CN104069489A

CN104069489A - 鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN104069489A
Application number: CN201410326770.5A
Authority: CN
Inventors: 于漾; 朱亚露; 揭鸿英; 毕志香; 褚轩; 何家惠; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2034-07-09
Also published as: CN104069489B

Abstract

本发明提供鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法，属于生物工程领域。所述疫苗活性成分为灭活的鸡新城疫病毒LaSota株和传染性法氏囊病毒NJ09株CGMCC NO：7758。本发明提供该疫苗的制备方法，将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液与传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩、灭活，然后混合均匀，得到混合病毒液；将混合病毒液与佐剂混合均匀。本发明灭活疫苗，含有灭活的传染性法氏囊病毒NJ09株，该毒株是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好；该二联灭活疫苗免疫后抗体水平高，免疫攻毒保护率高，对传染性法氏囊标准强毒株、超强毒株攻毒保护率达到90%以上，免疫持效期达到5个月。

Description

鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

鸡新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病。鸡新城疫(Newcastle disease，ND)是由鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高，对养鸡业危害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。

传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease Virus，缩写为IBDV)隶属于双RNA病毒科双RNA病毒属，此病主要损害鸡体淋巴器官造成免疫抑制，从而导致多种疫苗免疫无效及对其它疾病如新城疫、球虫病等的易感性增高而引起经济损失。传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)于1957年首次发生于美国Delware州南部Gumboro地区，我国于1979年相继在广州、北京、上海发现本病，对实际养殖生产造成重大损失，IBDV疫苗研究随即展开，至今国内外已开发出弱毒、中等毒力活疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗，对该病防控起到一定作用。但是近年来，我国一些地方，特别是在法氏囊母源抗体高低不齐的蛋鸡和肉鸡饲养区，仍然屡有传染性法氏囊病(IBDV)的发生和流行，其原因主要为：一是超强毒株出现。IBDV在野外环境中变异能力很强，每年均有超强毒力的IBDV野毒出现，这一类毒株的毒力极有可能突破现有疫苗的保护，从而导致免疫鸡群出现感染发病、死亡的现象。二是弱毒疫苗无法突破母源抗体。现行免疫程序中IBDV弱毒苗一般在14～18日龄免疫，接种后进入鸡体内的活病毒会被母源抗体捕获、中和而失去复制活性，因而不能达到保护效果。同时雏鸡体内母源抗体由高逐渐消减，虽有一定保护力但开始有部分鸡暴露在感染威胁当中。三是传染性法氏囊灭活疫苗研究落后。目前市场上使用的灭活疫苗一类是法氏囊全病毒灭活疫苗，使用传染性法氏囊病毒株适应细胞制备，另一类是基因工程疫苗，采用大肠杆菌表达传染性法氏囊病毒VP2基因制备。这两种疫苗可以产生一定的免疫保护效果，但是，对于出现基因变异的超强毒株，会出现保护性下降的情况。因此，针对目前我国鸡传染性法氏囊病发病趋势，分离法氏囊超强毒流行毒株，筛选其中免疫原性好、且可以适应细胞繁殖的种毒制备疫苗，对于该病的预防具有极其重要的意义，是符合生产实际需求的重要产品。

目前新城疫、传染性法氏囊严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗的免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、传染性法氏囊，已有相应的灭活单苗及二联灭活苗，但是免疫剂量大，抗体水平低，保护率不高，给免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制出免疫剂量小，免疫效果更好的新城疫、传染性法氏囊二联苗是一项具有重要意义的工作。

发明内容

本发明的目的在于提供鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，含有灭活的传染性法氏囊病毒NJ09株，该毒株是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好；该二联灭活疫苗免疫后抗体水平高，免疫攻毒保护率高，对传染性法氏囊标准强毒株及目前流行的法氏囊超强毒株攻毒保护率达到90％以上，一次免疫，免疫持效期达到5个月。

本发明的另一目的在于提供鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全、成本低。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，其活性成分为灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和传染性法氏囊病毒NJ09株，所述传染性法氏囊病毒NJ09株的保藏号为CGMCC NO：7758。

本发明还提供所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液与传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩、灭活，然后混合均匀，得到混合病毒液；将所述混合病毒液与佐剂混合均匀，得到所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。

在本发明中，将鸡新城疫病毒La Sota株接种鸡胚进行培养，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液；将传染性法氏囊病毒NJ09株接种DF-1细胞或Vero细胞进行培养，得到所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液。

在本发明中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量大于等于10^8.0EID₅₀/ml，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液的病毒含量大于等于10^7.0TCID₅₀/ml。

优选的技术方案中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至原体积的1/4-1/2，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液浓缩至原体积的1/5-1/7。

优选的技术方案中，所述浓缩后的鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别灭活后，按照体积比2:(1-3)混合均匀，得到混合病毒液。

在本发明中，将混合病毒液与吐温-80按照体积比96∶4混合均匀，得水相；将注射用白油和司本－80按照体积比为94：6混匀，得油相；将油相和水相按照体积比2∶1混合均匀，获得鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。

有益效果：

(1)鸡新城疫病毒La Sota株，是我国鸡新城疫疫苗制造的标准毒株，规模化生产工艺成熟、稳定，免疫原性好，安全。

(2)传染性法氏囊病毒NJ09株，是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好且适应细胞规模化培养。

(3)本发明二联灭活疫苗中含有的鸡新城疫病毒为标准制苗株La Sota株，成品按照20μl/羽份免疫SPF鸡后21天，新城疫抗体水平不低于4log2，达到效力检验标准；传染性法氏囊病毒NJ09株，是超强的流行毒株、免疫原性强、攻毒保护性好且适应细胞规模化培养。本发明二联灭活疫苗免疫后，抗体水平高，免疫攻毒保护率高，对传染性法氏囊标准强毒株及目前流行的法氏囊超强毒株攻毒保护率达到90％以上，一次免疫，免疫持效期达到5个月。

本发明制备鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的方法，简单、安全、成本低。

附图说明

图1是IBDV NJ09株F1、F2代细胞毒RT-PCR扩增产物的电泳图，其中泳道1-F1代细胞毒；2-F2代细胞毒；3-法氏囊病毒标准阳性对照；4-阴性对照；M-Marker。

保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

参椐的生物材料(株)：NJ09株。

分类命名：传染性法氏囊病毒。

保藏号：CGMCC NO.7758。

保藏日期：2013年6月20日。

具体实施方式

鸡新城疫病毒La Sota株：购自中国兽医药品监察所。

传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease Virus)BC6/85株、B87株来源：

购自中国兽医药品监察所。

具体实施方式

实例1 传染性法氏囊病毒NJ09株的分离与鉴定

1.NJ09株的分离

(1)病料

病料为无菌采集疑似法氏囊病死亡病鸡的法氏囊组织、心血、肝、脑、肺。

(2)组织触片

将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片，并进行染色镜检，发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。

(3)细菌培养

将上述病料，分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养(按现行《中国兽药典》附录方法配制)，结果显示无菌落生长，说明所述病料中不含有细菌。

(4)病料处理

将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素)作1∶5倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液保存于-20℃备用。

(5)病毒分离、细胞驯化及收获

将本实施例标题4中获得的上清液，尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种量0.2ml，接种后置37℃条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去，收获24小时以后死亡鸡胚尿囊膜及胚体，组织捣碎后，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含1000单位的青霉素和1000单位的链霉素)作1∶2倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液，即为通过鸡胚传代获得的抗原毒(鸡胚组织毒)E1代，并连续通过鸡胚传至E4代，测定红细胞凝集价及病毒含量。将红细胞凝集价测定为阴性，病毒含量不低于10^5.0ELD₅₀/0.2ml的抗原液1ml，接种已长成单层的DF-1细胞(由ATCC引进)，再加入9ml维持液(MEM营养液，购自默克密理博所属北京清大天一科技有限公司，按商品说明现配现用)，37℃培养。培养时间达到120小时，收获细胞毒，置－20℃反复冻融3次，离心取上清液连续盲传26代，然后接种DF-1细胞出现典型病变，收获细胞毒抗原液标记为F1代；继续在DF-1细胞上传1代，收获细胞毒抗原液，标记为F2代。取F2代细胞毒进行VP2基因序列测定。F2代细胞毒VP2全基因的RT-PCR扩增结果表明：扩增产物长度为1300bp(见图1)与设计片段大小完全相符测序，表明为鸡传染性法氏囊病毒，置－20℃保存。将F2代细胞毒通过DF-1细胞扩繁获得的种毒(细胞毒)，命名为传染性法氏囊病毒CV02株，缩写为IBDV CV02株。

(6)纯化获得NJ09株

采用细胞或鸡胚分离的病毒液中可能会混有1种或1种以上可以繁殖的其他病毒，需要通过纯化试验去除CV02株中混杂的野毒，分离到纯净、均一生长的传染性法氏囊病毒。按《中国兽药典》2010版附录44页方法制备CEF(鸡胚成纤维细胞)，细胞数为1.0-1.5×10⁶/ml,铺96孔细胞板,每孔加入0.1ml细胞悬液。将CV02株先10倍梯度稀释至10^-4，再2倍梯度、3倍梯度、5倍梯度分别稀释至2^-10、3^-10、5^-10。各稀释度病毒接96孔细胞板，每孔接0.2ml，接毒后置37℃培养5天，每天观察细胞病变情况。待细胞孔出现单个蚀斑时，把此孔细胞毒单独回收，反复冻融3次，-20℃保存备用。选择稀释度最高的蚀斑毒按此方法重复克隆两次。测定第三次挑选的蚀斑毒病毒含量，共挑选蚀斑毒三株，其中第一株病毒含量为10^7.1TCID₅₀/ml,高于另外两株10^6.5TCID₅₀/ml、10^6.7TCID₅₀/ml。选择病毒含量最高蚀斑毒命名为NJ09株，做为制苗用种毒，作为基础种毒F1代，并通过DF-1细胞连续传至F15代。

2.NJ09株鉴定和性质

(1)无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，NJ09株F1代种毒样品接种后，无菌生长。

(2)病毒含量测定

将NJ09株F1代病毒液10倍系列稀释后，取10^-6、10^-7、10^-8、10^-9四个稀释度，分别接种96孔细胞板上的单层鸡胚成纤维细胞，置37℃孵育120小时。120小时后，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明：NJ09株F1代种毒的病毒含量为10^7.1TCID₅₀/ml。

(3)特异性试验

将NJ09株F1代病毒液用灭菌生理盐水作1∶100稀释，与购自中国兽医药品监察所的鸡传染性法氏囊标准阳性血清混合，置37℃中和60分钟后，接种鸡胚成纤维细胞，0.2ml/孔(中和组)。同时设病毒对照组和阴性对照组各5孔，分别接种NJ09株F1代病毒液1∶100稀释液及灭菌生理盐水，0.1ml/孔。接种后置37℃培养5天，每天观察细胞病变情况。中和组、阴性对照组细胞无病变，病毒对照组所有孔全部出现典型病变，说明该毒株具有特异性，是传染性法氏囊病毒，命名为传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease Virus)NJ09株，缩写为IBDV NJ09株或传染性法氏囊病毒NJ09株或NJ09株，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

(4)毒力测定

(a)VP2基因序列分析

RT-PCR扩增IBDV NJ09株的VP2基因，序列如SEQ ID NO:1所示。IBDVNJ09株的VP2基因序列与已报道强毒(HarBin-1)同源性99％，提示IBDV NJ09株具有强毒力。

(b)对SPF鸡的毒力试验

攻毒用组织毒制备：将IBDV NJ09株病毒(10⁵BID/0.1ml)与IBDV经典制苗株B87株(10^5.5ELD/0.2ml)、IBDV标准攻毒毒株BC6/85株病毒液(10⁵BID/0.1ml)，分别按照1∶10稀释，点眼感染SPF鸡，72小时后剖检，分别收获各毒株感染鸡法氏囊组织，捣碎后加入组织体积3倍的生理盐水，即为攻毒用组织毒B1代，按此方法，用B1代组织毒再次感染SPF鸡并收获法氏囊组织，即为B2代组织毒。制备IBDV NJ09株B1、B2代组织毒，BC6/85株B1、B2代组织毒，B87株因是弱毒株，连续两次感染SPF鸡均不能使试验鸡发病。

毒力对比试验：取NJ09株病毒B1、BC6/85株B2和B87株E5代分别对SPF鸡进行攻毒，统计攻毒后72小时内SPF鸡的死亡数、感染数，结果如表1所示。从表1看出，NJ09株点眼感染SPF鸡后，可引起试验鸡72小时内50％死亡，感染率100％；BC6/85株可引起试验鸡100％感染，但不致死；B87株为制苗弱毒株，即便通过点眼、静脉注射接种，也未能引起试验鸡感染发病。各毒株攻毒试验结果说明，NJ09株毒力比IBDV标准攻毒毒株BC6/85株更强，是超强流行毒株，不仅能引起试验鸡100％感染，而且还会造成50％死亡。

表1各毒株对SPF鸡毒力比较试验结果

NJ09株与BC6/85株毒力对比：用NJ09株、BC6/85株各代次组织毒进行了对SPF鸡毒力试验，进一步对比两株病毒的毒力，结果(如表2和表3)表明：BC6/85株组织毒按照1∶2～1∶10⁴多个稀释度稀释后接种SPF鸡，可引起试验鸡80％以上感染，但未出现死亡鸡只；NJ09株按照1∶5～1∶10⁶稀释度稀释后接种SPF鸡，引起试验鸡80％以上感染，并且出现20％～66.7％的死亡率。因此认为，NJ09株为临床流行的强毒株，其毒力明显较目前疫苗效检使用的BC6/85株强，因此，针对该流行强毒免疫保护力开展疫苗研究是十分必要的。

表2BC6/85株各代次攻毒试验结果

表3NJ09株各代次攻毒试验结果

(5)免疫原性测定

将NJ09株F1代基础种毒，接种生长良好的DF-1单层细胞，收获F2代抗原。制成含量为10^6.7TCID₅₀/0.3ml的灭活疫苗，具体方法如下：将注射用白油和司本-80按照体积比94：6混合均匀后作为油相溶液。采用甲醛灭活传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液，得到灭活病毒液。将灭活病毒液和吐温-80按照体积比96：4混合均匀，作为水相溶液备用。将油相溶液和水相溶液按照体积比2:1混和均匀，即获得灭活疫苗。

将灭活疫苗按0.3ml/羽份免疫1月龄SPF鸡20只，另取10只不免疫，作为空白对照。免疫28天后，所有试验鸡采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》中方法进行血清中和试验及琼扩试验。同时对免疫组分别取10只鸡进行标准强毒株和超强流行毒株攻毒保护试验，对照组鸡分别取5只鸡进行标准强毒株和超强流行毒株攻毒保护试验。

标准强毒株攻毒保护试验：用IBDV标准强毒株BC6/85株B2代组织毒进行攻毒，每只鸡点眼0.1ml(含10个BID)，攻毒后观察72小时内鸡群状态，如出现死亡，进行剖检；72小时后对存活鸡逐只剖检。若出现法氏囊出血、水肿，胸肌腿肌刷状出血，肌胃腺胃交界处出血等其中一种法氏囊典型病变，则判为感染。以试验鸡剖检后组织正常，未出现肌肉出血、肌胃腺胃交界处出血及法氏囊出血、发黄、肿大等IBDV特征性病变判为阴性。

超强流行毒株攻毒保护试验：用IBDV NJ09株B2代组织毒进行攻毒，每只鸡点眼0.1ml(含5个BID)，攻毒后观察72小时内鸡群状态，如出现死亡，进行剖检；72小时后对存活鸡逐只剖检。若出现法氏囊出血、水肿，胸肌腿肌刷状出血，肌胃腺胃交界处出血等其中一种法氏囊典型病变，则判为感染；以试验鸡剖检后组织正常，未出现肌肉出血、肌胃腺胃交界处出血及法氏囊出血、发黄、肿大等IBDV特征性病变判为阴性。

结果表明，该疫苗按照0.3ml/羽份剂量免疫后28天，免疫组血清中和试验抗体水平为1∶10085，高于现有标准(1∶5120)，琼扩抗体水平9/10不低于1∶8，平均值为1∶15.6，达到现有标准。标准强毒攻毒保护试验结果表明，免疫组所有标准强毒攻毒鸡只均为阴性，对照组所有标准强毒攻毒鸡只均感染。超强毒株攻毒保护试验结果表明，免疫组所有超强毒株攻毒鸡只为阴性，对照组所有超强毒株攻毒鸡只均感染。

传染性法氏囊病毒NJ09株生物学特性研究结果表明，该毒株是超强流行毒株，可在DF-1细胞上高滴度增殖，免疫原性好，能完全抵抗同源病毒攻击，异源攻毒保护率也高达100％。因此可作为传染性法氏囊疫苗候选毒株，用于制备灭活疫苗。

实例2鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备

1.制苗用毒种来源：

制造本发明鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗用的毒种为鸡新城疫病毒La Sota株和传染性法氏囊病毒NJ09株；传染性法氏囊病毒NJ09株的保藏号为CGMCC NO：7758。

鸡新城疫病毒La Sota株(中国兽医药品监察所菌毒种编号：CVCC AV1615株)购自中国兽医药品监察所，传染性法氏囊NJ09株由江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心分离、鉴定，提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

2.病毒液的制备：

(1)制备鸡新城疫病毒La Sota株病毒液：将鸡新城疫病毒La Sota株接种至SPF鸡胚进行培养，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液，其病毒含量大于等于10^8.0EID₅₀/ml。

具体方法如下：

接种：取鸡新城疫病毒La Sota株，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10^-4或10^-5)，尿囊腔内接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察：鸡胚接种后，每日照蛋1次，将60小时以前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时弃去。当孵育时间达到96～120小时，不论死亡与否，全部收回，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液。鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量应大于等于10^8.0EID₅₀/ml。

在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入适宜抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位)，每组抽样测定红细胞凝集价，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

注意：在吸取胚液前，对每个鸡胚均应注意检查，凡出现腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获。

(2)制备传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液：将传染性法氏囊病毒NJ09株接种至DF-1细胞进行培养，收获传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液，其病毒含量大于等于10^7.0TCID₅₀/ml。

细胞复苏：DF-1细胞从液氮中取出，置37℃水浴中迅速化开后，1000rpm离心5分钟去除DMSO。细胞用1ml、含有5％(体积百分浓度)小牛血清的MEM营养液重悬后加到细胞瓶中，在细胞瓶中补加9ml MEM营养液，进行细胞培养。

细胞传代：待DF-1细胞长成致密单层后，用3-5ml PBS缓冲液洗细胞表面，再用0.1％胰酶消化细胞，细胞分散成单个细胞后，加入细胞生长液(含有5％(体积百分浓度)小牛血清的MEM营养液)，按1:3的比例分瓶。分瓶后把细胞置37℃的CO₂培养箱中培养。

IBDV接毒：DF-1细胞长成致密单层后，弃去培养液，用PBS洗细胞表面一次，加入含10％(体积百分浓度)小牛血清的MEM营养液，再加入IBDV NJ09株病毒液0.1ml，置CO₂培养箱中37℃条件下培养，待细胞出现80％细胞病变时，收获细胞毒，在-20℃冰箱中反复冻融3次，3000rpm离心10分钟去除细胞碎片，取上清液作为传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液，病毒含量大于等于10^7.0TCID₅₀/ml，保存于-70℃。

在传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液中加入抗生素(每毫升毒液中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位)，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

3.病毒液的浓缩与灭活：将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩，然后分别加入甲醛获得灭活病毒液。

(1)病毒液的浓缩：

将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别连续离心进行澄清(连续离心转速：10000转/秒)，除去病毒液中的大颗粒或细胞碎片，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统(购自美国Millipore公司，超滤膜孔径：100KD)，将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至原体积的1/3，将传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液浓缩至原体积的1/6。用鸡新城疫病毒La Sota株病毒液超滤浓缩过程中产生的滤出废液测定血凝价，应无血凝性。用传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液超滤浓缩过程中产生的滤出废液接种DF-1细胞，应不产生细胞病变(CPE)。

(2)病毒液的灭活：在浓缩后的鸡新城疫病毒La Sota株病毒液、浓缩后的传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液中分别加入10％甲醛水溶液(质量百分浓度)，得到各毒株的灭活病毒液。甲醛水溶液的加入量为浓缩病毒液体积的0.2％。

具体方法如下：

将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液或传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液置无菌灭活罐内，加入甲醛水溶液，随加随搅拌，使其充分混合。加完甲醛溶液后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内，置37℃下灭活36小时，即获得灭活病毒液。停止灭活后，从罐内取样进行灭活检验。灭活病毒液置2～8℃保存。

4.乳化：

(1)油相制备：将注射用白油和司本-80按照体积比为94：6混匀，作为油相。

(2)水相制备：将鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株灭活病毒液按体积比1:1混合均匀，得到混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80按照体积比96∶4混合，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，即得水相。

(3)乳化：将油相和水相按照体积比2∶1混合，搅拌均匀，获得鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。

具体操作步骤如下：将2份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相一份，加完后继续搅拌10～15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般6～8次)，乳化后取10ml疫苗，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象。

注：疫苗的配制过程需无菌操作。

为了检验鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的安全性、免疫效力和免疫持续期，按照上述方法制备五批次二联灭活疫苗：20110308201、20110310202、20110314203、20121118204、20121118205。

实施例3鸡新城疫和传染性二联灭活疫苗安全性试验

将实施例2制备5批次鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗(批号：20110308201、20110310202、20110314203、20121118204、20121118205)，进行安全性试验。

对7日龄SPF鸡、7日龄三黄肉鸡颈背部皮下注射鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗.0.6ml/只(双倍剂量)，通过观察接种后14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应以及接种后14天、28天疫苗吸收情况，对疫苗安全性进行研究。

试验设计：试验鸡用7日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)和7日龄三黄肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射五批鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照；对三黄肉鸡分别双倍剂量(0.6ml/只)颈部皮下注射三批鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照。

结果：7日龄SPF鸡和7日龄三黄肉鸡接种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，14日内未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表4。接种后14天，剖检注射部位80％以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒，说明疫苗未吸收完全；注射后28天剖检，大部分接种对象已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，见表4。因此，鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。

表4接种后14天和28天疫苗吸收检验结果

实施例4鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗免疫效力试验

将实施例2方法制备的五批疫苗(批号：20110308201、20110310202、20110314203、20121118204、20121118205)，参照二〇一〇年《中国兽药典》标准进行鸡新城疫血清学效力检验、法氏囊中和抗体血清学效力检验及攻毒保护效力检验，参照《兽用生物制品质量标准汇编(2006-2008)上册》标准进行法氏囊琼扩抗体血清学效力检验。

1.鸡新城疫效力检验标准：按照二〇一〇年《中国兽药典》中“鸡新城疫灭活疫苗效力检验”标准血清学方法，以20μl二联灭活疫苗免疫后21日，免疫鸡HI抗体效价的几何平均值应不低于1∶16(或4log2)，未免疫对照鸡HI抗体效价均应不高于1∶4判为合格。

2.传染性法氏囊效力检验标准：以1羽份(0.3ml)二联灭活苗免疫后28日，免疫鸡血清抗体的几何平均值不低于1∶5120，同时至少80％免疫组鸡只琼扩抗体水平不低于1∶8，判为血清学效力检验合格；攻毒保护效力检验以至少80％免疫组鸡只被保护，对照鸡至少80％发病判为合格，以所有制品三种效力检验均达到相应标准判为合格。

(1)五批疫苗鸡新城疫部分免疫效力检验

每批疫苗取1月龄SPF鸡15只，其中10只作为免疫组，每只SPF鸡颈部皮下注射20μl鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗；另5只作为对照组，不免疫。免疫后21天采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》方法进行血凝抑制试验。

(2)20110308201、20110310202、20110314203三批疫苗传染性法氏囊部分免疫效力检验

20110308201、20110310202、20110314203三批苗，每批取1月龄SPF鸡15只，其中10只各颈部皮下注射二联灭活疫苗0.3ml，另5只不接种，作为对照。28日后采血，按现行《中国兽药典》方法进行血清中和试验及琼扩抗体检验，测定血清中传染性法氏囊抗体水平。同时，对免疫鸡和对照鸡用传染性法氏囊病毒标准强毒株BC6/85株攻毒，每只0.1ml(含10BID)，点眼。攻毒后第3天逐只剖检，若出现法氏囊出血、水肿，胸肌腿肌刷状出血，肌胃腺胃交界处出血等其中一种法氏囊典型病变，则判为感染。

(3)20121118204、20121118205两批疫苗传染性法氏囊部分免疫效力检验

每批取1月龄SPF鸡30只，其中20只各颈部皮下注射灭活疫苗0.3ml，另10只不接种，作为对照。28日后采血，按现行《中国兽药典》方法进行血清中和试验及琼扩抗体检验，测定血清中传染性法氏囊抗体水平。同时，对试验鸡和对照鸡用传染性法氏囊病毒标准强毒株BC6/85株及超强毒株NJ09株攻毒。

标准强毒株(传染性法氏囊病毒BC6/85株)攻毒效检方法：用IBDV标准强毒株BC6/85株B2代组织毒强毒进行攻毒，每只鸡点眼0.1ml(含10个BID)。攻毒后观察72小时内鸡群状态，如出现死亡，进行剖检，72小时后对存活鸡逐只剖检，若出现法氏囊出血、水肿，胸肌腿肌刷状出血，肌胃腺胃交界处出血等其中一种法氏囊典型病变，则判为感染。

超强流行毒株(传染性法氏囊病毒NJ09株)攻毒效检方法：用传染性法氏囊NJ09株B2代组织毒强毒进行攻毒，每只鸡点眼0.1ml(含5个BID)。攻毒后观察72小时内鸡群状态，如出现死亡，进行剖检，72小时后对存活鸡逐只剖检，若出现法氏囊出血、水肿，胸肌腿肌刷状出血，肌胃腺胃交界处出血等其中一种法氏囊典型病变，则判为感染。

(4)五批疫苗的鸡新城疫部分效力检验结果

各批疫苗免疫后21天，鸡新城疫血凝抑制抗体平均效价为5.1log2～5.6log2，均不低于4log2的标准，对照组均不高于2log2，达到合格标准，结果见表5。

表5五批次鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗免疫后，新城疫血凝抑制检验结果

(5)五批疫苗的传染性法氏囊部分效力检验结果

各批疫苗免疫后28天，传染性法氏囊血清中和抗体水平为1∶11061～1∶13074，各免疫组琼扩抗体均9/10以上不低于1∶8，达到血清学效力检验标准；攻毒后，五批制品免疫组均9/10以上被保护，对照组均5/5感染，达到攻毒保护效力检验标准。以上结果表明，五批传染性法氏囊灭活疫苗均达到质量标准。结果见表6、表7、表8。

表6五批鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗免疫后，28天传染性法氏囊血清中和抗体的几何平均值测定结果

疫苗批号	平均值(1：n)
		20110308201批	11958
20110310202批	11879
		20110314203批	11061
对照组	0
		20121118204批	12582
20121118205批	13074
		对照组	0

表7五批鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗免疫后28天，传染性法氏囊血清琼扩抗体水平测定结果

表8五批鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗攻毒保护效力检验结果

实施例5鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗与同类产品比较试验及免疫持效期测定

为了对比本发明鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗与目前市场销售的其他同类产品的免疫效果及本发明二联灭活疫苗的免疫持效期，将实施例2制备的批号为20121118205鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗(每羽份疫苗中鸡新城疫病毒La Sota株为10^8.0EID₅₀、传染性法氏囊病毒NJ09株为10^7.0TCID₅₀)与国产产品和进口产品开展效力比较试验。

购买山东滨州沃华生物工程有限公司的鸡新城疫、传染性法氏囊二联灭活疫苗(兽药生字(2012)151722039，生产批号：130302，生产日期：20130320，有效期至：20140319)作为国产同类制品，每羽份疫苗中鸡新城疫病毒La Sota株为10^8.0EID₅₀、鸡传染性法氏囊抗原(BJQ902株)灭活前病毒含量不低于10^7.0TCID₅₀。

购买梅里亚动物保健有限公司进口产品，鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗(Ulster2C株+M41株+VNJ0株)，商品名：高力优，含灭活前鸡新城疫病毒(Ulster2C株)10^8.0EID₅₀/羽、传染性支气管炎病毒(M41株)10^6.7EID₅₀/羽、传染性法氏囊病毒(VNJ0株)10^5.7CCID₅₀/羽。批准文号：兽药生字(2011)100142126，生产批号：13042036。

对于不同产品中IBDV含量的说明：本次试验中所选择的制品均为市售产品，因各产品中所使用IBDV毒株不同，免疫原性也不相同，因此含量并不完全相同。但各制品中抗原添加量的标准是：使制品达到效检质量标准的有效含量。因此将各制品按照相应的使用剂量进行免疫效力比较。

为了与同类制品相区分，下述实验中，将本发明鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗简称为自制疫苗。

抗体产生期、免疫持效期及鸡新城疫和传染性法氏囊效力检验方法：将SPF鸡设为自制疫苗组、同类制品1组(国产产品)、同类制品2组(进口产品)和对照组。每组分别取30只鸡，另取15只作为对照。接种方法：自制疫苗组与同类制品组均采用颈部皮下注射，按照相应使用剂量(均为0.3ml/只)接种，对照组不接种。接种后7、14、21、28日、2个月、3个月、4个月、5个月，各组分别随机抽取10只鸡采血，测定血清中鸡新城疫抗体和传染性法氏囊抗体，通过测定免疫后抗体产生期、血清学效力检验、攻毒保护效力检验及抗体持续情况对比各种疫苗的免疫效果。免疫后28天，免疫组各抽取20只鸡，对照组抽取10只鸡，取抽检鸡中的一半进行IBDVBC6/85株攻毒保护试验，另一半进行NJ09株攻毒保护试验。

(1)鸡新城疫效力检验：各批疫苗按20μl/只免疫SPF鸡后21天，自制疫苗免疫组、同类制品1组、2组鸡新城疫的抗体效价分别为5.5log2、4.2log2、4.4log2，均达到新城疫血清学效检标准(4log2)，结果见表9。

表9与同类制品比较试验鸡新城疫血清学效力检验结果(log2)

(2)鸡新城疫病毒抗体产生期及免疫持效期测定结果：每种疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周龄SPF鸡后，鸡新城疫病毒抗体在免疫后7～14天产生，自制疫苗免疫后14天，平均抗体水平为5.6log2，同类制品分别为3.6log2和2.3log2。自制苗组免疫后5个月平均抗体水平为4.5log2，达到新城疫血清学效检标准(4log2)，同类制品1组免疫后4个月，平均抗体水平为3.6log2，同类制品2组免疫后3个月，平均抗体水平为3.2log2，均低于新城疫血清学效检标准。结果表明，自制疫苗免疫后产生的鸡新城疫抗体水平高于同类苗免疫组，且免疫持续期可达到5个月，较同类制品长1～2个月，结果见表10。

表10各疫苗新城疫抗体水平及持效期测定结果

(3)传染性法氏囊中和抗体产生期及免疫期测定结果：三种疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周龄SPF鸡后，传染性法氏囊中和抗体在免疫后7～14天产生。自制疫苗免疫后14天，抗体水平为1∶104，同类制品分别为1∶9和1∶2。免疫后28天，自制苗、同类制品1组、2组中和抗体水平分别为1∶13074、1∶11879、1∶8192，均达到传染性法氏囊中和抗体血清学效检标准(1∶5000)。自制苗组免疫后5个月平均抗体水平为1∶5793，达到传染性法氏囊中和抗体血清学效检标准；同类制品1组免疫后4个月，抗体水平为1∶1883，同类制品2组免疫后3个月，抗体水平为1∶3327，均低于中和抗体血清学效检标准。结果表明，自制疫苗免疫后产生的鸡传染性法氏囊中和抗体水平显著高于同类苗免疫组，高抗体水平维持时间较同类制品长，且免疫持续期可达到5个月，较同类制品长2个月以上，结果见表11。

表11传染性法氏囊中和抗体测定结果

(4)传染性法氏囊琼扩抗体产生期及免疫期测定结果：三种疫苗按照1羽份(0.3ml)免疫3周龄SPF鸡后，传染性法氏囊中和抗体在免疫后7～14天产生。自制疫苗免疫后14天，抗体合格率为4/10，同类制品分别为0/10和0/10。免疫后28天，自制苗、同类制品1组、2组琼扩抗体合格率分别为10/10、9/10、9/10，均达到传染性法氏囊中和抗体血清学效检标准(8/10)。自制苗组免疫后5个月抗体合格率为8/8，达到传染性法氏囊琼扩抗体血清学效检标准；同类制品1组免疫后4个月，抗体合格率为3/10，同类制品2组免疫后3个月，抗体合格率为5/10，均低于传染性法氏囊琼扩抗体血清学效检标准。结果表明，自制疫苗免疫后产生的鸡传染性法氏囊琼扩抗体水平合格率及平均值均显著高于同类苗免疫组，高抗体水平维持时间较同类制品长，且免疫持续期可达到5个月，较同类制品长2个月以上，结果见表12。

表12各疫苗免疫后传染性法氏囊琼扩抗体测定结果

注：自制疫苗免疫组免疫后4、5个月，分别有1只鸡因卡在隔离器自动饮水器管上致死。

(5)传染性法氏囊效力检验结果：各批苗免疫后28天，进行IBDV标准强毒BC6/85株、超强毒株NJ09株攻毒保护试验。自制苗免疫组对两种病毒攻毒均10/10保护，保护率均为100％；同类制品1组对标准强毒BC6/85株攻毒保护率100％，对超强毒株NJ09株保护率60％；同类制品2组对标准强毒BC6/85株攻毒保护率80％，对超强毒株NJ09株保护率100％。对照组均5/5感染。结果表明，自制苗免疫组对不同强毒株的保护率高于同类制品，采用国内分离株制备的疫苗，因种毒分离年代较早，对目前新出现的超强毒保护力开始下降，采用国外分离株制备的疫苗，对国内IBDV毒株交叉保护力不理想。结果见表13。

表13与同类制品比较试验攻毒保护效力检验结果

结论：用20121118205批疫苗与国内、国外同类制品进行了疫苗的免疫效力比较试验，测定内容包括疫苗免疫后各种抗体的产生期，近期血清学及攻毒保护效检以及疫苗的免疫保护期。结果表明：各批次疫苗免疫3～4周龄SPF鸡后，效力检验均达到合格标准，表明疫苗质量均合格。自制疫苗免疫后，各种抗体水平产生良好，且显著高于同类制品免疫组，对不同毒株的攻毒保护率显著高于同类制品，免疫持续期可以达到5个月，较同类制品长2个月以上。综上所述，采用细胞培养工艺制备本发明NJ09株高滴度抗原，并与鸡新城疫抗原混合制苗，解决了市场现有产品对超强毒交叉保护力不理想、抗体水平不高、免疫持效期短的难题，可以有效针对两种疾病提供保护。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法

<130> 20140708

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 703

<212> DNA

<213> 传染性法氏囊病毒NJ09株

<400> 1

ttctcacaca gtaccaagca ggtggagtaa caatcacact gttctcagct aatatcgatg 60

ccatcacaag cctcagcatc gggggagaac tcgtgtttca aacaagcgtc caaggcctta 120

tactgggtgc taccatctac cttataggct ttgatggaac tgcggtaatc accagagctg 180

tggccgcaga caatgggcta acggccggca ctgacaacct tatgccattc aatattgtga 240

ttccaaccag cgagataacc cagccaatca catccatcaa actggagata gtgacctcca 300

aaagtggtgg tcaggcggga gatcagatgt catggtcagc aagtgggagc ctagcagtga 360

cgatccacgg tggcaactat ccaggggccc tccgtcccgt cacactagta gcctacgaaa 420

gagtggcaac aggatctgtc gttacggtcg ccggggtgag caacttcgag ctgatcccaa 480

atcctgaact agcaaagaac ctggtcacag aatacggccg atttgaccca ggagccatga 540

actacacaaa attgatactg agtgagaggg accgtcttgg catcaagacc gtctggccaa 600

caagggagta cactgacttt cgcgagtact tcatggaggt ggccgacctc aactctcccc 660

tgaagattgc aggagcattc ggcttcaaag acataatccg gga 703

Claims

1.一种鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗，其活性成分为灭活的鸡新城疫病毒La Sota株和传染性法氏囊病毒NJ09株，所述传染性法氏囊病毒NJ09株的保藏号为CGMCC NO：7758。

2.权利要求1所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液与传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别浓缩、灭活，然后混合均匀，得到混合病毒液；将所述混合病毒液与佐剂混合均匀，得到所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。

3.根据权利要求2所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在将鸡新城疫病毒La Sota株接种鸡胚进行培养，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液；将传染性法氏囊病毒NJ09株接种DF-1细胞或Vero细胞进行培养，得到所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液。

4.根据权利要求3所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的病毒含量大于等于10^8.0EID₅₀/ml，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液的病毒含量大于等于10^7.0TCID₅₀/ml。

5.根据权利要求4所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至原体积的1/4-1/2，所述传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液浓缩至原体积的1/5-1/7。

6.根据权利要求5所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述浓缩后的鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和传染性法氏囊病毒NJ09株病毒液分别灭活后，按照体积比2:（1-3）混合均匀，得到混合病毒液。

7.根据权利要求6所述鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于将混合病毒液与吐温-80按照体积比96∶4混合均匀，得水相；将注射用白油和司本－80按照体积比为94：6混匀，得油相；将油相和水相按照体积比2∶1混合均匀，获得鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗。