CN101961488A - 一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法，包括以下步骤：番鸭细小病毒的制备，一免番鸭细小病毒抗原的制备，二免番鸭细小病毒抗原的制备，用二免番鸭细小病毒抗原制备番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗，用一免番鸭细小病毒抗原制备番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗，然后用制备得到的抗原与疫苗免疫番鸭，得到抗番鸭细小病毒的血清，采用本发明方法制备得到的血清的效价高，对预防和治疗番鸭细小病毒具有显著的疗效，预防率为96.6%，治愈率70%左右。

Description

一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法

技术领域

    本发明具体涉及一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法，属生物技术领域。

背景技术

番鸭细小病毒病是侵害雏番鸭的一种急性或亚急性传染病，它具有高度传染性，发病率和死亡率都很高，常造成严重的经济损失，主要发生于1-3周龄的雏番鸭，故称“三周病”。临床上以气喘、腹泻、生长迟缓、运动失调和出现神经症状为特征。 我国早在1987年，在福建饲养番鸭的部分地区就发现本病，它具有流行性，以后广东和浙江相继有发病流行的报道。近几年来，江苏、安徽等地也时有发生。世界上其他国家也有发病流行的报道，1989年秋，在法国西部集约化养鸭地区饲养的番鸭群也曾暴发本病，死亡率高达80%。

对死亡的番鸭如果处理不当，往往造成病毒的蔓延，产生更大的危害，目前社会上本病尚无特殊的抗病毒药物来防治番鸭细小病毒病。

发明内容

本发明目的在于提供一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于采用一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法，包括以下步骤：

1）从病变的番鸭中获得番鸭细小病毒；

2）制备一免番鸭细小病毒抗原；

3）制备二免番鸭细小病毒抗原；

 4）用二免番鸭细小病毒抗原制备番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗；

5）用一免番鸭细小病毒抗原制备番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗；

  6）用制备得到的抗原与疫苗免疫番鸭，得到抗番鸭细小病毒的血清。

  步骤1）所述的番鸭细小病毒的制备方法包括以下步骤：

A、在无菌的条件下取有典型病变的病鸭的心脏、肝脏、胆囊、肾、脾、胰腺、肠道、十二指肠、直肠，放入组织机捣碎；

B、取粉碎的组织，加入75%生理盐水混匀得到组织悬液，其中粉碎的组织占组织悬液总重的10%～20%，生理盐水占组织悬液总重的80～90%；

C、取组织悬液放入-20℃～-40℃冰箱中使组织液完全冻结为止，然后迅速放入37℃-40℃水浴锅中融化，反复冻融3～5次；

D、将反复冻融后的混悬液离心；

E、取离心后的上清液用孔径为0.22 um的滤菌膜过滤；

F、取除菌后的滤液，分别按每毫升滤液中加入2000单位-2500单位青霉素和2000单位-2500单位链霉素，然后放入0～4℃冰箱中备用。

步骤2）所述的一免番鸭细小病毒抗原的制备方法包括以下步骤：

A、用浓度为0.75%的生理盐水中稀释步骤1）制备得到番鸭细小病毒， 稀释100倍，得到稀释液，

B、用0.1ml-0.2ml的剂量接种12～14日龄的鹅胚的绒毛尿囊腔中；

C、接种后选取在48～120h之间具有胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿膜有轻度水肿的鹅胚，取其尿囊液；

D、在每毫升尿囊液中加入2000单位-2500单位的青霉素和2000单位-2500单位链霉素，即形成为一免番鸭细小病毒抗原，并将放入冰箱中在0～4℃条件下储藏备用。

步骤3）所述的二免番鸭细小病毒抗原的制备方法包括以下步骤：

A、取一免番鸭细小病毒抗原制备中经接种番鸭种毒后死亡的鹅胚体放入组织捣碎机中粉碎，取粉碎后的组织加入生理盐水混合，其中粉碎的组织占组织悬液总重的10%～20%，生理盐水占组织悬液总重的80～90%；

B、将混合组织悬液进行离心；

C、取离心后的上清液，在上清液中按每毫升分别加入2000单位-2500单位的链霉素和2000单位-2500单位）青霉素，

D、再加入总重的0.35%-0.4%的甲醛，制成灭活疫苗，即为二免番鸭细小病毒抗原，放入0～4℃冰箱备用。

步骤4）所述的番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗的制备方法包括以下步骤：按照佛氏不完全佐剂：二免番鸭细小病毒抗原=1:1的比例进行充分混合，即得到番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗。

步骤5）所述的番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗的制备方法包括以下步骤：按照佛氏完全佐剂：二免番鸭细小病毒抗原=1:1的比例进行充分混合，即得到番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗。

步骤6）所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法包括以下步骤：

A、选择健康无病的20日龄的番鸭，用一免佛氏完全佐剂疫苗在其颈部、腿部皮下进行多点注射，注射量均为1ml-2ml；

B、7天后用二免佛氏不完全佐剂疫苗进行皮下、腿部多点注射，注射量均为1ml-2ml；

C、再经7天后用不加佐剂的二免抗原进行皮下、腿部三免，注射量均为1ml-2ml；

D、三免注射后每隔5天采血一次，并进行抗体效价的检测，30天后当抗体效价在1：64～1：128范围时，在无菌条件下采集番鸭血；

E、将采集的血放入无菌容器中进行自然分离，吸取血清；

F、在得到的血清中加入1000单位-2000单位的青霉素和1000单位-2000单位链霉素，同时加入血清总重量1/10000的柳硫汞，即得到抗番鸭细小病毒的血清；

G、将得到的抗番鸭细小病毒的血清分装，经无菌检验、安全检验、效力检验和抗体效价检测后，冷冻保存。

    本发明有益效果：采用本发明方法制备得到的血清的效价高，1：64以上，对预防和治疗番鸭细小病毒具有显著的疗效，预防率为96.6%，治愈率70%。

具体实施方式

    实施例1从病变的番鸭中获得番鸭细小病毒

番鸭细小病毒的制备方法包括以下步骤：

A、在无菌的条件下取有典型病变的病鸭的心脏、肝脏、胆囊、肾、脾、胰腺、肠道、十二指肠、直肠，放入组织机粉碎；

B、取占组织悬液总量20%的粉碎组织与占组织悬液总量80%的浓度为0.75%的生理盐水，混匀，得到组织悬液；

C、取组织悬液放入-20℃冰箱中冷冻，然后迅速放入37℃水浴锅中融化，反复冻融3次；

D、将反复冻融后的混悬液在5000r/min条件下离心20min；

E、取离心后的上清液用孔径为0.22 um的滤菌膜过滤；

F、取除菌后的滤液，分别按每毫升滤液中加入2000单位的青霉素和2000单位的链霉素，得到番鸭细小病毒，然后放入4℃冰箱中备用。

实施例2  一免番鸭细小病毒抗原的制备

一免番鸭细小病毒抗原的制备方法包括以下步骤：

A、用浓度为75%的生理盐水中制备得到番鸭细小病毒， 稀释100倍，得到稀释液；

B、用0.1ml的剂量接种12日龄的鹅胚的绒毛尿囊腔中；

C、接种后选取在96h具有胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿膜有轻度水肿的鹅胚，取其尿囊液；

D、在每毫升尿囊液中加入2000单位青霉素和2000单位链霉素，即形成为一免番鸭细小病毒抗原，并将放入冰箱中在4℃条件下储藏备用。

实施例3  二免番鸭细小病毒抗原的制备

二免番鸭细小病毒抗原的制备方法包括以下步骤：

A、取一免番鸭细小病毒抗原制备中经接种番鸭种毒后死亡的鹅胚体放入组织捣碎机中粉碎，取粉碎后的组织加入生理盐水混合，其中粉碎的组织占组织悬液总重的10%，生理盐水占组织悬液总重的90%；

B、将混合组织悬液进行离心，离心条件5000r/min 离心20min；

C、取离心后的上清液，在上清液中按每毫升分别加入2000单位的链霉素和2000单位的青霉素，

D、再加入总重0.4%的甲醛，制成灭活疫苗，即为二免番鸭细小病毒抗原，放入4℃冰箱备用。

实施例4  番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗的制备

番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗的制备方法为：取1ml的佛氏不完全佐剂，加入1ml二免番鸭细小病毒抗原，充分混合，即可。

实施例5 番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗的制备

番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗的制备方法为：取1ml的佛氏完全佐剂，加入1ml一免番鸭细小病毒抗原，充分混合，即可。

实施例6  抗番鸭细小病毒血清的制备

制备抗番鸭细小病毒血清的方法包括以下步骤：

A、选择健康无病的20日龄的番鸭，用一免佛氏完全佐剂疫苗在其颈部、腿部皮下10个点进行注射，注射量均为1ml；

B、7天后用二免佛氏不完全佐剂疫苗在皮下、腿部10个点进行注射，注射量均为1ml；

C、再经7天后用不加佐剂的二免抗原在皮下、腿部10个点进行注射，注射量均为1ml；

D、在第三次注射后每隔5天采血一次，并进行抗体效价的检测，30天后当抗体效价在1：128时，在无菌条件下采集番鸭血；

E、将采集的血放入无菌容器中进行自然分离，吸取血清；

F、在得到的血清中加入1000单位的青霉素和1000个单位的链霉素，同时加入血清总重量1/10000的柳硫汞，即得到抗番鸭细小病毒的血清；

G、将得到的抗番鸭细小病毒的血清分装，经无菌检验、安全检验、效力检验和抗体效价检测后，冷冻保存。

实施例7 成品的检测

A. 无菌检验

取血清按0.1 mL分别接种于普通琼脂斜面、血平板、营养肉汤、厌氧肉汤培养基 ,培养 24～48 h应无菌生长。结果显示没有菌生长。

B. 安全检验

取健康的20日龄的番鸭10只，每只皮下注射2ml，观察7-10天，结果这这些实验番鸭全部健活。

C. 效价检测

用琼脂凝胶沉淀法检测血清效价，结果显示效价在1:64以上 。

D. 效力检验

取20日龄30 只 ,分成三组组。1 组为血清组, 2 组为生理盐水组对照组，3组为空白组对照，1、 2 组同时以番鸭细小病毒强毒攻击 ,攻毒24h血清组注射血清制品 1 mL/只，生理盐水组注射生理盐水 1 mL/只，观察 10 d, 血清组存活100 % ,空白组和死亡 70 %～100 %。

E. 保存期

该制品在 - 15 ℃条件下保存 3年仍有效。

Claims (7)

1.一种制备抗番鸭细小病毒血清的方法，所述的制备方法包括以下步骤：

1）从病变的番鸭中获得番鸭细小病毒；

2）制备一免番鸭细小病毒抗原；

3）制备二免番鸭细小病毒抗原；

4）用二免番鸭细小病毒抗原制备番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗；

5）用一免番鸭细小病毒抗原制备番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗；

 6）用制备得到的抗原与疫苗免疫番鸭，得到抗番鸭细小病毒的血清。

2.根据权利要求1所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法，其特征在于：步骤1）所述的番鸭细小病毒的制备方法包括以下步骤：

A、在无菌的条件下取有典型病变的病鸭的心脏、肝脏、胆囊、肾、脾、胰腺、肠道、十二指肠、直肠，放入组织机捣碎；

B、取粉碎的组织，加入75%生理盐水混匀得到组织悬液，其中粉碎的组织占组织悬液总重的10%～20%，生理盐水占组织悬液总重的80～90%；

C、取组织悬液放入-20℃～-40℃冰箱中冷冻，使组织液完全冻结为止，然后迅速放入37℃-40℃水浴锅中融化，反复冻融3～5次；

D、将反复冻融后的混悬液离心；

E、取离心后的上清液用孔径为0.22 um的滤菌膜过滤；

F、取除菌后的滤液，分别按每毫升滤液中加入2000单位-2500单位（青霉素和2000单位-2500单位链霉素，然后放入0～4℃冰箱中备用。

3.根据权利要求1所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法，其特征在于：步骤2）所述的一免番鸭细小病毒抗原的制备方法包括以下步骤：

A、用浓度为0.75%的生理盐水中稀释步骤1）制备得到番鸭细小病毒， 稀释100倍，得到稀释液，

B、用0.1ml-0.2ml的剂量接种12～14日龄的鹅胚的绒毛尿囊腔中；

C、接种后选取在48～120h之间具有胚体有广泛出血，毛囊出血，肝脏变性和坏死，绒毛尿膜有轻度水肿的鹅胚，取其尿囊液；

D、在每毫升尿囊液中加入2000单位-2500单位的青霉素和2000单位-2500单位链霉素，即形成为一免番鸭细小病毒抗原，并将放入冰箱中在0～4℃条件下储藏备用。

4.根据权利要求1所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法，其特征在于：步骤3）所述的二免番鸭细小病毒抗原的制备方法包括以下步骤：

A、取一免番鸭细小病毒抗原制备中经接种番鸭种毒后死亡的鹅胚体放入组织捣碎机中粉碎，取粉碎后的组织加入生理盐水混合，其中粉碎的组织占组织悬液总重的10%～20%，生理盐水占组织悬液总重的80～90%；

B、将混合组织悬液进行离心；

C、取离心后的上清液，在上清液中按每毫升分别加入2000单位-2500单位的链霉素和2000单位-2500单位）青霉素，

D、再加入总重的0.5%-0.4%的甲醛，制成灭活疫苗，即为二免番鸭细小病毒抗原，放入0～4℃冰箱备用。

5.根据权利要求1所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法，其特征在于：步骤4）所述的番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗的制备方法包括以下步骤：按照佛氏不完全佐剂：二免番鸭细小病毒抗原=1:1的比例进行充分混合，即得到番鸭细小病毒佛氏不完全佐剂疫苗。

6.根据权利要求1所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法，其特征在于：步骤5）所述的番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗的制备方法包括以下步骤：按照佛氏完全佐剂：二免番鸭细小病毒抗原=1:1的比例进行充分混合，即得到番鸭细小病毒佛氏完全佐剂疫苗。

7.根据权利要求1所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法，其特征在于：步骤6）所述的制备抗番鸭细小病毒血清的方法包括以下步骤：

A、选择健康无病的20日龄的番鸭，用一免佛氏完全佐剂疫苗在其颈部、腿部皮下进行多点注射，注射量均为1ml-2ml；

B、7天后用二免佛氏不完全佐剂疫苗进行皮下、腿部多点注射，注射量均为1ml-2ml；

C、再经7天后用不加佐剂的二免抗原进行皮下、腿部三免，注射量均为1ml-2ml；

D、三免注射后每隔5天采血一次，并进行抗体效价的检测，30天后当抗体效价在1：64～1：128范围时，在无菌条件下采集番鸭血；

E、将采集的血放入无菌容器中进行自然分离，吸取血清；

F、在得到的血清中加入1000单位-2000单位的青霉素和1000单位-2000单位链霉素，同时加入血清总重量1/10000的柳硫汞，即得到抗番鸭细小病毒的血清；

G、将得到的抗番鸭细小病毒的血清分装，经无菌检验、安全检验、效力检验和抗体效价检测后，冷冻保存。