CN1541266A

CN1541266A - 用于治疗过敏症及哮喘病的Fcε融合蛋白

Info

Publication number: CN1541266A
Application number: CNA028158113A
Authority: CN
Inventors: 安玲玲; C・冯; 吴和仁; M·S·C·冯
Original assignee: Tanox Inc
Current assignee: Tanox Inc
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2002-06-14
Publication date: 2004-10-27
Also published as: JP2004537991A; MXPA03011499A; WO2002102320A3; WO2002102320A2; US20040198961A1; CA2455387A1; EP1478748A2; EP1478748A4

Abstract

本发明包括与FCγ片段结合的Fcε片段，例如，Fcε1－铰链－FcE2－FcE3－FcE4－FCy；铰链－FcE2－FcE3－FcE4－Fcy；FCε2－Fcε3－Fcε4－FCγ；FCε2－Fcε3－Fcγ；FCε3－Fcγ；及FCε3－Fcε4－FCγ，或任何具有等效免疫功能的衍生物或肽。Fcγ片段可为任一IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)(较佳为IgG1或IgG3)的一片段，其中该片段结合有FcyRIIB。本发明亦包括适于给予一过敏性疾病患者的组合物，其包含融合蛋白构建体于一医药组合物中，该医药组合物包括(例如)一赋形剂、稀释剂或载剂。该治疗可与抗IgE疗法或过敏原免疫疗法结合。

Description

用于治疗过敏症及哮喘病的Fcε融合蛋白

对相关申请案的交叉参照

本申请案要求优先于2001年6月15日申请的美国临时申请案第60/298,710号。

发明领域

本发明涉及融合蛋白构建体，其包含IgE Fcε片段(天然及功能性衍生物)及IgG Fcγ片段。该些构建体可结合至高亲和性受体(FcεRI)或低亲和性受体(FcεRII)及Fcγ受体(例如FcγRIIB)，由此可下调FcεRI在细胞表面上的表达并阻断IgE结合至该些受体。

发明背景

免疫系统通过与伴随细菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞的抗原发生反应来抵御致病因子及肿瘤。然而，免疫反应并非均有益。

过敏反应由对其他无害因子(例如食物、药物及花粉)的免疫应答引起，且可造成多种疾病，例如哮喘病、过敏性鼻炎及食物和药物过敏症。该些过敏性疾病通常与IgE介导的超敏反应(亦称为速发型超敏反应)而非与迟发型或细胞介导的超敏反应相关。该些疾病可影响工业化国家中多达10至40％的人口(Janeway，CA.，等人之“免疫学：在健康及疾病状况中的免疫系统”(Immunology：the immune systemin health and disease)，第4版，Elsevier Science有限公司，伦敦；1999)。据估计，在美国仅哮喘病就影响1500万多人，其中每年死亡5000多人。10％以上的儿童在其孩童时期的某一时间皆患有过敏性湿疹(Leung，D.，Mol.Gen.及Metab.63：157-167(1998))。在过去20年内过敏性疾病的流行显著增加。

过敏性疾病通常(但非总是)与循环IgE的高水平相关。在IgE介导的过敏反应中，IgE结合至FcεRI，且若与受体结合的IgE与过敏原反应，则其会造成结合至效应细胞(例如肥大细胞及嗜碱性粒细胞)上的IgE抗体发生交联。由此，隐伏受体被聚集，引发一细胞内信号转导级联，该级联触发组胺和类胰蛋白酶的释放及立即去颗粒，随后合成并释放前列腺素、白细胞三烯、细胞素(例如，IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13、TNFα及GM-CSF)、以及其他过敏反应介体。该些介体可造成过敏反应的病理表现。

IgE有两种主要受体，即高亲和性受体FcεRI及低亲和性受体FcεRII。FcεRI在细胞表面上形成一三聚体αγ2(一条α链及两条γ链)或一四聚体αβγ2(一条α链、一条β链及两条γ链)结构(Kinet，JP.，Annu.Rev.Immunol.1999，17：931-972)。α链的细胞外结构域赋予该受体以高亲和力(Kd＝10^-9至10^-10M)结合IgE的能力。尽管该受体主要在肥大细胞及嗜碱性粒细胞的表面上表达，但在人类朗格汉斯细胞(Langerhan’s cell)、树突细胞及单核细胞上亦可发现低水平的FcεRI，其中FcεRI在IgE介导的过敏原递呈中发挥作用。另外，曾报道人类嗜酸性粒细胞及血小板中存在FcεRI(Hasegawa，S等人，“血细胞生成”(Hematopoiesis)，1999，93：2543-2551)。在B细胞、T细胞或嗜中性粒细胞的表面上未发现FcεRI。FcεRI在朗格汉斯细胞及皮肤树突细胞上的表达对于与IgE结合的抗原在过敏性个体中的递呈在功能及生物学方面均十分重要(Klubal R.等人，J.Invest.Dermatol.1997，108(3)：336-42)。

低亲和性受体FcεRII(CD23)是一凝集素样分子，其包含三个其中头部结构自细胞质膜的长α-螺旋状杆伸出的相同亚单元(Dierks，A.E.等人，J.Immunol.1993，150：2372-2382)。IgE CH3结构域可以低亲和力(Kd＝6.3×10^-7M)同时结合FcεRII三个头部结构中的两个。该IgE结合位点尽管位于CH3区，但其并不与FcεRI结合位点重叠。与IgE结合后，FcεRII即与B细胞上参与IgE合成调节的CD21相关(Sanon，A.等人，J.Allergy Clin.Immunol.1990，86：333-344，Bonnefoy，J.等人，Eur.Resp.J.1996，9：63s-66s)。人们早已认识到FcεRII可用于过敏原递呈(Sutton及Gould，1993，Nature，366：421-428)。与上皮细胞上的FcεRII结合的IgE负责特异性及迅速过敏性递呈(Yang，P.P.，J.Clin.Invest.，2000，106：879-886)。FcεRII存在于若干类型细胞上，该些细胞包括B细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、天然杀伤细胞、T细胞、滤泡树突状细胞及朗格汉斯细胞。

人们已鉴别出与FcεRI及FcεRII作用的IgE分子上的结构实体。诱变研究表明，CH3结构域可介导IgE与FcεRI(Presta等人，J.Biol.Chem.1994，269：26368-26373；Henry A.J.等人，Biochemistry，1997，36：15568-15578)及FcεRII(Sutton及Gould，Nature，1993，366：421-428；Shi，J.等人，Biochemistry，1997，36：2112-2122)二者的相互作用。高亲和性受体及低亲和性受体的结合位点均沿一穿过两个CH3结构域的中央旋转轴对称布置。FcεRI结合位点位于一CH3结构域中接近CH2结构域接点的外向侧，而FcεRII结合位点则位于CH3的羧基端上。

有关人类嗜碱性粒细胞密度的早期研究表明，患者血浆中的IgE水平与每一嗜碱性粒细胞的FcεRI受体数量之间存在关联(Malveaux等人，J.Clin.Invest.，1978，62：176)。他们注意到，过敏性及非过敏性个体中的FcεRI密度介于每一嗜碱性粒细胞10⁴至10⁶个受体之间。后来表明，用抗IgE治疗过敏性疾病可将循环IgE的数量降低至治疗前水平的1％(MacGlashan等人，J.Immunol.，1997，158：1438-1445)。MacGlashan分析了自用全抗IgE抗体(其与患者血清中循环的游离IgE结合)治疗的患者获得的血清。他们报道，降低患者中循环IgE的水平可导致存在于嗜碱性粒细胞表面上的受体数量减少。因此，其假设嗜碱性粒细胞及肥大细胞表面上的FcεRI密度直接或间接受循环IgE抗体水平的调节。

最近，WO 99/62550揭示了IgE分子及片段的用途，其结合至FcεRI及FcεRII IgE结合位点以阻断IgE结合至受体。然而，用于控制该些过敏性疾病的不具有害副反应的有效疗法较有限。一种治疗过敏性疾病的治疗方法涉及使用人源化抗IgE抗体来治疗过敏性鼻炎及哮喘病(Corne，J.等人，J.Clin.Invest.1997，99：879-887；Racine-Poon，A.等人，Clin.Pharmcol.Ther.1997，62：675-690；Fahy，J.V.等人，Am.J.Resp.Crit.Care Med.1997，155：1824-1834；Boulet，L.P.等人，Am.J.Resp.Crit.Care Med.，1997，155：1835-1840；Milgrom.E.等人，N.Engl.J.Med.，1999，341：1966-1973)。该些临床数据表明，抑制IgE结合至其受体是一种治疗过敏性疾病的有效方法。

较有利地，一Fcε-Fcγ融合蛋白可交联肥大细胞及嗜碱性粒细胞上的FcεRI(通过Fcε)及FcγRIIB(通过Fcγ)。该受体效联的结果将抑制该些细胞的去颗粒。人们认为该抑制作用涉及FcγRIIB胞质尾区中以免疫受体酪氨酸为主的抑制基元(ITIM)的酪氨酸磷酸化，形成用于含SH-2蛋白质(含Src同源结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1及2(SHP-1，SHP-2))及/或脂质(含SH2结构域的多磷脂酰-肌醇-5-磷酸酶)磷酸酶的结合位点，上述含SH-2蛋白质及/或脂质磷酸酶可对抗来自抗原受体FcεRI的活化信号，抗原受体FcεRI在胞质尾区具有一以免疫受体酪氨酸为主的活化基元。Fcε-Fcγ融合蛋白亦可结合至B细胞、朗格汉斯细胞、树突细胞及单核细胞上的FcεRII，从而阻断抗原(与IgE复合)通过FcεRI及/或FcεRII至该些细胞之递呈。此可降低对抗原的免疫应答，其包括自B细胞生成IgE及产生抗原特异性T细胞。

本发明提供一种通过下列手段治疗IgE介导的过敏性疾病的方法：下调IgE的生成，减少肥大细胞及嗜碱性粒细胞的去颗粒并降低FcεRI受体在肥大细胞及嗜碱性粒细胞上的表达。本发明亦提供一种通过防止抗原通过FcεRI至格朗汉斯细胞和树突细胞之递呈及通过FcεRII至B细胞之递呈来降低对抗原的免疫应答的方法。

发明概要

本发明包括含有IgE Fcε片段及IgG Fcγ片段的融合蛋白，例如Fcε1-铰链-Fcε2-Fcε3-Fcε4-FCγ；铰链-Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ；FCε2-Fcε3-Fcε4-FCγ；FCε2-Fcε3-Fcγ；FCε3-Fcγ；及FCε3-Fcε4-FCγ，或任何具有一等效免疫功能且可结合至FcεRI或FcεRII及FcγRIIB受体的经修饰的片段或肽。Fcγ片段可为任一IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的一片段且可包含Fcγ1-Fcγ2-Fcγ3或其可结合Fcγ-RIIB受体的任何较小片段。Fcγ片段可通过其C或N端连接至Fcε片段。Fcε片段及Fcγ片段彼此可直接结合或通过一连接体结合。

融合蛋白结合至嗜碱性粒细胞及肥大细胞上的FcεRI及B细胞上的FcεRII，由此阻断IgE结合至该些受体，并下调该些受体在嗜碱性粒细胞、肥大细胞及B细胞上的表达。该些融合蛋白可交联肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的FcεRI和FcγRIIB且由此可降低该些细胞的去颗粒。由于该些融合蛋白的Fcε片段上不存在过敏原结合区，故在肥大细胞或嗜碱性粒细胞的表面上可能不存在该些片段通过过敏原分子之交联，因而不存在受体聚集且不引发细胞内信号转导级联(其可触发负责过敏反应的介体的释放)。此外，Fcε片段与FcεRI受体的结合可防止IgE的结合，由此可消除过敏原特异性免疫应答。

本发明亦包括适于给予一过敏性疾病患者的组合物，其包含融合蛋白构建体于一组合物中，该组合物包括(例如)一赋形剂、稀释剂或载剂。该治疗亦可与抗IgE疗法或过敏原免疫疗法结合。

本发明包括核酸序列和编码该等融合蛋白的载体以及用该等序列转染的宿主细胞。该些哺乳动物序列包括小鼠、大鼠、兔子、犬、猫、羊、猪、马及人的序列。

本发明包括一种减轻或防止一易感哺乳动物受试者中IgE介导的过敏反应的方法，其包含向一哺乳动物受试者给予一有效量的包含Fcε片段和Fcγ片段的融合蛋白。过敏反应可涉及过敏性哮喘病、过敏性鼻炎、枯草热、食物过敏(例如花生或坚果过敏症)、过敏性湿疹或药物过敏。

附图简单说明

图1为人类IgE的ε重链的示意图。氨基酸位置对应于Bennich给出的编码系统(见下文)。

图2显示了ELISA中Fcε-Fcγ与重组人类可溶性FcεRIα的反应性。

图3显示了ELISA中Fcε-Fcγ对生物素化IgE结合至FcεRIα的抑制作用。

图4显示了ELISA中IgE对Fcε-Fcγ结合至FcεRIα的抑制作用。

图5显示了Fcγ的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明包括若干融合蛋白，其中一IgE Fcε片段(例如Fcε1-铰链-Fcε2-Fcε3-Fcε4；铰链-Fcε2-Fcε3-Fcε4；Fcε2-Fcε3-Fcε4；Fcε2-Fcε3；FCε3；及Fcε3-Fcε4)与一IgG Fcγ片段(例如：Fcγ2-Fcγ3或Fcγ2)结合且可为任一亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，较佳为IgG1或IgG3。该等融合蛋白可结合至FcεRI及/或FcεRII受体，由此阻断IgE与FcεRI和FcεRII以及Fcγ受体(尤其是FcγRIIB受体)之结合。因为融合蛋白仅包括免疫球蛋白Fc区且无该免疫球蛋白的抗原结合部分，所以与一过敏原接触不会导致肥大细胞或嗜碱性粒细胞的交联及去颗粒。

可通过该技术领域中熟知的各种连接体将Fcε片段结合至Fcγ片段。一适当连接体实例为一非免疫原16氨基酸连接体，其中序列(GGS)₂与(GGGGS)₂结合(Argos.P.，1990，J.Mol.Biol.211：943；Huston，J.S.等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879)。应将该连接体设计成对于接受该融合蛋白的哺乳动物受试者而言为非免疫原性。

已表明，当用抗IgE单克隆抗体治疗患者且循环IgE的量显著降低时，FcεRI受体的数量随之降低(Chang，“抗IgE疗法的药物学基础”(The pharmacological basis of anti-IgE therapy)，NatBiotechnol.2000年2月；18(2)：157-62)。本发明融合蛋白与FcεRI受体的结合可下调FcεRI表达，由此可因存在的受体更少而降低未来过敏反应的严重性或防止其发生。该下调亦可降低专职抗原递呈细胞(例如树突细胞)的抗原递呈。

若Fcγ片段亚类为IgG1或IgG3，则本发明的融合蛋白可交联肥大细胞和嗜碱性粒细胞上具有一胞质ITAM基元的FcεRI及具有一胞质ITIM基元的FcγRIIB，由此可防止该些细胞的去颗粒。或者，Fcγ可为IgG2或IgG4亚类。无论使用哪一种Fcγ亚类，融合构建体在宿主中的生物半衰期均远远长于仅有Fcε时的半衰期。这对于治疗性干预慢性疾病(如过敏症及哮喘病)较为有利。

另外，该融合蛋白可包含Fcε2-Fcε3-Fcγ3且结合至FcεRI和FcεRII受体。该Fcε片段亦可包含IgE-Fcε2-Fcε3-Fcε4的铰链区或其一功能性片段。本发明的融合蛋白可以天然IgE的至少75％结合亲和力、85％结合亲和力、95％结合亲和力或高于天然IgE的结合亲和力结合至FcεRI及/或FcεRII受体。

Fcε及Fcγ片段包括天然和合成片段以及若干具有不同于融合蛋白的序列但免疫功能与该融合蛋白相当的蛋白质。该些免疫等效蛋白将具有结合FcεRI和FcεRII二者以及FcγRIIB的能力。可通过多种熟知技术中的任何一种制造免疫等效蛋白，包括自一蛋合质组合库开始并分离结合蛋白，随后优化该些蛋白对FcεRI、FcεRII及FcγRIIB的结合亲和力或对融合蛋白(包括Fcε和Fcγ片段)进行选择性改变。用于改变抗体片段的氨基酸序列的方法在该领域中已为人们所熟知。一种在活体外将随机突变引入抗体基因中的常用方法涉及使用易错聚合酶及亲和性选择(Hawkins，R.等人，J.Mol.Biol.，1992，226：889-896)。功能等效融合蛋白可包括(但不限于)在该融合蛋白核苷酸序列编码的氨基酸序列内进行氨基酸残基的加成、取代、删除及修饰等作业形成的形式，但其产生一隐性变化，由此生成一功能等效基因产物。氨基酸取代可根据有关残基在极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性及/或两亲性方面的相似性实施。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、白氨酸、异白氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色胺酸及甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。

虽然可对融合蛋白编码DNA进行随机突变(使用所属技术领域的技术人员熟知的随机诱变技术)并可检测所生成突变体的活性，但亦可对该编码序列设计定位突变(使用所属技术领域的技术人员熟知的定位诱变技术)以生成功能增强(例如受体结合亲和力增强)、功能减弱及/或生理半衰期延长的突变体融合蛋白。该分析的一起始点是通过对Fcε片段或Fcγ片段序列与来自(例如)其他哺乳动物的相应基因/蛋白序列进行对比来鉴别在不同物种间保留的氨基酸序列基元。可在不同位置设计非保守性变化以改变功能、结合亲和力或二者。或者，若需改变功能，则可设计删除保留区(即氨基酸相同)或对其实施非保守性改变。例如各种保守结构域的删除或非保守性改变(取代或嵌入)，但应注意免疫原性的潜在作用。

可对该编码序列进行其他修饰以产生更适于在所选宿主细胞内表达、按比例增大等的融合蛋白。例如，可将半胱氨酸残基删除或用其他氨基酸取代之以消除二硫桥键；可改变或删除与N连接的糖基化位点以达成(例如)一同源产物之表达，该产物更易于自酵母宿主(已知其为超糖基化N连接位点)的回收及纯化。

本发明提供若干组合物，其包含本发明的融合蛋白及生理上可接受的赋形剂、添加剂、载剂或稀释剂。适当生理试剂阐述于本领域中常用的一参考文献Remington药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences，A.Osol)中。在实施本发明方法时，本发明的经结合化合物可单独使用或与其他治疗剂或附加试剂联合使用。该些附加试剂包括赋形剂(例如着色剂)、稳定剂、渗透剂及抗菌剂。

对于非经肠投药而言，本发明的融合蛋白可与一生理上可接受的非经肠媒剂一起调配成(例如)溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。该类媒剂的实例为水、盐水、林格(Ringer’s)溶液、葡萄糖溶液及5％人体血清白蛋白。亦可使用脂质体及非水性媒剂，例如固定油。媒剂或冻干粉末可含有维持等渗性的添加剂(例如氯化钠、甘露醇)及维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲液及防腐剂)。该调配物可通过常用技术灭菌。例如，通过将以重量计1.5％的有效成分溶于0.9％的氯化钠溶液中可制备一适于注射给予的非经肠组合物。根据本发明的组合物可以单次剂量或多次剂量给予。本发明的组合物即可作为单独治疗剂给予，亦可与其他治疗剂联合给予。本发明的治疗方法可与传统疗法结合，其可分别、依序或同时施用。

本发明的组合物可通过任何可使活性试剂到达靶细胞的方式给予。该些方法包括(但不限于)经口、外敷、皮内、皮下、静脉内及肠内给予模式。该等化合物可单独给予或其他化合物联合给予。欲添加的生理上可接受的试剂通常根据给予途径及标准医药惯例选择。

融合蛋白可通过(例如)重组DNA技术或通过形成一共价键的化学结合或此项技术中用于形成融合蛋白的其他熟知技术制备。提供一编码所需融合蛋白的适当DNA序列即可容许使用此项技术中熟知的重组技术生成该融合蛋白。该编码序列可自天然资源获得或使用广泛可用的起始材料通过常规方法来合成或构建。当以合成方式制备该编码DNA时，可利用DNA欲表达于其中的预期宿主的密码子偏好。

为生成本发明的融合蛋白，所属技术领域的普通技术人员可使用已知技术可自易于获得的人类DNA合成或获得一编码Fcε片段或其若干部分的DNA分子(其与一编码Fcγ片段或其若干部分的DNA分子结合)并将该DNA分子嵌入一市售表达载体中以用于已知表达系统中。该等系统包括那些其中相关融合蛋白作为一单链生成的系统。

已知多种可自若干公司(例如Invitrogen、San Diego、Calif.)购得的质粒之实例，其可用于大肠杆菌中的重组生产、酿酒酵母中的生产或在一完整杆状病毒表达系统中用于昆虫细胞中的生产。用于哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞及NS/O细胞)中生产的载体亦市面有售。

此项技术中的普通技术人员可使用该些市售表达载体及系统或使用已知方法及易于获得的起始材料生产载体。对于多种宿主而言，包含必需控制序列(例如启动子和聚腺苷酸化信号且较佳为增强子)的表达系统易于获得且已为熟悉此项技术者所熟知。参见，例如Sambrook等人的“分子克隆，一实验室手册”(Molecular Cloning a LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989))。因此，所需蛋白质可在原核及真核系统中制备，由此可生成蛋白质的多种处理形式。

多种真核宿主可用于生产重组外源蛋白。例如在细菌中，真核宿主可用直接产生所需蛋白质的表达系统转化，但更常见的是提供信号序列以影响蛋白质的分泌。真核系统具有额外优点，即其能够处理可能出现于编码高等生物蛋白质的基因组序列中的内含子。真核系统亦能够提供多种可导致例如某些氨基酸残基的糖基化、羧基端酰胺化、氧化或衍生化、构象控制及诸如此类的处理机制。

常用真核系统包括(但不限于)酵母、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞及高等植物细胞。可使用适当启动子，其可相容并适用于每一所述宿主类型且为终止序列及增强子，例如杆状病毒多角体启动子。如上所述，启动子既可为组成型亦可为诱导型。

在某些实施例中，使用本文的氨基序列信息及遗传密码来合成一包含一编码本发明融合蛋白的核苷酸序列的DNA分子。所属技术领域的普通技术人员使用一预期宿主细胞偏好的密码子可不难合成包含编码本发明融合蛋白的核苷酸序列的DNA分子。所生成的DNA分子可被嵌入一可容许在一预期宿主中以极高水平表达(有时称为超表达)的表达载体中。

用于构筑适于预期宿主的表达系统的细节已为所属技术领域的技术人员所熟知。对于蛋白质的重组生产而言，编码该蛋白质的DNA适于连接至相关表达载体中并随后用于转化该相容宿主，然后在其中可发生异源基因表达的条件下培养该宿主并予以维持。如此生成的本发明蛋白质可通过裂解细胞自该培养物回收或可自此项技术中熟知及合适的培养基来回收。

所属技术领域的普通技术人员可使用熟知技术分离所生成的蛋白质。

所属技术领域的技术人员将明了，一治疗组合物可以一口服液、片剂或胶囊、鼻喷剂、气溶胶、悬浮液、溶液、乳液及/或滴眼液的形式提供。替代给药方法包括注射、雾化或吸入。适宜剂量可根据活体外或动物研究中表明有效的剂量推定。所给予剂量视多种因素而有所不同，例如：药物动力学特性；给予模式及途径；接受者年龄、健康状况及体重；症状性质及程度；并行治疗类型；及治疗频次。通常，融合蛋白的剂量可为每50公斤体重约1至3000毫克、每50公斤体重10至1000毫克或每50公斤体重25至800毫克。通常每天以分次剂量1或多次将8至800毫克给予至一患者可有效获得预期结果。

Fc片段实例

人类IgE的ε链的示意图显示于图1中，其对应于Bennich给出的编码系统(“免疫学进展II”(Progress in Immunology II)，1974，1：49-58)。其中有5个结构域(一个可变结构域，4个恒定结构域CH1-CH4)，具有一含约550个氨基酸的序列。

(1)Fcε-Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ

在该实例中，该片段涵盖一自IgE的氨基酸113至氨基酸547的肽链段。Cys-225与Cys-139在CH1区中形成二硫键(图1)。

(2)Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ

该片段涵盖一自IgE的氨基酸224至氨基酸547的肽链段。可将Cys-225转变成另一氨基酸(例如Ala-225)(Young R.J.等人，“蛋白质工程”(Protein Engineering，1995，8：193-199))以避免与Fcε区内的其他游离巯基形成二硫键。

(3)Fcε2-Fcε3-Fcγ

该片段涵盖一自IgE的氨基酸224至氨基酸437的肽链段。如上所述，可将Cys-225转变成(例如)Ala-225。

(4)Fcε3-Fcγ

该片段涵盖一自IgE的氨基酸328至氨基酸437的肽链段。该片段包含Fcε2、Cys-328及Val-329中的两种氨基酸。Cys-328提供一用以形成二聚体的二硫键。

(5)Fcε3-Fcε4-Fcγ

该片段涵盖一自IgE的约氨基酸328至氨基酸547的肽链段。

图5所示为自IgG1基因人类免疫球蛋白恒定区的核苷酸序列推断的氨基酸序列(源自“核酸研究”(Nucleic Acid Research)10：4071(1982)Ellison，JW；Berson，BJ及Hood LE)。该融合蛋白的Fcγ部分可包含整个序列或任何结合至FcγRIIB受体的片段，例如Fcγ2-Fcγ3片段或Fcγ2片段。

融合构建体的制备

使用RT-PCR通过自人类IgE表达细胞系SE44(Sun，LK等人，J.Immunol.1991，146：199-205)分离的完整RNA可获得FcεcDNA序列。Fcε片段使用上述16氨基酸连接体结合至Fcγ片段(不同亚类)并克隆至pCDNA3.1中。将质粒转染至用于瞬时表达融合蛋白的293T细胞系中。通过蛋白质A层析法纯化该些融合蛋白，然后用不同分析法检测活性(参见下文)。功能性构建体表达于一稳定哺乳动物细胞系(例如CHO)中。

融合构建体的特征描述

实例1：Fcε-Fcγ4与FcεRIα在ELISA中的反应性

通过ELISA检测四种具有Fcε片段(Fcε2-Fcε3-Fcε4、Fcε2-Fcε3、Fcε3或Fcε3-Fcε4)的经纯化Fcε-Fcγ4融合蛋白与重组人类FcεRIα的结合力。Immunlon I微量试验板(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)的每一加样孔均用50微升0.2微克/毫升的经纯化杆状病毒表达的人类可溶性FcεRIα(Heska，Fort Collins，CO)溶于碳酸钠缓冲液(pH值为9.6)之溶液覆盖过夜。然后通过用200微升2％的BSA溶于PBS中之溶液培养1小时使加样孔中的非特异性结合位点饱和。然后用PBST缓冲液(含0.05％TWEEN20的PBS)洗涤加样孔。将50微升每一融合蛋白(1nM)溶于BSA中之溶液加至每一加样孔中并在室温下保持1小时。用PBST洗涤各加样孔。随后，所结合的融合蛋白通过其与经稀释的结合有辣根过氧化物酶(HRP)的小鼠抗人IgG4(Fc特异性)(Sigma，St.Louis，MO)在室温下反应1小时来检测。然后用PBST洗涤各加样孔。将含溶于0.1M乙酸钠(pH值为6.0)中的0.1％3，3，5，5，四甲基联苯胺(Sigma)和0.003％过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶基质加至各加样孔中以显色30分钟。该反应于每加样孔加入50微升0.5M的H₂SO₄时终止。使用一ELISA读数器(Dynatech)在450nm处读取光密度(OD)。

结果显示，Fcε2-Fcε3-Fcε4及Fcε-Fcε4与重组人类可溶性FcεRIα的结合力较强，而Fcε2-Fcε3及Fcε3与该蛋白的结合力较弱(图2)，表明Fcε2-Fcε3-Fcε4及Fcε-Fcε4均含有对于IgE至FcεRIα的结合而言必需的抗原决定部位。

实例2：ELISA中Fcε-Fcγ对生物素化IgE结合至FcεRIα的抑制

通过ELISA测试四种Fcε-Fcγ融合蛋白对生物素化IgE至重组人类可溶性FcεRIα的结合的竞争性。用50微升0.2微克/毫升的经纯化杆状病毒表达的人类可溶性FcεRIα(Heska，Fort Collins，CO)溶于碳酸纳缓冲液(pH值为7.4)中之溶液将Immunlon I微量试验板(Dynatech)的各加样孔覆盖过夜。然后通过用200微升2％的BSA溶于PBS中之溶液培养1小时使各加样孔中的非特异性结合位点饱和。然后用PBST缓冲液(含0.05％TWEEN20的PBS)洗涤各加样孔。以0.065、0.125、0.25、0.5、1、2及4(Fcε-Fcγ：IgE)的摩尔比混合递增量的融合蛋白与一恒定量的预滴定生物素化重组人类IgE(1nM)。未经标记的IgE用作阳性对照。向每一加样孔中加入50微升该混合物并在室温下培养1小时。然后用PBST缓冲液洗涤各加样孔。然后通过加入50毫升结合有链霉抗生物素的HRP(Jackson ImmunoResearch Lab，West Grove，PA)并在室温下培养1小时来检测所结合的生物素化IgE。然后洗涤各加样孔。然后如上所述加入过氧化物酶基质以进行显色。通过一ELISA平板读数器在450nm处测量OD。

结果显示，Fcε2-Fcε3-Fcε4及Fcε3-Fcε4二者均与未经标记的IgE同样有效地竞争生物素化IgE至FcεRIα的结合，如剂量依赖竞争曲线的相同斜率所示(图3)。如预期，Fcε2-Fcε3及Fcε3未显示出任何竞争性，因为所述两种蛋白与FcεRIα的结合力较弱，如图2所示。

实例3：ELISA中IgE对Fcε-Fcγ结合至FcεRIα的抑制

为了确认实例2中的结果，亦通过ELISA检测IgE对Fcε2-Fcε3-Fcε4及Fcε3-Fcε4结合至FcεRIα的抑制作用。用50微升0.2微克/毫升的经纯化杆状病毒表达的人类可溶性FcεRIα(Heska，Fort Collins，CO)溶于碳酸纳缓冲液(pH值为7.4)中之溶液将Immunlon I微量试验板(Dynatech)的各加样孔覆盖过夜。然后通过用200微升2％的BSA溶于PBS中之溶液培养1小时使各加样孔中的非特异性结合位点饱和。然后用PBST缓冲液(含0.05％TWEEN20的PBS)洗涤各加样孔。以0.125、0.25、0.5、1、2、4、8及16(IgE：Fcε-Fcγ)的摩尔比混合递增量的重组IgE与一恒定量的Fcε2-Fcε3-Fcε4或Fcε3-Fcε4(1nM)。向每一加样孔中加入50微升该混合物并在室温下培养1小时。然后用PBST缓冲液洗涤各加样孔。随后，所结合的融合蛋白通过其与经稀释的结合有辣根过氧化物酶(HRP)的小鼠抗人IgG(Fc特异性)(Sigma)在室温下反应1小时来检测。然后用PBST洗涤各加样孔。然后如上所述加入过氧化物酶基质以进行显色。通过一ELISA平板读数器在450nm处测量OD。

结果显示，IgE可有效地竞争Fcε2-Fcε3-Fcε4及Fcε3-Fcε4至FcεRIα的结合(图4)。图3及图4中的数据共同表明Fcε2-Fcε3-Fcε4及Fcε3-Fcε4保持了天然IgE的FcεRIα结合性质。

实例4：人类嗜碱性粒细胞的功能件分析

A.人类嗜碱性粒细胞的制备

将约40毫升自健康个体收集的静脉血液稀释于三倍体积的冰冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)中并小心地使35毫升该溶液的分液层置于15毫升菲可帕克(Ficoll Paque)上。经密度梯度离心后，抽吸掉上层，使单核细胞层原样保留在中间相位置。集中单核细胞层并用EDTA-PBS洗涤。通过锥虫蓝染色确定细胞数量且将最终量调节至每微升10⁶个。

然后使用一中型MACS管柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)进一步纯化嗜碱性粒细胞。该套组提供一半抗原-抗体混合剂，其含有结合有半抗原的抗CD3、CD7、CD14、CD15、CD16、CD36、CD45A抗体及抗HLA-DR抗体。用单克隆抗半抗原抗体结合胶体超磁性MACS微珠粒。使用该混合剂间接地磁性标记非嗜碱性粒细胞且通过在一磁场中将其保持于MACS管柱上除去磁性标记细胞。

然后通过流式细胞仪评价经纯化的嗜碱性粒细胞。用人类IgG(1微克/毫升10⁵个细胞)封阻待评价的试样。使用下列单标记：山羊抗人IgE-FITC、小鼠抗人CD123-PE、小鼠IgG1-PE、小鼠抗人CD45-PE及小鼠抗HLA-DR-FITC。使用下列双标记：(1)山羊抗人IgE-FITC和山羊抗CD45-PE及(2)小鼠抗CD123-PE和小鼠抗HLA-DR-FITC。在相应试样被染色后，进行FACS分析。

B.IgE介导的嗜碱性粒细胞去颗粒

为确保每一融合蛋白皆不会造成介体的释放，使用(例如)自Beckman Coulter(Fullerton，CA)获得的方案及标准试剂进行一组胺释放分析。简言之，于待检测融合蛋白存在或不存在的情况下用IgE敏化细胞。在该实例中，使用一重组IgE(rIgE)，其由对一衍生自HIV-1gp120 V3区的肽链段具有特异性的若干可变区及IgE的恒定区组成。然后用下列攻击经敏化的细胞：(1)阳性对照，HIV-1 gp 120 V3肽的一乳清蛋白偶联物，(2)一抗IgE、C5a、F-met混合物，或(3)IgG。测量所释放组胺的数量并将其用于测量该些融合蛋白引起的嗜碱性粒细胞去颗粒。

C.FcεRI在嗜碱性粒细胞上的表达

嗜碱性粒细胞的FcεRI表达将通过FACS分析来研究。首先将嗜碱性粒细胞在Iscove经修饰的Dulbeco氏培养基(含2％的热灭活胎牛血清、40微克/毫升的正大霉素及10毫微克/毫升的rIL-3)中培养14天。在第7天及第14天使用锥虫蓝染料测试细胞生存力。

培养14天后，将含0.5×10⁶个嗜碱性粒细胞的分液与下列试剂之一以不同浓度(10-1000毫微克/毫升)混合并培养7天：(1)仅rIgE；(2)rIgE+Fcε1-Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ；(3)rIgE+Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ；(4)rIgE+Fcε3-Fcε4-Fcγ；(5)rIgE+Fcε3-Fcγ；(6)rIgE+Fcε2-Fcε3-Fcγ；(7)rIgE+IgG-γ4；(8)无rIgE的细胞。亦作为对照，在每一个别Fcε-Fcγ融合蛋白存在但rIgE不存在的情况下培养细胞。

然后将细胞离心、洗涤并用IgG封阻以减少抗体至FcγR的非特异性结合。然后用抗FcεRI mAb-FITC或一小鼠同种型对照对每一试样染色并对每一试样进行FACS分析。未暴露于IgE的细胞(上文编号为8者)作为经培养嗜碱性粒细胞上所含受体数的一基线。在不含融合蛋白的情况下暴露于rIgE的细胞提供了一用于最大FcεRI表达的阳性对照(上文编号为1者)。

FcεRI受体数量较阴性对照的增加通过使用抗FcεRI mAb(其结合至一不同于IgE的抗原决定部位的抗原决定部位)染色的FITC染色程度的增加来衡量。那些展示出较低FITC染色程度的片段为用于治疗过敏反应的适当候选片段。

实例5：Fcε-Fcγ融合蛋白对IgE介导的组胺自经培养人类肥大细胞的释放的抑制作用

A.肥大细胞培养：

将冷藏人类脐带血CD34⁺细胞(BioWhittaker公司，Walkersville，MD)在一由下列组成的培养基中培养8周：RPMI 1640(GIBCO-BRL，Rockville，MD)，其补充有10％的胎牛白蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、2mM的L-谷氨酰胺、50mM的2-巯基乙醇、100U/毫升的青霉素、100毫克/毫升的链霉素、10毫克/毫升的正大霉素(GIBCO/BRL)、100毫微克/毫升的干细胞因子、50毫微克/毫升的IL-6及5毫微克/毫升的IL-10(R&D Systems公司，Minneapolis，MN)。每周更换一次细胞素补充培养基并通过将未粘附细胞转移至新的培养瓶来除去粘附细胞部分。在第三周期间根据制造商方案(Dynal，LakeSuccess，NY)使用涂敷有CD14及CD15特异性单克隆抗体(M-450 CD14，M-450 CD15)的珠粒排除CD14及CD15阳性细胞。取经培养细胞的分液并每周监测类胰蛋白酶表达，共监测8周。

B.免疫细胞化学

每周将含3-4×10⁴个经培养细胞的分液旋涂至细胞离心机中的载玻片上。在室温下对载玻片上的细胞进行空气干燥并将其在卡诺氏(Carnoy)液(60％乙醇、30％氯仿及10％冰醋酸)中固定10分钟。用PBS洗涤后，在室温下用封阻缓冲液(3％BSA、1.5％正常马血清、0.2％Triton X-100、0.02％NaN₃溶于PBS中之溶液)将载玻片封阻30分钟。封阻后，在37℃下将载玻片与小鼠抗人类胰蛋白酶MAb(结合有碱性磷酸酶，Chemicon，Temecula，CA)一起培养1小时。将抗体以1∶300的比例稀释于一PBS缓冲液(含3％BSA、0.2％Triton X-100、0.02％NaN₃)中。在PBS(含0.2％Triton X-100)中洗涤载玻片且使用碱性磷酸酶基质套组(Vector Lab公司，Burlingame，CA)实施免疫细胞化学程序。计数展示出强免疫活性的细胞并将其表达为全部计数细胞的百分比。

C.流式细胞仪分析

在第7周用PBS洗涤一次细胞，然后与补充有1％BSA和1％人类γ球蛋白的冷PBS(PBSBH)一起在4℃下预培养30分钟。然后，该等细胞与结合有PE/FITC的对下列抗原决定部位具特异性的小鼠抗人MAb(Mab购自BD Pharmingen)一起培养：c-套组(干细胞因子的受体)、CD13(一用于氨基肽酶N的标记物)、CD14(单核细胞的标记物)、CD16(嗜中性粒细胞标记物)及CD61(整合素家族的β₃亚单元)。该等细胞在4℃下与MAbs一起培养30分钟，然后用冷PBSBH洗涤三次。将经染色的细胞在1％低聚甲醛(4℃)中固定过夜并使用一流式细胞仪(EPICSXL-MCL，Beckman-Coulter，Miami，FL)分析。流式细胞仪分析显示，细胞对于c-套组呈强阳性(＞90％)对于CD13呈中度阳性(＞60％)，对于CD14及CD16呈阴性，且对于CD61呈弱阳性(＞50％)。

D.IgE介导的组胺自人类肥大细胞的释放

使用自Beckman Coulter(Fullerton，CA)获得的方案及标准试剂进行组胺释放分析。简言之，在存在或不存在不同浓度的Fcε-Fcγ蛋白质的情况下在37℃下用一重组IgE(0.1、1或10微克/毫升)将肥大细胞(1.5×10⁵)敏化1小时。重组IgE由对一衍生自HIV-1 gp 120V3区的肽链段具特异性的若干可变区及人类IgE的恒定区组成。经洗涤后，在37℃下用结合有多个HIV-1 V3肽的乳清蛋白Ova/V3(100毫微克/毫升)攻击细胞2小时。收集细胞上清液并使用一组胺免疫分析套组(Beckman-Coulter，Palatine，IL)根据制造商的方案测量其组胺含量。该免疫分析基于待分析组胺与组胺碱性磷酸酶偶联物之间的竞争。简言之，用一略呈碱性pH值的酰化剂酰化细胞上清液中的组胺并将其加至涂敷有抗体的微量滴定板上。微量滴定板涂敷有一有限数量的抗体，以容许偶联物与试样中的酰化组胺之间发生竞争。在4℃下培养2小时后，冲洗加样孔以除去未结合的组分。通过加入一显色基质(pNPP)来测量结合酶活性。颜色强度与试样中组胺的浓度成反比。根据用套组中提供的标样获得的一标准曲线来计算所释放的组胺。包括于该些研究中的对照组为：未经处理的细胞、用离子载体A23187(2μM)处理的细胞、仅用IgE处理的细胞或仅用Ova/V3处理的细胞。

上文描述的内容、术语、表达及实例仅为例示性而非限定性。本发明包括上述实施例的所有已知及未知等效形式二者。本发明仅受随附权利要求的限制而不受本文件任何其他部分或任何其他来源中的任何陈述内容的限制。

序列表

<110>安玲玲

吴和仁

冯锡忠

<120>用于治疗过敏症及哮喘病的Fcε融合蛋白

<130>TNX01-02

<150>US60/298,710

<151>2002-06-15

<160>2

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>330

<212>PRT

<213>人类

<220>

<221>肽

<222>(1)..(330)

<400>1

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Tle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asr

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Ly5 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>2

<211>16

<212>PRT

<213>合成构建体

<220>

<221>

<222>(1)..(16)

<223>

<400>2

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims

1、一种融合蛋白，其包含一IgE Fcε片段及一IgG Fcγ片段，其中该融合蛋白结合至一FcεRI及/或FcεRII受体及一FcγRIIB受体。

2、如权利要求1所述的融合蛋白，其中该Fcε片段包含可以天然IgE的至少75％结合亲和力结合至FcεRI及FcεRII的铰链-Fcε2-Fcε3-Fcε4或其一功能性片段。

3、如权利要求1所述的融合蛋白，其选自铰链-Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ、Fcε2-Fcε3-Fcε4-Fcγ、Fcε2-Fcε3-Fcγ、FCε3-Fcγ及Fcε3-Fcε4-Fcγ。

4、如权利要求1所述的融合蛋白，其中该Fcγ片段为一IgG亚类的片段，该IgG亚类选自IgG1或IgG3或其一可结合至FcγRIIB的修饰形式。

5、如权利要求1所述的融合蛋白，其中该Fcγ片段为铰链-Fcγ2-Fcγ3、Fcγ2-Fcγ3或Fcγ2。

6、一种融合蛋白，其包含一Fcε片段及一Fcγ片段，其中该融合蛋白包含Fcε2-Fcε3-Fcγ3且以天然IgE的至少75％结合亲和力结合至FcεRI及FcεRII受体。

7、如权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中该Fcε片段与该Fcγ片段通过一连接体结合。

8、如权利要求7所述的融合蛋白，其中该连接体为非免疫原性。

9、如权利要求8所述的融合蛋白，其中该非免疫原性连接体为一具有序列GGSGGSGGGGSGGGGS(SE1 ID NO：2)的16氨基酸连接体。

10、一种组合物，其包含如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白及一生理上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。

11、一种核酸分子，其编码如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白。

12、如权利要求11所述的核酸分子，其中该核酸分子可有效连接至一转录控制序列。

13、一种宿主细胞，其用权利要求12所述的核酸分子转染。

14、一种制备如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白的方法，其包含制备一编码该融合蛋白的载体，用该载体转染一宿主系统并在该宿主系统中表达该融合蛋白。

15、一种制备如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白的方法，其包含结合该Fcε片段至该Fcγ片段。

16、一种阻断一哺乳动物受试者中IgE结合至FcεRI及/或FcεRII的方法，其包含向该哺乳动物受试者给予一阻断量的如权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白或组合物。

17、如权利要求16所述的方法，其中该FcεRI或FcεRII被交联至FcγRIIB。

18、一种抑制一哺乳动物受试者中FcεRI的表达并下调IgE生成的方法，其包含向一哺乳动物受试者给予一抑制量的如权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白或组合物。

19、一种改善或防止一易感哺乳动物受试者中由IgE介导的过敏反应的方法，其包含向该哺乳动物受试者给予一改善或阻止量的如权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白或组合物。

20、如权利要求19所述的方法，其中该过敏反应涉及过敏性哮喘病、过敏性鼻炎、枯草热、食物过敏、特应性皮炎及药物过敏。

21、如权利要求20所述的方法，其中该过敏反应由花生过敏原引起。

22、如权利要求19所述的方法，其进一步包含给予一抗IgE抗体或其片段，其中该给予可同时、分别或依序进行。

23、如权利要求22所述的方法，其中该过敏反应涉及哮喘病、过敏性鼻炎、枯草热、食物过敏、特应性皮炎及药物过敏。

24、一种改善或防止一哺乳动物受试者中由IgE介导的过敏性疾病的方法，其包含给予一改善或阻止量的如权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白或组合物及一过敏原。

25、如权利要求24所述的方法，其中该融合蛋白或组合物及过敏原可分别、依序或同时给予。

26、如权利16至25中任一项所述的方法，其中该哺乳动物受试者为人、犬或猫。