CN1346372A - 抑制免疫球蛋白e与其高亲和性受体结合的抗体的抗独特型抗体 - Google Patents

抑制免疫球蛋白e与其高亲和性受体结合的抗体的抗独特型抗体 Download PDF

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Abstract

本发明描述了干扰IgE的Cε3区与其高亲和性受体结合的抗体的抗独特型抗体或抗体片段(模拟抗体),特别是BSW17的抗独特型抗体(BSW17－模拟抗体),以及它们在治疗IgE介导的疾病的药物,特别是疫苗中的用途。

Description

抑制免疫球蛋白E与其高亲和性 受体结合的抗体的抗独特型抗体
本发明涉及抗独特型抗体。本发明涉及对如下相互作用的抑制：细胞结合的IgE结合过敏原诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化、由此产生组胺与其它介质的释放以及参于调节过敏反应和炎症反应的细胞因子的从头合成。本发明涉及干扰IgE的Cε3区与IgE高亲和性受体结合的抗独特型抗体或抗体片段。
IgE上与其高亲和性受体(FCεRI)相互作用的特异性结合位点的知识，为产生通过识别该结合表位而阻止这种相互作用的抗体提供了基础。通过疫苗接种诱生这种抗体，产生了一种新的可普遍适用的过敏反应治疗方法。本发明特别描述了重组抗体片段的鉴定和生产，该重组抗体片段可配制成疫苗以产生能够防止诱导IgE介导的过敏反应的抗-IgE抗体。
细胞释放到周围组织和血管结构的血管活性胺类(介质)，特别是组胺，引起变态反应症状。组胺通常储存在称为肥大细胞和嗜碱性粒细胞的特殊细胞中。肥大细胞散布于整个动物组织中，而嗜碱性粒细胞存在于血管系统中。这些细胞合成并在细胞中储存组胺，除非特定系列事件的发生导致组胺释放。
IgE抗体在介导过敏反应中的作用是众所周知的。IgE是一个复杂排列的多肽链，与其它免疫球蛋白一样，由两条重链和两条轻链通过二硫键连接成“Y”构型。每条轻链有两个结构域，一个可变区(VL)与一个称作恒定区(CL)的相对不变的氨基酸序列相连。相反，重链有一个可变区(VH)，就IgE而言，还有4个恒定区(CH1，CH2，CH3，CH4，也称为Cε1，Cε2，Cε3，Cε4)。抗体两“臂”负责抗原结合，具有多肽结构可变的区域，称为Fab’片段或F(ab’)2，后者表示被二硫键连在一起的两个Fab’臂。抗体的尾部或中轴包含固定或恒定的多肽序列，称为Fc片段。Fc片段含有相互作用位点，使抗体能够通过结合Fc受体与其它免疫系统分子或细胞通讯。Fc受体是特异结合免疫球蛋白Fc区活性分子位点的分子。Fc受体以整合膜蛋白存在细胞外值膜中或以游离的“可溶性”分子自由循环在血浆或其它体液中。在人系统中，IgE与其FcεRI的高亲和性结合通过复杂的蛋白-蛋白相互作用完成，涉及IgE第三个重链恒定区结构域(Cε3)和FcεRIα亚单位的膜近侧免疫球蛋白样结构域(α2)。虽然Fcε的Cε3结构域和属于FcεRIαα2结构域的区域对结合有重要作用的残基已被确定，但结合过程的详细机制尚待阐明。实验证据表明人IgE采用一种弯曲结构，推测可能与IgE对FcεRI的高亲和性有关(Kd≌10-10M)。而且，推测这种弯曲结构可能负责IgE和细胞结合型或可溶型FcεRIα形成等摩尔复合物，虽然IgE分子在两个Cε3结构域中提供了受体结合的相同表位。为了避免在没有过敏原时的受体活化，这种单价性是功能上需要的。
根据它们的功能，相互作用位点可能已暴露，因此能够结合到细胞受体上。或者，它们也可能隐藏，直到抗体结合到抗原上，由此抗体可以改变结构并随后暴露能引发特异免疫活性的其它活性位点。构象重排影响Cε3的受体结合被认为是对细胞表面Fcε/FcεRI复合物1∶1化学计量的解释。
仅在以下情况下，机体内从肥大细胞和嗜碱性粒细胞过敏性(免疫性)释放介质：IgE分子必须通过Fc部分锁定或结合到细胞Fc受体位点上，这样确保IgE分子结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞上；且细胞结合的IgE分子的Fab部分必须与特定的亲和性抗原(过敏原)交联。只有发生这种相互作用，肥大细胞或嗜碱性粒细胞才能被自动触发释放组胺到局部环境中，产生熟悉的过敏反应症状(图1)。随后在晚期反应中发生其它生化事件，导致细胞因子和其它介质的从头合成和释放。
治疗变态反应的常规方法包括用抗组胺药系统治疗或试图使患者脱敏，这些方法并未涉及基本的IgE-肥大细胞/嗜碱性粒细胞相互作用。另一方法涉及产生能够阻断IgE抗体结合到细胞表面Fc受体上并从已结合IgE的结合位点替换IgE的多肽链，并研究IgE Fc区被认为提供了引发肥大细胞/嗜碱性粒细胞释放组胺的免疫信号的推定效应位点的本质。
已尝试用重组IgE片段作为免疫原产生保护性抗-IgE疫苗并表明是有效的。反对这种疫苗的主要原因是使用这种大片段IgE免疫，在患者中不仅可能诱发抑制性抗体，而且可能产生交联并因而产生过敏原性抗体。
克服该问题的一个策略是鉴定可能的最小IgE片段，理想地仅由受体结合位点组成，而且结合后埋藏在IgE/IgERI复合物中，因此不再被疫苗产生的免疫应答所交联。虽然仍在尝试，但考虑到参与IgE/IgERI相互作用的不同Cε3区的空间距离，这种策略不可能成功。
也许可通过使用短的模拟表位(mimotope)肽进行主动免疫来克服“经典”疫苗方法的内在问题，模拟表位肽或为偶联到合适载体上的化学合成肽，或为与如卵白蛋白或IgG的重组融合结构。这种肽是单克隆抗体BSW17所识别的表位的结构模拟物，BSW17识别Fcε上一个部分位于Cε3区、部分位于Cε4区的构象型表位。根据保藏微生物的布达佩斯条约规定，产生BSW17的杂交瘤细胞系已于1996年12月19日保藏在ECACC，保藏号是96121916。这种抗体显示了有趣的生物学活性，总结见图2。它本身无过敏原性，能够防止激活剂诱导的人肥大细胞和嗜碱性粒细胞IgE依赖性组胺释放。BSW17或BSW17样抗体在血管系统中循环，通过以下方式防止变态反应发生：a)通过竞争性抑制IgE/IgERI相互作用而抑制肥大细胞和嗜碱性粒细胞激活，和b)通过在B细胞水平上下调IgE合成而降低血清IgE水平。作为抗-IgE抗体表位的结构模拟物，化学合成的BSW17模拟表位肽诱生导致在宿主体内产生BSW17样抗体的免疫应答。由于BSW17无过敏原性、抑制IgE/IgERI结合以及B细胞的IgE合成，BSW17模拟表位肽疫苗诱生的这些抗体具有相似的保护性特性。这类BSW17模拟表位肽疫苗的一个可能缺点是化学合成肽需要偶联到载体蛋白上以增强肽的免疫原性。而且，短肽的结构灵活性使它们具有多种不同立体构象。这样，只有部分多克隆抗模拟表位免疫应答具有与人IgE交叉反应的治疗活性。
本发明避免了模拟表位肽方法内在的可能缺点。它基于干扰IgE结合到高亲和性受体的抗体的抗独特型抗体或抗体片段，特别是针对BSW17的重组抗独特型抗体。根据Jerne的网络理论(Jerne N，Ann.Immunol.125C[1974]373)，抗体(Ab1)高变区本身可作为抗原。以这种方式产生的抗体称为抗独特型抗体(Ab2)，因为它们结合到第一种抗体的独特型区域(图3)。这种抗独特型抗体针对第一种抗体(Ab1)的结合位点(抗原互补位)，这样代表了初始抗原的“内影像(internal image)”。随后，称为内影像抗体或Ab2β的抗独特型抗体(Ab2)也能够通过其高变区诱导抗体形成。这些抗-抗独特型抗体(Ab3)结构上模拟了Ab1的抗原互补位，因此具有与Ab1相似的生物学特性。在hIgE/BSW17系统中，IgE代表初始抗原，BSW17代表Ab1。因此抗-BSW17独特型抗体Ab2的抗原互补位代表了BSW17识别的hIgE区域(表位)的结构模拟。在结构上，Ab2抗原互补位等同于上述化学合成的BSW17模拟表位肽。如果这种(重组)抗-BSW17独特型抗体用作疫苗，将在接种患者中诱生BSW17样免疫应答(Ab3)。象BSW17一样，这些(多克隆)Ab3免疫球蛋白将干扰IgE与其高亲和性受体的结合，因此可以作为抗变态反应药剂。与灵活的合成模拟表位肽相反，Ab2抗原互补位将以结构上确定的构象在环境中出现。因此，针对确定的hIgE表位的免疫反应将更具特异性。而且不需要异源的免疫原性载体蛋白。因此可避免载体蛋白如破伤风类毒素或白喉类毒素引起的可能副反应。
本发明包含如E25(olizumab)、CGP56901或优选的BSW17等干扰IgECε3区与IgE高亲和性受体结合的抗体的抗独特型抗体或抗体片段。以下它们简称为“本发明的模拟抗体(mimobodies)”。当它们为BSW17的抗独特型抗体时，以下简称为“BSW17模拟抗体”。
因此，本发明的模拟抗体是这样的抗独特型抗体或抗体片段，即它们能够特异性结合作为抗-IgE抗体的抗原互补位的表位，该抗-IgE抗体识别结合IgE高亲和性受体(FcεRI)的IgE分子Cε3区域上的位点。
就人体应用而言，本发明的模拟抗体原则上是人来源的。优选地它们为重组抗体。优选地它们为单克隆抗体。优选地它们为抗体片段，例如由如下部分组成或包含如下部分：-重链和轻链(如Fab段)，或单个重链或轻链(如轻链二聚体)，优选地和它们的恒定区成分一起，如图4所定义的(seq.id.no.35，36，37和38)，其中“恒定区”也包括小的立体修饰，如同种异型变异体中存在的，如恒定部分1-5位氨基酸，通常仅为一个。-或其部分，尤其是至少其特异性决定部分，如图5a-5d所确定的(seq.id.no.2，4，6，8)。-或其小部分(subpart)，尤其是至少其高变区的小部分，例如至少包含一个CDR的氨基酸序列段组成的肽，如该氨基酸序列段包含图5a、5b、5c和5d(seq.id.no.2，4，6，8)中至少一个CDR，优选两个，更优选三个CDR，它们任选地与邻近构架区序列一起，如在CDR的一个或两个末端不超过约10个氨基酸的序列。
本发明的模拟抗体是分离的和大体上纯的抗体或抗体片段，来源于天然产生的抗-独特型抗-IgE抗体。特别是它们大体上无其它抗体。“大体上纯”指按重量比纯度为至少约60％，优选大约90％，更优选大约99％或更多。
本发明涉及药物组合物，特别是疫苗，其包含本发明的模拟抗体，或为单个分子实体或为化学偶联到免疫原性载体分子上的蛋白偶联物，适当地，与佐剂和常规赋形剂一起使用。
本发明还涉及本发明的模拟抗体用作药物，特别是疫苗，特别是用于治疗IgE介导的疾病。
本发明还涉及通过传统的方法如噬菌体展示技术，用干扰IgE Cε3区结合到IgE高亲和性受体的抗体如BSW17来鉴定本发明的模拟抗体。
本发明还涉及治疗IgE介导的疾病的方法，特别是通过疫苗接种的治疗方法，包括给予需要这种治疗或接种的患者以有效治疗剂量的本发明的模拟抗体。
本发明还涉及本发明的模拟抗体在制备防治IgE介导的疾病的药物(特别是疫苗)中的用途。
本发明还涉及本发明模拟抗体在生产用于被动免疫的多克隆或单克隆抗该模拟抗体的抗体中的用途；或者通过用本发明的模拟抗体免疫合适的非人动物并分离纯化由此产生的抗体，或者通过常规杂交瘤技术，来制备用于被动免疫的抗本发明模拟抗体的多克隆或单克隆抗体；以及以任何方式获自本发明模拟抗体的多克隆或单克隆抗体在通过被动免疫治疗IgE介导的疾病中的应用。
本发明还涉及鉴定本发明模拟抗体的方法，包括：-鉴定天然产生的抗-独特型抗-IgE抗体；-分离其片段；和-通过结合合适的抗-IgE单克隆抗体，如干扰IgE Cε3区结合到IgE高亲和性受体的BSW17，来选择其重组片段。
一旦鉴定和表征，本发明的模拟抗体可用常规方式，如通过重组DNA技术或化学合成来制备。
为了鉴定显示与上述模拟表位肽(即选择的IgE表位)特异性相同的抗独特型抗体，可使用表达人抗体库Fab部分的噬菌体展示文库。该文库从例如获自人扁桃体的B细胞库构建而成，固定化BSW17抗体用作生物淘洗的靶标。分离和富集特异性识别BSW17的表达人Fab的噬菌体颗粒。这些重组Fab片段即为本发明的模拟抗体并代表抗BSW17高变区的抗独特型。当用作疫苗时，它们在变态反应患者中诱生免疫应答，导致BSW17样抗体的产生。由于BSW17无过敏原性并抑制IgE/IgERI结合和B细胞的IgE合成，患者中诱生的抗BSW17抗-独特型Fab疫苗的多克隆抗体也有相似特性。由于与“经典疫苗方法”相反，疫苗中不含在免疫患者中可能诱生交联抗体的IgE来源的蛋白片段而且其组合物可以设想不含载体，所以免疫应答是非常特异和安全的。
这些BSW17模拟抗体是由来源于人免疫球蛋白G的可变区(V-区)和恒定区(C-区)组成的重组抗体或抗体片段。通过用固定化BSW17抗体对抗体噬菌体文库进行生物淘洗，已鉴定了其表面展示不同模拟抗体片段的两个克隆(克隆52和43)。模拟人IgE上BSW17表位的模拟抗体结构位于V-结构域的高变区(CDR)和邻近构架区(FR)中。克隆52和克隆43重链和轻链V-结构域的cDNA和氨基酸序列见图5a-5d(seq.id.no.1-8)。克隆52轻链结构(L.C.)2由一个二聚体“Fab-样”轻链片段组成。这些BSW17模拟抗体的完整结构图示于图4A-4C，其中其恒定区部分也包括上述小的立体修饰，如同种异型变异体中存在的这种修饰。这些克隆的每个完整重链和轻链的氨基酸序列见图12a-12d(Seq.id.no.35-38)。
本发明的模拟抗体具有药理学活性。因此它们适于用作药物，如作为疫苗的抗原。它们能够诱生与IgE Fc区靶标氨基酸序列有强烈血清学交叉活性的抗体，尽管基本上不能介导非细胞裂解性组胺释放。
本发明模拟抗体的初始剂量为，如从大约0.05mg到大约5mg，优选大约1mg；它通过如鼻腔、皮下或肌内等途径给药，随后如14-28天后以相同剂量重复给药(加强)。使用的剂量在一定程度上根据患者的年龄、体重和总体健康状况，并可调整为合适剂量。
用本发明的模拟抗体进行直接免疫(即主动免疫)，优选使用可在各种不同宿主表达系统如细菌、真菌或真核细胞中以常规方式生产的重组肽(Fab片段、轻链或重链)来进行。
优选给予游离的重组模拟抗体。然而，也可通过化学偶联到免疫原性载体上，进一步增强此免疫原的免疫原性。术语“免疫原性载体材料”在此包括具有在宿主动物中能够独立引起免疫原性应答特性的那些物质，它们能或者直接通过在多肽的游离羧基、氨基或羟基和免疫原性载体物质的相应基团之间形成肽键和酯键，或者通过常规的双功能交联基团，被共价偶联到多肽上。这类载体的实例包括动物血清白蛋白、动物血清球蛋白、动物甲状腺球蛋白、动物血红蛋白、动物血蓝蛋白(特别是匙孔血蓝蛋白[KLH])、从蛔虫提取的蛋白，如那些在免疫学杂志(J.Immun.)111[1973]260-280、免疫学杂志122[1979]302-308、免疫学杂志98[1967]893-900和美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)199[1960]575-578中描述的蛔虫提取物或其纯化产物；多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、赖氨酸-谷氨酸共聚物、含有赖氨酸或鸟氨酸的共聚物，等等。最近，已使用白喉类毒素如CRM197或破伤风类毒素作为免疫原性载体材料来生产疫苗(Lepow ML等，传染病学杂志(J.Infectious Diseases)150[1984]402-406；和Coen Beuvery，E等，传染与免疫(Infection andImmunity)40[1983]39-45)，这些类毒素材料也可用于此。与化学脱毒的白喉毒素相比，优选使用重组突变的白喉毒素CRM197。在CRM197中第52位甘氨酸残基被谷氨酸所代替，导致无毒产物。CRM197是阐述得很清楚的无毒载体蛋白并用于注册的人用疫苗。纯化的结核菌素蛋白衍生物(PPD)也可用于“主动”免疫方案中，因为：(1)它本身不诱导T细胞应答(即实际上它是一个“T细胞半抗原”)，但仍表现为完全加工的抗原并被T细胞所识别；(2)在偶联识别模型中，已知它是最强的半抗原“载体”之一；和(3)不需要进一步试验就可用于人体。
作为半抗原-载体结合剂，可使用在抗原制备中常规使用的那些。可用常规方式共价偶联本发明的模拟抗体和免疫原性载体材料。例如，对于直接共价偶联，可能使用双-N-琥珀酰亚胺衍生物作为偶联剂，最优选以双(磺化琥珀酰亚胺)辛二酸为偶联剂，或用戊二醛或碳二亚胺，最优选(二环已基)碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺。
半抗原、半抗原-载体结合剂和载体的比率可适当确定，但优选载体量为半抗原重量的约1-约6倍，优选为约1-约5倍，而半抗原-载体结合剂的量为半抗原摩尔当量的约5-约10倍。通过上述偶联反应，载体通过半抗原-载体结合剂结合到半抗原上，从而获得由本发明的模拟表位和载体的肽-载体复合物构成的期望抗原。
反应完成后，产生的免疫原可通过透析、凝胶过滤和分级沉淀等常规方式分离和纯化。
本发明本质上涉及通过直接疫苗接种而进行主动免疫。然而也探讨了被动免疫。在该情况下，将本发明的模拟抗体给予合适的非人动物，分离和纯化产生的抗抗体，然后施用给人体以减轻过敏症状。
本发明的模拟抗体可用作药物，特别是疫苗，特别是用于治疗变态反应等IgE-介导的疾病，如哮喘、特应性皮炎、过敏性形式的嗜酸性粒细胞增多、鼻炎、慢性荨麻疹和食物过敏。
“治疗”应理解为包括预防性和治疗性处理。优选的宿主为人，但本发明可根据实际情况作必要改变用于基本上任何动物，如猫或狗。
                      附图说明图1：IgE与其高亲合力受体之间的相互作用。图2：单克隆抗-hIgE抗体BSW17的特性。图3：抗独特型网络。
BSW17识别的hIgE表位和抗独特型抗原互补位用黑点表示。黑圆圈表示抗体BSW17(Ab1)和通过用抗独特型抗体Ab2免疫而诱生的多克隆抗体3(Ab3)的同源高变区。图4：三种重组BSW17模拟抗体的结构：A：抗-独特型-BSW17，克隆52(SDS426)；轻链：(L.C.)2(Seq.id.no.36)B：抗-独特型-BSW17，克隆52(SDS427)；Fab：FAB(Seq.id.no.35和36)C：抗-独特型-BSW17，克隆43(SDS463)；Fab：FAB(Seq.id.no.37和38)图5：抗-BSW17 Fab克隆：噬菌体展示的人免疫球蛋白DNA序列及推导的氨基酸序列：
高变区(互补决定区；CDR)用斜体表示：
图5a：克隆52；可变重链(Seq.id.no.1和2)(CDR1：Seq.id.no.39和40；CDR2：Seq.id.no.41和42；CDR3：Seq.id.no.43和44)；
图5b：克隆52；可变轻链(Seq.id.no.3和4)(CDR1：Seq.id.no.45和46；CDR2：Seq.id.no.47和48；CDR3：Seq.id.no.49和50)；
图5c：克隆43；可变重链(Seq.id.no.5和6)(CDR1：Seq.id.no.51和52；CDR2：Seq.id.no.53和54；CDR3：Seq.id.no.55和56)；
图5d：克隆43；可变轻链(Seq.id.no.7和8)(CDR1：Seq.id.no.57和58；CDR2：Seq.id.no.59和60；CDR3：Seq.id.no.61和62)；图6：抗BSW17 rFab和人hIgE Cε3结构域之间的氨基酸序列同源性：
A：分别为抗-独特型Fab，克隆52，重链(hIgE，Cε3：Seq.id.no.25；克隆52：Seq.id.no.26)；
   抗-独特型Fab，克隆52，轻链，比对1(hIgE，Cε3：Seq.id.no.27；克隆52：Seq.id.no.28)；
   抗-独特型Fab，克隆52，轻链，比对2(hIgE，Cε3：Seq.id.no.29；克隆52：Seq.id.no.30)；
B：分别为抗-独特型Fab，克隆43，重链(hIgE，Cε3：Seq.id.no.31；克隆43：Seq.id.no.32)；
   抗-独特型Fab，克隆43，轻链(hIgE，Cε3：Seq.id.no.33；克隆43：Seq.id.no.34)。
氨基酸序列比对：相同残基用黑框表示，相似氨基酸用灰框表示(Lipman和Pearson)。Fcε残基的位置标在每个比对上方。每对序列下方标出了重组Fab片段的高变区(CDR)和构架区(FR)。图7：异硫氰酸荧光素标记的BSW17与抗-独特型BSW17 rFab竞争性结合IgE致敏的CHOα细胞。图8：亲合纯化的兔抗-BSW17模拟抗体免疫球蛋白与人IgE的结合。
用夹心ELISA法测定hIgE/抗-模拟抗体复合物：hIgE和免疫亲和纯化的抗-BSW17模拟抗体制备物等摩尔浓度混合，4℃孵育过夜。然后将混合物加入包被有捕获抗体单克隆抗-hIgE抗体LE27(1μg/ml)的微量滴定板中。用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔-IgG检测结合的模拟抗体IgG。□＝hIgE/SDS410复合物；○＝hIgE/SDS411复合物；图9：Balb/c小鼠中抗BSW17的模拟抗体免疫反应：■＝小鼠1；●＝小鼠2；＝小鼠3；▲＝小鼠4；◆＝小鼠5A：抗-独特型-BSW17.52；轻链(SDS426)；B：抗-独特型-BSW17.52；Fab(SDS427)；C：抗-独特型-BSW17.43；Fab(SDS463)；
O.D.值代表读出的光密度值，已用未包被孔的背景结合校正。所示为两次重复测量的平均值。变异通常小于0.05O.D。图10：用免疫亲合纯化的抗-模拟抗体的抗体抑制hIgE/FcεRIα的结合：A：■＝BSW17●＝抗克隆52；轻链(SDS410)△＝抗克隆52；Fab(SDS411)＝抗克隆52；轻链(柱流通物)B：■＝BSW17●＝抗克隆43，Fab(SDS476)图11：不同模拟抗体制备物免疫的恒河猴组(n＝2)的PCA分值图谱：A： 免疫原：  抗-独特型-BSW17.52；轻链(SDS426)；B： 免疫原：  抗-独特型-BSW17.52；Fab(SDS427)；C： 免疫原：  抗-独特型-BSW17.43；Fab(SDS463)。
免疫后不同时间点恒河猴皮肤的被动皮肤过敏反应(PCA)。PCA分值代表通过皮肤蓝点直径对注射的IgE(JW8)浓度作图产生的曲线下方面积(AUC)计算而来的PCA强度。分值为每组中相同模拟抗体制备物免疫的两只猴子的平均数，从表4所示的单个猴子数值计算而来。变异用误差线表示。统计学P值标在误差线上方。加强免疫注射时间点标在X轴下方。图12：三种重组BSW17-模拟抗体重链和轻链的完整氨基酸序列图12a：抗-独特型-BSW17，克隆52：重链可变区与第一恒定区
  (Seq.id.no.35)；图12b：抗-独特型-BSW17，克隆52：κ轻链可变区与恒定区
  (Seq.id.no.36)；图12c：抗-独特型-BSW17，克隆43：重链可变区与第一恒定区
  (Seq.id.no.37)；图12d：抗-独特型-BSW17，克隆43：λ轻链可变区与恒定区
  (Seq.id.no.38)。
模拟抗体(L.C.)2克隆52包含二硫桥连接的图12b的轻链(Seq.id.no.36)的轻链，如图4A所示。
模拟抗体Fab克隆52包含二硫桥连接的图12b的轻链(Seq.id.no.36)和图12a的重链(Seq.id.no.35)，如图4B所述。
模拟抗体Fab克隆43包含二硫桥连接的图12d的轻链(Seq.id.no.38)和图12c的重链(Seq.id.no.37)，如图4C所示。
下述实施例用于说明本发明且无限制性。温度为摄氏温度。使用下述简写：anti-id      ＝  抗-独特型ABTS         ＝  [2，2′-连氮基-二(3-乙基-苯基噻唑啉)磺酸]BSA          ＝  牛血清白蛋白BSW17        ＝  抗-人IgE鼠单克隆抗体；Cε3特异的CDR          ＝  互补决定区Cε3         ＝  IgE第三个重链恒定区结构域Cε4         ＝  IgE第四个重链恒定区结构域CεE         ＝  模拟BSW17Cε3表位区的模拟表位肽CεM         ＝  模拟BSW17Cε4表位区的模拟表位肽cfu          ＝  集落形成单位ELISA        ＝  酶联免疫吸附试验Fab          ＝  缺乏重链恒定区2和3的抗体片段FcεRI；IgERI＝  IgE高亲和性受体FcεRIα     ＝  IgE高亲和性受体α链FCS          ＝  胎牛血清FR           ＝  构架区FITC         ＝  异硫氰酸荧光素结合的HRP       ＝  辣根过氧化物酶HSA       ＝  人血清白蛋白(h)IgE    ＝  (人)免疫球蛋白EmAb       ＝  单克隆抗体MNC       ＝  单核细胞NIP       ＝  3-硝基-4-羟基碘苯乙酸p.c.      ＝  多克隆Phab      ＝  展示Fab片段的噬菌体(表达Fab的噬菌体)PBS       ＝  磷酸盐缓冲液PCA       ＝  被动皮肤过敏PWM       ＝  美洲商陆有丝分裂原r         ＝  重组RT        ＝  室温SPR       ＝  表面等离子共振(surface plasmon resonance)
实施例1：噬菌体展示文库的构建
a)淋巴细胞的来源
从两个成年男性供体外周血制备单核细胞(NMC)。肌内注射0.5ml铝佐剂吸附的破伤风类毒素(Te Anatoxal Bern，瑞士血清和疫苗研究所，Bern，瑞士)加强免疫具有变态反应临床症状的第一个男性成年特应性供体。七天后用Ficoll(美国威斯康星州Milwaukee，Pharmacia，Lymphoprep)梯度离心分离MNC。然后用含103U/ml白细胞介素2(Sigma，St-Louis，MO，美国)、50μg/ml Pansorbin细胞(Staphylococcus aureusCowan株1，Calbiochem，La Jolla，加州，美国)和用RPMI-1640培养基1∶1000稀释的破伤风类毒素的RPMI-1640(Seromed，瑞士Basel)培养基中培养3天。用苯酚-氯仿异硫氰酸胍步骤从这些细胞中制备总RNA(Chomczynsi，P.和Sacci，N.，Anal.Biochem.162[1987]156)。第二个成年男性供体，一个超免疫的RhD供体，通过静脉注射2ml来源于已知RhD阳性男性供体的压紧红细胞来加强免疫。加强后十八天用Ficoll梯度离心分离MNC。在提取RNA之前，细胞先在含103U/ml白细胞介素2和10μg/ml美洲商陆有丝分裂原(PWM；SigmaL9379，Buchs，瑞士)的RPMI-1640培养基中培养3天。
人扁桃体样品从三例扁桃体摘除儿童获得。扁桃体在无菌培养皿中用RPMI-1640浸软并切成小块。再将组织、细胞和培养基转移到无菌试管中，让组织碎片沉降，用Ficoll梯度离心从上清中分离MNC。用包被CD19的顺磁珠与MNC孵育以选择B细胞，然后按照上述苯酚-氯仿异硫氰酸胍步骤制备RNA。
用于克隆所有模拟抗体链的pComb3载体获自美国加州La Jolla的Scripps研究所(Barbas III，C.F.和Lerner，R.A.，Companion MethodsEnzymol.2[1991]119)。用于转化pComb3载体的大肠杆菌菌株XL1-Blue和辅助噬菌体VCSM13购自Stratacyte(美国加州La Jolla)。
b)噬菌体文库构建
构建了三个独立的文库：第一个称为BS，来自从第一个男性特应性供体分离的MNC；第二个称为LD2，来自从第二个男性供体静脉注射加强18天后获得的MNC；第三个称为CT，来自从儿童扁桃体分离的MNC的B细胞富集亚群。用苯酚-氯仿异硫氰酸胍步骤从这些细胞中提取总RNA。用10μg这种RNA按照供应商(Boehringer Mannheim，德国)的指定条件使用寡聚(dT)引物(400ng)和M-MuLV逆转录酶通过逆转录制备cDNA。PCR扩增按Vogel，M等，欧洲免疫学杂志(E.J.of Immunol).24(1994)1200描述进行。简述为，100μl PCR反应液中含有Perkin-Elmer缓冲液，10mMMgCl2，5μl cDNA，150ng每种合适的5’和3’引物，四种dNTP各200μM和2U/ml Taq聚合酶(美国新泽西州Perkin Elmer)。用一套来自Stratacyte(详见下述)的引物分别PCR扩增Fab分子的重链和轻链。对于重链，使用与六个家族的VH基因分别杂交的六个上游引物。而对于轻链，使用一个κ链和一个λ链引物。下游引物设计为与重链恒定区γ1和γ3的铰链区匹配。对于轻链，下游引物与κ链和λ链恒定区的3’末端匹配。分别合并重链和轻链的PCR产物，凝胶纯化并分别用XhoI/SpeI和SacI/XbaI限制性内切酶(Boehringer Mannheim，德国)酶切。消化之后，PCR产物用苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，凝胶切割纯化。插入XhoI/SpeI消化的Fd片段，然后连接SacI/XbaI消化的轻链到pComb3载体上，转化XL1-Blue细胞和噬菌体产生均按照Barbas III，C.F.和Lerner，R.A.，Companion Methods Enzymol.2[1991]119的描述进行。转化大肠杆菌XL1-Blue细胞后，取样并在平板上滴定以测定文库容量。结果表明BS，LD2和CT表达文库分别为1×107，7.7×106和3×106cfu(集落形成单位)。
c)      PCR引物
VHI     5′-CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3′
                                       (Seq.id.no.9)；
VHII    5′-GTC CTG TCC CAG GTC AAC TTA CTC GAG TCT GG-3′
                                       (Seq.id.no.10)；
VHIII   5′-GTC CAG GTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3′
                                       (Seq.id.no.11)；
VHIV    5′-GTC CTG TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3′
                                       (Seq.id.no.12)；
VHV     5′-GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3′
                                       (Seq.id.no.13)；
VHVI    5′-GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3′
                                       (Seq.id.no.14)；
CHI(γI)5′-AGC ATC ACT AGT ACA AGA TTT GGG CTC-3′
                                       (Seq.id.no.15)；
VL(κ)  5′- GT GCC AGA TGT GAG CTC GTG ATG ACC CAG TCT CCA-3′
                                       (Seq.id.no.16)；
CL(κ)  5′-  T CCT TCT AGA TTA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT
                CTT TGT GAC GGG CGA ACT C-3′
                                       (Seq.id.no.17)；
VL(λ)  5′-  C TGC ACA GGG TCC TGG GCC GAG CTC GTG GTG ACT CA-3′
                                       (Seq.id.no.18)；
CL(λ)  5′-  G CAT TCT AGA CTA TTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC-3′
                                       (Seq.id.no.19).
实施例2：从噬菌体文库中筛选重组BSW17-特异性抗体片段(BSW17-模拟抗体)
通过四轮淘洗进行BSW17特异性噬菌体筛选。每轮中，在抗-IgE mAbBSW17吸附之前，用抗IgE-mAb Le27进行两次预吸附。预吸附按如下进行：两只免疫管(Maxisorp，Nunc)用4ml Le27(20μg/ml)4℃包被过夜，然后在37℃下用4ml PBS/2％脱脂奶封闭2小时。第一只管子用4ml含有2×1012cfu每种噬菌体文库(BS，LD2和CT)的封闭液室温振荡孵育30分钟。噬菌体再转入第二只管子，重复一遍该步骤。第二次预吸附后，非Le27-特异性的噬菌体加入到包被了4ml BSW17(20μg/ml)并用上述PBS/2％脱脂奶封闭的试管中。室温振荡孵育2小时后。连续用PBS/0.1％Tween和PBS洗管子各10遍。连续洗脱粘附的噬菌体：先用500ul 0.1M三乙胺洗，然后PBS洗三遍后，500ul用甘氨酸调pH到2.2的含1mg/ml牛血清白蛋白的0.1M HCl洗脱。每步洗脱室温进行10分钟，洗脱的噬菌体分别用250ul1M Tris.Cl(pH7.4)和30ul 2M Tris碱中和。按Barbas和Lerner，同上(1991)所述用大肠杆菌XL1-Blue细胞扩增筛选的噬菌体，然后用于随后的三轮淘洗。每轮淘洗后，用cfu测定确定洗脱的噬菌体的滴度(见表2)：
                       表2.
          连续几轮淘洗富集BSW17特异性Phabs
           淘洗轮数a)    洗脱的噬菌体数目
                              (cfu)
               1              3×105
               2              2×104
               3              3×105
               4              5×107
a)对于每轮淘洗，将6×1012噬菌体颗粒在包被了20ug/ml Le27的管
中预吸附两次，然后在一个包被了20ug/ml BSW17的管中孵育
实施例3：重组BSW17-模拟抗体的核苷酸序列
用Nucleotrap kit(Machery-Nagel，Duren，德国)从选择的噬菌体克隆制备质粒DNA。并用PRISM Ready Reactin DyeDeoxy Terminator CycleSequencing Kit(Applied Biosystems，德国)试剂盒在ABI 373A测序系统上进行核酸序列测定。
用于重链序列测定的引物是：
CHγ1  (5′-CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3′)(Seq.id.no.20)和
pCH    (5′-GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3′)(Seq.id.no.21).
为得到轻链序列，使用了下述引物：
Cλ    (5′-GAGACACACCAGTGTGGC-3′)(Seq.id.no.22)，
Cκ    (5′-CACAACAGAGGCAGTTCC-3′)(Seq.id.no.23)和
pCL    (5′-CTAAACTAGCTAGTCGCC-3′)(Seq.id.no.24).
引物由Microsynth(Balgach，瑞士)合成。从选出的不同噬菌体克隆的DNA序列，推导出BSW17特异性重组抗体重链和轻链的两个不同氨基酸序列(克隆52，克隆43)。这些序列以及高变区(CDR)和构架区序列的位置见图5a-5d(Seq.id.no.1-8)。
克隆52和克隆43的BSW17-特异性重组抗体片段氨基酸序列与人IgE的比对表明与结合高亲和性受体有关的人Cε3区域有同源性(图6)(Seq.id.no.25-34)。因此，重组抗体显示的抗原互补位模拟了人IgE的确定结构(“模拟抗体”)。因此用这些重组模拟抗体接种过敏反应患者产生的抗体将识别人IgE并通过抑制IgE/IgERI结合防止过敏反应。
实施例4：重组BSW17-模拟抗体的制备和纯化
制备来源于噬菌体克隆43和52(图5)(Seq.id.no.1-8)的可溶性模拟抗体。为生产可溶性Fab片段，去掉编码噬菌体颗粒pIII尾部蛋白的pIII序列，并用六组氨酸的标签代替，以便用Ni2+-螯合亲合层析纯化Fab片段。
用Nucleotrap kit(Machery-Nagel，Duren，德国)制备噬菌粒DNA。并用SpeI和NheI消化。缺乏gIII部分的4.7kb DNA片段用碱性磷酸酶处理，琼脂糖凝胶电泳纯化。将一编码6组氨酸DNA片段分别与线性化DNA的5’和3’端的SpeI和NheI限制性位点连接。DNA连接后，转化到大肠杆菌XL1-Blue细胞中，选择产生可溶性模拟抗体的单个克隆。选其中一个克隆以用于大规模纯化。37℃下在含有50ug/ml羧苄青霉素的1升SB(Super Broth)中培养到600nm的OD为1.0。培养物再用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Biofinex，Praroman，瑞士)37℃诱导4小时。细菌于4℃6000rpm离心20分钟，重悬于30ml超声缓冲液(0.1MNaPO4，8M尿素，pH8.0)。然后在冰上超声。4℃15000rpm离心30分钟去除不可溶成分，含Fab的上清在1ml镍-氮川乙酸盐(nickel-nitriloacetate)柱上纯化。柱子用超声缓冲液洗去污染物，然后分别用pH5.1和pH4.9超声缓冲液进行两步洗脱。组分监测用OD280nm，并用SDS-PAGE(12％非还原)分析小样以证实模拟抗体的纯度和特征性。然后合并含模拟抗体的组分，浓缩并用PBS透析。
通过SDS-PAGE测定样品来评估最终模拟抗体制备物的纯度(具体如图4和12所示)(Seq.id.no.35，36，37，38)。考马斯亮蓝染色检测蛋白带。通过比较考马斯亮蓝染色的模拟蛋白带和已知含量的标准蛋白(BSA)或通过光密度检测来定量蛋白浓度。然后这些模拟抗体制备物用于竞争性结合试验和免疫兔子。
实施例5：用重组BSW17-模拟抗体抑制BSW17介导的受体结合IgE的取代
BSW17识别并取代结合到其高亲和性受体上的IgE。为确定抗独特型BSW17 rFab片段能抑制该取代反应，用结合到细胞表面暴露的IgERI的IgE进行竞争性结合试验。稳定转染了编码人IgERIα链的DNA的重组中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)被用于该试验[CHOα细胞系；Blan k，U等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biol.Chem.)266(1991)2639]。一系列含5×104CHOα细胞的测试样品在含48ng IgE B11杂交瘤(Zurcher，A.W.等，Immunol.Lett.46(1995)49-57)的FACS缓冲液(PBS，0.3％BSA，0.02％NaN3)里室温孵育15分钟。用FACS缓冲液洗一遍后，样品在室温下与异硫氰酸荧光素结合的BSW17(BSW17-FITC)和递增量抗独特型BSW17rFabs的预制复合物共同孵育15分钟。该复合物制备如下：用不同量的抗独特型BSW17rFabs(40nM；200nM；1uM；4uM；40uM)和浓度为1.3nM的50ulBSW17-FITC室温孵育30分钟。只含CHOα细胞的对照样品与BSW17-FITC在室温孵育30分钟以确定非特异性结合。将CHOα细胞用FACS缓冲液洗一次。加入100ul FACS缓冲液后，用配有氩激光(调到488nm)的FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。前散射/侧散射的“门控”放在单细胞附近定量荧光并表述为平均通道荧光(mcf)。阳性细胞百分比计算为结合到CHOα细胞的BSW17百分比。如图7所示，随着抗独特型BSW17rFabs抗体片段浓度的增加，结合到CHOα细胞的BSW17减少。表明两个抗独特型BSW17rFabs能抑制BSW17结合到IgE。
实施例6：用重组BSW17模拟抗体免疫兔子
本实施例描述了用抗-BSW17rFab(如图4B、图12a和12b所示由克隆52的重链和轻链组成)(Seq.id.no.35和36)或仅由轻链组成的重组模拟抗体(图4A和图12b)(Seq.id.no.36)进行免疫，在兔子中诱生了与人IgE有交叉反应的体液免疫应答。两只雌性新英格兰白兔皮下注射300ug/ml用弗氏完全佐剂1∶1乳化的抗BSW17rFab或克隆52的轻链片段进行初次免疫。然后用弗氏不完全佐剂1∶1乳化的同样量模拟抗体加强三次，每两周一次。0天时(预取血)收集血清，最后一次注射7天后放血。
用化学交联到Sepharose 4B柱上的人IgE(SUS-11IgE)免疫亲和层析以纯化兔免疫血清。通过这种方法可以从总的免疫球蛋白中分离抗hIgE组分，使得能够就抗体滴度和亲和力准确评价治疗上相关免疫反应。
免疫亲和纯化与人IgE有交叉反应的抗-模拟抗体的抗体由两个步骤组成。第一步，用硫酸铵沉淀从兔抗血清分离IgG组分；第二步，hIgE-特异性的抗BSW17模拟抗体的抗体结合到人IgE(SUS-11 IgE)上，与CH-Sepharose 4B共价偶联的，然后洗脱、透析和浓缩。
ELISA证实了免疫亲和纯化的免疫球蛋白与人IgE在溶液中形成浓度依赖的复合物：SUS-11 IgE与等摩尔量的抗-模拟抗体免疫球蛋白在4℃孵育过夜。溶液中形成的复合物被加到包被有作为捕获抗体的抗-IgE抗体LE27的微量滴定板孔中。用多克隆抗-兔IgG-HRP检测结合的抗-模拟抗体IgG。结果见图8。
实施例7：用重组BSW17模拟抗体免疫小鼠
克隆43和克隆52来源的重组模拟抗体能诱生抗-模拟抗体的抗体。在小鼠中进行免疫。五只Balb/c小鼠一组，每只小鼠皮下注射5ug在大肠杆菌中生产的并用镍亲合层析纯化的重组BSW17模拟抗体。氢氧化铝用作佐剂：
第一组用SDS426批次免疫＝抗独特型-BSW17.52；轻链。
第二组用SDS427批次免疫＝抗独特型BSW17.52；Fab。
第三组用SDS463批次免疫＝抗独特型BSW17.43；Fab。
初次免疫后第21和41天，加强注射两次(每只鼠5ug)。初次接种后第0，20，28，35，42，49和56天取血样。制备血清并用ELISA检测抗-模拟抗体的抗体的存在。
用1ug/ml多克隆人IgG包被微量滴定板孔。并与初次免疫后在指定时间点所取血样制备的1∶50稀释的小鼠血清孵育。用辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠IgG(gamIgG-HRP)检测结合的抗-模拟抗体的抗体(ahIgG，抗人构架区和恒定区)。用ABTS生色底物显色。
所有重组模拟抗体制备物第二次加强免疫后，所有小鼠均产生了抗模拟抗体的抗体(图9)。
实施例8：兔体内产生的抗重组BSW17模拟抗体的免疫球蛋白对人IgE的高亲和性的结合
接种重组BSW17模拟抗体诱发对人IgE具有高亲和性的体液免疫应答。表示免疫亲和纯化的抗模拟抗体的免疫球蛋白与人IgE结合的的动力学参数用表面等离子共振(SPR)来分析。
SPR检测在BIAcore仪器(Biacore，Uppsala，瑞士)上进行。根据厂商指导，用氨偶联将人IgE或鼠IgG3偶联到CM5传感芯片上，从而制备特异性结合表面。通过这种程序，生物分子通过伯氨基基团连接到传感芯片的羧甲基化葡聚糖表面上。10pmol人骨髓瘤IgE或SUS-11 IgE被偶联到芯片独立流动池中。鼠IgG3mAb ABL364(ATCC HB 9324)固定到相同传感片的独立通道上。ABL364用作参考以确定抗模拟抗体与非hIgE免疫球蛋白结构的结合，并用来校正由缓冲液改变而引起的可能的折射率改变。偶联密度大约为13000RU。
所有用BioCore仪器测量的生物分子相互作用在25℃进行，用HBS(10mM Hepes，pH＝7.4，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％v/v表面活性剂P-20)作为连续流动缓冲液。用于动力学分析的流经传感芯片表面的分析物的浓度范围从33nM到499nM。流速是5ul/min。分析物进样1200秒，随后HBS进样大约1800秒以监测结合的分析物的解离。用10mM HCl处理120秒对芯片进行再生。通过将分析物流经ABL364对照通道来监测非特异性结合，并在动力学分析之前从特异性结合中减去。
SPR测定产生的结合曲线用BIAevaluation 3.0分析软件包分析。用单相模型相对比较抗模拟抗体/IgE的相互作用。分析每条曲线的结合常数Ka、解离常数Kd和平衡解离常数KD＝1/KA(KA＝亲和力常数)，总结见表3。
表3
多克隆(p.c.)兔抗模拟抗体Ig制备物和hIgE之间相互作用的动力学常数(SPR/BIAcore)
                                 骨髓瘤IgE          SUS-11 IgE
                      Ka(1/Ms)   未测定           0.8±0.3×104BSW17                     Kd(1/s)    未测定           4.2±0.9×10-6
                      KD(nM)     未测定           0.53±0.33抗(抗独特型-BSW17.52；    Ka(1/Ms)   2.1±0.8×104   2.2±0.9×104
轻链)1)              Kd(1/s)    2.8±0.5×10-4  2.3±0.2×10-4
(SDS410)              KD(nM)     13.3±6.8        10.7±3.3抗(抗独特型-BSW17.52；    Ka(1/Ms)   4.6±2.7×104   2.5±1.0×104
Fab)2)               Kd(1/s)    2.3±0.3×10-4  1.5±0.1×10-4
(SDS411)              KD(nM)     5.0±2.2         6.0±1.8抗(抗独特型-BSW17.43；    Ka(1/Ms)   未测定           2.2±0.4×104
Fab)3)               Kd(1/s)    未测定           1.6±0.1×10-5
(SDS476)              KD(nM)     未测定           0.75±0.02
                   1)即抗-SDS426
                   2)即抗-SDS427
                   3)即抗-SDS463
上述结果表明用重组BSW17模拟抗体免疫兔子可以诱生抗人IgE的高亲和性抗体(KD值在纳摩尔范围)。克隆43来源的Fab(SDS463；图4C；抗独特型-BSW17.43)具有诱生对人IgE有很高亲和性的免疫应答的能力(KD＜1nM)。
这样通过使用单克隆抗独特型抗体可能诱生人类疫苗接种策略所期望的抗IgE的强烈多克隆应答。
实施例9：抗重组BSW17-模拟抗体的兔子免疫球蛋白抑制人IgE与其高亲和性受体的结合
作为有活性的抗过敏反应疫苗，抗模拟抗体和hIgE形成复合物将预期阻止IgE与其高亲和性受体结合。与BSW17模拟抗体CDR的氨基酸序列同源的Val(370)-Asn(383)序列中的Cε3表位区域Val(370)-Gly(379)(图6)(Seq.id.no.25)涉及与高亲和性受体的结合。因此，预期抗重组BSW17模拟抗体的IgE特异性抗体通过封闭结合域抑制IgE与其高亲和性受体结合而发挥治疗作用。为证实这一点，通过竞争性ELISA测试从免疫兔子获得的纯化抗-模拟抗体的抗体对hIgE/FcεRIα结合的抑制。作为疾病相关读数，检测游离IgE与重组FcεRIα(RIα-HSA-RIα双融合蛋白；DFP)的结合能力(图10)。
hIgE(SUS-11；图10A 1ug/ml和图10B 0.1ug/ml)与递增量的抗模拟抗体免疫球蛋白或mAb BSW17(作为参考)在+4℃预孵育16小时。SDS410制备时免疫亲和柱上流通的大量免疫球蛋白作为阴性对照。形成的复合物被加到包被了1ug/ml抗IgE抗体Le27作为捕获抗体的微量滴定板上，用辣根过氧化物酶标记的FcεRIα-HSA-FcεRIα双融合蛋白(DFP)在37℃孵育1小时。用生色底物检测结合的DFP。O.D.值表述为％结合。与无竞争物的SUS-11 IgE的结合被设为100％。显示的是平行两次所测值的平均数。变异通常低于2％。
结果表明用BSW17模拟抗体免疫啮齿动物导致产生特异性的高亲和性抗-hIgE抗体。在体外，这些抗-模拟抗体的抗体抑制IgE与其高亲和性受体结合，表明了BSW17-模拟抗体接种策略对抗过敏反应疫苗研制的价值。
实施例10：通过重组BSW17模拟抗体接种恒河猴抑制被动皮肤过敏反应
抑制猴被动皮肤过敏反应(PCA)可被用来检测体内此化合物的抗过敏反应活性。
模拟抗体接种导致在恒河猴抑制皮肤过敏反应。每组两只猴子皮下注射500ug/只动物的重组抗BSW17模拟抗体。初次免疫后，给予两次加强注射。每次加强后大约10天，进行PCA试验。最后一次加强三个月后，猴VI91、VI92、VI93和VI95再次检测PCA反应。免疫方案总结于下表1。
                                  表1
猴 免疫原  加强免疫(天数)     PCA(天数)
VI 91 抗独特型BSW17.52；轻链(SDS426)(图4A) 0，21，54，92  0，30，61，105，203
VI 92 抗独特型BSW17.52；轻链(SDS426)(图4A) 0，21，54，92  0，30，61，105，203
VI 93 抗独特型BSW17.52；Fab(SDS427)(图4B) 0，21，54，92  0，30，61，105，203
VI 95 抗独特型BSW17.52；Fab(SDS427)(图4B) 0，21，54，92  0，30，61，105，203
VI 2 抗独特型BSW17.43；Fab(SDS463)(图4C) 0，21，54，112  0，33，64，123
VI 75 抗独特型BSW17.43；Fab(SDS463)(图4C) 0，21，54，112  0，33，64，123
用小剂量盐酸酮胺(10-15mg/kg，i.m.)(Ketalar，Parke Davis，GB)预处理恒河猴使其麻醉，腹部皮内注射不同剂量的IgE(JW8)(英国牛津Serotec)。IgE(JW8)为半抗原NIP特异的鼠抗原结合部分和人Fcε重链的嵌合抗体。体积100ul递增剂量(0，2，10，50，250ng/ml生理盐水)的IgE(JW8)用30号针头以头尾序列(cephalocaudal series)注射。两小时后，每只动物静脉内注射25mg BSA偶联的NIP。NIP-BSA偶联物静脉攻击后再次麻醉动物。为观察皮肤反应，抗原攻击后马上静脉内注射伊文氏蓝(Evans blue)染料(1％，0.5ml/kg)。抗原注射20分钟后通过测量蓝点的两个直径并计算平均值(用毫米来表示)来检测皮肤反应。
在初次免疫和加强免疫后指定时间点检测PCA反应。用通过蓝皮肤区直径对注射的IgE(JW8)浓度作图产生的曲线下的面积(AUC)来计算PCA强度。表4所示每个猴子的PCA分值表示计算出的AUC值。
表4
BSW17模拟抗体接种对恒河猴被动皮肤过敏的作用
                                  A
                                        PCA分值
免疫后天数 免疫原：抗独特型BSW17.52；轻链(SDS426)(图4A) 免疫原：抗独特型BSW17.52；Fab(SDS427)(图4B)
    猴VI91     猴VI92     猴VI93     猴VI95
 0     11.61)(100)2)     10.6(100)     15.8(100)     15.6(100)
 30     10.5(91)     10.5(99)     15.4(97)     16.8(108)
 61     10.1(87)     1.8(17)     21.4(139)     16.5(106)
 105     4.6(40)     2.1(20)     5.6(35)     7.0(45)
 203     9.8(84)     6.3(59)     12.6(80)     11.2(72)
                        B
PCA
免疫后天数 免疫原：抗独特型BSW17.43；Fab(SDS463)(图4C)
    猴VI2     猴VI75
    0     15.81)(100)2)     15.8(100)
    33     16.5(104)     18.9(120)
    64     9.8(62)     13.0(82)
    124     16.8(106)     18.9(120)
1)PCA分值，按上述(77)通过蓝皮肤区直径对注射的IgE(JW8)浓度作图产生的曲线下的面积(AUC)计算。
2)相对于免疫前数值的PCA强度。0天PCA＝100％
用各自的免疫前PCA分值(0天值)作为对照，所有猴子对BSW17模拟抗体接种都有应答，PCA强度降低。克隆52的轻链结构(SDS426)(图4A)结果最好，抑制率为60-83％(PCA分值40和17)。克隆52 Fab(SDS427批次)(图4B)接种的猴子抑制PCA达55-65％(PCA分值45和35)。克隆43Fab(SDS463批次)(图4C)观察到略微低的PCA抑制率18-38％(PCA分值82和62)，尽管其在BSW17结合和在兔中诱导高亲和性抗hIgE方面比克隆52模拟抗体要好。
按照该免疫程序，用克隆52模拟抗体接种在第三次加强注射后(除了猴VI92)有效，3个多月后仍观察到部分PCA抑制。相反，克隆43Fab在第二次加强注射后就有效，而第三次模拟抗体攻击无作用。
图11说明了从表4单个猴子的值计算出的用同一模拟抗体制备物接种的每组两只猴子的平均PCA分值图。
接种猴的阳性PCA结果(相对于各自处理前分值或未处理对照动物)清楚地显示了模拟抗体接种的有效性，并证实了这种机理概念的正确性。用重组BSW17模拟抗体接种恒河猴导致产生体内抑制PCA的高亲和性抗人IgE抗体。

Claims (10)

1.干扰IgE的Cε3区与IgE高亲和性受体结合的抗体的抗独特型抗体或抗体片段(模拟抗体)。
2.根据权利要求1的模拟抗体，其是针对抗体BSW17的抗独特型重组单克隆抗体片段。
3.根据权利要求1的模拟抗体，其包含或由图4(Seq.id.no.35、36、37和38)的轻链二聚体或两种Fab片段之一组成，其中恒定区也包括小的立体修饰，如同种异型变异体中发现的小立体修饰。
4.根据权利要求1的模拟抗体，其包含或由图5a、5b、5c和5d(Seq.id.no.2、4、6和8)的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1的模拟抗体，其包含或由图5a(Seq.id.no.2和Seq.id.no.40、42及44)、图5b(Seq.id.no.4和Seq.id.no.46、48及50)、图5c(Seq.id.no.6和Seq.id.no.52、54及56)或图5d(Seq.id.no.8和Seq.id.no.58、60及62)的至少一个，优选两个，更优选三个CDR，以及任选的CDR一个或两个末端不超过约10个氨基酸的邻近构架序列组成。
6.根据权利要求1的模拟抗体，其包含或由至少一个图6定义的与人IgE Cε3结构域同源的克隆52和克隆43的序列(Seq.id.no.26、28、30、32和34)组成。
7.药物组合物，如疫苗，其包含或由根据权利要求1-6之任意一项的单一分子实体形式或化学偶联到免疫原性载体分子上的蛋白质结合物形式的模拟抗体组成，适当地，与佐剂和其它常规赋形剂一起使用。
8.根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体，用作药物，特别是用于治疗IgE介导的疾病，如变态反应，特别是哮喘、特应性皮炎、鼻炎、慢性荨麻疹和食物过敏，或根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体在制备治疗IgE介导的疾病的药物，特别是疫苗，中的用途。
9.通过特别是疫苗接种，治疗IgE介导的疾病的方法，包括给需要这种治疗或疫苗接种的患者施用有效治疗剂量的根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体。
10.根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体在通过被动免疫诱生抗此模拟抗体的多克隆或单克隆抗体中的用途；抗根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体的单克隆或多克隆抗体的制备，方法是通过给适当的非人动物施用根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体并分离和纯化产生的抗此模拟抗体的抗体，或通过常规的杂交瘤技术；以无论何种方式从根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体获得的多克隆或单克隆抗体在通过被动免疫治疗IgE介导的疾病中的用途；或如BSW17等干扰IgE的Cε3区与IgE高亲和性受体结合的抗体在鉴定根据权利要求1-6之任意一项的模拟抗体中的用途。
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