CN102399784A - 一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学，具体的说是一种对虾、蟹等水产养殖动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用。具有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。将富含CpG寡聚核苷酸序列的质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株中，随后进行发酵。收集发酵产物，采用异丙醇沉降法进行CpG ODNs的分离纯化。应用所述序列表SEQ IDNO.1所示的碱基序列CpG寡聚核苷酸可应用于水产养殖饲料添加剂或免疫增强剂，如每千克饲料中添加10-100mg上述CpG寡聚核苷酸可明显促进养殖动物的生长。本发明利用生物工程发酵的技术和简化的提取方法来大量扩增和提取CpG寡聚核苷酸，比实验室条件下更省时省力，效率也更高，便于工业化推广。

Description

一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体的说是一种水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用。

背景技术

随着捕捞资源的急剧衰减，海水养殖已成为国际社会为满足人类日益增长的蛋白质需求普遍采纳的主要举措。根据世界粮农组织(FAO)数据，自2000年以来水产品的增长主要来自海水养殖。近年来，我国的海水养殖业取得了长足发展，一跃进入世界先进行列。按2007我国渔业统计年鉴资料显示，2007年我国水产品总产量4747.52万吨，养殖产量3278.33万吨，占总产量的69％。海水养殖业已成为我国国民经济的重要组成部分，是促进农村经济发展、调整农业产业结构、增加农民就业和收入的有效途径之一，对建设和谐社会具有重要作用。

然而海水养殖业多年来集约式、工厂化的快速发展，引起养殖环境不断恶化，多种养殖品种的病害频繁发生。目前常见病害就有300种以上，涉及的病原种类超过200多种，导致每年约有1/10的养殖面积受到病害侵袭，年损失产量占养殖总产量的15％～30％，直接经济损失上百亿元，并且呈上升趋势。病害频繁发生以及控制难度的增加已经严重影响到农民养殖的积极性。由于安全有效的生物渔药的严重匮乏以及利益驱动，在养殖中普遍存在大量使用化学消毒剂、抗生素、不安全添加剂等不良问题，结果形成了比较严重的药物残留的问题，影响水产品质量的安全，对消费者的健康构成了直接威胁，严重影响到水产品的对外贸易和我国的国际形象。同时还造成了病原微生物耐药性增强及养殖环境恶化。病害已成为当前水产养殖业最为突出和亟待解决的问题，如有关的科学问题不能得到有效的解决，不仅海水养殖业持续发展受到阻碍，而且将直接威胁到现有产业的生存。

为控制病害的频发，新型生物渔药和饲料添加剂的开发显得至关重要。在此方面，研究的主要进展集中于鱼类等的高效疫苗的研制和开发上。疫苗的广泛使用，有效地抵抗了多种重要水产病原的感染，大大减少了抗菌素等药物在养殖鱼类方面的使用量。挪威、美国、加拿大、荷兰等国鱼用疫苗产业化程度高、市场成熟，培育出众多从事鱼用疫苗开发的跨国公司，如Alpharma、Aqua Health、Intervet、Bayotek等。然而虾蟹类无脊椎动物因缺少获得性免疫体统，疫苗是无法应用于这些动物的病害防治，其渔药的制备主要利用生物活体或生物代谢过程中产生的具有生物活性的物质或从生物体提取的物质作为防治水产动物病害的药物。虽然目前通过基因工程、发酵工程、生化制备工程技术等手段，在一些微生态环境改良剂(光合细菌、消化菌、放线菌及其它生物活性剂等)、免疫促进剂(肽聚糖、葡聚糖、多肽等)、抗微生物制剂(干扰素、抗菌肽、凝集素、抗病毒肽、溶菌酶等)、生物防治剂(病毒制剂、噬菌体制剂、微生物制剂等)等的研制方面显示出广阔的应用前景。但整体而言，针对海洋无脊椎动物病害控制的有效药物或饲料添加剂的研究进展仍十分缓慢。

发明内容

本发目的在于提供一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸：特异的免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的制备方法：将人工设计合成的CpG寡聚核苷酸序列与pUC57质粒相连，而后转化入大肠杆菌DH5α菌株中，37℃，200-220rpm震荡培养4-6h；将上述菌液按1∶100的体积比接种与发酵培养基中，发酵培养7-9h；收集富含CpG寡聚核苷酸的发酵培养物于STET缓冲液中悬浮菌体并震荡搅拌，而后在每毫升菌体重悬液中加入80-100μg搅拌均匀于36.5-37.5℃中水浴20-30min，随后将裂解液于沸水浴中加热10-15min，沸水加热后冷却至室温，离心取上清；将上清加入到上清液0.6倍体积的预冷的异丙醇中，室温下沉降离心沉淀，即得具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs。

所述发酵培养基的组成成分：5g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，4g/L KH₂PO₄，4g/L K₂HPO₄，7g/L Na₂HPO₄，1.2g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/LNH₄Cl，加氨苄青霉素至50μg/ml；发酵过程中的补加培养基成分：71g/L酵母提取物，71g/L蛋白胨，170g/L甘油，5.7g/L MgSO₄；

所述STET缓冲液成分：80g/L蔗糖，2.0％(φ)TritonX-100，100mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-Cl，pH8.5。

水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的应用：所述序列表SEQ IDNO.1所示的碱基序列CpG寡聚核苷酸可作为水产养殖饲料的添加剂或免疫增强剂。将上述序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列CpG寡聚核苷酸加入到饲料中，每千克饲料中添加10-100mg上述序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的CpG ODNs寡聚核苷酸。

本发明所具有的优点：

1.从生产效率上讲，本发明利用生物工程发酵的技术来大量扩增目的基序，比实验室条件下更省时省力，效率也更高，便于工业化推广；并且本发明的核酸大量提取实验，费时少，一次至少可提取十升发酵产物，只需约4.5h；

2.从人力资源成本上讲，本发明涉及的核酸大量提取实验，技术简单，非专业人员也可进行操作，节约人力成本，便于工业化推广；

3.从涉及的药品和仪器上讲，本发明涉及的核酸大量提取实验所需要的试剂、仪器和相关设备等均为常规仪器，购买方便。

4.本发明CpG寡聚核苷酸(CpG ODNs)，可增强水产养殖动物的固有免疫反应，从而达到抵御病害的目的，并且本发明的核苷酸产物使用简单，不用经过其他任何处理，即可直接添加入水产养殖的饲料中。

附图说明

图1为本发明异丙醇沉淀前后核酸溶液的紫外扫描图(波长220nm-350nm)，其中A为裂解上清液；B为异丙醇沉降后的上清液；

图2.异丙醇沉降前后对比，其中泳道1为空白对照；泳道2为异丙醇沉降后的上清液；泳道3为异丙醇沉降后的重悬液；泳道4为粗裂解液；M为λ-Hind III digest DNA Marker。

具体实施方式

下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

实验例1

对虾、蟹等水产养殖动物具有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

SEQ ID NO.1

ACCGATGTCGTTGCCGGTGAGGGGGACGATCGTCGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGT

TTCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGTTTCCATGACGTCCCTGATGCTCTCGAGGA

(a)序列特征：

●长度：116bp

●类型：DNA

●链型：双链

(b)分子类型：双链DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工合成

(f)特异性名称：gene

实施例2

1、富含CpG寡聚核苷酸序列(CpG ODNs)的质粒构建和转化

设计五段具有CpG特征的基序，将其首尾相连人工合成(上海生工)，即得一段富含CpG寡聚核苷酸的序列(CpG-ODN)，将合成的CpG-ODN与pUC57质粒(上海生工)相连。随后将重组质粒导入大肠杆菌DH5α菌株中，具体步骤如下所述。重组质粒和大肠杆菌DH5α感受态细胞分别预冷30min后，将5μL质粒加入到感受态细胞中，在42℃中准确热激90s，迅速置于冰上2min。随后加入200μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养45min。取80μL涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上，37℃培养约12h。随机挑取数个单克隆菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养约4-6h。

将上述挑取的单克隆培养物利用载体引物(M13F(-21)5′TGTAAAACGACGGCCAGT3′和M13R 5′CAGGAAACAGCTATGAC3′)进行菌落PCR，筛选阳性克隆，测序验证CpG ODNs序列。

2、CpG寡聚核苷酸序列(CpG ODNs)的大量制备

利用生物工程技术即大规模发酵的方法对重组质粒转化的大肠杆菌菌株DH5α进行扩增。取上述适量菌体接种于1L含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜。随后，将其加入到已加入发酵培养基的发酵罐中发酵。单次发酵总体积约为10L，发酵时间控制在8h左右，发酵时溶氧量在30％以上，pH控制在7.0左右，温度为37℃。

发酵培养基的组成成分：5g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，4g/LKH₂PO₄，4g/L K₂HPO₄，7g/L Na₂HPO₄，1.2g/L(NH₄)₂ SO₄，0.2g/L NH₄Cl，加氨苄青霉素至50μg/ml；发酵过程中补加培养基成分：71g/L酵母提取物，71g/L蛋白胨，170g/L甘油，5.7g/L MgSO₄。

3、CpG寡聚核苷酸序列(CpG ODNs)的分离提纯

收集发酵产物后，利用适量修饰的STET缓冲液悬浮菌体，置于磁力搅拌仪上1000rpm，30min。向菌体重悬液中加入新鲜配制的溶菌酶，保证其终浓度为100μg/mL，搅拌均匀后于37℃中水浴20-30min。随后将裂解液沸水浴中加热约15min，迅速置于冰上冷却至室温。12,000g离心30min，取上清。将上清加入到0.6倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后室温下沉降20min。12,000g离心15min。弃掉上清，无菌水溶解沉淀。冷冻干燥，浓缩即得具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的寡聚核苷酸CpGODNs的提取物。

修饰的STET缓冲液成分：80g/L蔗糖，2.0％(φ)TritonX-100，100mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-Cl，pH8.5。

实施例3

将上述实施例2所得具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs的提取物(CpG ODNs)作为添加剂添加到凡纳滨对虾饲料(饲料成分参见表1)中，将经过28d的养殖，每千克饲料中添加40mg上述序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs时，明显促进对虾的生长，具体情况简表2的添加组的相对增长率和增重率均高于基础饲料组，增长率比基础饲料组高9.7％，增重率比基础饲料高19.4％。

表1  凡纳滨对虾基础饲料组成

表2饲料中添加CpG-ODN对凡纳滨对虾生长的影响

实施例4

将上述所得CpG ODNs作为添加剂添加到河蟹的饲料中，饲料成分如下表3所示，经过28d的养殖，40mg/kg和100mg/kg CpG-ODN添加组的相对增重率均高于基础饲料组，其中40mg/kg CpG-ODN添加组比基础饲料组高59.4％，100mg/kg CpG-ODN添加组比基础饲料组高29.2％见表4。

表3中华绒螯蟹基础饲料组成

表4饲料中添加不同水平CpG-ODN对中华绒螯蟹生长的影响

Claims (5)

1.一种对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸，其特征在于：对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸序列具有序列表SEQ ID N0.1所示的碱基序列。

2.一种按权利要求1所述的对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的制备方法，其特征在于：将人工设计合成的CpG寡聚核苷酸序列与pUC57质粒相连，而后转化入大肠杆菌DH5α菌株中，37℃，200-220rpm震荡培养4-6h；将上述菌液按1∶100的体积比接种与发酵培养基中，发酵培养7-9h；收集富含CpG寡聚核苷酸的发酵培养物于STET缓冲液中悬浮菌体并震荡搅拌，而后在每毫升菌体重悬液中加入80-100μg搅拌均匀于36.5-37.5℃中水浴20-30min，随后将裂解液于沸水浴中加热10-15min，沸水加热后冷却至室温，离心取上清；将上清加入到上清液0.6倍体积的预冷的异丙醇中，室温下沉降离心沉淀，即得具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的寡聚核苷酸CpG ODNs。

3.按权利要求2所述的对水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基的组成成分：5g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，4g/L KH₂PO₄，4g/L K₂HPO₄，7g/L Na₂HPO₄，1.2g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/L NH₄Cl，加氨苄青霉素至50μg/ml；发酵过程中的补加培养基成分：71g/L酵母提取物，71g/L蛋白胨，170g/L甘油，5.7g/L MgSO₄；

所述STET缓冲液成分：80g/L蔗糖，2.0％(φ)TritonX-100，100mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-Cl，pH8.5。

4.一种按权利要求1所述的水产动物有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的应用，其特征在于：所述序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列CpG寡聚核苷酸可作为水产养殖饲料的添加剂或免疫增强剂。

5.按权利要求4所述的具有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸的应用，其特征在于：将上述序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列CpG寡聚核苷酸加入到饲料中，每千克饲料中添加10-100mg上述序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列的CpG ODNs寡聚核苷酸。

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