CN1296385C

CN1296385C - 抗猪生长激素单克隆抗体及制备方法及应用

Info

Publication number: CN1296385C
Application number: CN 200510016662
Authority: CN
Inventors: 郑鑫; 朱世成; 李月红; 王哲
Original assignee: Individual
Current assignee: Wang Zhe; Jilin Agricultural University
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: CN1687135A

Abstract

本发明涉及抗猪生长激素单克隆抗体及制备方法及应用，属于生物技术领域。重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。本发明的有益效果，本发明筛选到具有稳定分泌猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤株，制备分泌特异性抗猪生长激素的单克隆抗体，为今后进一步建立快速、灵敏、特异的猪生长激素检测方法和研制新型促生长剂奠定基础。

Description

抗猪生长激素单克隆抗体及制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。本发明利用动物免疫、细胞融合和克隆等技术，构建了具有稳定分泌鼠抗猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤株，制备出分泌特异性猪生长激素的单克隆抗体。本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法以及该单克隆抗体的应用。

背景技术

生长激素(growth hormone，GH)是一种重要的促进动物生长和调节代谢的激素，能促进葡萄糖吸收，核酸和蛋白质合成，脂肪分解。猪生长激素是由猪垂体前叶分泌的长190个氨基酸组成的单链多肽激素，分子量为22kD。激素类药物曾经在现代动物生产上广为应用。但由于其在动物体内可蓄积残留，会对人类健康造成严重危害，因此，已被禁止使用。人们尝试改变使用生长激素的方式，寻找安全、有效利用生长激素的新途径。将免疫调控技术应用于促生长的研究，探索新的非激素类促进动物生长的方法是本发明的主要目的。

发明内容

本发明提供一种抗猪生长激素单克隆抗体，以解决猪生长激素类药物在生产上应用时产生的在动物体内蓄积残留，对人类健康造成严重危害的问题。

本发明的目的在于提供一种抗猪生长激素单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供编码上述抗体的DNA分子。在实例中，该DNA分子含有SEQ IDNO：1编码所示的单抗重链可变区的核苷酸序列。以及含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列。

所得抗体可用常规手段鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用酶联免疫吸附法(ELISA)来测定。单克隆抗体的亲和力采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.107-220)进行。

本发明的另一重要目的是提供抗猪生长激素单克隆抗体在制备检测猪血液生长激素含量的免疫检测试剂盒中的应用。

在这之前对猪的生长激素分泌情况研究所用检测试剂，均为人源或鼠源生长激素检测试剂盒，其检测指标只能作为参考，而本单抗则可以作专门针对猪生长激素的特异性检测试剂。其在体外的检测应用包括对血清、血浆或其他猪的体液中的抗原，进行放射免疫分析、放射免疫定量测定、酶免疫分析或比浊测定。

本发明的抗猪生长激素单克隆抗体还可用于制备猪生长激素抗独特型抗体。例如，将抗猪生长激素单克隆抗体注入另一种属的动物(兔、羊、马、鼠等)，会诱导动物产生免疫反应，从其血液中提取到猪生长激素抗独特型抗体。该抗体具有模拟抗原的功能，既具有模拟生长激素的作用，可以用其作为免疫促生长制剂应用于动物饲养业。本文所用术语“抗独特型抗体”是针对外来抗原的抗体分子(Ab1)可变区上Id可刺激机体产生相应的抗Id抗体(Ab2)。抗独特型抗体作为抗原内影像分子，可模拟蛋白质及多糖、糖蛋白性质的抗原表位，因此可将抗独特型抗体作为保护性抗原加以利用。

本发明的另一重要目的是提供抗猪生长激素单克隆抗体在制备猪的促生长疫苗中的应用。

本研究采用杂交瘤技术和单克隆抗体制备技术，以猪生长激素为抗原，免疫BALB/c小鼠，构建具有稳定分泌猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤株，制备出生长激素单克隆抗体，并以此为基础进一步开发应用，为免疫技术在动物促生长方面的应用提供理论和技术依据。为今后产业化生产开发效果好、成本低、安全、方便的新型促生长疫苗奠定基础。

本发明还提供一种抗猪生长激素单克隆抗体的制备方法，该方法包括下列步骤：

a)动物的免疫，

b)细胞融合、阳性克隆的单克隆抗体杂交瘤株的筛选，

c)腹水法制备单克隆抗体。

本发明的有益效果，本发明筛选到具有稳定分泌猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤株，制备分泌特异性抗猪生长激素的单克隆抗体(McAb)，为今后进一步建立快速、灵敏、特异的猪生长激素检测方法和研制新型促生长剂奠定基础。

利用本项目研究所取得的成果，可挖掘替代外源激素的新技术，经应用研究和推广后，可开发出具有安全可靠、能够提高饲料利用率，降低饲养成本的，可以取得自主知识产权的新型促生长疫苗。该项目能够填补国内免疫调控促生长研究的空白，能够促进养猪业产业化发展，创造良好的社会效益和经济效益。具有广阔的市场应用前景。

具体实施方式

本文所用术语“单克隆抗体”亦可简称为“单抗”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的针对抗原上单个决定簇，是通过杂交瘤细胞融合培养来合成、分泌的。

本文所用术语“抗体”就是免疫球蛋白(Ig)，具有特别的氨基酸序列和三维结构，可与抗原的互补结构相结合。是由相同结构特征的两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成的糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连。每条轻链和重链都有恒定区和可变区，其中可变区具有针对每个单抗的特异的核苷酸序列。它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。

本文所用术语“可变”表示可变区的某些部分在序列上有所不同。可变性并不均匀的分布在整个抗体的可变区中，它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。

本文所用术语单克隆抗体的“轻链”是指根据轻链恒定区的氨基酸序列归为明显不同的(κ和λ)两类中的一类。

本文所用术语单克隆抗体的“重链”是指根据重链恒定区的氨基酸序列归为不同的种类。共分为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM五类。其中的一些还可以进一步分成亚类，如IgG1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1和IgA2。

本发明提供抗猪生长激素单克隆抗体在制备检测猪血液生长激素含量的免疫检测试剂盒中的应用。可采用常规的制备试剂盒的方法和材料，制备试剂盒。

本发明提供抗猪生长激素单克隆抗体在制备猪的促生长疫苗中的应用。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例一抗猪生长激素单克隆抗体的制备

1.仪器设备

CO₂培养箱，日本SANYO产品；倒置显微镜，重庆光子仪器厂产品；超净工作台，苏洲净化设备厂，W-CT-1F；酶标仪，美国Bio-Rad550型；超纯水仪，millipore产品。

2.动物和细胞

实验动物Balb/c小鼠，长春生物实验动物中心，SP2/0细胞为购买到。

3.主要药品和培养基

3.1 抗原

猪生长激素(Porcine Growth hormone)为Sigma公司产品。PEG4000为Promega公司产品；HT、HAT以及酶标二抗均为Sigma公司产品；RPMI-1640、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂为Gibco公司产品。

3.2 基础培养基：

按说明书配制：取RPMI-1640培养基1袋(10.4g)，NaHCO₃ 2g，定溶于1000mL DDW，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装，4℃保存。

3.3 条件培养基：

基础培养基+10％新生牛血清+1％100×青链霉素溶液。

4.实验方法

4.1 动物的免疫

按照制定的动物免疫方案对小鼠进行免疫。免疫间隔为2周。每次抗原免疫用量为50μg/0.05ml只，初次免疫为等量弗氏完全佐剂乳化抗原，二、三次免疫为弗氏不完全佐剂乳化抗原。前三次的注射方式为背部皮下多点注射。第四次50μg腹腔加强免疫，3天后取脾进行融合。

4.2 饲养细胞的制备

融合前1～2d制备饲养细胞。取Balb/c小鼠2只，眶下窦放血，颈脱位致死，75％酒精消毒体表，以无菌手术剪开腹部皮肤，暴露腹膜。然后，将5ml预冷的HAT培养基打入小鼠腹腔，轻轻挤压腹部，重新吸出注入的液体，收取小鼠腹腔巨噬细胞。用HAT选择培养基稀释、调整细胞至按100μl/孔加入到4块96孔细胞培养板中，置37℃ 5％CO₂培养箱中培养。

4.3 细胞融合

将制备好的饲养细胞1×10⁷与已免疫的小鼠脾细胞1×10⁸混合，按常规方法用50％的PEG进行融合。将培养处于对数生长SP2/0细胞及脾细胞用洗液作适当稀释后计数，两种细胞按1∶5的比例混合，1200rpm离心6min，去上清，用1mL吸管将50％PEG(PH8.0)滴加到融合管中，边加边轻轻摇动融合管，1min内匀速加完，并继续在水浴中缓缓摇动融合管90S。，再加入洗液，加入步骤为：1ml/60s，1ml/30s，1ml/30s，然后将洗液加到40ml后，1200rpm离心6min，去上清，手振重悬细胞，加入HAT营养液，轻轻混匀。在准备好饲养细胞的96孔板上每孔加入1-2滴融合细胞悬液，最后将融合细胞培养板放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

4.4 阳性克隆的筛选

用间接ELISA检测培养上清，筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，用有限稀释法连续克隆、检测，直至所有的克隆细胞生长的细胞孔全部都为阳性为止，这一阳性克隆株即为猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩增培养后用其制备抗猪生长激素单克隆抗体。

4.5 腹水的制备单克隆抗体

将0.5ml的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，一周后注入1×10⁷个猪生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞株于小鼠腹腔，7～10天后，当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水，收集腹水置1500rpm离心10min，除去沉淀和表面蛋白脂膜，取上清即为抗猪生长激素单克隆抗体，分装-20℃保存。

实施例二抗猪生长激素单克隆抗体基因的克隆和DNA测序

1.细胞株、菌株及载体抗猪生长激素杂交瘤细胞株，由实施例一所得；大肠菌DH5α，购买得到并保存；pMD18-T载体，购自TaKaRa公司。

2.试剂限制性内切酶Sfi I、Not I及DL2000DNA Markers购自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、RNAgent Tptal RNA Isolation System、PoluATract Mrna Isolation SystemIV、Wizard PCR Preps DNA Purification System，购自Promega公司；Mouse ScFvMoudle/Recombinant Phage Antibody System，购自Pharmacia公司。

3.杂交瘤细胞总RNA的提取按RNAgent Total RNA Isolation System和PolyATractmRNA Isolation System IV提供的方法提取细胞总RNA和分离纯化mRNA。

4.cDNA第一链的合成按Mouse ScFv Moudle/Recombinant Phage antibody System提供的方法，在反转录酶作用下合成cDNA。

5.基因的PCR扩增及其产物纯化取上述cDNA产物，采用RT-PCR法进行基因扩增，以2％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。采用Wizard PCR Preps DNA Purification System回收重链可变区V_H和轻链可变区V_L可变区基因产物。

6基因的克隆与测序利用pMD-18T载体系统，将轻链和重链基因片段与载体连接，并转化至大肠菌DH5α中。转化菌经IPTG/X-Gal琼脂平板蓝白菌落筛选，挑取白色菌落，提取质粒并进行酶切鉴定。然后将克隆的轻链和重链基因质粒用ABI377全自动荧光DNA序列分析仪进行测序。

7基因的序列测定结果

对抗体进行序列测定，其重链可变区DNA序列如SEQ ID：1所示，该DNA序列编码SEQ ID：2所示的重链可变区氨基酸序列，其中CDR位于SEQ ID：2中的35-44、59-75、108-118位。抗体轻链可变区DNA序列如SEQ ID：3所示，其编码SEQ ID：4所示的轻链可变区氨基酸序列，其中CDR位于SEQ ID：4中的24-34、60-66、89-97位。

重链可变区基因大小为357bp，基因内无终止码，为一开放读框，可编码119个氨基酸。序列中有明确的4个框架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)，第21、95位的氨基酸为抗体可变区特征性的半胱氨酸残基，表明重链可变区的氨基酸序列符合鼠抗体可变区特征。轻链可变区基因长327bp，基因内无终止码，编码109个氨基酸；序列中亦有明确的4个FRs和3个CDRs，抗体可变区特征性的半胱氨酸残基位于第23、88位，表明轻链可变区的氨基酸序列符合鼠抗体可变区特征。

实施例三抗猪生长激素单克隆抗体免疫球蛋白Ig的亚类鉴定

对实施例一所得的单克隆抗体类型及亚类进行鉴定。选用Pierce公司的Immuno PureMonoclonal antibody istyping kit检测抗体试剂盒对所得的单抗杂交瘤细胞培养上清液进行检测，结果发现所检抗体属于IgG1亚类，轻链为κ链类型。

实施例四抗猪生长激素单克隆抗体亲和力测定

取达到单抗杂交瘤细胞培养培养上清最大A值50％的上清稀释液100μl，与系列稀释浓度的GH抗原的50μl混合(将抗原按20ng/ml～1ng/ml稀释)，37℃作用1h，然后进行ELISA检测，求得IC₅₀，相对亲和力Ka为IC₅₀的倒数。

经检测本发明单克隆抗体亲和力Ka为1.0×10⁹M^-1。

实施例五抗猪生长激素抗独特型抗体的制备

1.材料和方法

1.1 主要试剂猪生长激素单抗腹水(实施例一中)，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，sigma公司。

辛酸，DEAE-52国产。

1.2 实验动物免疫用家兔：体重2kg，雌性，购自生物制品所。

1.3 仪器酶标仪，Sunrise丹麦，核酸蛋白检测仪，Beckman公司。

2.抗独特型抗体的制备方法

2.1 家兔的免疫

抗原为纯化的抗猪生长激素腹水，经蛋白A亲和层析纯化用于免疫，核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度；

免疫剂量，按常规方法进行，免疫结束后耳静脉采血，间接ELISA法测定血清效价。

2.2 兔血清A纯化

免疫好的家兔心脏采血，4℃过夜后3000rpm离心10min，收集血清，采用辛酸-DEAE-52法纯化兔IgG。即为兔抗猪生长激素抗独特型抗体。

实施例六制备猪的促生长疫苗

取实施例五所得兔抗猪生长激素抗独特型抗体，加入免疫佐剂吐温-20，两者体积比为10∶1。

序列表

<110>郑，鑫

<120>抗猪生长激素单克隆抗体及制备方法及应用

<130>050318

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>357

<212>DNA

<213>(小鼠)Mus musculus

<400>1

gtgaaactgc agcagtcagg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 60

tgtgcagcct ctggattcac tttcagtaac tatggcatgt cttgggttcg ccagactccg 120

gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtggtggtg gtcgtgacat ctactatcca 180

gacagtgtga aggggcgatt cgccatctcc agagacaatg ccaagaacaa cctgtacctg 240

caaatgagca gtctgcggtc tgaggacacg gccttgtttt attgtgcaag acagcggtat 300

ggtacctact attctatgga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210>2

<211>119

<212>PRT

<213>(小鼠)Mus musculus

<220>

<221>CDR1

<222>(35)..(44)

<220>

<221>CDR2

<222>(59)..(75)

<220>

<221>CDR3

<222>(108)..(118)

<400>2

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala

35 40 45

Thr Glx Ser Gly Gly Gly Arg Asp Glx Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ala Glx Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Arg Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210>3

<211>327

<212>DNA

<213>(小鼠)Mus musculus

<400>3

gacatccaga tgacgcagtc tccagcctcc ctctctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agtaatttag catggtatca gcagaaacag 120

ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaagaaact tagcagatgg tgtgccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggggta ctccgtggac gttcggtgga 300

gggaccaagc tggaaataaa acgtaag 327

<210>4

<211>109

<112>PRT

<213>(小鼠)Mus musculus

<220>

<221>CDR1

<222>(24)..(34)

<220>

<221>CDR2

<222>(60)..(66)

<220>

<221>CDR3

<222>(89)..(97)

<400>4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Glx Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Ala Ala Arg Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Glx Asn Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys

100 105

Claims

1、一种抗猪生长激素单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于：重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

2、一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

3、根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：该DNA分子含有SEQ ID NO：1所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：3所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

4、权利要求1所述的抗猪生长激素单克隆抗体在制备检测猪血液生长激素含量的免疫检测试剂盒中的应用。

5、权利要求1所述的抗猪生长激素单克隆抗体在制备猪生长激素抗独特型抗体中的应用。

6、权利要求1所述的抗猪生长激素单克隆抗体在制备猪的促生长疫苗中的应用。