CN1348466A - 衍生自lgECε2区的表位或模拟表位、其拮抗剂以及它们的治疗用途 - Google Patents
衍生自lgECε2区的表位或模拟表位、其拮抗剂以及它们的治疗用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1348466A CN1348466A CN00806614A CN00806614A CN1348466A CN 1348466 A CN1348466 A CN 1348466A CN 00806614 A CN00806614 A CN 00806614A CN 00806614 A CN00806614 A CN 00806614A CN 1348466 A CN1348466 A CN 1348466A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ige
- peptide
- mimic epitopes
- seq
- epi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 184
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 claims description 147
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 47
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 32
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 22
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims description 13
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 17
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract 1
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 106
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 43
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 31
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 23
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 23
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 18
- 238000011160 research Methods 0.000 description 18
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 17
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 16
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 15
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 13
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 13
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 12
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 9
- 101710128966 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 8
- 102100038006 High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- -1 succinimide ester Chemical class 0.000 description 8
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 101100522260 Danio rerio ptmab gene Proteins 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 5
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 5
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 241000380131 Ammophila arenaria Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108060005989 Tryptase Proteins 0.000 description 4
- 102000001400 Tryptase Human genes 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 4
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000013138 pruning Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N Isodigeranyl Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC(C)(C=C)CCC=C(C)C MFGOTAHWOBKNNU-XMHGGMMESA-N 0.000 description 2
- MFGOTAHWOBKNNU-FQEVSTJZSA-N Isodigeranyl Natural products CC(=CCCC(=CC[C@](C)(CCC=C(C)C)C=C)C)C MFGOTAHWOBKNNU-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 101800004192 Peptide P1 Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKVZMKDXJFCMMD-UVWUDEKDSA-L (5ar,8ar,9r)-5-[[(2r,4ar,6r,7r,8r,8as)-7,8-dihydroxy-2-methyl-4,4a,6,7,8,8a-hexahydropyrano[3,2-d][1,3]dioxin-6-yl]oxy]-9-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-5a,6,8a,9-tetrahydro-5h-[2]benzofuro[6,5-f][1,3]benzodioxol-8-one;azanide;n,3-bis(2-chloroethyl)-2-ox Chemical compound [NH2-].[NH2-].Cl[Pt+2]Cl.ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl.COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 WKVZMKDXJFCMMD-UVWUDEKDSA-L 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCXJFMDOHDNDCC-UHFFFAOYSA-N 5-$l^{1}-oxidanyl-3,4-dihydropyrrol-2-one Chemical group O=C1CCC(=O)[N]1 HCXJFMDOHDNDCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016893 Amine Oxidase (Copper-Containing) Human genes 0.000 description 1
- 108010028700 Amine Oxidase (Copper-Containing) Proteins 0.000 description 1
- 101100443255 Arabidopsis thaliana DIR10 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150047683 ESC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 101000878611 Homo sapiens High affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 102220500287 Lysosomal alpha-glucosidase_D10G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 229920000361 Poly(styrene)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100532011 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RTT107 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000013 aluminium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910000329 aluminium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 108010067755 dinitrophenyl-bovine serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006122 polyamide resin Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- XXPDBLUZJRXNNZ-UHFFFAOYSA-N promethazine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 XXPDBLUZJRXNNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- IFIJJMKUTOBNME-UHFFFAOYSA-N pyrrole-2,5-dione;pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1.O=C1NC(=O)C=C1 IFIJJMKUTOBNME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 102200000740 rs193922744 Human genes 0.000 description 1
- 102200037754 rs6493068 Human genes 0.000 description 1
- 102220127750 rs886044686 Human genes 0.000 description 1
- 102220169028 rs886051722 Human genes 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及提供用于治疗、预防或缓解变应性疾病的新药物。具体地说,所述新药物是加入IgE Cε2区表面暴露区域的表位或模拟表位的分离的肽。本发明人已经发现:这些新的区域可能是被动和主动免疫预防或免疫治疗的靶。本发明还涉及所述药物、含所述药物的药用组合物的生产方法以及所述药物和药用组合物在医药中的应用。能够结合本发明的表面暴露IgE区域的配体、尤其是单克隆抗体以及它们在医药中作为被动免疫治疗或免疫预防的应用也构成了本发明的一个方面。
Description
本发明涉及提供用于治疗、预防或缓解变应性疾病的新药物。具体地说,所述新药物是加入IgE Cε2区表面暴露区域的表位或模拟表位(mimotope)的分离的肽。本发明人已经发现:这些新的区域可能是被动和主动免疫预防或免疫治疗的靶。本发明还涉及所述药物、含所述药物的药用组合物的生产方法以及所述药物和药用组合物在医学中的应用。能够结合本发明的表面暴露IgE区域的配体、尤其是单克隆抗体以及它们在医学中作为被动免疫治疗或免疫预防的应用也构成了本发明的一个方面。非肽模拟表位也是本发明的一个实施方案。
在变态反应中,通常与变态反应相关的症状是由于变态反应介质例如组胺从免疫细胞中释放到周围组织和脉管结构中而引起的。组胺通常贮藏在肥大细胞和嗜碱性粒细胞中,直至由于与变应原特异性IgE相互作用而触发这种释放。IgE在变态反应(例如哮喘、食物过敏、特应性皮炎、I型过敏反应和过敏性鼻炎)介导方面的作用是众所周知的。在遇到抗原例如花粉或尘螨变应原时,B细胞开始合成变应原特异性IgE。所述变应原特异性IgE随后与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI受体(高亲和性IgE受体)结合。随后的任何一次与变应原的相遇均导致通过相邻IgE/FcεRI复合体的交联而触发肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放组胺(Sutton和Gould,Nature,1993,366:421-428;EP 0477 231 B1)。
IgE同所有免疫球蛋白一样,包含两条重链和两条轻链。ε重链由5个区组成:一个可变区(VH)和四个恒定区(Cε1至Cε4)。IgE的分子量约为190,000Da,重链的长度约为550个氨基酸。在Padlan和Davis(Mol.Immunol.,23,1063-75,1986)以及Helm等(于2/10/90以PDB存储的2IgE模型结构(2IgE model structure deposited 2/10/90 with PDB)(Protein Data Bank,Research Collabarotory for Structural Bioinformatics;http:\pdb-browsers.ebi.ac.uk))中讨论了IgE的结构。第二个区Cε2大约包含IgE的氨基酸226-328(Flanagan J.G.和Rabbitts,T.H.,1982,EMBO J.,1,655-660;Kenten等,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6661-6665),但可以包含额外的氨基酸。通过与IgG1的已知结构进行比较,推定Cε3区的起始点是Ser337。
过去已经研究了许多设计用来干扰IgE介导的组胺释放机制的被动或主动免疫治疗途径,并且获得了不同程度的成功。这些途径包括或者用被动给予的抗体、或者通过被动给予竞争性结合FcεRI或FcεRII(低亲和性IgE受体)受体的IgE衍生肽,干扰IgE或变应原/IgE复合体与所述受体的结合。另外,某些作者已经描述了在主动免疫中应用衍生自IgE的特定肽,以刺激抑制组胺释放的免疫应答。
已经报道:参与IgE与其受体结合的IgE区是Cε3和Cε4(Sutton,B.J.和Gould,H.J.;Nature,1993,366:421-428;WO 97/31948),因此先前的治疗策略一直集中于这两个区的部分上。
该领域中先前的研究人员在其研究过程中,遇到了在设计新的抗变态反应疗法中必须考虑的许多事项和问题。最危险的问题之一围绕着在组胺释放信号中涉及IgE交联。最常见的情况是:在主动免疫接种期间产生的抗IgE抗体自身通过在缺乏变应原的情况下相邻IgE-受体复合体的交联,能够触发组胺释放。这种现象称为过敏原性。实际上,通常用于IgE检测分析的许多市售抗IgE单克隆抗体是过敏原性的,如果将其给予患者,则因此是无用且具有潜在的危险。
一种抗体是否具有过敏原性,取决于所述IgE分子上的靶表位的位置。然而,根据该领域的知识现状,虽然有巨大的科学意义并且作了许多努力,但对任一抗体或表位可能具有何种特性以及它是否可能对患者具有正或负的临床效应的可预测性却很低或者没有可预测性。
因此,为了安全和有效,被动给予的抗体或疫苗所诱导的抗体必须结合在IgE能够干扰组胺触发途径的区域中,并且所述抗体自身不具有过敏原性。本发明达到了所有这些目标,提供作为能够产生抑制组胺释放的非过敏原性抗体的药物。这些药物可以构成主动疫苗的基础,或用来产生用于被动免疫治疗的合适抗体,或对于某一治疗效应本身可以被动给予。
本领域技术人员已经进行了许多研究,以鉴定确实具有抗IgE介导的变态反应的有益效应的特异性抗IgE抗体(WO 90/15878,WO89/04834,WO 93/05810)。已经尝试鉴定出由这些有用抗体识别的表位,以构建这类表位的肽模拟表位,并且用所述肽模拟表位作为产生抗IgE抗体的免疫原。
WO 97/31948描述了这类研究的实施例,并且还描述了与载体分子缀合的来自Cε3和Cε4区的IgE肽,以用于主动疫苗接种目的。这些免疫原可以用于疫苗接种研究,并且据认为能够产生随后在体内抑制组胺释放的抗体。在这项研究中,描述了据认为可用于主动疫苗接种目的、能够与包含在Cε3区中的IgE肽结合的单克隆抗体(BSW17)。
EP 0 477 231 B1描述了用于主动免疫接种性免疫预防、与匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的衍生自IgE Cε4区(残基497-506,也称为Stanworth十肽)的免疫原。WO 96/14333是EP 0 477 231 B1中所述研究的继续。
其它途径基于鉴定自身与IgE竞争结合嗜碱性粒细胞或肥大细胞上高亲和性或低亲和性受体的肽(WO 93/04173,WO 98/24808,EP 0303 625 B1,EP 0 341 290)。
本发明鉴定出IgE Cε2区的新的表面暴露表位,它们可以用作变应性疾病状态的主动或被动免疫预防或治疗的靶。本发明提供加入所述分离的表位本身的肽,还提供这些新鉴定的表位的模拟表位,所述模拟表位本身可以用于治疗变态反应,或可以用于主动免疫接种性免疫预防或治疗的免疫原中。本发明的分离的表位或模拟表位最好用于主动免疫接种方案的免疫原中,以诱导自身抗IgE抗体,它们本身限制、缓解或消除接种疫苗的受治疗者的变态反应或症状。另一方面,本发明的模拟表位或免疫原可以被动给予患者,以限制、缓解或消除接种疫苗的受治疗者的变态反应或症状。
加入本发明的分离表位的肽当被稳定地呈递(例如在一种载体上)时具有免疫原性,而且在体内能够诱导非过敏原性的自身抗IgE抗体,并且有效缓解过敏反应。本发明的表位或模拟表位最好仅衍生自Cε2区,因为它们不衍生自任何其它区,亦即在Cε1、Cε3或Cε4区中未发现它们。特别是,作为一个优选实施方案,它们衍生自由人IgE的Ser222-Ala329编码的区。
已经发现特别适用于本发明的模拟表位或免疫原的Cε2区的特定表位,是本发明人已经发现的表面暴露的那些表位。可以根据其建模结构确定IgE区域的表面暴露。(Padlan和Davies,Mol.Immunol.,23,1063-75,1986;Helm等,于2/10/90以PDB存储的2IgE模型结构(Protein Data Bank,Research Collabarotory for StructuralBioinformatics))。本发明人已经发现:也发现可用于本发明的表位是高度表面暴露的。根据这一观察,本发明人已经设计出一种提供其它合适表位的方法,所述表位是在5残基滑动窗口范围计算的具有可及区的表位。本发明人已经发现:Cε2区中的优选区具有一个在5残基滑动窗口范围用分子模拟软件(MSI)计算的大于502、优选大于802的可及表面。
这类表面暴露的Cε2 IgE表位的实例是:
肽名称 | 序列 | 定位序列和IgE区 | SEQ ID NO. |
P1 | EDGQVMDVD | Cε2(Glu270-Asp278) | 1 |
P2 | STTQEGEL | Cε2(Ser283-Leu290) | 2 |
P3 | SQKHWLSDRT | Cε2(Ser300-Thr309) | 3 |
P4 | GHTFEDSTKK | Cε2(Gly318-Lys327) | 4 |
P5 | GGGHFPPT | Cε2(Gly245-Thr250) | 5 |
P6 | PGTINI | Cε2(Pro262-Ile267) | 6 |
P7 | FTPPT | Cε2(Phe231-Thr235) | 7 |
加入这类表位的肽构成本发明的一个优选方面。具有与这些表位相同特性的模拟表位以及包含这类模拟表位、产生与IgE分子环境内的IgE Cε2表位交叉反应的免疫应答的免疫原,也构成了本发明的部分。
因此,本发明包括包含天然的IgE表位本身及其任何模拟表位的分离的肽。模拟表位的含义定义为与天然IgE表位足够相似以能够被识别所述天然IgE表位的抗体识别的实体;(Gheysen,H.M.,等,1986,作为抗原的合成肽(Synthetic peptides as antigens).Wiley,Chichester,Ciba foundation symposium 119,第130-149页;Gheysen,H.M.,1986,Molecular Immunology,23,7,709-715);或与天然IgE表位足够相似以便当与合适的载体偶联时能够产生与所述天然IgE表位交叉反应的抗体的实体。
本发明的模拟表位可以是肽,或是非肽类。以上鉴定的表面暴露的IgE表位的肽模拟表位可以具有一段不同于所述天然表位的序列,但也可以具有与所述天然表位完全相同的序列。这样一种分子称为所述表位的模拟表位,因为虽然这两种分子共享相同的序列,但模拟表位将不在完整的Cε2区结构环境内呈递,并且因此所述模拟表位可能采取与所述天然IgE表位略为不同的构象。对于本领域技术人员显而易见的是,以上鉴定的线性序列(P1至P7)当在IgE三级结构中时,与IgE一级结构中可能相隔的其它区相邻。因此,例如一种P1的模拟表位可以是连续或是不连续的,因为它包含或模拟多个P1区段和由这些相隔氨基酸残基构成的区段。
可以用于本发明的优选的表面暴露区含有与环结构有关的区。因此,本发明的肽或模拟表位可以包含一个具有N端或C端延伸的环,所述延伸可以是来自相邻β-折叠的天然氨基酸残基。作为实例,P1含有IgE Cε2区的C-D环,P2含有所述区的D-E环,P3含有所述区的E-F环,P4含有所述区的F-G环,P5含有所述区的A-B环,而P6含有所述区的B-C环。因此,这些环的模拟表位构成本发明的一个方面。
特别优选的药物基于表位P1及其模拟表位。加入这种表位及其模拟表位的肽当与载体偶联时,有效诱导能够抑制人嗜碱性粒细胞释放组胺的抗IgE免疫应答。而且,这些免疫应答是非过敏原性的。P1的模拟表位最初被描述为当配制为免疫原时能够诱导免疫应答的实体,并且所述应答能够在IgE Cε2区的环境中识别P1。
P1对应于Cε2区的C-D环。免疫球蛋白折叠的C-D环结构对应于Cβ链末端和Dβ链起始之间的连接链(Introduction to proteinStructure,第304页,第2版,Branden和Tooze,Garland Publishing,New York,ISBN 0 8153 2305-0),大约对应于IgE分子的氨基酸残基号Trp268-Ser280。因此,IgE Cε2 C-D环的模拟表位以及能够与IgE Cε2C-D环结合的配体构成了本发明的一个优选方面。
可以通过添加、缺失或取代选定的氨基酸,设计用于特定目的的以上所鉴定IgE表位的肽模拟表位。因此,为了易于与蛋白载体缀合,可以对本发明的肽加以修饰。例如,对于某些化学缀合方法,可能希望在所述IgE表位中包括一个末端半胱氨酸。另外,可能希望与蛋白载体缀合的肽包括一个远离所述肽缀合末端的疏水末端,使得所述肽的游离的未缀合末端保持与载体蛋白表面结合。这降低了所述肽的构象的自由度,并因此增加了所述肽以最类似于完整IgE分子环境中发现的IgE肽的构象呈递的可能性。例如,可以改变所述肽,以使其具有一个N末端半胱氨酸和一个C末端疏水酰胺化尾。另一方面,可以添加或取代D-立体异构体形式的一个或多个氨基酸,以产生有益的衍生物,例如以增强所述肽的稳定性。本领域技术人员会认识到,这类修饰的肽或模拟表位可以是完全非肽或部分非肽的模拟表位,其中组成残基不必限于20种天然存在的氨基酸。另外,这些肽或模拟表位可以用本领域已知的技术进行环化,以将所述肽限于一种非常类似所述肽序列在完整IgE分子环境中的形状的构象。
含有一对半胱氨酸残基以允许形成二硫桥的优选环化肽的实例是PT1079(SEQ ID NO.14)、PT1079GS(SEQ ID NO.15)、PT1078(SEQID NO.16)和P15q(SEQ ID NO.11)。
此外,本领域技术人员会认识到,本发明的模拟表位或免疫原可以比所述分离的肽长,并且可以包含本文公开的序列。因此,本发明的模拟表位可以包括在一端或两端加入许多其它天然残基的N端和/或C端延伸。所述肽模拟表位也可以是天然IgE序列的retro序列,因为所述序列方向是反向的;或者所述序列可以全部或至少部分由D-立体异构体氨基酸组成(inverso序列)。此外,所述肽序列可以是相称的retro-inverso,因为序列方向是反向的并且所述氨基酸是D-立体异构体形式。这类retro或retro-inverso肽的优点是非自身的,因此可以解决免疫系统中自身耐受的问题(例如P15r-参见下文)。
或者,可以采用例如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)的技术,用本身能够与本发明IgE表位结合的抗体鉴定肽模拟表位。该技术产生大量的模拟天然肽结构、并因此能够与抗天然肽抗体结合的肽序列,但可能其自身不必与所述天然IgE肽共享显著的序列同源性。这种途径可能由于允许鉴定出免疫原性特性增强(例如与所述IgE受体或抗IgE抗体的较高亲和性结合特性,或能够诱导以较高亲和性与IgE结合的多克隆免疫应答)的肽而具有明显的优势,或者可以解决可能与天然肽序列应用有关的任何潜在的自身抗原耐受的问题。另外,该技术使得能够根据所识别的模拟表位序列中其共享的化学特性,鉴定出每种天然肽的识别模式。
修饰的肽模拟表位的优选实例和噬菌体衍生的模拟表位的实例包括:
肽 | 序列 | 描述 | SEQID NO. |
P15 | CLEDGQVMDVDLL-NH2 | P1模拟表位 | 8 |
P15r | LLDVDMVQGDELC-NH2 | P1 retro模拟表位 | 9 |
P15p | WLEDGQVMDVDLC | P1模拟表位 | 10 |
P15q | CLEDGQVMDVDLC | P1模拟表位 | 11 |
C67/8 | CFINKQMADLELCPRE | P1模拟表位 | 12 |
C67 | CFMNKQLADLELCPRE | P1模拟表位 | 13 |
PT1079 | CLEDGQVMDVDLCPREAAEGDK | P1模拟表位 | 14 |
PT1079GS | CLEDGQVMDVDLCGGSSGGP | P1模拟表位 | 15 |
PT1078 | CLEDGQVMDVDCPREAAEGDK | P1模拟表位 | 16 |
P15s | QVMDVDL | P1模拟表位 | 17 |
EEC39-I | KCREVWLGESETIMDCE | P1模拟表位 | 18 |
EEC39-J | ACREVWLGESETIMDCD | P1模拟表位 | 19 |
EEC39-10 | SCREVWLGESETVMDCG | P1模拟表位 | 20 |
EEC40-9 | NCQDLMLREDAGCWSKM | P1模拟表位 | 21 |
EEC47-3 | DCEEPMCSPVLLQQLKL | P1模拟表位 | 22 |
P15t | LEDGQVMDVD | P1模拟表位 | 23 |
P16 | CSTTQEGELA-NH2 | P2模拟表位 | 24 |
P2sh | TTQEGE | P2模拟表位 | 25 |
P17 | CSQKHWLSDRT-NH2 | P3模拟表位 | 26 |
P4ex | TYQGHTFEDSTKKCADSNPRGV | P4模拟表位 | 27 |
P5sh | GGHFPP | P5模拟表位 | 28 |
P5long1 | CSSCDGGGHFPPTIQC | P5模拟表位 | 192 |
P5long2 | CLQSSCDGGGHFPPTIQLLC | P5模拟表位 | 193 |
在其它模拟表位中,P1、P2、P3、P4、P4、P5、P6或P7的氨基酸残基每个可以被最类似该氨基酸的氨基酸独立地取代。例如,A可以被V、L或I取代,如下表所述。
原始残基 | 典型的取代 | 优选的取代 |
A | V,L,I | V |
R | K,Q,N | K |
N | Q,H,K,R | Q |
D | E | E |
C | S | S |
Q | N | N |
E | D | D |
G | P,A | A |
H | N,Q,K,R | R |
I | L,V,M,A,F | L |
L | I,V,M,A,F | I |
K | R,Q,N | R |
M | L,F,I | L |
F | L,V,I,A,Y | L |
P | A | A |
S | T | T |
T | S | S |
W | Y,F | Y |
Y | W,F,T,S | F |
V | I,L,M,F,A | L |
能够与表面暴露的Cε2 IgE表位结合的配体以及包含所述配体的药用组合物构成了本发明的部分。这类配体能够用于被动预防或治疗,通过将这类配体给予患者,缓解变应性疾病。这类有用配体的实例包括单克隆抗体或多克隆抗体。例如,可以对在1只动物中诱导的抗体加以纯化,并且被动给予另一只动物,以预防或治疗变态反应。采用本领域已知的技术,也可以应用本发明的肽来产生单克隆抗体杂交瘤(采用已知的技术,例如Khler和Milstein,Nature,1975,256,第495页)、人源化单克隆抗体或CDR移植单克隆抗体。因此,本发明的一个相关方面是能够与IgE Cε2区的表面暴露表位结合的配体。这类配体的实例是抗体(或Fab片段)。这类抗体可以用于被动免疫预防或免疫治疗,或其本身可以用于鉴定IgE肽模拟表位。
本文的术语“抗体”用来指具有有用抗原结合特异性的分子。本领域技术人员容易理解:该术语也可以包括作为抗体片段或衍生物、但可以显示出相同或非常类似的功能性的多肽。本文使用的术语抗体将包括这类抗体片段或衍生物。
优选的配体是单克隆抗体。特别优选的配体是P1的配体,最好是单克隆抗体。例如,PTmAb0011是根据用于专利的微生物保存布达佩斯条约于1999年3月8日保藏于ECACC(欧洲动物细胞保藏中心,Vaccine Research and Production Laboratory,Public HealthLaboratory Service,Centre for Applied Microbiology Research,PortonDown,Salisbury,Wiltshire,SP4 OJG,英国)的小鼠IgG1型单克隆抗体的参考名称,其保藏号为99030805。
例如,PTmAb0011识别Cε2的C-D环,其本身与人嗜碱性粒细胞上高亲和受体结合时能够识别IgE,而不引起脱颗粒,此外它能够通过阻止IgE与FcεR1α结合并且抑制变应性嗜碱性粒细胞中LolP1触发的组胺释放,阻断非变应性嗜碱性粒细胞的被动敏化。识别Cε2的C-D环的另一单克隆抗体是is PTmAb0005(可得自SigmaChemicals Catalogue number I6510,克隆号GE-1)。本发明提供药用组合物中的这种单克隆抗体。
通过用PTmAb0011和PTmAb0005进行噬菌体淘选,已经鉴定出Cε2 IgE的C-D环的其它肽模拟表位。这类模拟表位的实例包括:
肽P1模拟表位(PTmAb0011噬菌体淘选) | SEQ NO. |
HCQQVFFPQDYLWCQRG | SEQ ID No.32 |
SCREVWLGGSEMIMDCE | SEQ ID No.33 |
ECNQNLSGSLRHVDLNC | SEQ ID No.34 |
DCEEPMCSPVLLQKLKP | SEQ ID No.35 |
SCREVWLGGSEMIMDCE | SEQ ID No.36 |
RCDQQLPRDSYTFCMMS | SEQ ID No.37 |
SCPAFPREGDLCAPPTV | SEQ ID No.38 |
FCPEPICSPPLSRMTLS | SEQ ID No.39 |
VCDECVSRELAL | SEQ ID No.40 |
WCLEPECAPGLL | SEQ ID No.41 |
VCDECVSRELAL | SEQ ID No.42 |
DCLSKGQMADLC | SEQ ID No.43 |
SCQGREVRRECW | SEQ ID No.44 |
WCREVWLGESETIMDCE | SEQ ID No.45 |
ACREVWLGESETIMDCD- | SEQ ID No.46 |
GCAEPKCWQALHQKLKP- | SEQ ID No.47 |
肽P1模拟表位(PTmAb0005噬菌体淘选) | SEQ NO. |
ECRGPNMQMQDHCPTTD | SEQ ID No.48 |
QCNAVLEGLQMVDHCWN | SEQ ID No.49 |
CCVADPETQMTPSSEMF | SEQ ID No.50 |
HCKNEFKKGQWTYSCSD | SEQ ID No.51 |
QCRQFVMNQSEKEFGQC | SEQ ID No.52 |
NCFMNKQLADLELCPRE | SEQ ID No.53 |
SCAYTAQRQCSDVPNPG | SEQ ID No.54 |
GCFMNKQMADLELCPRTAA | SEQ ID No.55 |
ACFMNKQMADLELCPRVAA | SEQ ID No.56 |
GCFINKQLADLELCPRVAA | SEQ ID No.57 |
GCFMNKQLADWELCPRAAA | SEQ ID No.58 |
ECFMNKQLADSELCPRVAA | SEQ ID No.59 |
GCFMNKQLADPELCPREAE | SEQ ID No.60 |
GCFMNKQLVDLELCPRGAA | SEQ ID No.61 |
GCFMNKQLADLELCPREAA | SEQ ID No.62 |
GCFMNKQQADLELCPRGAA | SEQ ID No.63 |
GCFINKQMADLELCPREAA | SEQ ID No.64 |
因此,能够与PTmAb0005或PTmAb0011结合的IgE Cε2的模拟表位以及包含这些模拟表位的免疫原构成了本发明的一个重要方面。包含能够与PTmAb0005或PTmAb0011结合的模拟表位的疫苗可用于治疗变态反应。
虽然不限制P1模拟表位的更广义的定义,但根据这些和其它噬菌体序列,已经鉴定出一个亚组P1样肽的核心模式。该模式是一个亚组的P1模拟表位,并且在该特定抗P1单克隆抗体的识别所需的每个位置中氨基酸的化学特性方面描述了其模拟表位:
y h x d h h a n a n x y
其中:
y......y 可以被环化。
h 疏水性(cys;pro;gly;ala;val;ile;leu;trp;met;phe)。
d 给予离子键的(arg;lys;his;gln;asn;trp;tyr;thr;ser)。
a 酸性(asp;glu)。
n 离子中性/非极性(除asp、glu、lys、arg外的所有氨基酸)。
x 任何氨基酸(n=0-3)。
因此,在一个实施方案中,P1的模拟表位可以用上述通用核心特征 y h x d h h a n a n x y 来加以描述。P1肽或其模拟表位可以任选地在任一端邻接其它氨基酸,以有助于缀合或用于任何其它目的。
P1的一种特别优选的模拟表位是P15s(SEQ ID NO.17),已经表明其Q、M和第一个D残基对于PTmAb0011和PTmAb0005结合活性是关键性的(参见实施例)。因此,一种其中非必需残基被相似氨基酸(如上概述)取代的P15s模拟表位的结构式将是:
Q,X1,M,D,X1,X2,X3
其中X1选自V、I、L、M、F或A;X2选自D或E;而X3选自L、I、V、M、A或F。
应用PTmAb0005和PTmAb0011鉴定IgE的新模拟表位以随后用于变态反应治疗,也构成了本发明的一个重要方面。由于PTmAb0005是市售的,因此这种配体不构成本发明的组合物,然而,包含PTmAb0005的药用组合物及其在鉴定P1模拟表位中的应用则构成了本发明的两个重要方面。
P2、P3、P4和P5的模拟表位也构成本发明的一个重要方面。例如,P16和P17分别是P2和P3的模拟表位。这些肽当在载体上适当地呈递时,均能够诱导非过敏原性的强抗IgE抗体应答。
在一个优选实施方案中,加入以上鉴定的本发明的表位或者肽或非肽模拟表位的肽的大小将很小,使得它们模拟选自完整Cε2区的一个区域。设想了肽模拟表位因此应该在长度上小于100个氨基酸,优选不足75个氨基酸,更优选不足50个氨基酸,最优选长度在4-25个氨基酸的范围内。优选的肽模拟表位的具体实例是PT1079和P15q,它们分别长21个氨基酸和13个氨基酸。根据分子体积,设计了大小很小的其肽对应物的非肽模拟表位。
对于本领域技术人员显而易见的是:可以采用多种技术证实特定构建体作为模拟表位的资格(status)。这类技术包括以下技术:可以分析推定的模拟表位,以确定所述构建体的免疫原性,因为由所述推定的模拟表位产生的抗血清与所述天然IgE分子交叉反应,并且也有效地阻断变应性效应细胞释放变应性介质。这些应答的特异性可以通过用所述模拟表位本身或所述天然IgE和/或已知结合IgE Cε2的表面暴露表位的特异性单克隆抗体阻断抗血清活性的竞争实验来加以证实。用于所述竞争测定的这类单克隆抗体的具体实例包括例如PTmAb0005和PTmAb0011,这将证实所述推定的模拟表位作为IgECε2区C-D环模拟表位的资格。
在本发明的一个实施方案中,将至少一种加入一个IgE表位或模拟表位的上述肽与载体分子连接,以形成用于疫苗接种方案的免疫原。最好是,所述载体分子与所述天然IgE分子无关。所述肽或模拟表位通过化学共价缀合或通过遗传工程融合配偶体的表达、任选地通过一个接头序列而连接。
可以以本领域众所周知的方式进行所述肽与免疫原性载体的共价偶联。因此,例如利用碳二亚胺、戊二醛或(N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基])琥珀酰亚胺酯,利用普通市售的异双功能接头例如CDAP和SPDP(采用生产商的说明)进行直接共价偶联是可能的。在偶联反应之后,可以借助透析法、凝胶过滤法、分级分离法等容易地分离并纯化所述免疫原。
本领域技术人员容易了解用于本发明免疫原中的载体的类型。载体的功能是提供细胞因子辅助,以有助于诱导针对所述IgE肽的免疫应答。可以用于本发明的非详尽载体表包括:匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、灭活细菌毒素例如破伤风毒素或diptheria毒素(TT和DT)、或其重组片段(例如TT片段C的结构域1、或DT的易位结构域(translocation domain)、或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。另一方面,可以将所述模拟表位或表位直接与脂质体载体缀合,这还可以包括能够提供T细胞辅助的免疫原。肽与载体之比最好约为1∶1至20∶1,最好每个载体应该携带3-15个肽。
在本发明的一个实施方案中,一种优选的载体是流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的D蛋白(EP 0 594 610 B1)。D蛋白是一种流感嗜血菌的IgD结合蛋白,并且已由Forsgren取得专利权(WO91/18926,已授权的EP 0 594 610 B1)。在某些情况下,例如在重组免疫原表达系统中,可能希望使用D蛋白的片段,例如D蛋白的1/3(包含D蛋白N末端100-110个氨基酸(GB 9717953.5))。
呈递本发明IgE肽的另一种优选方法是在重组融合分子的环境中。例如,EP 0 421 635 B描述了应用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原粒子,以在病毒样粒子中呈递外源肽序列。因此,本发明的免疫原可以包含在由乙型肝炎核心抗原组成的嵌合粒子中呈递的IgE肽。另外,所述重组融合蛋白可以包含本发明的模拟表位和一种载体蛋白,例如流感病毒的NS1。对于构成本发明部分的任何重组表达的蛋白而言,编码所述免疫原的核酸也构成本发明的一个方面。
用于本发明的肽可以容易通过本领域众所周知的固相法合成。通过采用“T-boc”或“F-moc”法可以进行合适的合成。运用众所周知的“F-moc”法和在全自动装置中用聚酰胺树脂,可以通过固相法合成环肽。另一方面,本领域技术人员会了解必需的实验室步骤以人工进行所述方法。固相合成的技术和步骤描述于′Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach′,E.Atherton和R.C.Sheppard,由IRL at OxfordUniversity Press出版(1989)。或者,可以采用重组法产生所述肽,所述重组法包括:在细菌或哺乳动物细胞系中表达编码所述模拟表位的核酸分子,然后纯化所表达的模拟表位。用于重组表达肽和蛋白的技术是本领域已知的,并且描述于Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook等,Molecular cloning,a laboratory manual,第2版;Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)。
本发明的免疫原可以包含先前描述的肽,包括模拟表位;或可以是免疫交叉反应衍生物或其片段。编码本发明免疫原或肽、模拟表位或其衍生物的核酸的部分也构成了本发明的部分。另外,本发明的免疫原可以在同一免疫原中包含一种以上类型的表位,即P1和P2,或所述模拟表位本身可以包含一种以上类型的表位。
因此,本发明提供了新肽(包括本发明的表位或模拟表位)(如上所限定的)在预防或治疗变态反应的药用组合物生产方面的应用。包含本发明模拟表位或肽以及载体分子的免疫原也可供用于用来免疫预防或治疗变态反应的疫苗。因此,本发明的模拟表位、肽或免疫原可供用于医学以及变应性疾病的医药治疗或预防。因此,提供了治疗变态反应的方法,包括将本发明的疫苗或药物给予患有或易患变态反应的患者。
本发明的疫苗最好也包括一种佐剂。用于本发明疫苗的合适佐剂包括能够增强针对所述IgE肽免疫原的抗体应答的那些佐剂。佐剂是本领域众所周知的(Vaccine Design-The Subunit and AdjuvantApproach,1995,Pharmaceutical Biotechnology,第6卷,Powell,M.F.和Newman,M.J.编著,Plenum Press,New York和London,ISBN 0-306-44867-X)。与本发明免疫原一起使用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。其它佐剂包括皂苷佐剂,例如QS21(US 5,057,540)和3D-MPL(GB 2220 211)。
一般将给予初次剂量和加强剂量的本发明疫苗。预期加强剂量将予以适当地间隔,或最好每年给予一次,或以循环抗体下降至所需水平之下时给予。加强剂量可以包括在缺乏原始载体分子情况下的所述肽。这种加强构建体可以包含一种替代载体,或可以没有任何载体。
在本发明的再一方面,提供本文描述的用于医药的疫苗。
通过系统途径或粘膜途径给予本发明的疫苗制剂,可以用所述疫苗制剂来保护或治疗易患或患有变态反应的哺乳动物。这些给药可以包括经肌内、腹膜内、皮内或皮下途径注射;或经粘膜给予口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。一种优选的给药途径是经皮途径,例如通过皮肤贴剂。
每个疫苗剂量中的蛋白量选定为典型疫苗中诱导免疫保护反应且无明显副作用的量。这种量将根据使用何种具体免疫原以及如何呈递免疫原而变化。一般而言,预期每个剂量将包含1-1000μg蛋白,优选1-500μg,,优选1-100μg,其中最优选的范围是1-50μg。特定疫苗的最适量可以通过包括观察受治疗者的合适免疫应答的标准研究来确定。在初次接种后,受治疗者可以接受适当间隔的一次或数次加强接种。
包含上述配体的药用组合物也构成本发明的一个方面。也提供所述配体在医学以及变态反应治疗药物生产方面的应用。
本发明的多个方面也可以用于诊断分析。例如,可以用多组识别不同本发明肽的配体,来分析取自患者的血清中存在的抗IgE的效价。此外,所述肽本身可以用来将循环抗IgE分型。在某些情况下,分析例如特应性患者中循环抗IgE水平是合适的,因此本发明的肽和多克隆/单克隆抗体可以用于诊断特应性。另外,所述肽可以用来从患者血液中亲和除去循环抗IgE,然后将所述血液回输给所述患者。
也构成本发明部分的是:采用IgE结构的计算机模型,鉴定用于免疫预防或治疗变态反应的免疫原以及鉴定IgE的表面暴露的那些肽的方法。然后可以将这些区域配制到免疫原中并用于医学。因此,应用PTmAb0005和PTmAb0011鉴定用于变态反应免疫预防或治疗的肽也构成本发明的部分。
在New Trends and Developments in Vaccines,Voller等编著,University Park Press,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978中全面描述了疫苗制剂。Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757公开了蛋白与大分子的缀合。
IgE氨基酸残基的编号系统通常是Dorrington KJ和Bennich H(1978)Immunol Rev 41 3-25以及Bennich H和Bahr-Lindastrom,H von(1978)Prog Immunol 11 49-58描述的编号系统。然而,随后的人IgE基因和cDNA序列的测定(Max,E.E.等1982,Cell 29 691-699;FlanaganJ.G.和Rabbitts,T.H.,1982,参见上文;Kenten,J.H.等,1982,参见上文),揭示了Cε2中位置273(Kabat编号)的一个额外的亮氨酸,该亮氨酸是先前的论文中未曾报道的。因此,本发明人所采用的编号方案可能不同于Dorrington KJ和Bennich采用的编号方案。
附图描述
图1,采用Padlan和Davies 1986模型的IgE氨基酸表面暴露。
图2,化学方案1,固相肽合成。
图3,化学方案2和方案3,修饰的载体制备。
图4,化学方案4,肽/载体缀合。
图5,C67-8抗IgE数据。(A)用25μg BSA-IgE C67-8(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-IgE C67-8构建体免疫的Balb C小鼠血清抗平板结合IgE的反应性。(B)用25μg BSA-IgE C67-8(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-IgE C67-8构建体免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。
图6,用可溶性IgE和IgE C67-8肽进行的竞争测定。将来自BSA-IgE C67-8或HBC-IgEC67-8免疫的小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或IgE C67-8肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图7,PT1079抗IgE数据。(A)用25μg BSA-PT1079(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-1079构建体免疫的Balb C小鼠血清抗平板结合IgE的反应性。(B)用25μg BSA-1079(用PTL化学缀合的)或3μg HepB核心-1079构建体免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。
图8,用可溶性IgE和PT1079肽进行的竞争测定。将来自BSA-1079或HBC-1079免疫小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或PT1079肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图9,PT1078抗IgE数据。(A)用25μg BSA-PT1078(用PTL化学缀合的)免疫的Balb C小鼠血清抗平板结合IgE的反应性。(B)用25μgBSA-1078(用PTL化学缀合的)免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。
图10,用可溶性IgE和PT1078肽进行的竞争测定。将BSA-1078免疫小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或PT1078肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图11,PT1079gs抗IgE数据。(A)用3μg HBC-1079gs免疫的BalbC小鼠血清抗平板结合IgE的反应性,(B)用3μg HBC-1079gs免疫的Balb C小鼠血清抗受体结合IgE的反应性。
图12,用可溶性IgE和PT1079肽进行的竞争测定。将HBC-1079gs免疫小鼠的血清与可溶性IgE(10μg/ml)或PT1079肽(25μM)或不相关肽PT326(25μM)预温育,然后加入到IgE包被的ELISA板中。数据为平均值±S.E.M(n=10)。
图13,BSA-C67-8诱导的小鼠抗血清的抑制活性。来自LolP1敏感性供体的细胞用小鼠血清(以1/50稀释)处理,然后用LolP1触发以释放组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。
图14,用BSA-1078和BSA 1079诱导的小鼠抗血清的抑制活性。来自LolP1敏感性供体的细胞用小鼠血清(BSA和BSA-1078抗血清以1/50稀释;BSA-1079抗血清以1/1250稀释)处理,然后用LolP1触发以释放组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。
图15,用HBC-C67-8、HBC-1078、HBC-1079和HBC-1079gs诱导的小鼠抗血清的抑制活性。来自LolP1敏感性供体的细胞用小鼠血清(HBC野生型(wt)和HBC-IgEC67-8抗血清以1/50稀释;HBC-1079和HBC-1079gs抗血清以1/1250稀释)处理,然后用LolP1触发以释放组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。
图16显示依赖于浓度的抗体PTmAb0005和PTmAb0011与IgE的结合。
图17,显示与对照相比的抗体PTmAb0005和PTmAb0011对IgE与FcεR1α/IgG构建体结合的浓度依赖性抑制。
图18,显示与对照比较的、抗体PTmAb0005对IgE与直接结合于塑料板的FcεRIα的修剪胞外域结合的浓度依赖性抑制。
图19,显示采用抗体PTmAb0005(GE-1)和PTmAb0011的IgE与FcεRII(CD23)的结合。
图20,显示与对照比较的、抗体PTmAb0005和PTmAb0011对变应性人血嗜碱性粒细胞组胺释放的浓度依赖性阻断。
图21,PTmAb0005和PTmAb0011两者对LolP1触发的变应性人嗜碱性粒细胞组胺释放的抑制。
图22,PTmAb0011与不同IgE的结合;(A)PTmAb0011与嵌合IgE的结合;(B)PTmAb0011与骨髓瘤IgE的结合;(C)PTmAb0011与抗原定向IgE的结合;(D)PTmAb0011与热变性IgE的结合
图23,PTmAb0011对IgE与FcεR1α结合的抑制。
图24,PTmAb0011与受体结合IgE的结合。
图25,(A)PTmAb0011对IgE与RPMI 8866细胞上FcεRII结合的影响。将RPMI 8866细胞(1×106/ml)在冰上与嵌合IgE(1μg/ml)和抗IgE mAb(10-0μg/ml)孵育1小时。使IgE和抗IgE于室温温育1小时,然后加入细胞中。用FITC-山羊抗人IgE检测结合的IgE。结果显示通过流式细胞术分析10,000个活的门控(gated)事件测定的复份样品的平均通道(channel)荧光(MCF)。(B)非P1特异性抗体PTmAb0017。
图26,PTmAb0011对IgE与原代人B细胞上FcεRII结合的影响。将外周血单核细胞(1×106/ml)在冰上与嵌合IgE(1μg/ml)和抗IgEmAb(10-0μg/ml;空心)或相同浓度的同种型匹配的对照mAb(实心)孵育1小时。将所述IgE和抗IgE于室温预温育1小时,然后加入细胞中。用FITC-山羊抗人IgE检测结合的IgE,用PE缀合的抗CD19显示原代B细胞。显示通过流式细胞术分析5,000个活的门控事件测定的复份样品的平均通道荧光(MCF)。
图27,PTmAb0011对原代人B细胞分泌IgE的影响。
外周血单核细胞(2×105/孔)在补充IL-4(10ng/ml)和抗CD40抗体(1μg/ml)的培养液中培养。加入PTmAb0011或一种同种型匹配的对照mAb(1μg/ml)达14天,然后收获细胞上清液,并通过ELISA分析总IgE含量。结果以在缺乏任何抗体的情况下分泌的IgE量的百分比表示。
图28,抗人IgE单克隆抗体在变应性(A)和非变应性(B)人嗜碱性粒细胞中的过敏原性。来自变应性供体或用1μg/ml嵌合IgE被动敏化的非变应性供体的PBMC用mAb于37℃处理30分钟。通过特异性EIA测定组胺的释放。数据为每个不同供体3个独立实验的平均值。
图29,抗人IgE单克隆抗体在敏化(A)和非敏化(B)人肺肥大细胞中的过敏原性。敏化或非敏化的粗制人肺肥大细胞悬浮液用抗体于37℃处理45分钟。通过比色分析,测定上清液中类胰蛋白酶的释放。数据为来自一个代表实验的复份测定的平均值。
图30,抗人IgE抗体在RBL J41细胞中通过人FcεR1(A)和小鼠FcεR1(B)的过敏原性。RBL J41细胞用嵌合人IgE或小鼠IgE敏化,然后用抗体于37℃处理30分钟。通过比色分析,测定上清液中的β-氨基己糖苷酶释放。数据为来自一个代表性实验的三份平行测定的平均值。
图31,PTmAb0011对人嗜碱性粒细胞中变应原触发的组胺释放的抑制。将PBMC与PTmAb0011或者直接(变应性测定(A))于37℃温育30分钟,或者将它们与IgE(阻断测定(B))一起于37℃温育30分钟。随后细胞用抗原于37℃触发30分钟,然后通过特异性EIA测定组胺的释放。数据为不同供体的3个独立实验的平均值±s.e.m.。
图32,PTmAb0011和PTmAb0005对猴皮肤中被动皮肤过敏反应的抑制。单克隆抗体Dec7B(stanworth十肽)用作对照。
通过以下实施例说明本发明,但本发明不限于以下实施例。部分1 本发明的模拟表位和免疫原实施例1.1.1表面暴露表位的鉴定、化学缀合和血清学方法
用Padlan和Davies描述的人IgE的建模结构(Mol.Immunol.,23,1063-75,1986),鉴定IgE Cε2区的表面暴露表位。鉴定出连续的溶剂暴露的肽。这通过以下步骤完成:采用分子模拟软件(MSI)计算每种IgE氨基酸的可及性,在5残基滑动窗口范围平均所述可及表面,由此鉴定出IgE肽中5-mer内平均值大于802的区域。试验结果示于图1。结果
从图1以及采用1990 Helm等模型(于2/10/90以PDB存储的2IgE模型结构(Protein Data Bank,Research Collabarotory for StructuralBioinformatics))的同一方法的多次重复来看,有许多天然肽可以用作用以产生抗IgE抗体的免疫原。表1,天然表面暴露的连续IgE肽。
肽名称 | 序列 | 定位序列和IgE区 | SEQ ID NO. |
P1 | EDGQVMDVD | Cε2(Glu270-Asp278) | 1 |
P2 | STTQEGEL | Cε2(Ser283-Leu290) | 2 |
P3 | SQKHWLSDRT | Cε2(Ser300-Thr309) | 3 |
P4 | GHTFEDSTKK | Cε2(Gly318-Lys327) | 4 |
P5 | GGGHFPPT | Cε2(Gly245-Thr250) | 5 |
P6 | PGTINI | Cε2(Pro262-Ile267) | 6 |
P7 | FTPPT | Cε2(Phe231-Thr235) | 7 |
合成这些肽或其模拟表位,并且或者将其与载体蛋白缀合,或者将其置于肝炎核心抗原构建体中,以形成表达重组肽的病毒样粒子。1.2采用琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联剂合成IgE肽/D蛋白缀合物
采用马来酰亚胺-琥珀酰亚胺交联剂,可以将D蛋白直接与IgE肽缀合,形成本发明的抗原。这种化学通过固定琥珀酰亚胺基团提供载体残基的受控NH2活化。所述马来酰亚胺基团是一个半胱氨酸结合位点。因此,对于以下实施例的目的,待缀合的IgE肽需要加入一个N末端半胱氨酸。
所述偶联剂是一种选择性异双功能交联剂,该化合物的一端通过琥珀酰亚胺基酯活化蛋白载体的氨基,而另一端通过马来酰亚胺基团偶联所述肽的巯基。反应方案如下:a.通过赖氨酸和琥珀酰亚胺基酯之间的反应活化蛋白:b.通过与马来酰亚胺基反应在活化蛋白和所述肽的半胱氨酸之间偶联:1.3IgE肽-D蛋白缀合物的制备
将D蛋白以2.5mg/ml的浓度溶于pH7.2的磷酸缓冲盐溶液中。将偶联剂(N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯-GMBS)以102.5mg/ml溶于DMSO中,并加入所述蛋白溶液中。1mg D蛋白使用1.025mg GMBS。将反应溶液于室温温育1小时。通过在sephacryl200HR渗透凝胶上脱盐步骤除去副产物。所用的洗脱液是磷酸缓冲盐溶液Tween 80 0.1%pH6.8。收获并合并所述活化蛋白。将所述肽(在表1中鉴定的,或其衍生物或模拟表位)以4mg/ml溶于0.1M乙酸中,以避免形成二硫键。偶联使用每1分子活化D蛋白2-20个肽的摩尔比。将所述肽溶液缓慢加入到所述蛋白中,并且将混合物于25℃温育1小时。在偶联期间,将pH保持在6.6。通过于25℃、pH6.5下加入半胱氨酸(以4mg/ml溶于0.1M乙酸中每mg活化PD 0.1mg半胱氨酸)达30分钟,进行一个猝灭步骤。对NaCl 150mM Tween 80 0.1%透析2次,以除去过量的半胱氨酸或肽。
最后一个步骤是在0.22μm膜上进行过滤除菌。终产物是澄清的可过滤溶液,将其保存于4℃。可以通过氨基酸分析测定最终的肽/PD比。
以类似的方式,可以将本发明的肽与其它载体包括BSA缀合。
一种P1的模拟表位是合成的CLEDGQVMDVDLL(P15,SEQ IDNO.8),采用上述技术将其与D蛋白和BSA两者缀合。1.4ELISA法抗肽或抗肽载体ELISA
用以下概述的ELISA技术,研究抗肽和抗载体免疫应答。微量滴定板(Nunc)用PBS中的特定抗原包被(4°过夜),然后进行以下两者之一:2μg/ml链霉抗生物素蛋白(然后与生物素酰化肽(1μM)于37℃温育1小时)、洗涤3X PBS-Tween 20 0.1%。用PBS-BSA 1%-Tween 200.1%(饱和缓冲液)将板于37°饱和1小时。加入第一(1°)抗体=以两步稀释的血清(于饱和缓冲液中),于37°温育1小时30分钟。洗涤3次。加入与HRP偶联的第二(2°)抗小鼠Ig(或抗小鼠同种型特异性单克隆抗体),于37°温育1小时。洗涤5次。用TMB于室温避光显色10分钟。用0.4N H2SO4阻断反应。检测小鼠血清中抗人IgE反应性的方法(IgE板结合ELISA)
ELISA板用pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液中的1μg/ml人嵌合IgE于37℃包被1小时,或于4℃包被过夜。用含5%w/v Marvel奶粉的PBS/0.05%Tween-20于37℃ 1小时封闭非特异性位点。随后加入小鼠血清在PBS/0.05%Tween-20/1%w/v BSA/4%新生小牛血清中的连续稀释液于37℃达1小时用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000),然后用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000),检测多克隆血清结合。。用TMB底物于450nm检测缀合的抗体。在每个板上包括一条PTmAb0011标准曲线,以便可以以μg/ml计算血清样品中的抗IgE反应性。检测小鼠血清中抗人受体结合IgE反应性的方法
ELISA板用pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液中的0.5μg/ml重组人FcεR1α于37℃包被1小时,或于4℃包被过夜。用含5%w/vMarvel低脂奶粉的PBS/0.05%Tween-20于37℃ 1小时封闭非特异性位点。然后加入1μg/ml人IgE于37℃达1小时。随后加入小鼠血清在PBS/0.05% Tween-20/1% w/v BSA/4%新生小牛血清中的连续稀释液于37℃达1小时。用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000),然后用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000),检测多克隆血清结合。用TMB底物于450nm检测缀合的抗体。在每个板上包括一条PTmAb0011标准曲线,以便可以以μg/ml计算血清样品中的抗IgE反应性。用模拟表位肽-可溶性IgE或PTmAb0011竞争IgE结合
在预封闭的聚丙烯96孔板中,将多克隆小鼠血清的单一稀释液与单一浓度的或者模拟表位肽或人IgE混合。将混合物于37℃温育1小时,然后加入到IgE包被的ELISA板中于37℃达1小时。用山羊抗小鼠IgG-生物素(1/2000),然后用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000),检测多克隆血清结合。用TMB底物于450nm检测缀合的抗体。对于血清和PTmAb0011竞争IgE的结合,将血清和PTmAb0011-生物素的混合物加入到IgE包被的ELISA板中。用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)检测PTmAb0011的结合。1.5人嗜碱性粒细胞测定
用人嗜碱性粒细胞(HBA)进行两种类型的测定,一种测定是测定所述单克隆抗体的过敏原性,包括将所述抗体加入到分离的PBMC中;第二种测定是测量通过所述HBA与所述单克隆抗体的预温育对LolPI(一种强变应原)触发的组胺释放的抑制。
通过静脉穿刺术从变应性供者将血液收集到含有0.1体积2.7%EDTA,pH7.0的试管中。然后将其用等体积的含0.1%人血清白蛋白的HBH培养液(HBH/HSA)以1/2稀释。将所产生的细胞悬浮液铺在50%体积的Ficoll-Paque上,然后以400g于室温离心30分钟。收集位于界面的外周血单核细胞(PBMC)层,并弃去沉淀。细胞在HBH/HAS中洗涤1次,对其计数,将其重悬于HBH/HAS中,细胞密度为2.0×106/mL。将100μl细胞悬浮液加入到含100μl稀释的试验样品或单克隆抗体的V形底96孔板各孔中。以一定范围的稀释液测试每种试样样品,每种稀释液6个孔。用平板摇动器将孔内容物短暂混合,然后于37℃温育30分钟,同时以120rpm振摇。
对于每种血清稀释液,通过加入10μl LolpI提取物(最终稀释度为1/10000)触发3个孔,而3个孔含有加入的10μl HBH/HSA,以评价过敏原性。用平板摇动器再次将孔内容物短暂混合,然后于37℃再温育30分钟,同时以120rpm振摇。通过以500g离心5分钟终止温育。取出上清液,以采用市售组胺EIA测量试剂盒(Immunotech)进行组胺测定。常规包括含有细胞但无试验样品的对照孔,以测定自发释放和触发释放。也包括含细胞+0.05%Igepal去污剂的孔,以测定总细胞组胺。
结果如下表示:过敏原性测定由试验样品引起的组胺释放=来自试样样品处理的细胞的组胺释放的百分比-自发组胺释放的百分比。阻断测定
采用下式可以计算组胺释放的抑制程度:
抑制百分比
=1-(来自试样样品处理的细胞的组胺释放*)×100
(来自抗原刺激的细胞的组胺释放*)
根据自发释放校正数值。实施例2,用P15缀合物(P15-BSA或P15-PD)免疫小鼠,诱导抗人IgE抗体的产生。
将在1.4中描述的包含模拟表位P15(25μg蛋白/剂量)的缀合物给予各组的10只BalbC小鼠,用WO 95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL的水包油乳液作为佐剂。在第21天和第42天进行加强,并且可以在第42天和第56天收集血清。用实施例1所述方法,测定免疫应答抗肽和抗平板结合IgE。结果
在第3次接种后第14天测量的抗肽和抗IgE应答的结果示于表2中。表2,P15免疫原性结果
实施例3,用缀合物免疫后在小鼠中诱导的抗IgE是非过敏原性的
模拟表位缀合物 | 抗肽应答(中点效价) | 抗IgE应答(μg/ml(PTmAb0011)) | ||||
平均 | 标准偏差 | 几何平均 | 平均 | 标准偏差 | 几何平均 | |
P15-PD(n=16) | 41391 | 26858 | 36154 | 1.6 | 4.5 | 0.3 |
P15-BSA(n=10) | 49591 | 9259 | 48719 | 2.2 | 2.5 | 1.0 |
可以在存在从变应性患者新收集的外周血的嗜碱性粒细胞的情况下,测试全血清或从缀合物免疫小鼠纯化的IgG的几种稀释液。
如下所述,通过测量由待测试抗体诱导的组胺释放,可以评价过敏原性:■在葡萄糖葡聚糖梯度上从外周血中取出红细胞■洗涤细胞,并且加入待测试样品(例如变应原、抗体、变应原+抗体、...)■温育后,收集上清液,按照生产商的说明(Immunotech,组胺酶免疫测定试剂盒)测量组胺释放
用或者P15-BSA或者P15-PD产生的抗血清都未表现出过敏原性。实施例4,用缀合物免疫后在小鼠中诱导的抗IgE能够阻断变应原触发变应性患者的嗜碱性粒细胞诱导的IgE介导的组胺释放。
可以测量在存在或缺乏全血清或从缀合物免疫小鼠纯化的IgG的几种稀释液的情况下用不同浓度变应原触发的嗜碱性粒细胞样品中的组胺释放。通过测量由所述变应原诱导的组胺释放的抑制,评估抗血清中抗P15抗体的阻断活性。如实施例3所述,测量组胺释放和抑制。由于P15是一种P1的模拟表位,因此将PTmAb0011用作对照,因为已知它与同一表位(P1)结合。结果示于表3中。表3,对变应性人嗜碱性粒细胞组胺释放的抑制
实施例5,P2和P3的模拟表位的免疫原性
抗血清 | 稀释度 | 组胺释放的抑制百分比 |
P15-PD(小鼠4.12) | 1/30 | 79 |
P15-PD(小鼠4.5) | 1/30 | 57 |
P15-BSA(小鼠7.3) | 1/30 | 67 |
P15-BSA(小鼠7.5) | 1/30 | 57 |
PTmAb0011 | 0.1μg/ml | 56 |
PTmAb0011 | 1μg/ml | 90 |
抗BSA血清 | 1/30 | 40 |
抗PD血清 | 1/30 | 40 |
用实施例1.2所述技术,将以下模拟表位与BSA缀合,并且采用实施例2所述的相同制剂和方案,用所述缀合物免疫小鼠。
P16 | CSTTQEGELA-NH2 | P2模拟表位 | SEQ ID NO.24 |
P17 | CSQKHWLSDRT-NH2 | P3模拟表位 | SEQ ID NO.26 |
在最后一次免疫后给小鼠放血,并在IgE平板结合ELISA中测试抗IgE反应性。以下总结了单个结果、平均结果(Av)、几何平均结果(GM)(SD=标准偏差)。表4,P16和P17免疫原性结果
实施例6,P1模拟表位的产生和其免疫原性/功能活性6.1免疫原的产生
抗肽免疫应答/小鼠(第3次接种后的第14天),中点效价 | |||||||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Av | SD | GM | |
P16 | 1891 | 649 | 1299 | 2349 | 591 | 1474 | 4605 | 918 | 4177 | 865 | 1882 | 1436 | 1478 |
P17 | 100 | 4349 | 2850 | 3434 | 6133 | 2231 | 5085 | 2991 | 13070 | 8874 | 5446 | 3515 | 4656 |
通过噬菌体展示技术或通过对IgE Cε2区的C-D环分子建模进行合理设计,衍生P1的模拟表位。合成以下肽,并将其构建为BSA-肽缀合物,也将其构建到HepB核心抗原重组构建体中。
肽名称 | 序列 | SEQ ID NO. | |
C67/8 | CFINKQMADLELCPRE | P1模拟表位 | 12 |
PT1079 | CLEDGQVMDVDLCPREAAEGD | P1模拟表位 | 14 |
PT1079GS | CLEDGQVMDVDLCGGSSGGP | P1模拟表位 | 15 |
PT1078 | CLEDGQVMDVDCPREAAEGDK | P1模拟表位 | 16 |
如下产生所述肽/蛋白载体构建体。如方案1(图2)所示,在固相上制备酰基肼肽衍生物。用众所周知的‘Fmoc’法,在全自动仪器中,采用或者聚酰胺或者聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持体,通过本领域众所周知的技术[用于固相合成的技术和方法由E.Atherton和R.C.Sheppard描述于‘Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach’,由IRL at Oxford University Press出版(1989)],可以容易地制备这些肽衍生物。酸介导的切割提供了线性、去保护、经修饰的肽。用D.Andreau等在‘Methods in Molecular Biology,第35卷:PeptideSynthesis Protocols(M.W.Pennington和B.M.Dunn编著),第7章,第91-171页中概述的方法,可以容易地将这种肽氧化和纯化,得到二硫桥修饰的表位。
采用以下技术,可以将由此合成的肽与蛋白载体(在这种情况下为牛血清白蛋白,BSA)缀合:6.2修饰载体的合成
采用如方案2所述(图3,有关进一步的细节参见WO 98/17628)制备的琥珀酰亚胺基活性酯(BAL-OSu),引入芳基醛官能团。将BAS(牛血清白蛋白)的氨基官能取代至约50%,得到常规可溶性的修饰蛋白。对所述BSA进行更多的取代,产生不溶性构建体。在DMSO/缓冲液(参见方案3,图3)中将等摩尔浓度的BSA和BAL-OSu混合2小时。这种实验性衍生的方案导致通过荧光胺试验判断,BSA中约50%游离氨基被取代。6.3肽-BSA构建体:
修饰的肽和衍生化BSA的简单组合提供容易通过透析分离的肽-BSA构建体(方案4,图4)。用SDS-PAGE来证实分子量的增加。6.4肝炎核心抗原构建体
用EP 0 421 635 B中描述的分子生物学技术,也制备了肝炎核心抗原重组构建体(HBC)。在这些HBC实验中,对PT1079加以修饰,以除去末端赖氨酸。
肽 | 序列 | SEQ ID NO. |
PT1078HBC | CLEDGQVMDVDCPREAAEGD | 65 |
PT1079HBC | CLEDGQVMDVDLCPREAAEGD | 66 |
通过用PTmAb0005和PTmAb0011进行BIAcore实验,证实P1模拟表位肽的表达。用仅为3μg/剂HBC的剂量产生免疫原性结果。6.5免疫原性研究
纯化所述模拟表位/HBC和模拟表位/BSA构建体,将其配制为疫苗,并且用WO 95/17210中描述的含有QS21和3D-MPL的水包油乳液作为佐剂(25μg BSA缀合物剂量)。将这些疫苗给予各组的10只BalbC小鼠,并且在第14天和第28天进行加强,然后在第42天收集血清。然后用实施例1.4中描述的技术,研究对抗平板结合IgE和受体定向IgE的免疫应答。此外,用1.5中描述的技术,测量抗血清在抑制变应性嗜碱性粒细胞释放组胺方面的活性。6.6结果
当所述IgE直接结合于ELISA板时,以及定向到高亲和性受体时,所有BSA和HBC构建体均诱导高效价的抗IgE抗体。而且,证实所有这些应答均是特异性的,因为它们受到游离IgE和所述模拟表位本身的竞争,并且不受非特异性肽的竞争。由这些免疫原诱导的抗IgE能够抑制来源于变应性供体(黑麦草,LOLP1)的人嗜碱性粒细胞释放组胺。
C67-8的结果参见图5、6、13和15。PT1078的结果参见图9、10、14和15。PT1079的结果参见图7、8、14和15。PT1079GS的结果参见图11、12和15。
此外,由这些肽模拟表位产生的免疫应答不是过敏原性的。表5,P1模拟表位抗血清的过敏原性
表的脚注,来自LolP1过敏性供体的细胞用稀释的小鼠血清处理30分钟。通过市售的组胺特异性EIA测定释放的组胺。数据为平均值±S.E.M.(n=10)。部分2 与本发明的表位和模拟表位结合的配体
免疫原 | 血清稀释度 | %组胺释放 |
自发释放 | 0.25±0.06 | |
未经试验的血清 | 1/50 | 1.9±0.4 |
BSA | 1/50 | 2.15±0.65 |
BSA-IgE C67-8 | 1/50 | 2.9±1.1 |
BSA-1078 | 1/50 | 5.00±1.40 |
BSA-1079 | 1/1250 | 0.43±0.04 |
HBCwt | 1/50 | 3.5±1.0 |
HBC-1079 | 1/1250 | 0.12±0.04 |
HBC-1079gs | 1/1250 | 0.02±0.02 |
HBC-IgE C67-8 | 1/50 | 2.14±0.26 |
肽免疫原为部分1中描述的肽免疫原,它们在以疫苗形式给予哺乳动物后,诱导免疫应答,所述免疫应答(a)识别IgE,和(b)能够体外抑制组胺释放。部分2描述了能够与本发明的表位或模拟表位结合的配体,并且描述了其功能。已经鉴定出两种识别IgE Cε2的c-d环的单克隆抗体-PTmAb0005和PTmAb0011。在部分1中已经表明这种肽的模拟表位是免疫原性的,并且在活性疫苗中有功能。这一节描述这些单克隆抗体的表征,并且提供它们在被动疫苗接种方面用途的证据。
采用噬菌体淘选技术,即多个噬菌体靶的序列对比,鉴定所述抗体的靶表位,随后精选,并通过结构域作图和定点诱变加以证实。所述抗体的功能活性不仅在体外通过分析抗IgE的识别和变应性介质释放的抑制得以证实,而且在体内通过猴被动皮肤过敏性(PCA)研究而得以证实。实施例7,7.1单克隆抗体靶的噬菌体作图
用噬菌体展示文库,采用3种不同的噬菌体文库,在噬菌体gVIIIp的N末端展示或者XCX15、XCX10或者XAX10肽序列(其中X为任何氨基酸),将所述单克隆抗体的结合位点作图。表6和表7显示分别用抗人IgE单克隆抗体PTmAb0005和选择肽配体的结果。所述肽和人IgE之间的氨基酸模式的相似性表明与IgE Cε2区中的c-d环的强同源性匹配。由噬菌体回复产生的同源性模式是:Qhhahah(其中h=疏水性氨基酸,而a=酸性氨基酸),并且这与人IgE Cε2区C-D环中的序列QVMDVDL(SEQ ID NO.17)是匹配的。
在IgEC67中,也对得自噬菌体淘选实验并且对PTmAb0005具有最高亲和性的肽进行表位作图。通过经PCR诱变引入随机突变,并且亚克隆到Fuse 5载体中用于次要丝状噬菌体蛋白gIIIp展示,进行这种作图。将IgEC67突变体按与PTmAb0005结合的顺序分等级,如表8中所示。这些结果和其它结果表明了IgEC67中与所述Cε2表位匹配的氨基酸的重要性。例如,L8P、D10G、L11M、E12G和L13R突变体均降低与抗IgE PTmAb0005的结合(数据未显示)。其它位点的突变对与PTmAb0005的亲和性几乎没有影响。
由最高亲和性PTmAb0005和PTmAb0011噬菌体展示衍生肽制备随机亚文库,以采用先前描述的方法(Yu,J.和Smith,G.P.(1996)“噬菌体展示的肽配体的亲和性突变”Methods in Enzymology,267,3-27)增强所述肽对所述抗体的亲和性,这涉及借助一个随机PCR步骤,将DNA亚克隆从所述主要外壳蛋白(gVIIIp)丝状噬菌体展示载体转移至较低拷贝数的次要噬菌体外壳蛋白(gIIIp)展示载体。由包括最高亲和性PTmAb0005配体IgEC67和IgE C67-8在内的几个噬菌体序列制备亚文库。C67和C67-8的亲和性成熟(matured)序列分别示于表8和表9。在所述表中包括等级次序,也包括BIAcore亲和性(如果可得到的话)。当用表达IgEC67-8的噬菌体作为免疫原时,IgEC67-8能够在小鼠中诱导抗人IgE应答。7.2通过结构域作图证实靶
产生大量构建体,以将PTmAb0005和PTmAb0011对IgE恒定区的结合特异性作图。产生以下构建体:Cε2-4、Cε2-3、Cε3-4、Cε3-4L(Cε3-4加Cε2区和Cε3区之间的接头序列)和单独的Cε2。
用衍生自杂交瘤系JW8/5/13的cDNA,克隆包含不同人IgE Fc区的片段,所述杂交瘤系表达嵌合人IgE(Neuberger,MS等(1985)Nature 314 268-270;Bruggemann,M等(1987)J Exp Med 166 1351-61)。用合适的引物对并用JW8/5/3 cDNA作为模板,扩增所述IgE Fc片段。cε2-4片段编码氨基酸(aa)S225-K547。cε3-4片段编码aaG335-547。cε3-4L片段(结构域3-4加连接cε2至cε3的接头序列)编码aa E322-K547。cε2-3片段编码aa S225-G436。cε2片段编码aa S225-S324。所有的构建体均含有一个COOH末端六组氨酸尾,以用于检测和纯化。将这些片段克隆到真核生物表达载体中,且与得自CD33的前导编码序列符合读框,以指导所表达片段的分泌。这使得能够在哺乳动物细胞系中表达。该载体衍生自pcDNA3.1+(Invitrogen)。为了表达所克隆的片段,将合适的克隆转染到COS-7细胞中,并且在转染后48-60小时收获所产生的条件培养液。
通过ELISA测定,通过使所述构建体与EILSA板结合,然后与PTmAb0005和PTmAb0011温育,并且用抗小鼠抗体显示,研究PTmAb0005和PTmAb0011与所表达的IgE区的结合。此外,通过众所周知的蛋白质印迹技术,研究与变性构建体的结合。
PTmAb0005的结果显示,与天然形式的Cε2-4、Cε2-3和Cε2强结合,在蛋白质印迹中也与变性后的Cε2-4和Cε2结合。在两种测定中都未观察到与Cε3-4或Cε3-4L的结合。
PTmAb0011也与天然形式的Cε2-4、Cε2-3和Cε2结合;也与变性形式的Cε2-4和Cε2结合。
因此,显然这两种抗体均识别IgE Cε2区中存在的一个靶表位。7.3通过定点诱变证实靶
结构域作图研究证明,两种mAb均能够与单独的Cε2区结合。对衍生自噬菌体展示肽文库的生物淘选序列的分析表明,PTmAb0005衍生序列显示出与P1的显著相似性。在IgE模型结构中该区在Cε2的C-D β链之间形成一个环。进行定点诱变研究以证实该序列对于PTmAb0005和PTmAb0011为表位。
经淘选的噬菌体序列的分析和所述IgE模型结构(Helm等1990,参见上文)与已知的人IgG1 Fc结构(Deisenhoffer,J.,1981,Biochemistry,20,2361-2370)的比较,导致鉴定出3个可能参与抗体识别的残基。这些残基是谷氨酰胺(Q)273、甲硫氨酸(M)275、天冬氨酸(D)276。将这3个残基中的每个残基变为丙氨酸(A),而至少另一个氨基酸残基如下。
Q273:A和E(谷氨酸)
M275:A;Q和K(赖氨酸)
D276:A和N(天冬酰胺)
所述丙氨酸突变既改变所述靶残基的结构,又改变所述靶残基的化学,而另一突变保持结构(尽可能地接近),但改变电荷,例如Q273E。这里,谷氨酸具有与谷氨酰胺基本相同的结构,但带负电,而不是中性的。
在Cε2-4构建体中独立地产生每种突变。每种突变多肽的表达水平与野生型(WT)Cε2-4相似,并且在基于ELISA的测定中,每种突变多肽均能够同WT cε2-4产物同样有效地与重组FcεR1α胞外域结合。总之,这些数据表明,所述突变对在所述表达系统中所述多肽的产生/分泌没有影响,并且大体上不影响cε2-4片段的结构。
除D276N外,所有的突变均基本上消除了与PTmAb0005和PTmAb0011的结合,D276N将与PTmAb0005的结合仅降低约50%(表10)。进行Cε2内的可变谷氨酰胺残基Q317的突变,以作为这些实验的对照。产生Q317E和Q317K突变体,并且发现它们对PTmAb0005和PTmAb0011识别Cε2-4的能力没有影响。同样,不影响FcεR1α的识别。
因此,PTmAb0005和PTmAb0011的结合活性特异性地受Cε2的C-D环内突变的影响。
总之,序列P1包含对PTmAb0005和PTmAb0011两者的主要结合决定簇。表10,PTmAb0005和PTmAb0011对IgE结构域构建体的识别
7.4 IgE Cε2的C-D环的精细建模
突变 | 被PTmAb0005识别 | 被PTmAb0011识别 | 被FcεR1α胞外域识别 |
WT cε2-4 | ++++ | ++++ | ++++ |
Q273A | - | - | ++++ |
Q273E | - | - | ++++ |
M275A | +/- | +/- | ++++ |
M275Q | +/- | +/- | ++++ |
M275K | +/- | +/- | ++++ |
D276A | - | - | ++++ |
D276N | ++ | - | ++++ |
Q317E | ++++ | ++++ | ++++ |
Q317K | ++++ | ++++ | ++++ |
由于尚未确定人IgE的实际结构(尽管可得到一种模型),因此在详细水平上检查后该模型结构仍有可能出错。因此,本发明人通过将IgE的Cε2环区作图至人IgG1 Cγ2的等同区(Deisenhoffer J 1981参见上文),改进了IgE的Cε2环区的这种模型。
根据关于所述结构特征范围的这一新信息,设计了一种环化肽,所述环化肽当合成时,应该采取非常类似全IgE分子环境中Cε2的C-D环构象的构象。这种肽-Ac-CLEDGVQMDVDLCPREAAEGDK(Ac)-NH2被命名为PT1079(SEQID NO.14)。
用BIAcore技术,测量PT1079与PTmAb0005和PTmAb0011两者的亲和性,发现PT1079表现出对这两种单克隆抗体非常强的识别(被PTmab0005和PTmAb0011两者识别,其表观亲和性分别为~20nM和~250nM)。对照为其中环化位点仅移动一个氨基酸残基的PT1079的衍生肽,并因此将所述环化位点之间的肽长度减少一个氨基酸残基(PT1078),所述对照降低了所述肽与或者PTmab0005或者PTmAb0011的结合。此外,将PT1078修饰,以便加入一个额外残基,使得环区的残基数与PT1079相同,然而这一修饰不能恢复与PTmAb0005或PTmAb0011的结合。因此,表明正确呈递本发明的肽以使其采取非常类似全IgE分子环境中所述天然靶的形状的重要性。总结
本文描述的研究表明,单克隆抗体PTmAb0005和PTmAb0011特异性地识别P1。这些抗体已经用于噬菌体展示研究,以鉴定被所述单克隆抗体以高亲和性识别的IgE Cε2区中c-d环的模拟表位。7.5 PTmAb0005和PTmAb0011特征的功能特征
以下实验描述了PTmAb0005和PTmAb0011的功能特征。因此,应用这些抗体的靶将诱导PTmAb0005和PTmAb0011样免疫应答。因此,采用基于这些肽的免疫原的疫苗接种将具有相同的功能特征。实施例8,8.1材料和方法8.1.1 FcεRIα结合测定(A蛋白平板)
在该测定中,用重组形式的IgE高亲和性受体α链的胞外域(α胞外域),结合嵌合IgE。将所述α胞外域的羧基末端与人IgG1 Fc序列融合。这使得所述重组分子能够通过所述Fc区,结合A蛋白包被的微量滴定板。因而,大多数所述α胞外域分子应该可得到结合配体,并且提供一种用于分析IgE-受体相互作用的系统。下述测定形式的目的是检测阻断抗IgE抗体活性的(高亲和性)受体。8.1.2用于检测IgE与高亲和性受体α链胞外域结合的ELISA方案
用在封闭缓冲液(PBS/5% BSA/0.05% Tween-20)中稀释至0.25μg/ml的100μl/孔α胞外域(α-ecto)-Ig融合蛋白包被A蛋白板。于37℃温育1小时。在10%猪血清中将嵌合IgE稀释至0.03125μg/ml。在该IgE溶液中将抗IgE抗体稀释至合适的试验浓度。于室温温育1小时。运用洗板机,用PBS/0.05%Tween-20洗板3次。加入100μl/孔的IgE:抗IgE溶液(每个抗IgE浓度分析4个平行测定)。于37℃温育1小时。运用洗板机,用PBS/0.05%Tween-20洗板3次。加入100μl/孔的山羊抗小鼠λ链HRPO缀合的抗体在封闭缓冲液中稀释的1∶6000稀释液。于37℃温育1小时。运用洗板机,用PBS/0.05% Tween-20洗板3次。加入200μl/孔的OPD底物,并于室温避光温育2-10分钟。加入25μl 25%H2SO4终止反应。在平板摇动器上慢速混合已终止的反应物。于490nm读出OD。
可以计算出关于对IgE与其受体结合的抑制百分比的图。根据仅在10%猪血清中含有IgE(即无抗IgE)的一组孔的平均值,确定IgE的最大结合值。
因此,抑制百分比值计算为:
(最大IgE值-抗IgE平行测定的平均值)/最大IgE值×1008.1.3 FcεRIα结合测定(经修剪的胞外域)
该测定基本上与前一测定相同,只是FcεRIα胞外域/IgG构建体用蛋白水解酶-因子X处理,以切割所述两个部分。用A蛋白微珠(bead)除去IgG Fc部分,而用链霉抗生物素蛋白微珠除去因子X,因此留下基本纯的α链胞外域产物。在该测定形式中,所述α胞外域直接与塑料微量滴定板结合,所有其它测定细节如上所述。8.1.4 CD23结合测定(FcεRII,低亲和性受体)
该测定或者在RPMI 8866细胞上或者在原代人B细胞上进行;可以使用两种形式,一种形式用于检测与结合了FcεRII的IgE结合的mAb,而第二种形式分析所述mAb是否干扰结合了FcεRII的IgE。对于第一种测定,在PBS,1%FBS,0.1%NaN3中,在冰上向细胞加入嵌合IgE(1μg/ml)达1小时。除去过量的IgE并加入抗IgE mAb。结合的mAb均用FITC缀合的大鼠抗小鼠IgG1抗体显现。对于第二种测定,将嵌合IgE(1μg/ml)与抗IgE mAb于室温预温育1小时,同时温和混合,然后将其加入到细胞中。将该混合物与所述细胞在冰上孵育1小时,然后洗涤以除去未结合的IgE。用FITC-山羊抗人IgE检测结合的IgE,或者用FITC-缀合的大鼠抗小鼠IgG1抗体检测结合的抗IgE mAb。当在PBMC上进行研究时,用PE缀合的抗CD19抗体鉴定组分B细胞。通过流式细胞术分析样品。8.2结果
PTmAb0005和PTmAb0011的结果示于图16-21。
图16显示单克隆抗体与平板结合的IgE的浓度依赖性结合。图17显示PTmAb0005和PTmAb0011对IgE与FcεR1α/IgG构建体结合的浓度依赖性抑制。图18显示抗体PTmAb0005和PTmAb0011对IgE与直接结合于塑料板的FcεRIα经修剪的胞外域结合的抑制。图19显示抗体PTmAb0005(克隆GE-1)和PTmAb0011对IgE与FcεRII(CD23)的结合没有抑制作用。图20和21显示抗体PTmAb0005和PTmAb0011对变应性人血液嗜碱性粒细胞组胺释放的浓度依赖性阻断作用。
PTmAb0011是一种对人IgE有特异性的小鼠单克隆抗体,表明与其它人Ig同种型或大鼠/小鼠IgE没有交叉反应性。当以随机方向与ELISA板结合时,PTmAb0011与天然IgE和经热处理的IgE均结合,表明IgE上的其识别位点不是热不稳定的。当通过抗原与ELISA板结合时,PTmAb0011也识别IgE。重要的是,这种mAb可以完全阻断人IgE与高亲和性IgE受体(FcεRI)的α链结合组分之间的相互作用。然而,这种mAb当预结合于FcεRI时仍识别人IgE,表明该mAb结合位点在受体结合时未丧失。实施例9,9.1通过普通EILSA和抗原定向ELISA分析PTmAb0011的IgE结合特性
如实施例1中所述,通过用人嵌合IgE、骨髓瘤IgE、人Ig同种型或啮齿动物IgE(1μg/ml,在pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐包被缓冲液中)包被平板,进行普通的IgE结合ELISA法。对于抗原定向ELISA,以饱和浓度包被NP-BSA,然后加入嵌合IgE(1μg/ml)。另一方面,包被可溶性人FcεRIα链(0.25μg/ml),然后包被嵌合IgE。如实施例1所述(用于检测小鼠抗人IgE mAb的ELISA方案)进行其余的ELISA。9.2结果
图22说明,PTmAb0011当以随机定向方式结合于ELISA板时,与人/小鼠嵌合IgE和人骨髓瘤IgE均结合。同样,与抗原定向IgE的结合(即与平板结合NP-BSA结合的IgE)是剂量依赖性的。也分析了PTmAb0011识别在56℃热处理一定时间后的嵌合IgE的能力。图22也表明,PTmAb0011对IgE的结合容量不受热处理影响。
进一步扩展所述mAb的表征,以确定PTmAb0011是否能够抑制IgE与高亲和性IgE受体的α链组分的相互作用(图23)。将IgE与PTmAb0011预温育,然后加入到平板结合的FcεRIα链中,导致对IgE与FcεRIα链相互作用的剂量依赖性抑制。PTmAb0011也(图24)以剂量依赖性方式识别FcεRIα链连接的IgE。实施例1010.1原代人B细胞分泌IgE的分析
在96孔U形孔板中,在补充IL-4和抗CD40的培养液中以2×105细胞/孔接种PBMC。加入PTmAb0011或同种型匹配的对照mAb,并且在收获上清液进行IgE分析之前将细胞培养14天。通过用0.5M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中(pH9.6)的兔抗人IgE抗体(10μg/ml)包被ELISA板,测量总IgE水平。用PBS,0.05%Tween 20,5%BSA封闭经洗涤的板。将细胞上清液和IgE标准与饱和量的PTmAb0011(10μg/ml)于室温温育1小时,然后加入至ELISA板中,以让其形成IgE/抗IgE复合体。在温育和洗涤步骤后,用HRP-绵羊抗人IgE,然后用OPD底物,检测结合的IgE。然后估计相对于标准曲线的细胞上清液中的IgE水平。10.2结果
将IgE与剂量范围为10μg/ml至0.5μg/ml的PTmAb0011预温育,并检查其对随后的IgE与人B细胞系RPMI8866上FcεRII结合的影响。图25说明,IgE与PTmAb0011的预温育增强了IgE与FcεRII的结合。非P1特异性单克隆抗体(PTmAb0017)不增加IgE与FcεRII受体的结合。PTmAb0011也增加IgE与原代B细胞上FcεRII的结合(图26)。10.3 PTmAb0011对原代人B细胞分泌IgE的影响
在加入IL-4和抗CD40抗体的情况下,用PTmAb0011培养外周血单核细胞,以促进B细胞同种型转换为IgE分泌。开发了一种ELISA测定,该测定提供对总IgE(即游离IgE和PTmAb0011复合的IgE)水平的测量。为了达到这种定量,将分泌的IgE与饱和水平的PTmAb0011一起预温育,以让所有IgE复合。相对于也已经与饱和水平的PTmAb0011复合的IgE的标准曲线,对组织培养上清液中的总IgE定量。图27说明,在三种不同供体中,原代B细胞与PTmAb0011(1μg/ml)的温育导致分泌IgE总水平的显著降低。用所述同种型匹配的对照抗体没有观察到这种抑制作用。10.4人嗜碱性粒细胞组胺释放的测定
采用两种测定形式。用1μg/ml嵌合IgE于37℃被动敏化得自非变应性供体的PBMC,洗涤,然后用单克隆抗体于37℃处理30分钟。或者,用单克隆抗体于37℃将得自LolP1敏化的供体的PBMC直接处理30分钟。通过离心终止反应。通过特异性免疫测定(Immunotech2562),测定细胞上清液的组胺释放。在用0.5%Igepal去污剂裂解的细胞中测定总细胞组胺含量。10.5嗜碱性粒细胞阻断测定
通过将得自非变应性供体的PBMC与嵌合IgE在存在单克隆抗体和IL-3的情况下于37℃温育30分钟,测定抗IgE抗体阻断嵌合IgE与人嗜碱性粒细胞上FcεR1结合的能力。洗涤细胞,并用NP-BSA于37℃再触发组胺释放达30分钟。通过离心终止反应,并如上所述测定组胺释放。10.6变应性嗜碱性粒细胞抑制测定
通过将得自LolP1敏化供体的PBMC与单克隆抗体于37℃预温育30分钟,然后用LolP1触发,来研究抗IgE抗体抑制变应原触发的脱颗粒的能力。10.7人肺肥大细胞类胰蛋白酶释放的测定
通过用包含饱和透明质酸酶、链霉蛋白酶和DNA酶的混合剂进行酶消化,由人肺组织制备粗制肥大细胞悬浮液。或者直接使用细胞,或者用嵌合IgE预敏化细胞,然后用抗IgE抗体处理。通过对颗粒酶类胰蛋白酶的比色测定,测定肥大细胞的脱颗粒。10.8用人FcεR1α转染的RBL细胞的β-氨基己糖苷酶释放的测定
从University of Sheffield的B.Helm博士获得转染的细胞系RBLJ41。用或者小鼠单克隆IgE抗DNP或者人嵌合IgE抗NP被动敏化细胞,然后用抗人IgE抗体触发。通过对β-氨基己糖苷酶释放的比色测定,测定脱颗粒。10.9结果10.9.1抗IgE单克隆抗体在人嗜碱性粒细胞中的过敏原性
对多种不同的抗IgE单克隆抗体分析其既触发变应性嗜碱性粒细胞的组胺释放、又触发非变应性嗜碱性粒细胞的组胺释放的能力(图28)。与其它抗体相对比,PTmAb0011一致地不能产生显著的组胺释放。10.9.2抗IgE单克隆抗体在人肺肥大细胞中的过敏原性
在敏化和非敏化人肺肥大细胞中,PTmAb0011也都不能释放显著量的类胰蛋白酶(图29)。多克隆抗人IgE在这些细胞中产生60-70%的释放。10.9.3抗IgE单克隆抗体在用人FcεR1α转染的RBL细胞中的过敏原性
用嵌合人IgE抗NP被动敏化的RBL J41细胞可以用抗原NP-BSA以及用多克隆抗人IgE触发,而不能用PTmAb0011触发(图30)。相反,当细胞用小鼠IgE抗DNP敏化时,两种抗人IgE抗体均没有作用。所述细胞仍可以被抗原DNP-BSA触发。10.9.4嗜碱性粒细胞阻断测定
PTmAb0011在非变应性嗜碱性粒细胞中能够阻断IgE与FcεR1的结合,因此抑制随后的用NP-BSA抗原的触发。该活性的IC50值约为60ng/ml(图31)。PTmAb0011也能够有效地抑制LolP1触发的变应性嗜碱性粒细胞的组胺释放,其IC50值为40ng/ml(图31)。实施例11,猴被动皮肤过敏反应研究
也测试了PTmAb0005和PTmAb0011的体内活性。简而言之,刮下非洲绿猴的局部皮肤肥大细胞,通过在两臂皮内给予100ng抗NP IgE(人IgE抗硝基苯乙酰(NP),购自Serotech)进行敏化。24小时后,在一臂上给予人IgE的相同注射位点上,注射一定剂量范围的待测试的单克隆抗体。所述动物另一臂上的对照位点或者接受磷酸缓冲盐溶液(PBS),或者接受非特异性人IgE(对人巨细胞病毒(CMV)或人免疫缺陷病毒(HIV)特异性的)。5小时后,通过静脉注射给予10mgBSA-NP缀合物(购自Biosearch Laboratories)。15-30分钟后,对照动物产生容易观察到的由过敏反应所致的大致环形的水肿,这可以以毫米来测量。结果或者以各组3只猴子的平均水肿直径来表示,或者以与PBS对照相比的抑制百分比来表示。描述于EP 0 477 231 B中的Dec7B识别人IgE Cε4区中的肽496-506,将其用作阳性对照。
待测试的样品量(μg) | 水肿的平均直径(mm) | ||||
mAb0005 | mAb0011 | Dec7B | IgEα-CMV对照 | IgEα-HIV对照 | |
20 | 0 | 0 | 0 | 19.5 | 21 |
10 | 0 | 0 | 20 | 20.7 | 22 |
1 | 4 | 4.5 | 25 | 22.7 | 23 |
0.1 | 14.8 | 15.7 | 20 | 21.8 | 22.5 |
0.05 | 17.8 | 18.7 | 22.5 | 21.5 | 22.8 |
PBS | 23.2 | 28.2 | 26 | 24.5 | 22.5 |
过敏反应的抑制百分比示于图32中。表6-根据亲和性从初次噬菌体展示生物淘选鉴定的PTmAb0005肽配体人IgECε2 EDGQVMDVD-SEQ ID NO.1
表7-根据亲和性从初次噬菌体展示生物淘选鉴定的PTmAb0011肽配体人IgE Cε2 EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
表8-对PTmAb0005和PTmAb0011亲和性改进的IgEC67突变体得自所述原始序列的突变体以蓝色显示人IgE Cε2 EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
表9-对PtmAb0005亲和性改进的IgEC67-8突变体人IgE Cε2 EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
等级(ECL) PTmAB BIAcore KD Rel(μM) SEQ ID NO.名称 文库 PTmAb0005 PTmAb0005 PTmAb0011 |
IgEC67 XCX15 CFMNKQLADLELCPRE 243 0.1 4.8 13IgEC26 XCX15 QCNAVLEGLQMVDHCWN; 43 3 53.4 67IgEC29 XCX15 CCVADPETQMTPSSEMF; 40 >600 >600 68IgEC42 XCX15 ECLKIEQQCADIVEIPR; 15 19.4 >500 69IgEC69 XCX15 SCAYTAQRQCSDVPNPG; 11 6.6 6.4 70IgEC9 XCX15 ECRGPNMQMQDHCPTTD; 10 - - 71IgEC13 XCX15 ECLVYGQMADCAAGGWP; 5 >1000 >1000 72IgEC56 XCX15 QCRQFVMNQSEKEFGQC; 0 60 >1000 73IgEC43 XCX15 HCKNEFKKGQWTYSCSD; 0 - - 74IgEC81 XCX15 CCVTDVQTTNMDVPAGQ; 0 78 6.3 75IgEC83 XCX15 TCCVTDIPPPDYEQSLG; 0 - - 76IgEC70 XCX15 CCESDIPLNELHALADP; 0 - - 77IgEC64 XCX15 CCKSDIPSPVTQFNTMK; 0 - - 78IgEC73 XCX15 CCQSDVPHQPGINDLHV; 0 >600 >600 79IgEC72 XCX15 CCMSDTPDISRLPVPDS; 0 - - 80IgEC66 XCX15 CCMSDSPADPNRGLPIW; 0 >600 >600 71IgEC75 XCX15 CCLSDDAPTLPVRR; 0 - - 82ESC18 XCX15 CCITDVPQGVMYKGSPD; 0 - - 83ESC45 XCX15 ECKVDGQLSDSPLLRNN; 0 - - 84ESC12 XCX15 CCMTDDPMDPNSTWAIR; 0 - - 85 |
等级(ECL) PTmAB BIAcore KD Rel(μM) SEQ ID NO.名称 文库 PTmAb0005 PTmAb0005 PTmAb0011 |
ESC43 XCX15 CCMTDDPMYTNSTWAIR; 0 - - 86ESC1 XCX15 CCVDDTPNSGLAMRVSK; 0 - - 87ESC4 XCX15 CCEVDDFPTHHPGWTLR; 0 - - 88ESC46 XCX15 SCNLNHQSCDIPPVKQI; 0 - - 89ESC20 XCX15 CCMADQELDLGHNAANA; 0 - - 9091ESD36 XCX10 CCVMDLELASGF; 0 - - 92ESD14 XCX10 CCVMDIEVRGSA; 0 - - 93ESD38 XCX10 CCQRDVELVFGS; 0 - - 94ESD15 XCX10 CCRADFEVGNGG; 0 - - 95ESD6/10/40 XCX10 CCVSDEPAGVRD; 0 - - 96ESB4/35 XAX10 GAGWQEKDKELR; 0 70 700 96ESB25 XAX10 GAMTAGQLSDLP; 0 60 >1000 97ESB10/38 XAX10 VAGGQVVDRELK; 0 139 >1000 98ESB8 XAX10 KAGEQAMDMELR; 0 257 >1000 99ESB29/36 XAX10 RGRNQIMDLEI; 0 - - 100ESB15 XAX10 QIDRQITDTLL; 0 - - 101ESB26 XAX10 REQQISDVPRV; 0 - - 102ESB12 XAX10 CQAMDAEILNQV; 0 - - 103ESB1/6etc XAX10 GQMMDTELLNR; 0 - - 104ESB7 XAX10 SMEGQVRDIQV; 0 - - 105ESB18 XAX10 YQQRDLELLAE; 0 - - 106ESB9 XAX10 SMGQKVDRELV; 0 - - 107ESB40 XAX10 SMGQEVDRELV; 0 - - 108SB21/33/31 XAX10 AENDQMVDWEI; 0 - - 109 |
等级(ECL) PTmAB BIAcore KD Rel(μM) SEQ ID NO.名称 文库 PTmAb0005 PTmAb0005 PTmAb0011 |
ESB32 XAX10 GGWQESDIPGR; 0 - - 110ESB4/35 XAX10 GGWQEKDKELR; 0 - - 111ESB24 XAX10 HCCRIDREVSGA;0 - - 112ESB13 XAX10 CAPGMGCWESVK;0 - - 113 |
等级(ECL) PTmAb BIAcore KD Rel SEQ ID NO.(μM)名称 文库 PTmAb0011 PTmAb0011 PTmAb0005 |
EEC39/50/129 XCX15 SCREVWLGGSEMIMDCE; 1611 2.4 >1000 114EEC131 XCX15 SCPAFPREGDLCAPPTV; 910 42 >1000 115EEC147 XCX15 FCPEPICSPPLSRMTLS; 883 - - 116EEC40 XCX15 ECNQNLSGSLRHVDLNC; 547 - - 117EEC115/3/48 XCX15 RCDQQLPRDSYTFCMMS; 438 - - 118EEC36 XCX15 HCQQVFFPQDYLWCQRG; 158 - - 119EEC17/47/25 XCX15 DCEEPMCSPVLLQKLKP; 147 - - 120EEC40A XCX15 NCQDQMLREDAGCWSKI; 80 - - 121EEC51/48/53 XCX15 HCEEPEYSPATRVFCGR; 75 - - 122EEC2/23/44/132 XCX15 DCDWINPPDPPHFWKDT; 33 7 >600 123EEC41 XCX15 ACFSRNGQVTDVPHSCY; 31 - - 124EEC135 XCX15 KCPTYPKPNDRCLWPVP; 19 - - 125EEC116 XCX15 YCPKYPLEGDCLLDNDY; 4 - - 126EEC21/19 XCX15 RCEEWLCIPPAPAFAPP; 3 27.8 14.9 127EEC55 XCX15 TCGQSELRCASLETHHV; 0 - - 128EEC5 XCX15 NCNDNPMLDCMPAWSS; 0 - - 129EEB33 XAX10 DALDERAWRARA; 15 117 >600 130EED183 XCX10 SCQGREVRRECW; 596 - - 131EED35/53/164 XCX10 VCDECVSRELAL; 330 - - 132 |
等级(ECL) PTmAb BIAcore KD Rel SEQ ID NO.(μM)名称 文库 PTmAb0011 PTmAb0011 PTmAb0005 |
EED38 XCX10 WCLEPECAPGLL;330 - - 133EED147/173 XCX10 DCLSKGQMADLC;281 - - 134EED35/53/164 XCX10 VCDECVSRELAL;118 - - 135EED36 XCX10 GCPTWPRVGDHC;52 - - 136EED131/138/102 XCX10 RCQSARVVPECW;32 - 137EED18/47/48 XCX10 SCAPSGDCGYKG;31 - - 138EED132 XCX10 GCPMWPQPDDEC;28 - - 139EED139 XCX10 ECPRWPLMGDGC;26 - - 140EED134 XCX10 GCQVGELVWCRE;14 - - 141EED33 XCX10 QCVRDGTRKVCM;7 - - 142EED50 XCX10 TCLVDRQESDVC;6 - - 143EED34/104 XCX10 DCVVDGDRLVCL;3 - - 144EED41/56 XCX10 RCEQGALRCVGE;0 - - 145EED51 XCX10 VCPPGWKNLGCN;0 - - 146EED57 XCX10 MCQGWEIVSECW;0 - - 147 |
PtmAb等级 | BIAcore KD Rel(μM) | SEQ ID NO. | ||||
名称 | 0005 | 0011 | 0005 | 0011 | ||
IgEC67 | CFMNKQLADLLLCPRE | - | - | 0.1 | 4.8 | 13 |
IgEC67-8 | CFINKQMADLELCPRE | 4.36 | 2.4 | 0.0094 | 0.066 | 12 |
IgEC67-10IgEC67-1IgEC67-2IgEC67-3IgEC67-12IgEC67-9IgEC67-4IgEC67-5IgEC67-6IgEC67-11IgEC67-14IgEC67-13IgEC67-7 | ADGAGCFMNKQMADLELCPREAAEA;ADGAGCFMNKQMADLELCPRTAAEA;ADGAACFMNKQMADLELCPRVAAEA;ADGAGCFINKQLADLELCPRVAAEA;ADGAGCFINKQLADLELCPREAAEA;ADGAGCFMNKQLADLEMCPRDDAEA;ADGAGCFMNKQLADPELCPREAEEA;ADGAGCFMNKQLVDLELCPRGAAEA;ADGAGCFMNNQLADWELCPRAAAEA;ADGAGCFMNKQMADWEMCPRAAAEA;ADGAGCFMNKQQADLELCPRGAAEA;ADGAECFMNKQLADSELCPRVAAEA;ADGAGCFMNKQLADLELCPREAAEA; | 4.24.13.2332.72.41.91.91.81.21.11 | 2.32.21.81.71.92.41.31.61.61.90.90.81 | ------------- | ------------- | 148149150151152153154155156157158159160 |
克隆 | 相对等级A | 相对等级B | SEQ ID NO. | |
IgEC67-8 | GCFINKQMADLELCPRE | 1.00 | 1.00 | 12 |
对PTmAb0005亲和性改进的突变体 | ||||
1-32-133-113-1,3-9,3-101-112-154-91-4,1-2,1-125-164-12-121-9,2-52-9,2-61-161-54-2,4-31-10 | ADGAGCFINMQMADQELCPRAAAEA;ADGAGCFINKQMSDFELCPREAGEA;ADGAGCFINKQMADLELCTREAAEA;ADGAGCFINKQMADLELCPRQAAEA;ADGAGCFINNQMADLELCPRGGAEA;ADGAGCFINKQMADWELCPREGAEA;ADGAGCFINKQMADLELCPSQAAEA;ADGAGCFINKQMADLELCPREGAEA;ADGAGCFINKQMADSELCPREPAEA;ADGAGCFIKKQMADLELCPREAWEA;ADGAECFINKQMADRELCAREVAEA;ADGAGCFIDKQMADLELCPRAAAEA;ADGAGCFINKQMADLELCRREAGEA;ADGAGCFKNKQMVDSELCARQAAEA;ADGAGCFQNKQMADLELCPREAAEA;ADGAECFINKQRADLELCPGEAAEA;ADGAGCFINKQMADSELCPAAAAEA; | 1.731.561.541.541.451.441.381.371.291.241.221.211.191.141.131.111.10 | 1.312.142.021.851.321.571.701.391.831.521.501.411.541.171.731.601.08 | 161162163164165166167168169170171172173174175176177 |
克隆 | 相对等级A | 相对等级B | SEQ ID NO. | |
对PTmAB0005亲和性相似的突变体 | ||||
5-111-85-105-21-12-32-8,1-13,4-11,1-141-61-72-11,2-4,2-10,2-74-4 | ADGAGCFINRQMADPELCPREAAEA;ADGAGCFIEKQMADMELCQARAAEA;ADGAGCFINKQMADWELCPREAAEA;ADGAGCFINNQMADLELCPREAAEA;ADGAGCFIEKQMADMELCQRETAEA;ADGAGCFINKQMADMELCPREAAEA;ADGAGCFINKQMADLELCPREAAEA;ADGAGCFRNKQMADLELCPREAAEA;ADGAGCFINKQMADLELCPARAAEA;ADGAGCFINRQLADMELCSRGAAEA;ADGAECFINRQMADLELCGREAAEA; | 1.091.081.051.041.041.031.000.950.910.790.69 | 1.971.321.831.241.291.311.001.161.251.391.03 | 178179180181182183184185186187188 |
对链霉抗生物素蛋白具有亲和性的突变体 | ||||
6-9,5-1,6-2,6-8,6-46-12,5-86-10 | ADGAGCFISPQLADWKRCMREAAEA;ADGAGCSIHTQMADWERCLREGAEA;ADGAGCSIHRQMADWERCLREGAEA; | 1.530.930.91 | 1.190.670.69 | 189190191 |
Claims (41)
1.一种包含一个分离的IgE Cε2区的表面暴露表位或其模拟表位的肽。
2.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P1(SEQ ID No.1)或其模拟表位。
3.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P2(SEQ ID No.2)或其模拟表位。
4.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P3(SEQ ID No.3)或其模拟表位。
5.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P4(SEQ ID No.4)或其模拟表位。
6.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P5(SEQ ID No.5)或其模拟表位。
7.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P6(SEQ ID No.6)或其模拟表位。
8.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述Cε2的表面暴露表位是P7(SEQ ID No.7)或其模拟表位。
9.一种权利要求1-8的任一项中要求保护的模拟表位,其中所述模拟表位是一种肽。
10.一种权利要求1中要求保护的肽,其中所述分离的表位衍生自IgE Cε2区的一种环结构。
11.一种权利要求10中要求保护的肽,其中所述IgE Cε2区的环结构是A-B环或C-D环。
12.一种权利要求2中要求保护的肽,其中所述P1的模拟表位是通式为hxdhhananxy的肽;
其中:h为疏水性氨基酸残基;d为提供离子键的氨基酸残基;a为酸性氨基酸残基;n为离子中性/非极性氨基酸残基;而x为一种氨基酸。
13.一种权利要求2中要求保护的肽,其中所述P1的模拟表位为具有以下通式的肽:
Q,X1,M,D,X1,X2,X3
其中X1选自V、I、L、M、F或A;X2选自D或E;而X3选自L、I、V、M、A或F。
14.一种权利要求2中要求保护的肽,其中所述P1的模拟表位选自P15q(SEQ ID No.11)、PT1079(SEQ ID No.13)、PT1079GS(SEQID No.15)、PT1078(SEQ ID No.16)、PT15(SEQ ID No.8)。
15.一种权利要求3中要求保护的肽,其中所述P2的模拟表位是P16(SEQ ID No.24)。
16.一种权利要求4中要求保护的肽,其中所述P3的模拟表位是P17(SEQ ID No.26)。
17.一种用于治疗变态反应的免疫原,其包含权利要求1-16的任一项中要求保护的肽或模拟表位,还包含一种载体分子。
18.一种权利要求17中要求保护的免疫原,其中所述载体分子选自D蛋白或乙型肝炎核心抗原。
19.一种权利要求17或18中要求保护的免疫原,其中所述免疫原是权利要求1-16中要求保护的肽或模拟表位的化学缀合物,或其中所述免疫原作为融合蛋白表达。
20.一种权利要求17-19的任一项中要求保护的免疫原,其中所述肽或肽模拟表位存在于所述载体的一级序列中。
21.一种用于治疗变态反应的疫苗,其包含权利要求17-20的任一项中要求保护的免疫原,还包含一种佐剂。
22.一种能够识别IgE Cε2区的表面暴露表位的配体,其特征为所述配体不是PTmAb0005。
23.一种权利要求22中要求保护的配体,其中所述配体是1999年3月8日根据用于专利的微生物保存布达佩斯条约保藏于ECACC、保藏号为99030805的PTmAb0011。
24.一种药用组合物,其包含一种能够识别IgE Cε2区的表面暴露表位的配体。
25.一种权利要求24中要求保护的药用组合物,其中所述配体能够识别IgE Cε2区的C-D环。
26.一种权利要求25中要求保护的药用组合物,其中所述配体是选自PTmAb0005或PTmAb0011的单克隆抗体。
27.一种用于医药的权利要求1-16的任一项中要求保护的肽。
28.一种用于医药的权利要求21中要求保护的疫苗。
29.一种用于医药的权利要求17-20的任一项中要求保护的免疫原。
30.权利要求1-16的任一项中要求保护的肽在用于治疗或预防变态反应的药物生产方面的用途。
31.一种能够识别IgE Cε2区的表面暴露表位、用于医药的配体。
32.一种能够识别IgE Cε2区的表面暴露表位的配体在变态反应治疗药物生产方面的用途。
33.权利要求31或32中要求保护的配体的用途,其中所述配体是PTmAb0005或PTmAb0011。
34.PTmAb0005或PTmAb0011在P1模拟表位鉴定方面的用途。
35.一种能够为PTmAb0005或PTmAb0011所识别的肽。
36.一种包含权利要求35中要求保护的肽的免疫原。
37.一种权利要求1-16中要求保护的肽在诊断血液循环抗IgE抗体或从血液中亲和纯化循环抗IgE抗体方面的用途。
38.一种生产疫苗的方法,包括生产权利要求17-20的任一项中要求保护的免疫原,并且将所述免疫原与一种佐剂一起配制。
39.一种治疗患有或易患变态反应的患者的方法,包括给予所述患者一种权利要求1-16的任一项中要求保护的肽。
40.一种治疗患有或易患变态反应的患者的方法,包括给予所述患者一种权利要求21中要求保护的疫苗。
41.一种治疗患有或易患变态反应的患者的方法,包括给予所述患者一种权利要求24-26的任一项中要求保护的药用组合物。
Applications Claiming Priority (20)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9904405.9A GB9904405D0 (en) | 1999-02-25 | 1999-02-25 | Vaccine |
GB9904405.9 | 1999-02-25 | ||
GB9907151.6 | 1999-03-29 | ||
GBGB9907151.6A GB9907151D0 (en) | 1999-03-29 | 1999-03-29 | Therapeutic antibody composition and use |
GB9910538.9 | 1999-05-07 | ||
GBGB9910538.9A GB9910538D0 (en) | 1999-05-07 | 1999-05-07 | Therapeutic antibody, Immunogenic compositions ansd uses |
GB9910537.1 | 1999-05-07 | ||
GBGB9910537.1A GB9910537D0 (en) | 1999-05-07 | 1999-05-07 | Therapeutic antibody, Immunogenic compositions and uses |
GBGB9918603.3A GB9918603D0 (en) | 1999-08-07 | 1999-08-07 | Novel peptides |
GB9918603.3 | 1999-08-07 | ||
GBGB9918594.4A GB9918594D0 (en) | 1999-08-07 | 1999-08-07 | Novel peptides |
GB9918594.4 | 1999-08-07 | ||
GB9921046.0 | 1999-09-07 | ||
GB9921047.8 | 1999-09-07 | ||
GBGB9921047.8A GB9921047D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | Therapeutic antibody, immunogenic compositions & uses |
GBGB9921046.0A GB9921046D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | Therapeutic antibody composition & use |
GBGB9925619.0A GB9925619D0 (en) | 1999-10-29 | 1999-10-29 | Vaccine |
GB9925619.0 | 1999-10-29 | ||
GBGB9927698.2A GB9927698D0 (en) | 1999-11-23 | 1999-11-23 | Therapeutic antibody |
GB9927698.2 | 1999-11-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1348466A true CN1348466A (zh) | 2002-05-08 |
Family
ID=27579426
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN00806614A Pending CN1348466A (zh) | 1999-02-25 | 2000-02-22 | 衍生自lgECε2区的表位或模拟表位、其拮抗剂以及它们的治疗用途 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1155037A1 (zh) |
JP (1) | JP2004538238A (zh) |
KR (1) | KR20020007313A (zh) |
CN (1) | CN1348466A (zh) |
AR (1) | AR029336A1 (zh) |
AU (1) | AU2672700A (zh) |
BR (1) | BR0008963A (zh) |
CA (1) | CA2363637A1 (zh) |
CO (1) | CO5210906A1 (zh) |
CZ (1) | CZ20013082A3 (zh) |
HK (1) | HK1044004A1 (zh) |
HU (1) | HUP0200049A2 (zh) |
IL (1) | IL145024A0 (zh) |
MX (1) | MXPA01008613A (zh) |
NO (1) | NO20014130L (zh) |
NZ (1) | NZ513679A (zh) |
PL (1) | PL350993A1 (zh) |
TR (1) | TR200102506T2 (zh) |
WO (1) | WO2000050460A1 (zh) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9913327D0 (en) * | 1999-06-08 | 1999-08-11 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US6787524B2 (en) | 2000-09-22 | 2004-09-07 | Tanox, Inc. | CpG oligonucleotides and related compounds for enhancing ADCC induced by anti-IgE antibodies |
EP1497318A4 (en) * | 2001-04-18 | 2006-03-01 | Dyax Corp | BINDING MOLECULES FOR FC ZONE POLYPEPTIDES |
GB0209878D0 (en) * | 2002-04-30 | 2002-06-05 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
WO2008099188A1 (en) * | 2007-02-15 | 2008-08-21 | Astrazeneca Ab | Binding members for ige molecules |
AR065368A1 (es) * | 2007-02-15 | 2009-06-03 | Astrazeneca Ab | Anticuerpos para moleculas de ige |
US9187568B2 (en) | 2009-05-07 | 2015-11-17 | Stallergenes S.A. | Use of IgG1 immunoglobulins and/or ligands of the CD32 receptor for treating inflammatory diseases and manifestations via the mucosal route |
EP3882274A4 (en) * | 2018-09-21 | 2022-06-29 | Riken | Anti-ige antibody specifically binding to membrane-bound ige antibody of ige antibody-producing b cells and method for diagnosing and treating allergic symptoms using the same |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4171299A (en) * | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
WO1998024808A2 (en) * | 1996-12-06 | 1998-06-11 | THE UNITED STATES OF AMERICA represented by THE SECRETARY DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES, THE NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH | INHIBITION OF IgE-MEDIATED ALLERGIES BY A HUMAN IgE-DERIVED OLIGOPEPTIDE |
JP2001516009A (ja) * | 1997-07-17 | 2001-09-25 | ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ | ガン関連核酸及びポリペプチド |
-
2000
- 2000-02-22 CA CA002363637A patent/CA2363637A1/en not_active Abandoned
- 2000-02-22 TR TR2001/02506T patent/TR200102506T2/xx unknown
- 2000-02-22 BR BR0008963-0A patent/BR0008963A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-02-22 CZ CZ20013082A patent/CZ20013082A3/cs unknown
- 2000-02-22 KR KR1020017010939A patent/KR20020007313A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-02-22 EP EP00905073A patent/EP1155037A1/en not_active Withdrawn
- 2000-02-22 IL IL14502400A patent/IL145024A0/xx unknown
- 2000-02-22 PL PL00350993A patent/PL350993A1/xx unknown
- 2000-02-22 AU AU26727/00A patent/AU2672700A/en not_active Abandoned
- 2000-02-22 WO PCT/EP2000/001455 patent/WO2000050460A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-02-22 CN CN00806614A patent/CN1348466A/zh active Pending
- 2000-02-22 NZ NZ513679A patent/NZ513679A/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-02-22 HU HU0200049A patent/HUP0200049A2/hu unknown
- 2000-02-22 MX MXPA01008613A patent/MXPA01008613A/es unknown
- 2000-02-22 JP JP2000601038A patent/JP2004538238A/ja active Pending
- 2000-02-25 AR ARP000100820A patent/AR029336A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-02-25 CO CO00013394A patent/CO5210906A1/es not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-08-24 NO NO20014130A patent/NO20014130L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-05-16 HK HK02103724.5A patent/HK1044004A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20020007313A (ko) | 2002-01-26 |
PL350993A1 (en) | 2003-02-24 |
TR200102506T2 (tr) | 2002-06-21 |
NO20014130D0 (no) | 2001-08-24 |
NO20014130L (no) | 2001-09-13 |
NZ513679A (en) | 2001-09-28 |
AU2672700A (en) | 2000-09-14 |
MXPA01008613A (es) | 2003-06-24 |
IL145024A0 (en) | 2002-06-30 |
CO5210906A1 (es) | 2002-10-30 |
JP2004538238A (ja) | 2004-12-24 |
BR0008963A (pt) | 2001-11-27 |
CA2363637A1 (en) | 2000-08-31 |
EP1155037A1 (en) | 2001-11-21 |
HK1044004A1 (zh) | 2002-10-04 |
HUP0200049A2 (en) | 2002-05-29 |
AR029336A1 (es) | 2003-06-25 |
CZ20013082A3 (cs) | 2002-02-13 |
WO2000050460A1 (en) | 2000-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100584051B1 (ko) | 알레르기에 대한 백신 접종 및 치료를 위한 펩티드임뮤노겐 | |
CA2060666C (en) | Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted iga | |
JP2002537403A (ja) | IgEのC−イプシロン−3またはC−イプシロン−4ドメイン由来のエピトープまたはミモトープ、その拮抗薬、及びそれらの治療的使用 | |
US6913749B2 (en) | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses | |
CN1541266A (zh) | 用于治疗过敏症及哮喘病的Fcε融合蛋白 | |
CN1193353A (zh) | 变应原-xcd32融合蛋白 | |
CN1348466A (zh) | 衍生自lgECε2区的表位或模拟表位、其拮抗剂以及它们的治疗用途 | |
CN1346372A (zh) | 抑制免疫球蛋白e与其高亲和性受体结合的抗体的抗独特型抗体 | |
JP3990730B2 (ja) | マラセチア由来の抗原性蛋白質 | |
CN1313484C (zh) | 人b细胞特异性膜分子cd20的12氨基酸模拟表位及其用该模拟表位构建的多肽表位疫苗 | |
CN1175958A (zh) | 单克隆抗独特型抗体(ab2)和其用途 | |
CN1158623A (zh) | 新的免疫避孕肽 | |
JPH02504284A (ja) | 抗原、および、抗イディオタイプ抗体、または抗原に対する細胞受容体に特異的な抗体に共通のアミノ酸配列に由来する免疫原および生物学的活性ペプチド | |
AU757334B2 (en) | Specific binding proteins for treating canine allergy | |
CA2329152A1 (en) | Peptide vaccine for canine allergy | |
CN1634978A (zh) | Sars病毒hla-a2限制性表位多肽及其应用 | |
CN1253953A (zh) | 肽免疫原、用其制成的治疗变态反应的疫苗及其制备方法 | |
US20030147906A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
US20050214285A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of IgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
US20030170229A1 (en) | Vaccine | |
CN107849119A (zh) | 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗 | |
RU2214279C2 (ru) | Усовершенствованные вакцины | |
ZA200107016B (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses. | |
HUT67010A (en) | Supressor t-cell hybridoma | |
EP1621209A2 (en) | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |