CN108949598A - 重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法 - Google Patents

重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组鱼类白细胞介素‑2的工程菌及其产物的制备方法，该工程菌的制备方法为：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，提取总mRNAs，再将总mRNAs逆转录成cDNA模版，PCR扩增得白细胞介素‑2基因片段；将IL2序列和pYES2质粒双酶切，回收相应的酶切片段后连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌，筛选，获得重组的IL2‑pYES2质粒；将质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌。有益效果为：本发明工程菌能成功、高效表达出鱼干扰素重组蛋白，工程菌产物‑重组鱼类白细胞介素‑2的产量高，重组白细胞介素‑2基因易于诱导表达且表达稳定性，不需要进行纯化即可应用。

Description

重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法。
背景技术
随着我国渔业生产的迅猛发展，养殖水产动物病害日益突出，病害发生已严重制约水产业健康可持续发展，鱼类抗病毒能为差的问题显现出来，尤其是人工饲养的试验用鱼类其抵抗力较野生型的更低，因此，鱼类免疫学逐渐受到学者和养殖户们的广泛关注。在养殖中发现的多发病如草鱼病毒病（草鱼出血病）、虹蹲病毒病（传染性膜腺坏死病、病毒性出血败血症和传染性造血组织坏死病）、鲤鱼病毒病（鲤春病毒血症、鲤痘疮病和鲤鳃坏死病等）、鳗鲡病毒病（鳗鲡花丛病病毒、鳗鲡弹状病毒和类疮疹病毒等）都是由病毒引起。水环境中存在大量细菌和病毒，与其他脊椎动物相比鱼类更依赖天然免疫防御的保护。此外，长期来，由于缺乏有效的病害防治方法，各种抗生素、杀虫剂广泛使用，造成养殖环境和水产品严重污染，水产食品安全受到严重威胁，同时抗生素产生的耐药性又加剧了水产动物病害的发生。因此，研制开发天然、安全、高效的水产动物病害防治制剂及其相关应用技术是一项十分紧迫的任务。水产养殖品种重要免疫抗病基因的开发利用是从根本上解决水产动物病害防治、保障水产食品安全的最有效途径之一，代表了当前发展绿色和环境友好型水产养殖模式的主要方向。
白细胞介素（Interleukin，IL）是一类由淋巴细胞、单核细胞等产生的重要细胞因子，在调节细胞生长与分化、维持机体免疫功能、参与造血和炎症反应等过程中发挥着极其重要的作用。在白细胞介素中，白细胞介素-2是免疫细胞因子家族中最重要的成员，具有激活T、B淋巴细胞增殖分化，促进巨噬细胞吞噬杀菌以及天然杀伤细胞（NK）和细胞毒效应细胞（TCL）功能，同时还能调节多种免疫因子如干扰素、其它白细胞介素等的表达，具有全面提高机体免疫水平的功能。因此，鱼白细胞介素-2在增强鱼类的免疫功能、抗肿瘤功能和增强造血功能上有重要的应用，将其作为水产动物饲料的添加剂将极大地提高水产动物的产量和质量，同时消除了药物残留，具有天然高效的优点。但是，由于从血液中提取鱼白细胞介素-2的工艺复杂，产量低造成成本较高，难以大规模应用。鉴于国内外大量运用酵母作为真核表达系统来生产鱼白细胞介素-2，而酵母本身是优质的饲料蛋白源，因此通过酵母表达鱼白细胞介素-2并制备成含鱼白细胞介素-2的菌粉饲料添加剂是理想的选择。它可以大幅度降低生产成本，而且操作简便，具有实际应用性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法，工程菌能成功、高效表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白，工程菌产物-重组鱼类白细胞介素-2的产量高，重组鱼类白细胞介素-2基因易于诱导表达且表达稳定性，不需要进行纯化即可应用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
酵母菌种购于上海北诺生物科技有限公司。
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类白细胞介素-2基因的酵母菌。该工程菌含有重组鱼类白细胞介素-2基因的重组质粒，成功表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白，表达量达到酵母菌细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，经实验室内连续传代10次，经PCR检测目的基因仍遗传稳定，经SDS检测外源基因仍能稳定表达。
作为优选，重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，然后用TRizol提取鱼淋巴细胞总mRNAs，再用逆转录试剂盒将总mRNAs进行逆转录成cDNA模版，在反转录反应管中加入TaKaRa ExTaqTM HS和其它PCR反应用试剂合成cDNA的第二链，并进一步进行PCR扩增，即得白细胞介素-2基因片段；
步骤2：将PCR扩增得到的完整IL2序列和pYES2质粒用EcoR I和Xho I双酶切，回收相应的酶切片段后以10:1的量比连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌DH5α，Amp抗性筛选，得到的克隆抽提质粒后酶切鉴定，获得重组的IL2-pYES2质粒，上述pYES2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、GAL1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点以及URA3基因，其中草鱼干扰素基因是目的片段，是pYES2质粒进行外源表达的主要基因，上述外源基因插在pYES2质粒的EcoR I和Xho I酶切位点间，删除片段系多克隆位点内的片段，对质粒扩增、筛选和外源基因的表达无影响，得到的IL2-pYES2为双链闭环的DNA质粒载体，可以在微生物中繁殖，用PCR和Western-blot能够确定目的基因的存在，分析目的基因的表达情况；
步骤3：将IL2-pYES2质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌，上述酵母工程菌含有重组鱼类白细胞介素-2基因的重组IL2-pYES2质粒，成功表达出重组鱼类白细胞介素-2，表达量达到酵母细胞总蛋白的20%以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，连续传代10次，经PCR检测目的基因仍遗传稳定，经SDS检测外源基因仍能稳定表达。
进一步优选，步骤1中丝裂原诱导的具体步骤为：采用51%的percoll在1000-2000rpm的条件下离心15-25min，然后用Hanks洗2-3遍，用L-15培养液稀释至每毫升五千万个细胞，取3μl培养于25ml的培养瓶中，加入ConA或PHA-P，使其最终浓度分别为2-20μg/ml，然后再加入PMA，使其最终浓度为40-60μg/ml，在25-30℃下培养12-15h，即可。上述草鱼头肾淋巴细胞经ConA和PMA或PHA-P和PMA诱导后收集的培养上清中，含有能够明显促进丝裂原激活的淋巴母细胞增殖的物质，即IL-2，为进一步分离mRNA、克隆草鱼IL-21 cDNA基因提供了依据。
进一步优选，步骤1中PCR扩增用上游引物为：5’-ATGTACAGCATGCAGCT-3’，下游引物为：5’-AGTTGAGATGATGACCTGAC-3’；PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5ul、dNTPMixture(各2.5mM) 4ul、TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0.6ul、模板DNA 2ul、上游引物(20uM)1ul、上游引物 (20uM) 1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其具体步骤为：
摇瓶培养：将活化后的工程菌接种至YPD种子培养基中，在温度为28-32℃、转速为200-300r/min的条件下培养10-14h得一级种培养物，然后将一级种培养物按8-12%（V/V）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为200-300r/min的条件下培养10-14h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；
发酵罐培养：将二级种按8-12%（V/V）的接种量接种到发酵罐中，在28-32℃的条件下培养至OD600达到0.55-0.62，加入诱导终浓度为0.58-0.62mmol/L的IPTG，然后在20-30℃、200-300rpm的条件下诱导培养3-5h，然后在4000-6000r/min的条件下离心15-25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到酵母菌体，同时可诱导外源基因鱼干扰素重组蛋白的表达，使其表达量增高，产物稳定，易纯化；
产物制备：将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物，该产物不存在活的酵母菌，无致病性，不产生有毒物质，对环境安全性无影响，产物有效成分为表达的重组鱼类白细胞介素-2，所表达的重组鱼类白细胞介素-2具有效率高、成本低的优点，所获的工程菌产物可作为抗病饲料添加剂，能提高水产动物的抗病功能和肉质，对渔业病害防治中逐步替代抗生素、保证水产食品和养殖环境安全等具有重要意义。
作为优选，发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖90-110份、酵母粉25-35份、蛋白胨4-6份、尿素13-16份、麦芽汁2-4份、天门冬氨酸0.12-0.2份、KH2PO4 3-5份、K2HPO4·3H2O 2-3份、MgSO4·7H2O 0.08-0.12份、ZnSO4·7H2O 0.002-0.003份、MnSO4·4H2O 0.01-0.015份、生物素0.003-0.005份。上述天门冬氨酸中含有0.32-0.42%的右旋天门冬氨酸，上述天门冬氨酸能够和培养基的其他成分起到协同作用，使得发酵培养基的pH能够得到控制，为工程菌提供最佳的生存环境，保证工程菌的快速繁殖，缩短进入到对数期的时长，提高重组鱼类白细胞介素-2的产量，同时可增强重组鱼类白细胞介素-2基因对诱导物IPTG的敏感性，使重组鱼类白细胞介素-2基因易于诱导表达，降低诱导表达的时间，避免IL2基因出现漂移现象，在工程菌中连续传代10代以上仍能检测到目的基因及其表达产物，提高IL2基因的表达稳定性，上述发酵培养基各成分有相互协同作用，不仅能充分提供酵母工程菌发酵所需的碳源、氮源及各种生长因子，还能提高酵母工程菌的IL2基因表达量，最终提高产物的产量，且产物不需要进行纯化即可应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：1）本发明将鱼淋巴细胞的分离、丝裂原诱导后克隆出白细胞介素-2基因IL2，将其克隆入表达质粒pYES2，得到重组表达质粒IL2-pYES2，再通过电转化法导入酵母菌，成功表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白；2）本发明工程菌是一种稳定的微生物，成功表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，遗传性状非常稳定，连续传代10次外源基因仍能稳定表达；3）该工程菌发酵容易，工程菌产物-重组鱼类白细胞介素-2的产量高、成本低，可作为抗病饲料添加剂，能提高水产动物的抗病功能和肉质。
附图说明
图1是是诱导组RT-PCR产物电泳图；
图2是重组质粒IL2-pYES2的酶切图；
图3是工程菌诱导表达的SDS-PAGE分析图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类白细胞介素-2基因的酵母菌。该工程菌含有重组鱼类白细胞介素-2基因的重组质粒，成功表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白，表达量达到酵母菌细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，经实验室内连续传代10次，经PCR检测目的基因仍遗传稳定，经SDS检测外源基因仍能稳定表达。
上述重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，然后用TRizol提取鱼淋巴细胞总mRNAs，再用逆转录试剂盒将总mRNAs进行逆转录成cDNA模版，在反转录反应管中加入TaKaRa ExTaqTM HS和其它PCR反应用试剂合成cDNA的第二链，并进一步进行PCR扩增，即得白细胞介素-2基因片段；
步骤2：将PCR扩增得到的完整IL2序列和pYES2质粒用EcoR I和Xho I双酶切，回收相应的酶切片段后以10:1的量比连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌DH5α，Amp抗性筛选，得到的克隆抽提质粒后酶切鉴定，获得重组的IL2-pYES2质粒，上述pYES2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、GAL1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点以及URA3基因，其中草鱼干扰素基因是目的片段，是pYES2质粒进行外源表达的主要基因，上述外源基因插在pYES2质粒的EcoR I和Xho I酶切位点间，删除片段系多克隆位点内的片段，对质粒扩增、筛选和外源基因的表达无影响，得到的IL2-pYES2为双链闭环的DNA质粒载体，可以在微生物中繁殖，用PCR和Western-blot能够确定目的基因的存在，分析目的基因的表达情况；
步骤3：将IL2-pYES2质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌，上述酵母工程菌含有重组鱼类白细胞介素-2基因的重组IL2-pYES2质粒，成功表达出重组鱼类白细胞介素-2，表达量达到酵母细胞总蛋白的20%以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，连续传代10次，经PCR检测目的基因仍遗传稳定，经SDS检测外源基因仍能稳定表达。
步骤1中丝裂原诱导的具体步骤为：采用51%的percoll在2000rpm的条件下离心15min，然后用Hanks洗3遍，用L-15培养液稀释至每毫升五千万个细胞，取3μl培养于25ml的培养瓶中，加入ConA或PHA-P，使其最终浓度分别为8μg/ml，然后再加入PMA，使其最终浓度为60μg/ml，在25℃下培养15h，即可。上述草鱼头肾淋巴细胞经ConA和PMA或PHA-P和PMA诱导后收集的培养上清中，含有能够明显促进丝裂原激活的淋巴母细胞增殖的物质，即IL-2，为进一步分离mRNA、克隆草鱼IL-21 cDNA基因提供了依据。
步骤1中PCR扩增用上游引物为：5’-ATGTACAGCATGCAGCT-3’，下游引物为：5’-AGTTGAGATGATGACCTGAC-3’；PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5ul、dNTP Mixture(各2.5mM) 4ul、TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0.6ul、模板DNA 2ul、上游引物(20uM) 1ul、上游引物(20uM) 1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其具体步骤为：
1）摇瓶培养：将活化后的工程菌接种至YPD种子培养基中，在温度为28℃、转速为300r/min的条件下培养10h得一级种培养物，然后将一级种培养物按12%（V/V）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28℃、转速为300r/min的条件下培养10h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；
2）发酵罐培养：将二级种按12%（V/V）的接种量接种到发酵罐中，在28℃的条件下培养至OD600达到0.6，加入诱导终浓度为0.6mmol/L的IPTG，25℃、250rpm诱导培养5h，然后在4000r/min的条件下离心25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到酵母菌体，同时可诱导外源基因鱼干扰素重组蛋白的表达，使其表达量增高，产物稳定，易纯化；
3）产物制备：将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物，该产物不存在活的酵母菌，无致病性，不产生有毒物质，对环境安全性无影响，产物有效成分为表达的重组鱼类白细胞介素-2，所表达的重组鱼类白细胞介素-2具有效率高、成本低的优点，所获的工程菌产物可作为抗病饲料添加剂，能提高水产动物的抗病功能和肉质，对渔业病害防治中逐步替代抗生素、保证水产食品和养殖环境安全等具有重要意义。
上述发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖90份、酵母粉35份、蛋白胨4份、尿素16份、麦芽汁2份、天门冬氨酸0.2份、KH2PO4 3份、K2HPO4·3H2O 3份、MgSO4·7H2O 0.08份、ZnSO4·7H2O 0.003份、MnSO4·4H2O 0.01份、生物素0.005份。上述天门冬氨酸中含有0.32%的右旋天门冬氨酸，上述天门冬氨酸能够和培养基的其他成分起到协同作用，使得发酵培养基的pH能够得到控制，为工程菌提供最佳的生存环境，保证工程菌的快速繁殖，缩短进入到对数期的时长，提高重组鱼类白细胞介素-2的产量，同时可增强重组鱼类白细胞介素-2基因对诱导物IPTG的敏感性，使重组鱼类白细胞介素-2基因易于诱导表达，降低诱导表达的时间，避免IL2基因出现漂移现象，在工程菌中连续传代10代以上仍能检测到目的基因及其表达产物，提高IL2基因的表达稳定性，上述发酵培养基各成分有相互协同作用，不仅能充分提供酵母工程菌发酵所需的碳源、氮源及各种生长因子，还能提高酵母工程菌的IL2基因表达量，最终提高产物的产量，且产物不需要进行纯化即可应用。
实施例2：
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类白细胞介素-2基因的酵母菌。
上述重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，然后用TRizol提取鱼淋巴细胞总mRNAs，再用逆转录试剂盒将总mRNAs进行逆转录成cDNA模版，在反转录反应管中加入TaKaRa ExTaqTM HS和其它PCR反应用试剂合成cDNA的第二链，并进一步进行PCR扩增，即得白细胞介素-2基因片段，对提取的模板做RT-PCR，结果如图1，图中0为阴性对照，1为ConA＋PMA cDNA做模板，2为PHA-P＋PMA cDNA做模板，M为PCR Marker，从图1可见，不管是ConA还是PHA-P协同PMA诱导后，都能扩增出特异性的目的条带，与PCR Marker对比分析测得片断大小为500bp左右，与人和其他高等脊椎动物的IL-21 cDNA基因片断长度相差不大，而且两种模板扩增产物的片断大小一致；
步骤2：将PCR扩增得到的完整IL2序列和pYES2质粒用EcoR I和Xho I双酶切，回收相应的酶切片段后以10:1的量比连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌DH5α，Amp抗性筛选，得到的克隆抽提质粒后酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，获得重组的IL2-pYES2质粒，由图2可知，质粒IL2-pYES2出现500bp的条带，证明得到插入方向正确的重组表达质粒，含完整的IL2基因；
步骤3：将IL2-pYES2质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌。
步骤1中丝裂原诱导的具体步骤为：采用51%的percoll在1500rpm的条件下离心20min，然后用Hanks洗2遍，用L-15培养液稀释至每毫升五千万个细胞，取3μl培养于25ml的培养瓶中，加入ConA或PHA-P，使其最终浓度分别为5μg/ml，然后再加入PMA，使其最终浓度为50μg/ml，在27℃下培养14h，即可。
步骤1中PCR扩增用上游引物为：5’-ATGTACAGCATGCAGCT-3’，下游引物为：5’-AGTTGAGATGATGACCTGAC-3’；PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5ul、dNTP Mixture(各2.5mM) 4ul、TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0.6ul、模板DNA 2ul、上游引物(20uM) 1ul、上游引物(20uM) 1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其具体步骤为：
1）摇瓶培养：将活化后的工程菌接种至YPD种子培养基中，在温度为30℃、转速为250r/min的条件下培养12h得一级种培养物，然后将一级种培养物按10%（V/V）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为250r/min的条件下培养12h，即得二级种，备用；
2）发酵罐培养：将二级种按10%（V/V）的接种量接种到发酵罐中，在30℃的条件下培养至OD600达到0.6，加入诱导终浓度为0.6mmol/L的IPTG，25℃、250rpm诱导培养4h，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测表达产物，电泳结果如图3所示，然后在5000r/min的条件下离心20min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，图3中1为：未诱导对照，2为：诱导3h菌体，3为：诱导5h菌体，M为：低分子量标准蛋白，从图3中可以看出，与未诱导对照相比，表达菌经IPTG诱导后，在分子量为21kD附近都出现特异性的表达产物条带，表明重组IL2基因在酵母菌中得到了表达，且IPTG诱导时间对表达产物量影响没有明显得差异；
3）产物制备：将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物。
上述发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖100份、酵母粉30份、蛋白胨5份、尿素15份、麦芽汁3份、天门冬氨酸0.16份、KH2PO4 4份、K2HPO4·3H2O 2.5份、MgSO4·7H2O 0.1份、ZnSO4·7H2O 0.0025份、MnSO4·4H2O 0.0125份、生物素0.004份。上述天门冬氨酸中含有0.35%的右旋天门冬氨酸。
重组鱼类白细胞介素-2在酵母细胞中的表达量达到26.7%，活性达到105U/mg蛋白。
实施例3：
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备，进一步优化步骤为：
步骤1：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，然后用TRizol提取鱼淋巴细胞总mRNAs，再用逆转录试剂盒将总mRNAs进行逆转录成cDNA模版，在反转录反应管中加入TaKaRa ExTaqTM HS和其它PCR反应用试剂合成cDNA的第二链，并进一步进行PCR扩增，即得白细胞介素-2基因片段，对提取的模板做RT-PCR，结果如图1，图中0为阴性对照，1为ConA＋PMA cDNA做模板，2为PHA-P＋PMA cDNA做模板，M为PCR Marker，从图1可见，不管是ConA还是PHA-P协同PMA诱导后，都能扩增出特异性的目的条带，与PCR Marker对比分析测得片断大小为500bp左右，与人和其他高等脊椎动物的IL-21 cDNA基因片断长度相差不大，而且两种模板扩增产物的片断大小一致；
步骤2：将PCR扩增得到的完整IL2序列和pYES2质粒用EcoR I和Xho I双酶切，回收相应的酶切片段后以10:1的量比连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌DH5α，Amp抗性筛选，得到的克隆抽提质粒后酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，获得重组的IL2-pYES2质粒，由图2可知，质粒IL2-pYES2出现500bp的条带，证明得到插入方向正确的重组表达质粒，含完整的IL2基因；
步骤3：将IL2-pYES2质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌。
步骤1中丝裂原诱导的具体步骤为：采用51%的percoll在1500rpm的条件下离心20min，然后用Hanks洗2遍，用L-15培养液稀释至每毫升五千万个细胞，取3μl培养于25ml的培养瓶中，加入ConA或PHA-P，使其最终浓度分别为5μg/ml，然后再加入PMA，使其最终浓度为50μg/ml，在27℃下培养14h，即可。
步骤1中PCR扩增用上游引物为：5’-ATGTACAGCATGCAGCT-3’，下游引物为：5’-AGTTGAGATGATGACCTGAC-3’；PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5ul、dNTP Mixture(各2.5mM) 4ul、TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0.6ul、模板DNA 2ul、上游引物(20uM) 1ul、上游引物(20uM) 1ul、N,N-二甲基乙酰胺0.01ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.003ul、灭菌蒸馏水加至50ul，PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。该PCR反应体系中N,N-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够破坏DNA分子内碱基对之间的氢键，缩短DNA序列的变性时间，降低对酶活性的损害，最大限度地激活Taq DNA聚合酶的催化活性，进而提高聚合酶的延伸速率，从而有效扩增DNA片段，同时能够避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构，避免非特异扩增，提高PCR扩增产物的得率和稳定性，进而保证工程菌能成功、高效表达出鱼白介素-2重组蛋白。
重组鱼类白细胞介素-2在酵母细胞中的表达量达到28.2%，活性达到111U/mg蛋白。
实施例4：
重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法用发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖100份、酵母粉30份、蛋白胨5份、尿素15份、麦芽汁3份、KH2PO4 4份、K2HPO4·3H2O 2.5份、MgSO4·7H2O 0.1份、ZnSO4·7H2O 0.0025份、MnSO4·4H2O 0.0125份、生物素0.004份。其余条件和实施例2完全一致。
重组鱼类白细胞介素-2在酵母细胞中的表达量达到26.7%，活性达到93U/mg蛋白。
由实施例2和实施例4可知，发酵培养基中天门冬氨酸的加入能够提高重组鱼类白细胞介素-2的产量；由实施例2和实施例4可知，PCR反应体系中N,N-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够提高鱼白介素-2重组蛋白的表达量和产量。
实施例5：
工程菌产物在鲈鱼养殖中的应用
试验在6-9月份进行，将养殖鲈鱼网箱分成6组，3组网箱为试验组，3组为对照组，试验组使用含实施例2工程菌产物的饲料（每公斤饲料添加含工程菌产物60mg）投喂，对照组投喂等量空白饲料，连续投喂8周，统计自然发病死亡率，计算相成活率和平均成活率，结果如表1所示。
表1 工程菌产物在鲈鱼养殖中的应用试验结果
由表1可知，试验组组鲈鱼的病害发生率显著下降，成活率和平均成活率均高于对照组，表明饲喂实施例2工程菌产物能增强鲈鱼防病抗病能力，最终提高鲈鱼的成活率。
实施例6：
工程菌产物在甲鱼养殖中的应用
试验在6-9月份进行，在四幢甲鱼小温室进行饲养试验，其中三幢为试验组，一幢为对照组，试验组使用含实施例3工程菌产物的饲料（每公斤饲料添加8%）投喂，对照组投喂等量空白饲料，连续投喂65天，统计自然发病死亡率，计算相对免疫保护率，结果如表2所示。
表2 工程菌产物在甲鱼养殖中的应用试验结果
由表2可知，试验组组甲鱼的成活率提高了13.42%(周期)，饲料系数下降13%，饲料转化率提高19.28%，增重率提高了10.16%，减少换水次数，降低成本10%以上，总体经济效益提高20%以上，说明饲喂实施例2工程菌产物能促甲鱼的生长，提高免疫力和抗病防病作用明显。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.重组鱼类白细胞介素-2的工程菌，其特征在于：所述工程菌是具有重组鱼类白细胞介素-2基因的酵母菌。
2.重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法，其特征在于：所述制备方法为：
步骤1：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，提取鱼淋巴细胞总mRNAs，逆转录成cDNA模版，并进一步进行PCR扩增，即得白细胞介素-2基因片段；
步骤2：将PCR扩增得到的完整IL2序列和pYES2质粒用EcoRI和XhoI双酶切，回收相应的酶切片段后连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌，筛选，获得重组的IL2-pYES2质粒；
步骤3：将IL2-pYES2质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌。
3.根据权利要求2所述的重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法，其特征在于：所述步骤1中丝裂原诱导的具体步骤为：采用51%的percoll离心，用L-15培养液稀释至每毫升五千万个细胞，取3μl培养于25ml的培养瓶中，加入ConA或PHA-P，使其最终浓度分别为2-20μg/ml，然后再加入PMA，使其最终浓度为40-60μg/ml，在25-30℃下培养12-15h，即可。
4.根据权利要求2所述的重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法，其特征在于：所述步骤1中PCR扩增用上游引物为：5’-ATGTACAGCATGCAGCT-3’，下游引物为：5’-AGTTGAGATGATGACCTGAC-3’，PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5ul、dNTP Mixture(各2.5mM) 4ul、TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0.6ul、模板DNA 2ul、上游引物(20uM) 1ul、上游引物(20uM) 1ul、灭菌蒸馏水加至50ul；PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。
5.根据权利要求2所述的重组鱼类白细胞介素-2的工程菌的制备方法，其特征在于：所述步骤2中IL2基因和载体的连接量比为10:1。
6.重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，包括摇瓶培养、发酵罐培养、产物制备，其特征在于：所述制备方法为：将活化后的工程菌进行一级培养、二级培养和发酵罐培养得酵母菌体，然后将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物，所述发酵罐培养用培养基中含有天门冬氨酸。
7.根据权利要求6所述的重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述天门冬氨酸中含有0.32-0.42%的右旋天门冬氨酸。
8.根据权利要求6所述的重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖90-110份、酵母粉25-35份、蛋白胨4-6份、尿素13-16份、麦芽汁2-4份、天门冬氨酸0.12-0.2份、KH2PO4 3-5份、K2HPO4·3H2O 2-3份、MgSO4·7H2O 0.08-0.12份、ZnSO4·7H2O 0.002-0.003份、MnSO4·4H2O 0.01-0.015份、生物素0.003-0.005份。
9.根据权利要求6所述的重组鱼类白细胞介素-2的工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述发酵罐培养步骤为：将二级种按8-12%（V/V）的接种量接种到发酵罐中，在28-32℃的条件下培养至OD600达到0.55-0.62，加入诱导终浓度为0.58-0.62mmol/L的IPTG，然后在20-30℃、200-300rpm的条件下诱导培养3-5h，离心后收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体。
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