CN1544630A - 重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途 - Google Patents
重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1544630A CN1544630A CNA2003101086586A CN200310108658A CN1544630A CN 1544630 A CN1544630 A CN 1544630A CN A2003101086586 A CNA2003101086586 A CN A2003101086586A CN 200310108658 A CN200310108658 A CN 200310108658A CN 1544630 A CN1544630 A CN 1544630A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- interleukin
- duck
- expression
- product
- reorganization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 title claims abstract description 123
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 title abstract description 24
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 title abstract description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 70
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 70
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 34
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 33
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 claims description 30
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 6
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 230000024835 cytogamy Effects 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 3
- 239000010977 jade Substances 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 claims 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 241000272522 Anas Species 0.000 abstract 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 abstract 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 206010049466 Erythroblastosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010068676 Pneumoretroperitoneum Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005727 Retropneumoperitoneum Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000001669 bursa of fabricius Anatomy 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003526 lymphopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- VDYQCGZDQGNKFI-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(4-azidophenyl)ethanimidate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=N)CC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 VDYQCGZDQGNKFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000590 parasiticidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002297 parasiticide Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003257 protein preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组鸭白介素2蛋白制备方法及其用途。RT-PCR扩增的不同品种鸭的鸭白介素-2cDNA片段与原核表达载体pBAD/hisB载体和真核表达载体pMETαA构建高效表达质粒,重组表达载体分别转化大肠杆菌LMG194和酵母菌株PMAD11和PMAD16后诱导表达。大肠杆菌诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素-2粗制品,用蛋白纯化系统得到鸭白介素2纯品。鸭白介素-2粗制品或纯品加保护剂后可以作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。鸭白介素-2单克隆抗体和多克隆抗体的制备过程简单经济,可以作为良好的免疫抑制剂。本发明应用基因工程技术制备的重组鸭白介素-2蛋白,具有工艺流程简单,生产成本低,稳定性好,生物学活性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途。
背景技术
1997年Sundick等用构建cDNA文库的方法首次从鸡脾脏中获得鸡IL-2基因,1998年Choi等把含信号序列长430个核苷酸的鸡IL-2基因克隆入PUC18载体和真核表达载体pcDNA3,分别在大肠杆菌和CHO-K1细胞中进行表达,得到的两种蛋白都具有鸡T淋巴细胞增殖的生物学活性。1999年Stepaniak等对鸡IL-2体外表达进行了比较深入的研究,将去除前导肽的鸡IL-2基因在大肠杆菌Pgex-2t系统中进行了表达,得到的蛋白具有鸡IL-2蛋白的生物学活性,但表达效率较低仅为63μg/L,且多为非可溶性蛋白,不利于蛋白的回收和纯化。为解决此问题,他们采用了pET32a+高效表达系统,将IL-2与硫氧还原蛋白在缺失硫代还原酶的大肠杆菌菌株中进行融合表达,结果发现蛋白表达量提高到4mg/L,而且绝大部分为可溶性蛋白,该学者同时将含前导肽的完整鸡IL-2基因克隆入真核表达载体pCR3.1+中,在肾成纤维细胞系中进行表达,结果发现该系统不但能稳定表达鸡IL-2蛋白,而且上清和经纯化的蛋白都具有完整的生物学活性,这说明鸡IL-2和哺乳动物IL-2相似,其活性并不依赖于前导序列。
成熟的鸡IL-2蛋白是由121个氨基酸组成。它和人IL-2具有相类似的生物学活性,如促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖,增强NK细胞的杀伤活性等功能,在机体免疫中发挥重要作用。家禽中一些造成重大经济损失的疾病如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒、新城疫病毒、传染性贫血病病毒、禽骨髓成红细胞增多症病毒、禽流感病病毒以及球虫感染后大多伴有IL-2分泌异常,因此鸡IL-2可能在抗感染免疫中发挥重要作用。并且,研究发现,鸡IL-2在抗沙门氏菌和寄生虫的实验中效果明显。
我们利用RT-PCR技术从鸭脾淋巴细胞中扩增了2个不同品系鸭IL-2的cDNA片段,并实现了在原核和真核细胞中的高效表达,表达产物具有明显的生物学活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组鸭白介素2蛋白制备方法及其用途。
重组鸭白介素2蛋白的制备方法的步骤如下:
1)自中国的绍兴麻鸭和外来品种美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/his B组建成高效表达载体pBAD/His B/dkIL-2;或者与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成高效表达载体pMETαA/dkIL-2;
2)用RM作为基础培养基,通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194;
3)用BMDY作为基础培养基,通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16,在表达不同时间加氮源、碳源营养素;
4)大肠杆菌LMG194诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素2粗制品,PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素2主要以分泌形式存在于培养基中,经过离心取上清即可得到鸭白介素2粗制品;用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到鸭白介素2纯品;
5)制备的重组鸭白介素2纯品或非纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后,无菌过滤、分装和冻干后制成的成品,保存于-20℃的冷藏环境中;
6)鸭白介素2单克隆抗体的制备:用重组鸭白介素2纯品抗原免疫小鼠,经细胞融合,杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆,液氮保存。获得的单克隆抗体腹水纯化后,液氮保存;
7)鸭白介素2多克隆抗体的制备:用鸭白介素2纯品抗原0.3-0.5mg,加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子,3周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫,3周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫;7-10天后采血清,试血测其效价再次加强免疫,7天以后采血清测效价,琼扩效价达1:32-64,离心取上清低温保存。
它用于免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
本发明的优点:(1)大肠杆菌表达的鸭白介素-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在基因工程菌内,经超声波就可以使目的蛋白释放出来,不需要其他的处理就可以得到鸭白介素-2粗蛋白,且其稳定性好、生物学活性较高;(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA,所表达的鸭白介素-2蛋白大部分被分泌到培养基中,不但不需要任何的处理就可以得到鸭白介素-2粗制品,且目的蛋白具有良好的稳定性和生物学活性;(3)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单,得到的蛋白纯度高;(4)重组鸭白介素-2作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力;作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性;作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫系统功能的作用以及促生产作用,dkIL-2蛋白单抗、多抗具有良好的免疫抑制性能;(5)5株鸭白介素-2单抗杂交瘤细胞株稳定性好,抗体分泌能力强,单克隆抗体的效价高和亲合力强。
附图说明
图1是BSA制定的标准曲线图;
图2是重组鸭白介素2原核表达产物的活性检测结果。
具体实施方式
重组鸭白介素2蛋白的制备方法的步骤如下:
1)设计PCR引物,自绍兴麻鸭和美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA片段SEQ No.1、SEQ No.2;
2)上述鸭白介素-2cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/dkIL-2;或者上述鸭白介素-2cDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/dkIL-2;
3)用RM作为基础培养基,通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194;
4)用BMDY作为基础培养基,通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16,在表达不同时间加氮源、碳源等营养素;
5)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD11和PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素-2粗制品,PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素-2主要以分泌形式存在于培养基中,经过离心取上清即可得到鸭白介素-2粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到鸭白介素-2纯品;
6)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后,无菌过滤、分装和冻干后制成成品,保存于-20℃的冷藏环境中。
7)用鸭白介素-2纯品免疫小鼠,获5F6、2B3、1H4、5H6、4G12等5株单克隆抗体杂交瘤细胞株。
8)用鸭白介素-2纯品免疫家兔,获得效价达1:32-64的鸭白介素-2多抗血清。
本发明中,1鸭白介素-2基因克隆 用刀豆素(ConA)刺激鸡脾细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法分别扩增和克隆了绍兴麻鸭和美洲鸭鸭白介素-2cDNA,将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector,测定鸭白介素-2cDNA序列。
2重组表达鸭白介素-2基因工程大肠杆菌的构建绍兴麻鸭鸭白介素-2的PCR扩增产物亚克隆到-新型高效表达载体pBAD/His B中,构建成鸭白介素-2原核表达质粒pBAD/His B/dkIL-2,它能在大肠杆菌LMG194中高效表达,使鸭白介素-2占菌体总蛋白的7~9%,表达率经100次以上传代不降低。
3重组表达鸭白介素-2基因工程酵母菌的构建将绍兴麻鸭鸭白介素-2的PCR扩增产物亚克隆到一新型高效真核表达载体pMETαA中,分别构建成鸭白介素-2表达质粒pMETαA/dkIL-2中,用BMDY作为基础培养基,用甲醇作为诱导剂,通过优化溶氧、震荡速度、发酵pH值等工艺参数,可以使鸭白介素-2基因在P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16中得到高效表达,表达量分别占菌体总蛋白的15~20%和10~12%。,表达率经100次以上传代不降低。
4重组鸭白介素-2粗制品的制备及纯化工艺。
所建立的粗制品的制备及纯化工艺流程简单、稳定性好、活性高。本工艺具有以下特点:(1)大肠杆菌表达的鸭白介素-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内,经超声波就可以使目的蛋白释放出来,不需要其他的处理就可以得到鸭白介素-2粗蛋白,且其生物学活性较高;(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA,所表达的鸭白介素-2蛋白大部分被分泌到培养基中,不需要任何的处理就可以得到鸭白介素-2粗产品,并目的蛋白具有良好的生物学活性;(3)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单,得到的蛋白纯度高。
5粗制品或纯品加入磷酸缓冲液等助溶剂,用微空滤膜过滤除菌,可以作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
鸭白介素-2的一个重要生物功能就是促进T淋巴细胞的增殖,我们用经有丝分裂原刺激的鸡脾T淋巴细胞作为靶细胞,用MTT法对鸭白介素-2的活性进行了检测,证实表达产物具有较高的生物学活性。
本发明运用重组DNA技术,采用反转录PCR方法得到了一种重组的鸭白介素-2。经过下游纯化,中试规模下的产品达到了临床用药的质量要求。
实施例1.寡核苷酸引物的设计与合成
根据Sundick等报道的鸡IL-2核苷酸序列设计了5’端和3’端一对引物。5’端引物和3’端引物引入Hind III酶切位点。合成以下两条引物:
5’端引物:5’-GC
GGATCCAACACTGACAAGATGTGC-3’
3’端引物:5’-GC
GGATCCGTAGGTTACTGAAATTTA-3’
实施例2.脾淋巴细胞的分离
饲养至12日龄的两个不同品系的雏鸭经颈动脉放血后无菌采集脾脏、剪碎置于无Ca2+、Mg2+离子的PBS中(717mmol/L K2HPO4,283mmol/L KH2PO4,PH7.2)中,300×g 4℃离心10min,上清液移至含有等体积淋巴细胞分离液的离心管中,500×g 4℃离心30min,毛细管伸至单核细胞层中,沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用PBS洗两次,再以RPMI1640培养液(不含犊牛血清)洗涤1次,台盼蓝(0.1%)染色活细胞计数后,用RPMI1640生长培养液(含10%的犊牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)将细胞分别配成2×106/ml的细胞悬液。细胞悬液中加入10μg/ml终浓度ConA,分装细胞培养板,5%二氧化碳培养箱40℃培养20小时,收集单个核淋巴细胞。
实施例3.RT-PCR扩增目的基因片断
采用Trizol reagent(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)提取单个核淋巴细胞mRNA,以收集的单个核淋巴细胞mRNA为模板,5’端和3’端合成引物,用ReverseTranscription System kit反转录合成dkIL-2 cDNA第一链;反转录产物在95℃1min、56℃45s、72℃2min环境下30个循环进行PCR,最后延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例4.测序载体的构建和序列测定
用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段,利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-Teasy vector,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选。挑取阳性克隆,分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA自动测序仪测定每个品种鸡dkIL-2基因核苷酸序列。每个品种鸭白介素-2基因核苷酸及推导氨基酸序列见表1、表2。
1 AACACTGACAAGATGTGCAAAGTACTCATCTTCAGCTGCCTTTCAGTACTAATGCTTATGACTACAGCT 69
2 M C K V L I F S C L S V L M L M T T A 69
1 TATGGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACAACACTCTTAAAACTTTAATAAAAGATTTAGAAAACCTGGGA 138
2 Y G A P L S E K D N T L K T L I K D L E N L G 138
1 ACAAGCATGAATGGGATTGATCTTGAGCTCTACACACCAAATGACACAAAGGAGTGCAGCTGGCAAACT 207
2 T S M N G I D L E L Y T P N D T K E C S W Q T 207
1 CTGCAATGTTACTTGAAAGAAATAGTCACCTTGGAGGAAGAAATTGAAGATGAGGATGAAATTGAAGAT 276
2 L Q C Y L K E I V T L E E E I E D E D E I E D 276
1 GAGAAGGTATCTAGTGTTCGGAATATCAAAATGAATCTCCAAAAACTTATGGACCTAATTCCCCCAGGA 345
2 E K V S S V R N I K M N L Q K L M D L I P P G 345
1 ACGGGATGCAATATCTGTGAAGCTAATGCCAACAACTTCCCTGAATTTCGCCAAGAGCTGACCAACTTC 414
2 T G C N I C E A N A N N F P E F R Q E L T N F 414
1 CTGAGATCTATGCTAAAATAAGCAGATGACCATTTCTATTTTTACTGCTATGTTATTTATTTAACTATT 483
2 L R S M L K
1 TAATTACAAATAATTTATATATTTTACCCTGGGGCTACCTAACTTGCTGTCCGCTTTGGGACCACTGTA 552
1 TGCTCTTAGTGTGGGCGATAACGTGTCTGTTCTAAGATCACATTTGATCCTTTTATGTAAGCCCTACGG 621
1 GCTCAAAATGTATGTTGGAAAACTAATTTGTTCTCGCTTTGTCAATAAACTTAAAATGACAACTATTTA 690
1 TTGAAAGAATTGTTAAAAGTTACTTGTAGATGATATTTAATAAATTTCAGTAAGGTAC 748
表1.绍兴麻鸭dkIL-2核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.1)
(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)
1 AACACTGACAAGATGTGCAAAGTACTCATCTTCAGCTGCCTTTCAGTACTAATGCTTATGACTACAGCT 69
2 M C K V L I F S C L S V L M L M T T A 69
1 TATGGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACAACACTCTTACAACTTTAATAAAAGATTTAGAAAACCTGGGA 138
2 Y G A P L S E K D N T L T T L I K D L E N L G 138
1 ACAAGCATGAATGGGATTGATCTTGAGCTCTACACACCAAATGACACAAAGGAGTGCAGCTGGCAAACT 207
2 T S M N G I D L E L Y T P N D T K E C S W Q T 207
1 CTGCAATGTTACTTGAAAGAAATAGTCACCTTGGAGAAAGAAATTGAAGATGAAGATGAAATTGAAGAT 276
2 L Q C Y L K E I V T L E K E I E D E D E I E D 276
1 GAGAACGTATCTAGTGTTCGGAATATCAAAATGAATCTCCAAAAACTTATGGACCTAATTCCCCCAAGA 345
2 E N V S S V R N I K M N L Q K L M D L I P P R 345
1 ACGGGATGCAATATCTGTGAAGCTAATGCCAAGAACTTCCCTGAATTTCGCCGAGAGCTGACCAACTTC 414
2 T G C N I C E A N A K N F P E F R R E L T N F 414
1 CTGAGATCTATGCTAAAATAAGCAGATGACCATTTCTATTTTTACTGCTATGTTATTTATTTAACTATT 483
2 L R S M L K
1 TAATAACAAATAATTTATATATTTTACCCTGGGGCTACCTAACTTGCTGTCCACTTTGGGACCACTGTA 552
1 TGCTCTTAGTGTGGGTGATAACGTGTCTGTTCTAAGATCACATTTGATCCTTTTATGTAAGCCCTACGG 621
1 GCTCAAAACATATGTTGGAAAACTAACTTGTTCTCGCTTTGTCAATAAACTTAAAATGACAACTATTTA 690
1 TTGAAAGAATTGTTAAAAGTTACTTGTAGATTATATTTAATAAATTTCAGTAACCTAC 748
表2.美洲鸭核苷酸及氨基酸序列(SEQ No.2)
(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)
实施例5.pBAD/His B/dkIL-2表达载体构建、筛选及鉴定
根据绍兴麻鸭白介素-2序列,在成熟蛋白序列两端合成上下游引物:UP1(5’-CGAATTCGCACCTCTATCAGAGAAA-3’),5’端含EcoRI酶切位点;DOWN1(5’CAAGCTTTTATTTTAGCATAGATCT 3’),5’端含Hind III酶切位点;以pGEM-T-Easy/dkIL-2为模板在95℃1min、56℃45s、72℃2min环境下30个循环进行PCR,最后延伸10min。PCR产物电泳回收后,经EcoRI、Hind III双酶切后,回收目的片段并克隆于表达质粒pBAD/His B的EcoRI+Hind III酶切窗口中,构建重组表达质粒pBAD/His B/dkIL-2,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
实施例6.重组鸭白介素-2的发酵生产(大肠杆菌)
经鉴定的重组质粒转入LMG194宿主菌,挑取单克隆接种到含有氨卞青霉素和葡萄糖的RM培养基中,37℃培养过夜,按1∶100的比例将培养物接种于RM培养基中,250rpm震荡培养2小时左右,使OD600≈0.5,按1∶100的比例加入20%浓度的L(+)-阿拉伯糖诱导培养3小时,离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液,采用15%的SDS-PAGE鉴定,产物表达量可达7~9%。
实施例7.pMETαA/dkIL-2表达载体构建、筛选及鉴定
根据绍兴麻鸭dkIL-2序列在其成熟蛋白序列合成上下游引物:上游引物同实例5中UP1;下游引物DOWN2(5’-C
GGATCCTTTTAGCATAGATCTCAG-3’),5’端含BamHI酶切位点。以pGEM-T-Easy/dkIL-2为模板进行PCR,扩增条件同实例5。PCR产物电泳回收后,经EcoRI、BamHI双酶切后,回收目的片段克隆于表达质粒pMETαA强启动子下游的EcoRI+BamHI酶切窗口中,构建重组表达质粒,转化宿主菌TOP10,提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
采用Choi等报道的方法制备PMAD11和PMAD16感受态细胞,分别取100μlPMAD11和PMAD16酵母感受态细胞与2μg经APAI酶切完全的pMETαA/dkIL-2和混合,使用Bio-Rad Gene Pluser在375V/cm,25μF、250Ω的条件下进行转化,然后加入1ml室温的YPAD,28~30℃孵育1h,1500×g室温离心3min收集菌体,重新悬于100μl 1×YNB,将菌液涂布于MD选择平板上,28~30□培养3~4天,观察转化子的生长情况。随机筛选MD平板上白色菌落,用Genomic DNAmini-prepkit提取酵母基因组DNA进行PCR扩增鉴定。
实施例8.重组鸭白介素-2的发酵生产(酵母)
分别挑取PCR鉴定为阳性的PMAD11和PMAD16克隆接种于20mL BMDY培养基中,28~30℃,250r/min震荡培养16~18h至OD600=2~10。室温,1500×g离心5min,收集菌体重悬于10mL BMMY培养基中。28~30℃,250r/min继续震荡培养4天,每24小时补加5%的甲醇使甲醇终浓度为0.5%,离心收集上清,SDS-PAGE电泳鉴定dkIL-2表达水平,凝胶成像系统扫描显示dkIL-2占菌体总蛋白的15%。
实施例9.基因工程菌的保存与稳定性(酵母)
工程菌加30%甘油,-70℃保存。短期保存菌种可用YPAD平板。为检查工程菌的稳定性,将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当,证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例10.基因工程菌的保存与稳定性(大肠杆菌)
工程菌加30%甘油,-70℃保存。短期保存菌种可用LB平板。为检查工程菌的稳定性,将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当,证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例11.重组鸭白介素-2粗蛋白的制备及分离纯化
经大肠杆菌菌株LMG194表达的鸭白介素-2主要以融合蛋白的形式存在,菌体经超声波破碎后,可以得到鸭白介素-2粗制品,进一步用QIAGEN公司的Ni-NTA蛋白纯化系统可以较快的得到鸭白介素-2纯品。
含有pMETαA/dkIL-2重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素-2主要以分泌形式存在于培养基中,经过离心取上清即可得到鸭白介素-2粗制品,用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化系统可以较快的得到鸭白介素-2纯品;
实施例12.鸭白介素-2纯品的定量。
用Bradford法对蛋白纯化产物进行定量。
经测定每升大肠杆菌可以得到4mg有活性的鸭白介素-2,每升酵母培养产物可以得到30mg有活性的鸭白介素-2。
实施例13.重组鸭白介素-2的鉴定
SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98%以上,MTT法测定粗制品及纯品的生物学活性,大肠杆菌和P.methanolica酵母的表达产物不但具有刺激T淋巴细胞生长的活性,且活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液的活性,但dkIL-2在体外不具有刺激T淋巴细胞生长的活性。
实施例14.重组鸭白介素-2理化性质及稳定性
重组鸭白介素-2对热较稳定,56□1小时、37□12小时或70□15分钟处理仍保留活性,4可保存1年以上,其活性在pH2~9范围内保持稳定。重组鸭白介素-2对蛋白酶敏感,对DNA酶、RNA酶不敏感。
实施例15.重组鸭白介素-2的生物学活性检测
从鸭脾脏获得的淋巴细胞悬液用含犊牛血清(10%)和刀豆素A(10ug/ml)的RPMI1640稀释成5*106个/ml的细胞细胞悬液,41℃,5%CO2培养48h.收集到的细胞重悬于含0.1M的甲基甘露醇的RPMI1640培养液作用半小时。处理后的细胞重悬于含犊牛血清(10%)和刀豆素A(10ug/ml)的RPMI1640培养液,终浓度为5*106个/ml,然后加入到96孔细胞培养板中,用MTT法检测表达产物的生物学活性。将RPMI1640稀释成一系列倍数的鸭白介素-2粗蛋白加入到96孔培养板,空质粒的表达产物及纯RPMI培养液作为阴性对照。41℃,5%CO2培养48h用MTT(20ul/孔)作用3小时,加10%SDS-0.01mol/LHCl裂解细胞充分融解甲晶体。用紫外分光光度计在OD490处读数。结果表明重组鸭白介素-2的原核、真核表达产物均具有明显的生物学活性。图2为重组鸭白介素-2原核表达产物的活性检测结果,其它数据未显示。
a:只含有RPMI培养液的鸭淋巴细胞;
b:培养液中只含有空质粒表达产物的鸭淋巴细胞;
c-g:培养液中含不同浓度梯度重组dkIL-2原核表达产物的鸭淋巴细胞
实例17.鸭白介素-2单克隆抗体的制备
1.抗原免疫
用纯化的鸭白介素-2原核表达产物(50-100μg/只与等体积弗氏完全佐剂混合)作免疫原,经腹腔注射体重18-20g BALB/C雌性小鼠。间隔3周取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后,进行第二次腹腔注射,过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射,3天后取脾细胞进行融合。
2.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例,在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀,1500rpm离心5min,去除培养基,用50%PEG(Sigma)作为融合剂,在37℃下加入0.5-0.7ml,融合2-3min,用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后,1500-2000rpm离心5min,沉淀用HAT培养基悬浮,分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中,37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养。
3.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选
细胞培养箱中培养5天后,用HAT培养基换液一次,第10天用HAT培养基换液,等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时,常规间接ELISA方法筛选阳性孔。阳性率为15%。
4.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆
阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法。用包被液包被抗原(原核表达的鸭白介素-2、His融合表达蛋白、含空质粒表达菌体的裂解液),37℃过夜;PBST洗涤三次后用5%的脱脂奶粉封闭0.5-2小时;加入阳性孔培养上清100ul/孔,37℃1-2小时;PBST洗涤三次后加入经脱脂奶粉稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔,37℃ 1-2小时,PBST洗涤三次后,用OPD-H2O2底物显色,15分钟后2mol/L H2SO4终止反应,用酶标仪读取OD490的值,以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。筛选到针对鸭白介素-2的特异性细胞株,筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆,获5F6、2B3、1H4、5H6、4G12等5株单抗细胞株。细胞株进一步扩大培养,用于制备单抗腹水和液氮冻存。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠,腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma),7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞,注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大,采取腹水,2000rpm离心3min,收集上清液,即为单克隆抗体腹水。
实例18.多抗的制备
用鸭白介素-2纯品抗原(Ag)0.3-0.5mg,加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子,3周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫(背部皮下注射),3周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫。7-10天后采血清,试血测其效价再次加强免疫,7天以后采血清测效价,琼扩效价达1:32-64,离心取上清低温保存。
实例19.重组鸭白介素-2作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。用重组鸭白介素-2作为鸭病毒性肝炎灭活疫苗的免疫佐剂,在雏鸭出壳1至3天进行免疫,进行鸭病毒性肝炎攻击,可以明显降低雏鸭死亡率(下降40%),发病症状也明显减轻。并且对未免疫的发病鸭注射高免血清(或卵黄)或康复鸭的血清的同时添加重组鸭白介素-2,与不添加相比也明显减少病死率。重组鸭白介素-2作为饲料添加剂,鸭的食欲增进,增重较对照组明显,抵抗力明显增强。鸭白介素-2的单抗和多抗具有明显的免疫抑制功能,有助于对水禽免疫系统机理,肿瘤机制展开深入研究。
Claims (6)
1.一种重组鸭白介素2制备方法,其特征在于它的步骤如下:
1)自中国的绍兴麻鸭和外来品种美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/his B组建成高效表达载体pBAD/His B/dkIL-2;或者与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成高效表达载体pMETαA/dkIL-2;
2)用RM作为基础培养基,通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194;
3)用BMDY作为基础培养基,通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16,在表达不同时间加氮源、碳源营养素;
4)大肠杆菌LMG194诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素2粗制品,PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素2主要以分泌形式存在于培养基中,经过离心取上清即可得到鸭白介素2粗制品;用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统可得到鸭白介素2纯品;
5)制备的重组鸭白介素2纯品或非纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后,无菌过滤、分装和冻干后制成的成品,保存于-20℃的冷藏环境中;
6)鸭白介素2单克隆抗体的制备:用重组鸭白介素2纯品抗原免疫小鼠,经细胞融合,杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆,液氮保存。获得的单克隆抗体腹水纯化后,液氮保存;
7)鸭白介素2多克隆抗体的制备:用鸭白介素2纯品抗原0.3-0.5mg,加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子,3周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫,3周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫;7-10天后采血清,试血测其效价再次加强免疫,7天以后采血清测效价,琼扩效价达1∶32-64,离心取上清低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种重组鸭白介素2蛋白的制备方法,其特征在于上述所说的鸭白介素-2cDNA与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/dkIL-2经转化大肠杆菌LMG 194为dkIL-2基因工程大肠杆菌,L(+)-阿拉伯糖诱导表达后,产物以融合蛋白的形式存在工程菌内。
3.根据权利要求1所述的一种重组鸭白介素2蛋白的制备方法,其特征在于上述所说的鸭白介素-2cDNA与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/dkIL-2经电击转化酵母菌PMAD11和PMAD16为鸭白介素-2基因工程酵母菌,甲醇诱导表达,产物以分泌物形式存在于工程菌培养基中。
4.根据权利要求1所述的一种重组鸭白介素2蛋白的制备方法,其特征在于所说的通过发酵技术扩增大肠杆菌工程菌LMG194,用RM作为基础培养基,是通过破碎大肠杆菌菌体,用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统纯化产品。
5.根据权利要求1所述的一种重组鸭白介素2蛋白的制备方法,其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16,用BMDY作为基础培养基,在表达不同时间加入氮源、碳源营养素,酵母工程菌PMAD11和PMAD16分泌物用Ni-NTA Argarose蛋白纯化系统进行纯化。
6.一种重组鸭白介素2蛋白的用途,其特征在于它用于免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310108658 CN1231585C (zh) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | 重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200310108658 CN1231585C (zh) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | 重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1544630A true CN1544630A (zh) | 2004-11-10 |
CN1231585C CN1231585C (zh) | 2005-12-14 |
Family
ID=34334796
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200310108658 Expired - Fee Related CN1231585C (zh) | 2003-11-12 | 2003-11-12 | 重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1231585C (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101961488A (zh) * | 2010-10-20 | 2011-02-02 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法 |
CN104178494A (zh) * | 2013-05-23 | 2014-12-03 | 上海华新生物高技术有限公司 | 一种人白介素2的制备工艺及其应用 |
CN106434685A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-02-22 | 大连海洋大学 | 制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法 |
CN109627332A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-16 | 深圳康体生命细胞技术有限公司 | 一种免疫抗体及其制备方法 |
CN113603766A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-05 | 北京宝易生物技术有限公司 | 用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用 |
CN114369152A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-19 | 扬州大学 | 一种重组鸡白细胞介素-9蛋白及其抗体的制备与应用 |
-
2003
- 2003-11-12 CN CN 200310108658 patent/CN1231585C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101961488A (zh) * | 2010-10-20 | 2011-02-02 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法 |
CN101961488B (zh) * | 2010-10-20 | 2013-09-11 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法 |
CN104178494A (zh) * | 2013-05-23 | 2014-12-03 | 上海华新生物高技术有限公司 | 一种人白介素2的制备工艺及其应用 |
CN106434685A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-02-22 | 大连海洋大学 | 制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法 |
CN109627332A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-04-16 | 深圳康体生命细胞技术有限公司 | 一种免疫抗体及其制备方法 |
CN113603766A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-05 | 北京宝易生物技术有限公司 | 用于免疫增强的鸭白细胞介素-2及其作为免疫增强剂的应用 |
CN114369152A (zh) * | 2022-01-24 | 2022-04-19 | 扬州大学 | 一种重组鸡白细胞介素-9蛋白及其抗体的制备与应用 |
CN114369152B (zh) * | 2022-01-24 | 2023-11-21 | 扬州大学 | 一种重组鸡白细胞介素-9蛋白及其抗体的制备与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1231585C (zh) | 2005-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1177982A (zh) | 作为融合蛋白的异源抗原的表达系统 | |
CN1062605C (zh) | 大肠杆菌疫苗的制备方法 | |
Zhou et al. | Cloning, in vitro expression and bioactivity of duck interleukin-2 | |
CN1231585C (zh) | 重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途 | |
CN101054416A (zh) | HAb18GC2单抗和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用 | |
CN1236391A (zh) | 制备疟疾完全抗原gp190/MSP1的重组方法 | |
CN1872346A (zh) | Ⅰ型糖尿病疫苗及其构建方法 | |
CN103232545A (zh) | 一种重组猪干扰素α1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
CN1296385C (zh) | 抗猪生长激素单克隆抗体及制备方法及应用 | |
CN1803846A (zh) | p53蛋白的表位(SQAMDDLMLS)与丝状噬菌体基因8蛋白的杂合蛋白及其应用 | |
CN1218962C (zh) | 生长抑素卵黄抗体及其制备 | |
CN1236059C (zh) | 一种石斑鱼胰岛素样生长因子ⅱ基因、含有该基因的载体、重组株及其应用 | |
CN103232544A (zh) | 一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
CN1224704C (zh) | 重组chBJSTWO蛋白的制备方法 | |
CN101050448A (zh) | 一种促进动物生长的口服重组dna疫苗及应用 | |
CN107502616B (zh) | 一种可溶性重组蛋白cta-cd154及其制备方法和应用 | |
CN1195868C (zh) | 一种体外免疫人b淋巴细胞生产人单克隆抗体的方法 | |
CN1053642A (zh) | 传染性支气管炎病毒疫苗 | |
CN1544629A (zh) | 重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法及其用途 | |
CN1231339A (zh) | 人、猪共患囊虫病核酸疫苗 | |
CN1721531A (zh) | 重组人抗体表达载体及其应用 | |
CN1831121A (zh) | 抗乙肝病毒人单克隆抗体的杂交瘤细胞系构建方法及应用 | |
CN1173741C (zh) | 鱼病多联抗独特型单克隆抗体疫苗制剂 | |
CN1944644A (zh) | HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法 | |
CN111850021A (zh) | 一种缩短浙东白鹅就巢周期的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20051214 Termination date: 20101112 |