫信号级联通路，最终引起多种免疫细胞的增殖和成熟分化，然后在水产动物体内通过免疫信号分子间复杂的相互作用，产生强烈的型免疫应答，且使免疫反应高峰出现的时间大大提前，对各种细菌、病毒等病原微生物具有广谱的抵抗能力，促进水产动物生长和提高其抗应激能力。
溶菌酶中含有溶菌酶重量0.3％的β-环糊精和溶菌酶重量0.018％的腺嘌呤核苷，溶菌酶的活性部位能够催化分解细菌细胞壁多糖的主要成分N-乙酰氨基葡糖 -N-乙酰氨基葡糖乳酸的共聚物，溶菌酶活性部位所在的裂缝能够被6个糖残基装满，只有第四个糖残基的D环因空间原因必须由正常的椅式变为能量较高的半椅式构象，因此该处糖苷键较为脆弱，容易断裂，而组成环糊精的D型吡喃葡萄糖单元都是椅式构象，有助于把半椅式构象转变为椅式构象，提高溶菌酶的稳定性，且腺嘌呤核苷分子结合到溶菌酶表面如芳香族氨基酸等具有较强疏水尾链的氨基酸残基上，阻止溶菌酶蛋白之间的相互作用，避免溶菌酶聚合而使得活性部位被占，使得底物能够顺利进入溶菌酶蛋白的活性部位，最终提高CpG寡核苷酸的提取效率和得率，从而降低天然免疫增强剂的成本。
STET缓冲液的成分为：80g/L蔗糖、2.0％Triton X-100、100mM EDTA、50mM Tris-Cl，STET缓冲液的pH为8.5。
细胞裂解液的制备方法为：将15g CTAB先用600mL ddH2O加热溶解，然后加入75mL的浓度为1M、pH为8.0的Tris-HCl溶液、58.5gNaCl、30mL的浓度为0.5M的EDTA溶液，随后定容至1000mL，混合均匀。该细胞裂解液可以破坏掉细胞膜，而对细胞核膜破坏的作用弱，释放蛋白，和溶菌酶共同作用，进而获得CpG寡核苷酸。
天然免疫增强剂包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸8份、富含虾青素红法夫酵母粉10份、果寡糖10份、甘露寡糖20份。该天然免疫增强剂中各成分起到相互增益的作用，能够提高水产动物的免疫力和抗应激能力，提高对病害的抵抗力，促进水产动物生长，从而提高水产动物全周期养殖的成活率，且该免疫增强剂无毒副作用、无残留和无抗药性，可作为饲料添加剂在水产动物饲料中配合使用，用以取代抗生素，对饲料适口性也无任何不良影响。
一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其具体步骤为：
1)菌种活化：选择含高免疫活性CpG寡核苷酸(pYES2-90CpG质粒)的酿酒酵母，将酿酒酵母工程菌接种到SC-U斜面培养基上，在25℃的条件下培养50h，备用，由于菌种长时间保藏于温度较低的菌种库中，其新陈代谢很弱，处于一种休眠状态，因此在使用前要给它提供一个很好的生存环境和条件进行活化，获得活力旺盛的、接种数量足够的酿酒酵母工程菌；
2)摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种至YEPD种子培养基中，在温度为 25℃、转速为250r/min的条件下培养18h得一级种培养物，然后将一级种培养物按12％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中，在温度为25℃、转速为250r/min 的条件下培养20h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；
3)发酵罐培养：将二级种按12％(V/V)的接种量接种到发酵罐中，调节转速和空气流量控制溶氧≥30％，发酵过程中通过流加浓度为18％的氨水控制发酵液的pH为5.5，在25℃的条件下培养，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加22％甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵45h结束，然后在6000r/min的条件下离心15min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，然后将酵母菌体分离纯化得CpG寡核苷酸，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到大量酵母菌体；
4)天然免疫增强剂的制备：按配方量取CpG寡核苷酸、果寡糖、甘露寡糖，混合均匀，即得天然免疫增强剂，该天然免疫增强剂所用原料来源稳定、价格低廉，制备方法简单，应用于水产动物饲料中，少量的添加就能使水产动物达到较好生长效果，提高饲料利用率，节约饲料资源，降低水产动物饲养成本，不影响饲料的口感。
一种水产用的天然免疫增强剂的用途，该天然免疫增强剂应用于水产动物的饲料中，其添加量为饲料重量的0.05％。该水产动物饲料具有促进水产动物机体的新陈代谢、提高机体免疫力、促经生长、提高产量、改善品质的作用，从而提高水产动物全周期养殖的成活率，弥补了饲料中添加抗生素的问题，安全性好，低毒高效，且口感合适，不影响水产动物的正常进食。
实施例2：
一种水产用的天然免疫增强剂，包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸 10份、富含虾青素红法夫酵母粉5份、果寡糖20份、甘露寡糖10份。
一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其具体步骤为：
1)菌种活化：选择含高免疫活性CpG寡核苷酸(pYES2-90CpG质粒)的酿酒酵母，将酿酒酵母工程菌接种到SC-U斜面培养基上，在30℃的条件下培养45h，备用；
2)摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种至YEPD种子培养基中，在温度为 30℃、转速为150r/min的条件下培养24h得一级种培养物，然后将一级种培养物按8％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为150r/min的条件下培养30h，即得二级种，备用；
3)发酵罐培养：将二级种按8％(V/V)的接种量接种到发酵罐中，调节转速和空气流量控制溶氧≥30％，发酵过程中通过流加浓度为22％的氨水控制发酵液的pH为4.5，在30℃的条件下培养，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加18％甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵50h结束，然后在4000r/min的条件下离心25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；
4)分离纯化：将酵母菌体中加入STET缓冲液，在800r/min的条件下磁力搅拌40min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为80μg/mL，搅拌均匀后置于 40℃的水浴中20min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热20min，迅速冷却至室温，然后在10000r/min的条件下离心40min，再将上清加入到0.5倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-2℃的条件下沉降15min，然后在15000r/min的条件下离心 10min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得CpG寡核苷酸，计算CpG 寡核苷酸实际含量，上述STET缓冲液的成分为：80g/L蔗糖、2.0％Triton X-100、 100mM EDTA、50mM Tris-Cl，STET缓冲液的pH为8.5；溶菌酶中含有溶菌酶重量0.36％的β-环糊精和溶菌酶重量0.012％的腺嘌呤核苷；细胞裂解液的制备方法为：将15g CTAB先用600mL ddH2O加热溶解，然后加入75mL的浓度为1M、pH 为8.0的Tris-HCl溶液、58.5gNaCl、30mL的浓度为0.5M的EDTA溶液，随后定容至1000mL，混合均匀；
5)天然免疫增强剂的制备：按配方量取CpG寡核苷酸、果寡糖、甘露寡糖，混合均匀，即得天然免疫增强剂。
一种水产用的天然免疫增强剂的用途，该天然免疫增强剂应用于水产动物的饲料中，其添加量为饲料重量的0.3％。
实施例3：
一种水产用的天然免疫增强剂，包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸9 份、富含虾青素红法夫酵母粉8份、果寡糖15份、甘露寡糖15份。
一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其具体步骤为：
1)菌种活化：选择含高免疫活性CpG寡核苷酸(pYES2-90CpG质粒)的酿酒酵母，将酿酒酵母工程菌接种到SC-U斜面培养基上，在28℃的条件下培养48h，备用；
2)摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种至YEPD种子培养基中，在温度为 28℃、转速为200r/min的条件下培养20h得一级种培养物，然后将一级种培养物按10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28℃、转速为200r/min 的条件下培养24h，即得二级种，备用；
3)发酵罐培养：将二级种按10％(V/V)的接种量接种到发酵罐中，调节转速和空气流量控制溶氧≥30％，发酵过程中通过流加浓度为20％的氨水控制发酵液的pH为5.0，在28℃的条件下培养，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加20％甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵48h结束，然后在5000r/min的条件下离心20min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；
4)分离纯化：将酵母菌体中加入STET缓冲液，在1000r/min的条件下磁力搅拌30min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为100μg/mL，搅拌均匀后置于38℃的水浴中25min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热15min，迅速冷却至室温，然后在12000r/min的条件下离心30min，再将上清加入到0.7倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-4℃的条件下沉降20min，然后在12000r/min的条件下离心15min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得CpG寡核苷酸，计算 CpG寡核苷酸实际含量，上述STET缓冲液的成分为：80g/L蔗糖、2.0％Triton X-100、 100mM EDTA、50mM Tris-Cl，STET缓冲液的pH为8.5；溶菌酶中含有溶菌酶重量0.33％的β-环糊精和溶菌酶重量0.015％的腺嘌呤核苷；细胞裂解液的制备方法为：将15g CTAB先用600mL ddH2O加热溶解，然后加入75mL的浓度为1M、pH 为8.0的Tris-HCl溶液、58.5gNaCl、30mL的浓度为0.5M的EDTA溶液，随后定容至1000mL，混合均匀；
5)天然免疫增强剂的制备：按配方量取CpG寡核苷酸、果寡糖、甘露寡糖，混合均匀，即得天然免疫增强剂。
一种水产用的天然免疫增强剂的用途，该天然免疫增强剂应用于水产动物的饲料中，其添加量为饲料重量的0.15％。
实施例4：
一种水产用的天然免疫增强剂，包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸9 份、富含虾青素红法夫酵母粉8份、果寡糖15份、甘露寡糖15份。
一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其具体步骤为：
1)菌种活化：选择含高免疫活性CpG寡核苷酸(pYES2-90CpG质粒)的酿酒酵母，将酿酒酵母工程菌接种到SC-U斜面培养基上，在28℃的条件下培养48h，备用；
2)摇瓶培养：将活化后的斜面菌种接种至YEPD种子培养基中，在温度为 28℃、转速为200r/min的条件下培养20h得一级种培养物，然后将一级种培养物按10％(V/V)的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28℃、转速为200r/min 的条件下培养24h，即得二级种，备用；
3)发酵罐培养：将二级种按10％(V/V)的接种量接种到发酵罐中，调节转速和空气流量控制溶氧≥30％，发酵过程中通过流加浓度为20％的氨水控制发酵液的pH为5.0，在28℃的条件下培养，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加20％甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵48h结束，然后在5000r/min的条件下离心20min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；
4)分离纯化：将酵母菌体中加入STET缓冲液，在1000r/min的条件下磁力搅拌30min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为100μg/mL，搅拌均匀后置于38℃的水浴中25min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热10min，迅速冷却至室温，然后在12000r/min的条件下离心30min，再将上清加入到0.7倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-4℃的条件下沉降20min，然后在12000r/min的条件下离心15min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得CpG寡核苷酸，计算 CpG寡核苷酸实际含量，上述STET缓冲液的成分为：80g/L蔗糖、2.0％Triton X-100、 100mM EDTA、50mM Tris-Cl，STET缓冲液的pH为8.5；溶菌酶中含有溶菌酶重量0.33％的β-环糊精和溶菌酶重量0.015％的腺嘌呤核苷；细胞裂解液的制备方法为：将15g CTAB先用600mL ddH2O加热溶解，然后加入75mL的浓度为1M、pH 为8.0的Tris-HCl溶液、58.5gNaCl、0.02g二乙基乙醇胺、0.01g 2-羟基乙胺、30mL 的浓度为0.5M的EDTA溶液，随后定容至1000mL，混合均匀，上述裂解液中二乙基乙醇胺和2-羟基乙胺的加入可将大团的酵母菌分散开，使得酵母菌能够充分和裂解液接触，提高裂解的速率和程度，且能促进裂解液可以破坏掉细胞膜，进而缩短裂解时间，避免有效成分失效，大大减少裂解液的用量，降低天然免疫增强剂的生产成本；
5)天然免疫增强剂的制备：按配方量取CpG寡核苷酸、果寡糖、甘露寡糖，混合均匀，即得天然免疫增强剂。
一种水产用的天然免疫增强剂的用途，该天然免疫增强剂应用于水产动物的饲料中，其添加量为饲料重量的0.15％。
实施例5：
一种水产用的天然免疫增强剂，包括以下成分及其重量份：富含虾青素红法夫酵母粉8份、果寡糖15份、甘露寡糖15份。
实施例6：
CpG寡核苷酸总收率
CpG寡核苷酸理论含量的测定：
取10ml的培养酵母菌液，5000g离心收集酵母细胞，用无菌去离子水洗2 次，按照酵母质粒小量提取试剂盒操作说明提取质粒DNA。采用紫外分光光度计法分别在波长260nm和280nm下测定吸收值A260和A280，A260/A280比值在1.75-1.85之间表明质粒纯度较高，并以吸光值A260计算浓度，以此作为CpG 寡核苷酸的理论含量。
CpG寡核苷酸的理论含量C(μg/ml)＝50×A×n
其中：50：在260nm下1个OD值表示50μg/ml的双链DNA；A：吸光值 A260；n：稀释倍数。
分别测定实施例1、实施例2、实施例3和实施例4发酵液的CpG寡核苷酸含量，每个批次各1000ml，通过上述方法分别计算实施例1、实施例2、实施例3和实施例4发酵液的CpG寡核苷酸理论含量和实际含量及工艺提取总收率，结果如表1所示。
表1 CpG寡核苷酸理论含量和实际含量及工艺提取总收率
由表1可知，实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中CpG寡核苷酸总收率均较高，且实施例4的总收率最高，表明裂解液中二乙基乙醇胺和2-羟基乙胺的加入能够减低裂解时间，提高CpG寡核苷酸总收率。
实施例7：
天然免疫增强剂对牙鲆的养殖测试
养殖品种：1克左右的牙鲆稚鱼2500条，随机分配为五组：网箱1、网箱2、网箱3、网箱4和网箱5，各组总重相当，每组网箱总放养牙鲆稚鱼500条；
养殖条件：环境因素、化学因素和生物因素基本相同的同一水域的网箱；
养殖管理：其它条件基本相同，所不同的只是网箱1每天投喂的饲料中添加有0.15％(重量)实施例1产品；网箱2每天投喂的饲料中添加有0.15％(重量) 实施例2产品；网箱3每天投喂的饲料中添加有0.15％(重量)实施例3产品；网箱 4(对照组)每天投喂的饲料中未添加天然免疫增强剂；网箱5每天投喂的饲料中添加有0.15％(重量)实施例5产品；
结果比较：养殖实验持续2个月，然后计算牙鲆的成活条数、成活率和免疫保护率，免疫保护率＝(1-实验组死亡率/对照组死亡率)×100，实验结果如表2 所示；
表2：天然免疫增强剂在牙鲆养殖中的应用效果
| 类别 | 成活条数(条) | 成活率(％) | 免疫保护率(％) |
| 网箱1 | 263 | 52.6 | 31.9 |
| 网箱2 | 283 | 56.6 | 37.6 |
| 网箱3 | 302 | 60.4 | 43.1 |
| 网箱4 | 221 | 44.2 | 19.8 |
| 网箱5 | 152 | 30.4 | 0 |
免疫保护率(％)＝[1-(试验组死亡率/对照组死亡率)]×100％
从表1中可以看出，网箱1、2、3比网箱5的免疫保护率高19.8％以上，网箱1、 2、3比网箱4的免疫保护率高12％以上，说明本发明的牙鲆稚鱼用的免疫增强剂可以提高大牙鲆鱼苗的成活率，而CpG寡核苷酸对牙鲆鱼苗的免疫效果好。
实施例8：
天然免疫增强剂对大黄鱼的养殖测试
将养殖大黄鱼网箱分成8组，5组网箱为试验组，3组为对照组。试验组每天投喂的饲料中添加有0.15％(重量)实施例3产品，对照组投喂大黄鱼配合饲料。试验持续90天，统计自然发病死亡率。试验期间不使用其它药物，养殖管理方式和养殖条件相同。试验结果见表3：
表3天然免疫增强剂在大黄鱼养殖中的应用效果
通过养殖试验结果显示，大黄鱼配合饲料中添加天然免疫增强剂有助于改善大黄鱼幼鱼的生产性能，投喂添加天然免疫增强剂的大黄鱼配合饲料的试验组大黄鱼幼鱼，在第30d其成活率就有所提高，到第50d时，试验组幼鱼成活率显著高于对照组，试验组增重率为282.33％、成活率为92.98％。与对照组相比，试验组大黄鱼增重率提高15.62％、成活率提高20.25％，免疫保护率为74.25％。这表明饲料中添加天然免疫增强剂能提高大黄鱼幼鱼的免疫力，进而提高其抗病力，提高其成活率，且表现出时间效应。可见，天然免疫增强剂在水产配合饲料中应用是有效的，有助于推进功能性水产配合饲料的研发与应用。
实施例9：
天然免疫增强剂对鲈鱼的养殖测试
在鲈鱼养殖水面设网箱6组，其中三组网箱为试验组，三组为对照组。试验鲈鱼鱼种(规格10厘米-15厘米)8000余尾，试验组每天投喂的饲料中添加有 0.15％(重量)实施例3产品，对照网箱饲喂不含天然免疫增强剂的正常饲料(添加正常酵母粉)，连续投喂90天，统计养殖期间鲈鱼的自然发病死亡率和成活率，试验期间不使用抗生素等其它药物。应用试验结果见表4：
表4天然免疫增强剂在鲈鱼养殖中的应用效果
结果显示，使用含天然免疫增强剂饲料的养殖鲈鱼，平均成活率达到89.08％，而不使用天然免疫增强剂饲料的对照养殖鲈鱼，平均成活率为67.33％。因此，使用天然免疫增强剂饲料的养殖鲈鱼，平均成活率提高21.74％，免疫保护率达到 66.57％，使用天然免疫增强剂的试验组，成活率明显提高，表明天然免疫增强剂能明显提高鱼体免疫力和防病抗病能力。预计该产品推广应用后，每亩养殖水面能增产增收鲈鱼100多公斤，亩产增值2400多元。
实施例10：
天然免疫增强剂对梭子蟹的养殖测试
在梭子蟹试验养殖中设置6组池塘，面积为1亩水面，水深1.5米。其中三组池塘为试验组，三组为对照组。试验梭子蟹苗种(规格3厘米-5厘米)8000 个蟹种，试验组梭子蟹试验组每天投喂的饲料中添加有0.15％(重量)实施例3 产品，对照组池塘饲喂不含天然免疫增强剂的梭子蟹配合饲料，连续投喂90天，统计养殖期间梭子蟹的自然发病死亡率和成活率，试验期间不使用抗生素等其它药物。应用试验结果见表5：
表5梭子蟹抗病试验结果
结果显示，使用含天然免疫增强剂的梭子蟹配合饲料养殖梭子蟹，平均成活率达到89.08％，而不使用天然免疫增强剂的对照组养殖梭子蟹，平均成活率为 67.33％。因此，使用天然免疫增强剂的养殖梭子蟹，平均成活率提高21.74％，免疫保护率达到66.57％，成活率明显提高，试验表明天然免疫增强剂能明显提高梭子蟹免疫力和防病抗病能力。预计该产品推广应用后，每亩养殖水面能增产增收梭子蟹100多公斤，亩产增值2400多元。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种水产用的天然免疫增强剂，其特征在于：所述天然免疫增强剂包括由下述方法制备得到的CpG寡核苷酸：将酵母菌体中加入STET缓冲液，依次用溶菌酶和细胞裂解液处理，离心上清加入到异丙醇中沉降，冷冻干燥得到，所述溶菌酶中含有β-环糊精和腺嘌呤核苷。
2.根据权利要求1所述的一种水产用的天然免疫增强剂，其特征在于：所述溶菌酶中含有溶菌酶重量0.3-0.36%的β-环糊精和溶菌酶重量0.012-0.018%的腺嘌呤核苷，溶菌酶添加至其终浓度为80-120μg/mL。
3. 根据权利要求1所述的一种水产用的天然免疫增强剂，其特征在于：所述STET缓冲液的成分为：80g/L蔗糖、2.0%Triton X-100、100 mM EDTA、50mM Tris-Cl，STET缓冲液的pH为8.5。
4. 根据权利要求1所述的一种水产用的天然免疫增强剂，其特征在于：所述细胞裂解液的制备方法为：将15g CTAB先用600mL ddH2O加热溶解，然后加入75mL的浓度为1M、pH为8.0的Tris-HCl溶液、58.5gNaCl、30mL的浓度为0.5M的EDTA溶液，随后定容至1000mL，混合均匀。
5.根据权利要求1所述的一种水产用的天然免疫增强剂，其特征在于：所述天然免疫增强剂包括以下成分及其重量份：CpG寡核苷酸8-10份、富含虾青素红法夫酵母粉5-10份、果寡糖10-20份、甘露寡糖10-20份。
6.一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其特征在于：选择含高免疫活性CpG寡核苷酸的酿酒酵母，活化后进行一级培养、二级培养和发酵罐培养得酵母菌体，然后用酵母菌体制备得CpG寡核苷酸；按配方量取CpG寡核苷酸、富含虾青素红法夫酵母粉、果寡糖、甘露寡糖，混合均匀，即得天然免疫增强剂。
7.根据权利要求6所述的一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述一级种培养物的培养条件为：培养温度为25-30℃、转速为150-250r/min、时间为18-24h，所述二级种的培养条件为：接种量为8-12%（V/V），培养温度为25-30℃、转速为150-250r/min、时间为20-30h。
8.根据权利要求6所述的一种水产用的天然免疫增强剂的制备方法，其特征在于：所述发酵罐培养为：将二级种按8-12%（V/V）的接种量接种到发酵罐中，调节转速和空气流量控制溶氧≥30%，发酵过程中通过流加浓度为18-22%的氨水控制发酵液的pH为4.5-5.5，在25-30℃的条件下培养，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加18-22%甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵45-50h结束，然后在4000-6000r/min的条件下离心15-25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体。
9.一种水产用的天然免疫增强剂的用途，其特征在于：所述天然免疫增强剂应用于水产的饲料中，其添加量为饲料重量的0.05-0.3%。
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