CN104178494A - 一种人白介素2的制备工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程法制备蛋白领域，具体涉及一种白介素2的制备工艺及其应用。本发明采用基因工程的方法，人工合成表达人IL-2蛋白的重组基因EK-IL2，将该重组基因序列插入载体，转化宿主细胞，通过发酵工艺的设计，分离、酶切、纯化等步骤的组合，最终获得纯化的人IL-2蛋白。获得的人IL-2蛋白活性好，产量高；人IL-2蛋白的制备工艺简单、安全，成本低，利于人IL-2蛋白的工业大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程法制备蛋白领域，具体涉及一种白介素2的制备工艺及其应用。
背景技术
1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养，称为T细胞生长因子(T cell growthfactor，TCGF)，1979年统一命名为白介素2(interleukin2，IL-2)。
白介素-2是白细胞介素中的一种。其为多细胞来源，主要由活化T细胞产生，是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类最有力的T细胞生长因子，属于Th1型细胞因子。白介素-2是具有多向性作用的细胞因子，主要起促进淋巴细胞生长、增殖、分化的作用，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗中具有重要作用。
人白细胞介素2（白介素-2，IL-2）可促进其他细胞因子的分泌以及刺激T细胞在体外的生长。在免疫应答系统中起着极其重要的调节作用，是一种天然的免疫增强佐剂和治疗剂；白介素2可以提高人体对病毒、细菌、真菌、原虫等感染的免疫应答，使细胞毒性T淋巴细胞（CTL)、天然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等；白介素2还可以增加抗体和干扰素(IFN)等细胞因子的分泌，在机体免疫应答中具有非常重要的作用，作为一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。
自1983年人类IL-2基因被首次克隆和测序以来，目前已有几十个物种的IL-2基因被发现。现有技术已经利用基因重组技术，分别在大肠杆菌、酵母、猴COS细胞和昆虫细胞中表达了有活性的IL-2，目前人IL-2已经全部采用基因工程的方法生产，并且IL-2融合蛋白也是IL-2研究的热门方向。
人们对白介素2的研究已经有30多年的历史了，白介素2仍然是目前研究最多的细胞因子之一，白细胞介素2的工业化生产也需要随着IL-2临床应用及医药用途的发展进一步发展和提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、产量高，有利于大规模生产的利用基因工程的方法制备人白介素2的生产新工艺。本发明利用基因工程的方法，人工合成表达人IL-2蛋白的重组基因EK-IL2，将该重组基因序列插入表达载体，转化宿主细胞，通过发酵，分离、酶切、纯化等步骤获得人IL-2蛋白。
本发明首先公开了一种人IL-2蛋白的制备工艺，具体步骤如下：
1）重组质粒的构建：合成表达人IL-2蛋白的重组基因EK-IL2，将重组基因EK-IL2片段插入载体，获得含有人IL-2蛋白表达序列的重组质粒；所述重组基因EK-IL2片段序列5’至3’方向依次含有Kpn I酶的限制性酶切位点序列、肠激酶识别位点序列、人IL-2蛋白基因序列和BamH I酶的限制性酶切位点序列；
2）基因工程菌的制备：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌；
3）外源基因的表达：基因工程菌发酵表达Trx-IL2融合蛋白；
4）目的蛋白的纯化：裂解菌体，收集Trx-IL2融合蛋白，并通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得人IL-2蛋白产品。
较优的，步骤1）所述肠激酶识别位点的氨基酸序列为：DDDDK（SEQ ID NO:1）；所述肠激酶识别位点的核苷酸序列为：5’-GACGACGACGACAAG-3’（SEQ ID NO:2）。
较优的，步骤1）所述人IL-2蛋白的氨基酸序列为：myrmqllsci alslalvtns aptssstkktqlqlehllld lqmilnginn yknpkltrml tfkfympkka telkhlqcle eelkpleevl nlaqsknfhlrprdlisnin vivlelkgse ttfmceyade tativeflnr witfcqsiis tlt（SEQ ID NO:3）。
更优的，步骤1）所述合成的表达人IL-2蛋白的重组基因EK-IL2的序列如SEQ ID NO:4所示。
较优的，步骤1）所述载体为pET32a(+)。
将本发明所述重组基因EK-IL2插入到pET32a(+)的Kpn I酶和BamH I酶的酶切位点之间，与硫氧还蛋白（TrxA）融合表达，表达包含标签蛋白、肠激酶识别位点和人IL-2蛋白的融合蛋白，便于目的蛋白的分离纯化。
较优的，步骤2）所述宿主细胞为大肠杆菌。
更优的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL2l(DE3)。
较优的，步骤3）所述基因工程菌的发酵方法如下：
a.种子的活化：挑取斜面种子，接种于添加了80～120ug/ml氨苄青酶素的一级种子培养基中，35～38℃，180～300rpm摇瓶培养4～12小时，获得一级种子液；所述一级种子培养基的组成为：NH4Cl0.8～1.2g/L，MgSO480～120mg/L，CaCl24.2～5.6g/L，NaCl8～11.5g/L，蛋白胨12～13g/L，酵母膏4～5.5g/L，乳糖4.5～5.5g/L，其余为水；
b.种子的扩大培养：取一级种子液，按5～10％接种量接种于添加了80～120ug/ml氨苄青酶素的二级种子培养基中，35～38℃，180～250rpm摇瓶培养4～10小时，获得二级种子液；所述二级种子培养基的组成为：MgSO445～55mg/L，NaCl8～12g/L，MnSO46.4～6.8mg/L，H3BO31.0～2.5mg/L，烟酸0.3～0.5mg/L，维生素B10.1～0.2mg/L，柠檬酸1.5～2.5mg/L，蛋白胨10～15g/L，酵母膏5～10g/L，葡萄糖5～10g/L，甘油2～3g/L，其余为水；
c.发酵罐发酵：将二种子液按5～8％接种量加入不含葡萄糖的发酵培养基中，35～38℃发酵培养4～8h，控制pH值在7.0～7.2，转速180～220rpm；再向培养基中添加葡糖糖，由通气和搅拌速度控制溶氧在30％以上，35～37℃培养6～8h；最后加入IPTG至终浓度为0.45～0.55mM，诱导3～5小时收菌；所述发酵培养基的组成为：蛋白胨10～18g/L，酵母膏12.5～20g/L，葡萄糖3～7/L，甘油2～3g/L，KH2PO41.5～4.5g/L，pH值7.0～7.2，其余为水。
优选的，步骤a为：挑取2～3环斜面种子，接种于添加了100ug/ml氨苄青酶素的一级种子培养基中，37℃，250rpm摇瓶培养6小时，获得一级种子液。
较优的，所述一级种子培养基的组成为：NH4Cl1.0g/L，MgSO4100mg/L，CaCl25g/L，NaCl10g/L，蛋白胨12.5g/L，酵母膏5g/L，乳糖5g/L，其余为水。
优选的，步骤b为：取一级种子液，按8％接种量接种于添加了100ug/ml氨苄青酶素的二级种子培养基中，37℃，200rpm摇瓶培养6小时，获得二级种子液。
较优的，所述二级种子培养基的组成为：MgSO450mg/L，NaCl10g/L，MnSO46.6mg/L，H3BO31.5mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素B10.1mg/L，柠檬酸2.0mg/L，蛋白胨12.5g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖7.5g/L，甘油3g/L，其余为水。
较优的，步骤c为：将二种子液按6％接种量加入不含葡萄糖的发酵培养基中，37℃发酵培养6h，控制pH值在7.0～7.2，转速200rpm；再向培养基中添加葡糖糖，由通气和搅拌速度控制溶氧在40～55%，37℃培养8h；最后加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导4.0小时收菌
较优的，所述发酵培养基的组成为：蛋白胨12.5g/L，酵母膏15g/L，葡萄糖5g/L，甘油3g/L，KH2PO43g/L，pH值7.0～7.2，其余为水。
较优的，步骤4）所述融合蛋白的酶切、纯化步骤具体如下：
A.第一步亲和层析：Chelating Sepharose F.F.层析柱初步分离Trx-IL2融合蛋白；
B.酶解融合蛋白：用肠激酶酶切前一步骤获得的分离的Trx-IL2融合蛋白，获得酶解液；
C.第二步亲和层析：XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲和柱，纯化前一步骤所得的酶解液，分离得到纯化的人IL-2蛋白。
较佳的，所述步骤A第一步亲和层析具体为：先用含25～35mM咪唑、300～600mMNaCl，pH值7.5±0.5，25～35mM的Tris-HCL缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；采用菌体裂解处理后得到的上清液配置含有25～35mM咪唑、300～600mMNaCl，pH值7.5±0.5的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min，用5～6倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含200～250mM咪唑、300～600mM NaCl，pH值7.5±0.5，浓度为20～25mM的Tris-HCL缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
更佳的，所述步骤A为：先用含30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的Tris-HCL缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；采用菌体裂解处理后得到的上清液配置含有30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min，用5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含250mM咪唑、500mMNaCl，pH值7.5±0.5，浓度为20mM的Tris-HCL缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
较佳的，所述步骤B酶解融合蛋白具体为：将第一步收集的活性蛋白峰流出液稀释5～10倍后，用肠激酶进行处理，获得酶解液；加入的肠激酶与融合蛋白的质量比为1：500～2000，酶解反应温度为12～16℃，酶切16～20小时。
融合蛋白的重量可通过考马氏亮蓝染色法（Bradford法）测定流出液的浓度来进行换算。
较佳的，所述步骤C亲和层析具体为：采用XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲和柱，上样缓冲液用18～22mmol/L Tris-HCL，pH值7.5±0.5，洗脱缓冲液为18～22mmol/L Tris-HCL，15～25mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上样缓冲液流洗，待流穿风出现并洗至基线后，30min，0-50%梯度洗脱，收集流穿组分，即为纯化的IL-2蛋白。
更佳的，所述步骤C为：采用XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲和柱，上样缓冲液用20mmol/L Tris-HCL，pH值7.5±0.5，洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCL，20mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上样缓冲液流洗，待流穿风出现并洗至基线后，30min，0-50%梯度洗脱，收集流穿组分，即为纯化的IL-2蛋白。
本发明基因工程的方法制备的基因工程菌，配合本发明的发酵方法以及纯化法，最终获得的人IL-2蛋白纯度可达95%，目标蛋白的回收率在72%左右。
本发明其次还公开了前述制备工艺制备人IL-2蛋白的应用。
本发明的有益效果为：采用大肠杆菌作为宿主，表达Trx标签融合的IL-2蛋白，经肠激酶切除标签以及一系列纯化，最终得到HPLC纯度高达95%的人IL-2蛋白，并且制备获得的人IL-2蛋白活性好，产量高。本发明技术方案简单、安全，填补了IL-2蛋白生产工艺的欠缺，利于人IL-2蛋白的工业大规模生产。
附图说明
图1：pET-32a(+)载体物理图谱
图2：重组质粒的酶切电泳图谱
图3：融合蛋白Trx-IL2在基因工程菌内表达的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：融合蛋白）
图4：融合蛋白Trx-IL2经肠激酶酶切后的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：肠激酶酶切16小时后）
图5：纯化后的IL-2蛋白的SDS-PAGE电泳分析（M：标准蛋白质分子量；1：纯化后的IL-2蛋白）
具体实施方式
本发明利用基因工程的方法，人工合成表达白介素2蛋白的重组基因EK-IL2，将该重组基因序列插入表达载体，转化宿主细胞，通过发酵工艺，分离纯化等步骤获得白细胞介素2蛋白。
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明的保护范围。
实施例1基因工程菌的制备
1.重组基因EK-IL2的人工合成
重组基因EK-IL2全序列由上海生工生物工程公司合成，所述重组基因EK-IL2的基因序列包括靠近5’端的肠激酶（EK）识别位点序列（SEQ ID NO:2）、靠近3’端的人IL-2蛋白基因序列（SEQ ID NO:3，GenBank:AAH66255.1）以及重组基因EK-IL2序列两端的Kpn I酶和BamH I酶的酶切位点序列。Kpn I和BamH I酶切位点用于重组质粒的构建；人工合成的重组基因EK-IL2序列如SEQ ID NO：4所示。
2.重组质粒的构建
1）表达载体的构建：将人工合成的重组基因EK-IL2片段经Kpn I/BamH I双酶切后克隆于经Kpn I/BamH I双酶切的pET32a(+)载体中，进行连接反应，连接反应条件为：T4DNA连接酶（Promega公司），2～16℃，1～30小时，构建得到连接产物。
2）连接产物的鉴定：将上一步获得的重组质粒通过CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化DH5α菌，Amp抗性筛选阳性克隆，对阳性克隆进行酶切鉴定，采用Kpn I和BamH I双酶切，酶切鉴定结果如图2所示（Mark为分子量标准，1泳道为重组质粒双酶切产物），酶切出的大片段和小片段分别与载体及目的片段的大小相符；将酶切片段进行序列分析，结果表明：目的片段中含有的DNA序列与文献报道的人IL-2基因序列一致，与及实验设计也完全一致，构建成功的重组质粒为重组质粒pET32a(+)-IL2。
3.基因工程菌的制备
1）构建基因工程菌：
将构建成功的重组质粒pET32a(+)-IL2以CaCl2法（分子克隆实验指南，第二版，科学出版社）转化受体菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆。选择表达相对最高的一株作为融合蛋白表达的工程菌pET32a(+)-IL2/BL21(DE3)。
2）鉴定表达产物：
将经筛选的重组工程菌pET32a(+)-IL2/BL21(DE3)划线在含100ul/ml氨苄青酶素的LB琼脂平板上，37℃培养17小时。挑选生长良好的单菌落，接种于LB培养液（含Ampl00ug/ml），37℃培养过夜。将过夜菌以2%接种量接种于50ml LB培养液中（含Ampl00ug/ml），37℃振荡培养。当OD600达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导4小时。菌液经5000rpm，5min离心，去培养基上清，沉淀菌体加入上样缓冲液，100℃水浴3min，离心后上SDS-PAGE电泳（积层胶4％，分离胶15％），染色，脱色，扫描分析；SDS-PAGE结果表明：在33KD和45KD之间有明显表达条带，与预期相符，融合蛋白占菌体总蛋白的31％左右。
实施例2发酵表达融合蛋白
1.培养基
一级种子培养基：NH4Cl1.0g/L，MgSO4100mg/L，CaCl25g/L，NaCl10g/L，蛋白胨12.5g/L，酵母膏5g/L，乳糖5g/L，其余为水。
二级种子培养基：MgSO450mg/L，NaCl10g/L，MnSO46.6mg/L，H3BO31.5mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素B10.1mg/L，柠檬酸2.0mg/L，蛋白胨12.5g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖5g/L，甘油3g/L，其余为水。
发酵培养基：蛋白胨12.5g/L，酵母膏15g/L，葡萄糖5g/L，甘油3g/L，KH2PO43g/L，pH值7.0～7.2，其余为水。
2.发酵方法
种子活化：将斜面保存的本发明制备的大肠杆菌工程菌pET32a(+)-IL2/BL21(DE3)种子挑取两环接种于一级种子液中（添加100ug/ml氨苄青酶素），37℃，250rpm摇瓶培养6小时，获得一级种子液。
种子扩大培养：取一级种子液，按8％接种量接于二级液中（添加100ug/ml氨苄青酶素），37℃，200rpm摇瓶培养6小时，获得二级种子液。
30升发酵罐发酵：将二种子液按6％接种量加入装有发酵培养基的发酵罐（发酵培养基不含葡萄糖）中，37℃发酵培养6h，控制pH值在7.0～7.2，转速200rpm；再添加葡糖糖，由通气及搅拌速度控制溶氧在30％以上，35～37℃培养8h；最后加入IPTG至终浓度为0.5mM，诱导4.0小时收菌。
SDS-PAGE测蛋白表达量（积层胶3％，分离胶10％），电泳结果见图3，电泳结果显示：目的融合蛋白分子量约为37.4KD。
实施例3目的蛋白的纯化
1.菌体处理
将发酵培养后的菌体4℃，9000rpm离心25分钟，弃上清液。用5倍菌体重量的磷酸盐缓冲液（pH7.0～9.0）悬浮菌体，然后匀浆，破菌，将裂解物于4℃，9000rpm离心40分钟，取上清液。
2.分离纯化
Chelating Sepharose F.F.亲和层析法：先用含30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5，20mM的Tris-HCL缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；向菌体裂解处理后得到的上清液中加入1.0M咪唑、NaCI固体及Tris-HCL缓冲液，配置含有30mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min，用5倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含250mM咪唑、500mM NaCl，pH值7.5±0.5，浓度为20mM的Tris-HCL缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
酶解融合蛋白：以肠激酶：融合蛋白质量比为1：1000，向融合蛋白中加入肠激酶进行酶解酶切温度为16℃，酶切16小时获得酶解液；并对酶切16小时获得的酶解液进行SDS-PAGE，电泳结果见图4。
进一步纯化分离目的蛋白：XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲和柱，上样缓冲液用20mmol/L Tris-HCL，pH值7.5±0.5，洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCL，20mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上样缓冲液流洗，待流穿风出现并洗至基线后，30min，0-50%梯度洗脱，收集流穿组分，即为纯化后的蛋白IL-2，蛋白的电泳结果见图5。
MTT法检测IL-2蛋白活性，具体方法可参考亚甲基兰检测人白介素-2（rhIL-2）活性，微生物学杂志2000年9月，第20卷第3期；结果表明本发明方法制备的IL-2蛋白可达到90U／mL的生物学活性。
Claims (10)
1.一种人IL-2蛋白的制备工艺，具体步骤如下：
1）重组质粒的构建：合成表达人IL-2蛋白的重组基因EK-IL2，将重组基因EK-IL2片段插入载体，获得重组质粒；所述重组基因EK-IL2片段序列5’至3’方向依次含有Kpn I酶的限制性酶切位点序列、肠激酶识别位点序列、人IL-2蛋白基因序列和BamH I酶的限制性酶切位点序列；
2）基因工程菌的制备：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞制备基因工程菌；
3）外源基因的表达：基因工程菌发酵表达Trx-IL2融合蛋白；
4）目的蛋白的纯化：裂解菌体，收集Trx-IL2融合蛋白，并通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得人IL-2蛋白产品。
2.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤1）所述人IL-2蛋白表达序列如SEQID NO:3所示。
3.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤1）所述合成的表达人IL-2蛋白的重组基因EK-IL2的序列如SEQ ID NO:4所示。
4.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤1）所述载体为pET32a(+)。
5.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤2）所述宿主细胞为大肠杆菌。
6.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤3）所述基因工程菌的发酵方法如下：
a.种子的活化：挑取斜面种子，接种于添加了80～120ug/ml氨苄青酶素的一级种子培养基中，35～38℃，180～300rpm摇瓶培养4～12小时，获得一级种子液；所述一级种子培养基的组成为：NH4Cl0.8～1.2g/L，MgSO480～120mg/L，CaCl24.2～5.6g/L，NaCl8～11.5g/L，蛋白胨12～13g/L，酵母膏4～5.5g/L，乳糖4.5～5.5g/L，其余为水；
b.种子的扩大培养：取一级种子液，按5～10％接种量接种于添加了80～120ug/ml氨苄青酶素的二级种子培养基中，35～38℃，180～250rpm摇瓶培养4～10小时，获得二级种子液；所述二级种子培养基的组成为：MgSO445～55mg/L，NaCl8～12g/L，MnSO46.4～6.8mg/L，H3BO31.0～2.5mg/L，烟酸0.3～0.5mg/L，维生素B10.1～0.2mg/L，柠檬酸1.5～2.5mg/L，蛋白胨10～15g/L，酵母膏5～10g/L，葡萄糖5～10g/L，甘油2～3g/L，其余为水；
c.发酵罐发酵：将二种子液按5～8％接种量加入不含葡萄糖的发酵培养基中，35～38℃发酵培养4～8h，控制pH值在7.0～7.2，转速180～220rpm；再向培养基中添加葡糖糖，由通气和搅拌速度控制溶氧在30％以上，35～37℃培养6～8h；最后加入IPTG至终浓度为0.45～0.55mM，诱导3～5小时收菌；所述发酵培养基的组成为：蛋白胨10～18g/L，酵母膏12.5～20g/L，葡萄糖3～7/L，甘油2～3g/L，KH2PO41.5～4.5g/L，pH值7.0～7.2，其余为水。
7.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤4）所述融合蛋白的酶切、纯化步骤具体如下：
A.第一步亲和层析：Chelating Sepharose F.F.层析柱初步分离Trx-IL2融合蛋白；
B.酶解融合蛋白：用肠激酶酶切前一步骤获得的分离的Trx-IL2融合蛋白，获得酶解液；
C.第二步亲和层析：XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲和柱，纯化前一步骤所得的酶解液，分离得到纯化的人IL-2蛋白。
8.如权利要求7所述的制备工艺，其特征在于，所述步骤A第一步亲和层析具体为：先用含25～35mM咪唑、300～600mM NaCl，pH值7.5±0.5，25～35mM的Tris-HCL缓冲液平衡填充有Chelating Sepharose F.F.的亲和柱；采用菌体裂解处理后得到的上清液配置含有25～35mM咪唑、300～600mM NaCl，pH值7.5±0.5的上样溶液；上柱：上样溶液流速为10mL/min，用5～6倍柱床体积的平衡液清洗亲和柱，再用含200～250mM咪唑、300～600mM NaCl，pH值7.5±0.5，浓度为20～25mM的Tris-HCL缓冲液洗脱目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。
9.如权利要求7所述的制备工艺，其特征在于，所述步骤C亲和层析具体为：采用XK16/10Chelating Sepharose Fast Flow镍离子亲和柱，上样缓冲液用18～22mmol/LTris-HCL，pH值7.5±0.5，洗脱缓冲液为18～22mmol/L Tris-HCL，15～25mM咪唑，pH值7.5±0.5。上柱后，用上样缓冲液流洗，待流穿风出现并洗至基线后，30min，0-50%梯度洗脱，收集流穿组分，即为纯化的IL-2蛋白。
10.权利要求1-9任一权利要求所述制备工艺制备人IL-2蛋白的应用。
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