DE60038608T2

DE60038608T2 - Anti-idiotypische antikörper gegen antikörper, welche die bindung zwischen immunoglobulin e und seinem hochaffinitätsrezeptor hemmen

Info

Publication number: DE60038608T2
Application number: DE60038608T
Authority: DE
Inventors: Franz Kricek; Beda Stadler; Monique Vogel
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: HK1044544A1; EP1169353B1; CN1346372A; ZA200107906B; PE20010046A1; PT1169353E; PL350676A1; DE60038608D1; CA2363991A1; IL145507A; AU3966000A; CN1268644C; AR029624A1; WO2000063252A1; NO20014936D0; NO20014936L; KR20020007366A; CO5241329A1; US7041288B2; KR100492202B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf antiidiotypische Antikörper. Sie ist gerichtet auf die Inhibition von Interaktionen, die normal das Triggern von Mastzellen und Basophilen verursachen würden, was eingeleitet wird durch Zell-gebundenes Immunglobulin E (IgE), das an ein Allergen gebunden ist, wodurch sich die Freisetzung von Histamin und anderen Mediatoren und auch die de novo Synthese von Cytokinen ergibt, die bei der Regulation allergischer und inflammatorischer Reaktionen involviert sind. Sie betrifft antiidiotypische Antikörper und Antikörperfragmente, die mit der Bindung der Cε3 Region von IgE an den hoch affinen Rezeptor IgE interferieren.
Eine Kenntnis spezifischer Bindungsstellen an IgE, das mit seinem hoch affinen Rezeptor (FcεRI) interagiert, eröffnet eine Basis für die Generation von Antikörpern, die dessen Interaktion durch Erkennung der Bindeepitopen verhindert. Eine Induktion solcher Antikörper durch eine Vakzination führt zu einer neuen und allgemein anwendbaren Therapie für eine Allergie. Die vorliegende Erfindung beschreibt nun die Identifikation und Produktion von besonders rekombinanten Antikörperfragmenten, die in ein Vakzin formuliert werden können, zur Generation von anti-IgE Antikörpern, die vor einer Induktion allergischer Reaktionen schützen, welche durch IgE mediiert werden.
Allergische Symptome werden induziert durch die Freisetzung von vasoaktiven Aminen (Mediatoren), insbesondere Histamin, aus Zellen in die umgebenden Gewebestrukturen und Vaskularstrukturen. Histamin wird normal in speziellen Zellen gelagert, die als Mastzellen und basophile Granulozyten bekannt sind. Die Mastzellen werden durch das gesamte tierische Gewebe dispergiert, während die Basilophile innerhalb des Vaskularsystems zirkulieren. Diese Zellen synthetisieren und lagern Histamin innerhalb der Zellen, sofern es nicht zu einer speziellen Sequenz an Ereignissen kommt, die dessen Freisetzung triggern.
Die Rolle von IgE Antikörpern bei der Mediation allergischer Reaktionen ist gut bekannt. IgE ist ein komplexes Arrangement von Polypeptidketten, die wie bei anderen Immunglobulinen aus zwei leichten und zwei schweren Ketten bestehen, welche in einer Y-förmigen Konfiguration über Disulfidbindungen verbunden sind. Jede leichte Kette hat zwei Domainen, nämlich eine variable Domain (V_L), die an eine Domain mit einer relativ invarianten Aminosäuresequenz gebunden ist, welche als eine konstante Domain (C_L) bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu haben schwere Ketten eine variable Domain (V_H) und im Fall von IgE vier konstante Domainen (C_H1, C_H2, C_H3, C_H4, die auch als Cε1, Cε2, Cε3, Cε4 bekannt sind). Die beiden Arme des Antikörpers sind verantwortlich für eine Antigenbindung, haben Regionen, wo die Polypeptidstruktur variiert, und sind terminierte Fab' Fragmente oder F(ab')₂, die zwei Fab' Arme repräsentieren, welche über Disulfidbindungen miteinander verknüpft sind. Der Schwanz oder die zentrale Achse des Antikörpers enthält eine fixierte oder konstante Sequenz von Peptiden und wird als das Fc Fragment bezeichnet. Das Fc Fragment enthält interaktive Stellen, die den Antikörper zu einer Kommunikation mit anderen Molekülen oder Zellen des Immunsystems durch Bindung an ihre Fc Rezeptoren befähigen. Fc Rezeptoren sind Moleküle, die spezifisch an aktive Molekülstellen innerhalb der Regionen von Immunglobulin Fc binden. Fc Rezeptoren können als integrale Membranproteine innerhalb der äußeren Plasmamembran der Zellen existieren oder können als freie lösliche Moleküle existieren, die im Blutplasma oder in sonstigen Körperflüssigkeiten frei zirkulieren. Beim humanen System wird eine hoch affine Bindung von IgE an FcεRI erreicht durch ein komplexes Protein, nämlich durch eine Proteininteraktion, bei der verschiedene Teile der dritten schweren Kette der konstanten Regionsdomain (Cε3) von IgE und der Membran involviert sind, die sich proximal zur Immunglobulin-artigen Domain (α2) an der Subeinheit FcεRIα befindet. Es sind bereits Reste innerhalb der Cε3 Domain von Fcε und Regionen, die zur α2 Domain von FcεRIα gehören, identifiziert worden, die für eine Bindung wichtig sind, wobei aber bisher keine detaillierten Mechanismen über den Bindeprozess charakterisiert worden sind. Eine experimentelle Evidenz hat gezeigt, dass humanes IgE eine gekrümmte Struktur annimmt, von der über einen ein Beitrag zur hohen Affinität von IgE für FcεRI (Kd ≅ 10^–10 M) spekuliert wird. Ferner wird von dieser gebogenen Struktur auch postuliert, dass sie für den equimolaren Komplex zwischen IgE und zellgebundenem oder löslichem FcεRIα verantwortlich ist, obgleich das IgE Molekül für identische Epitope an den beiden Cε3 Domainen für eine Rezeptorbindung sorgen sollte. Diese Monovalenz ist eine funktionale Notwendigkeit, wenn eine Rezeptortriggerung in Abwesenheit eines Allergens vermieden werden soll.
Interaktive Stellen können in Abhängigkeit von ihrer Funktion leicht freigesetzt werden und daher zu einer Bindung an zellulare Rezeptoren fähig sein. Alternativ können sie solange verborgen sein, bis der Antikörper an das Antigen bindet, worauf der Antikörper seine Struktur ändern und dann andere aktive Stellen freisetzen kann, die dann eine spezifische Immunaktivität triggern können. Als eine Erklärung für die 1:1 Stöchiometrie des Komplexes von Fcε zu FcεRI an der Zelloberfläche ist auch bereits eine konformationale Umlagerung vorgeschlagen worden, die Cε3 nach einer Rezeptorbindung affektiert.
Die allergische (immunologische) Freisetzung von Mediatoren innerhalb des Organismus der Mastzellen und der Basophilen kann nur unter den folgenden Umständen auftreten: Ein IgE Molekül muss anloggen oder sich selbst mit seinem Fc Teil an die zellulare Fc Rezeptorstelle befestigen, um so das IgE Molekül an der Mastzelle oder dem Basophil zu sichern, und die Fab' Teile der zellgebundenen IgE Moleküle müssen durch ein besonderes kompatibles Antigen (das Allergen) verknüpft sein. Sollte es zu einer Interaktion kommen, dann wird die Mastzelle oder das Basophil automatisch getriggert unter Freisetzung von Histamin an die lokale Umgebung, was familiäre allergische Symptome manifestiert (1). Andere biochemische Events folgen in einer Spätphasenreaktion und führen zu einer de novo Synthese und Freisetzung von Cytokinen und anderen Mediatoren.
Bei herkömmlichen Annäherungen an eine Allergiebehandlung waren involviert mit einer systemischen Therapie mit Antihistaminen und mit Versuchen zur Desensibilisierung von Patienten, wobei die Versuche aber nicht selbst auf die grundlegende Interaktion zwischen IgE Mastzellen und Basophilen gerichtet waren. Eine weitere Annäherung war direkt auf die Produktion von Polypeptidketten gerichtet, die befähigt sind zu einer Blockierung der Bindung des IgE Antikörpers an die Fc Rezeptoren an den Zelloberflächen und einer Verlagerung von IgE aus den Bindestellen, an die IgE bereits gebunden ist, und beschäftigen sich mit der Art einer putativen Effektorstelle innerhalb der IgE Fc Region, von der spekuliert wurde, dass sie für ein immunologisches Signal sorgen würde, das eine Triggerung von Mastzellen und Basophilen für eine Freisetzung von Histamin ergibt.
Es wurde auch bereits die Anwendung rekombinanter IgE Fragmente als Immunogene zur Generation eines schützenden anti-IgE Vakzins ausprobiert, was sich als erfolgreich gezeigt hat. Der Haupteinwand gegen ein solches Vakzin resultiert von der Möglichkeit, dass die Anwendung großer IgE Fragmente zur Immunisation nicht nur zur Initiation der Produktion von Inhibitorantikörpern führen könnte, sondern auch zur Generation einer Vernetzung und hierdurch von anaphylactogenen Antikörpern bei den Patienten.
Eine Strategie zur Überwindung dieses Problems würde abzielen auf die Identifikation des kleinstmöglichen IgE Fragments, das ideal nur aus der Rezeptorbindestelle bestehen würde, die sich nach einer Bindung innerhalb des IgE/IgERI Komplexes befinden würde, so dass sie nicht mehr für eine Vernetzung durch die vom Vakzin erzeugte Immunantwort zugänglich wäre. Entsprechende Bemühungen werden noch immer durchgeführt, doch ist von dieser Strategie kein Erfolg zu erwarten im Hinblick auf die räumlichen Entfernungen der bei der Interaktion zwischen IgE und IgERI involvierten verschiedenen Cε3 Regionen.
Die mit dem klassischen Vakzinversuch intrinsisch verknüpften Probleme lassen sich nun durch Anwendung kurzer mimotoper Peptide für eine aktive Immunisation verwenden, bei denen es sich entweder um chemisch synthetisierte Peptide handelt, die an geeignete Träger gekuppelt sind, oder um rekombinante Fusionskonstrukte mit beispielsweise Ovalbumin oder IgG. Solche Peptide sind strukturle Mimiken des Epitops, das durch den monoklonalen Antikörper BSW17 erkannt wird, der ein konformationales Epitop am Fcε mit einem Teil davon erkennt, der im Cε3 beheimatet ist, und mit einem Teil, der im Cε4 residiert. Die das BSW17 produzierende Hybridomazelllinie ist seit dem 19. Dezember 1996 bei der ECACC unter den Vorschriften des Vertrages von Budapest über die Hinterlegung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer 96121916 hinterlegt. Dieser Antikörper entwickelt ein interessantes Profil biologischer Aktivitäten, wie sie in der 2 zusammengefasst sind. Er ist selbst nicht anaphylactogen und schützt humane Mastzellen und Basophile vor einer von IgE abhängigen Histaminfreisetzung, die durch Triggermittel induziert wird. BSW17 oder BSW17-artige Antikörper, die innerhalb des Vaskularsystems zirkulieren, schützen vor allergischen Reaktionen durch a) eine Inhibition der Triggerung von Mastzellen und Basophilen durch eine kompetitive Inhibition der Interaktion zwischen IgE und IgERI und durch b) eine Erniedrigung der Serum IgE Spiegel durch eine Herabregulation der Synthese von IgE auf die Höhe der B-Zelle. Als strukturelle Mimika eines anti-IgE Antikörperepitops induzieren chemisch synthetisierte BSW17 mimotope Peptide eine Immunantwort, die beim Wirt zur Produktion von BSW17-artigen Antikörpern führt. BSW17 hat sich als nicht anaphylactogen und als Inhibitor für eine Bindung zwischen IgE und IgERI und für eine Synthese von IgE an B-Zellen erwiesen, so dass diese Antikörper, die gegen das mimotope Peptid BSW17 gerichtet sind, auf einem Vakzin mit ähnlichen Schutzeigenschaften beruhen. Ein möglicher Nachteil eines solchen BSW17 mimotopen Peptids, das auf einem Vakzin basiert, kann von der Notwendigkeit einer Kupplung der chemisch synthetisierten Peptide an Trägerproteine unter Erhöhung der Immunogenizität der Peptide herrühren. Die strukturelle Flexibilität befähigt kurze Peptide auch zu einer Adoption vieler unterschiedlicher sterischer Konformationen. Somit ist nur eine Fraktion der polyklonalen antimimotopen Immunantwort therapeutisch wirksam durch eine Kreuzreaktion mit humanem IgE.
Die vorliegende Erfindung vermeidet die möglichen Nachteile, die Versuchen mit einem mimotopen Peptid innewohnen. Dieser basiert auf Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die antiidiotypisch sind für Antikörper, die interferieren mit der Bindung von IgE an seinen hoch affinen Rezeptor, besonders an einen rekombinanten antiidiotypischen Antikörper für BSW17. Der Netzwerktheorie von Jerne entsprechend, wozu hingewiesen wird auf N. Jerne, Ann. Immunol. 125C, (1974), Seite 373, können hypervariable Regionen eines Antikörpers (Ab1) selbst als Antigene wirken. Die auf diese Weise produzierten Antikörper sind bekannt als antiidiotypische (anti-id) Antikörper (Ab2), da sie an die idiotypische Region des ersten Antikörpers binden, wozu auf 3 verwiesen wird. Solche anti-id Antikörper sind auf die Bindestelle (Paratop) des ersten Antikörpers (Ab1) gerichtet und repräsentieren somit ein internes Abbild des ursprünglichen Antigens. Infolgedessen sind die anti-id Antikörper (Ab2), die als interne Abbildanti körper oder Ab2β bezeichnet werden, auch befähigt zur Hervorrufung einer Antikörperbildung über ihre hypervariablen Regionen. Diese anti-anti-id Antikörper (Ab3) mimen strukturell das Paratop von Ab1 und haben daher ähnliche biologische Eigenschaften wie der Ab1 Antikörper. Im Fall des Systems hIgE/BSW17 repräsentiert IgE das ursprüngliche Antigen und BSW17 den Antikörper Abt. Das Paratop eines idiotypischen anti-BSW17 Antikörpers Ab2 repräsentiert daher eine strukturelle Mimik der hIgE Region (das Epitop), die von BSW17 erkannt wird. Das Ab2 Paratop ist strukturell äquivalent zu den oben erwähnten chemisch synthetisierten BSW17 Mimotoppeptiden. Wird ein solcher (rekombinanter) anti-BSW17 idiotypischer Antikörper als ein Vakzin verwendet, dann wird beim vakzinierten Patienten eine BSW17 ähnliche Immunantwort (Ab3) induziert. Wie BSW17 interferieren diese (polyklonalen) Ab3 Immunglobuline auch mit der Bindung zwischen IgE und seinem hoch affinen Rezeptor und wirken daher als antiallergische Mittel. Im Gegensatz zu flexiblen synthetischen mimotopen Peptiden präsentiert sich das paratopische Ab2 der Umgebung als eine strukturell definierte Konformation. Die gegen das definierte hIgE Epitop gerichtete Immunreaktion ist daher spezifischer. Darüber hinaus ist kein heterologes immunogenes Trägerprotein notwendig. Infolgedessen werden mögliche Nebeneffekte vermieden, die durch ein Trägerprotein, wie Tetanustoxoid oder Diphterietoxoid, verursacht werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst nun Antikörper oder Antikörperfragmente, die antiidiotypisch zum Antikörper BSW17 sind, der interferiert mit der Bindung der Cε3 Region von IgE an den hoch affinen Rezeptor für IgE entsprechend den Ansprüchen 1 und 2. Sie werden im Folgenden kurz als die erfindungsgemäßen Mimokörper oder als BSW17 Mimokörper bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Mimokörper sind somit antiidiotypische Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch an ein Epitop binden, das das Paratop eines anti-IgE Antikörpers ist, welches die Stelle an der Cε3 Region des IgE Moleküls erkennt, die an den hoch affinen Rezeptor für IgE (FcεRI) bindet.
Die erfindungsgemäßen Mimokörper sind im Prinzip humanen Ursprungs, sofern sie zur Verwendung bei Menschen in Betracht gezogen werden. Sie sind rekombinante monoklonale Antikörper oder Antikörperfragmente.
Die erfindungsgemäßen Mimokörper repräsentieren isolierte und im Wesentlichen reine Antikörper oder Antikörperfragmente, die von natürlich vorkommenden anti-id Antikörpern oder IgE Antikörpern abgeleitet sind. Sie sind vor allem im Wesentlichen frei von anderen Antikörpern. Unter im Wesentlichen frei wird eine Reinheit von wenigstens etwa 60 Gew.-%, vorzugsweise etwa 90 Gew.-% und bevorzugter etwa 99 Gew.-% oder mehr verstanden.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, insbesondere Vakzine, die die erfindungsgemäßen Mimokörper umfassen, entweder als eine einzelne molekulare Einheit oder als ein Proteinkonjugat, das chemisch an ein immunogenes Trägermolekül gekuppelt ist, falls zweckdienlich zusammen mit einem Adjuvans oder weiteren herkömmlichen Hilfsstoffen.
Zur Erfindung gehören auch die erfindungsgemäßen Antikörper für eine Verwendung als ein Pharmazeutikum, besonders als ein Vakzin, und insbesondere für die Behandlung von durch IgE mediierten Krankheiten.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Antikörpern, die mit der Bindung der Cε3 Region von IgE an den hoch affinen Rezeptor für IgE, wie BSW17, interferieren, zur Identifikation von erfindungsgemäßen Mimokörpern unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, wie einer Phagenabbildtechnologie.
Weiter bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Mimokörper zur Herstellung eines Arzneimittels gegen durch IgE mediierte Krankheiten, insbesondere ein Vakzin.
Weiter bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Mimokörper zur Erzeugung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper hiergegen für eine passive Immunisation, die Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper gegen erfindungsgemäße Mimokörper für eine passive Immunisation entweder durch Verabreichung erfindungsgemäßer Mimokörper an ein nicht-humanes geeignetes Tier und durch Isolation und Reinigung der hiergegen generierten Antikörper, oder durch herkömmliche Hybridomatechnologie, und auf die Verwendung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, sofern diese aus erfindungsgemäßen Mimokörpern erhalten worden sind, für die Behandlung von durch IgE mediierten Krankheiten durch eine passive Immunisation.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation der erfindungsgemäßen Antikörper, umfassend eine

– Identifikation natürlich vorkommender antiidiotypischer anti-IgE Antikörper,
– Isolation von Fragmenten hiervon, und
– Selektion von rekombinanten Fragmenten hiervon durch Bindung an einen geeigneten anti-IgE monoklonalen Antikörper, wie BSW17, der interferiert mit der Bindung der Cε3 Region von IgE an den hoch affinen Rezeptor für IgE.

Nach ihrer Identifikation und Charakterisierung können die erfindungsgemäßen Mimokörper in herkömmlicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch rekombinante DNA Technologie oder durch chemische Synthesen.
Für die Identifikation antiidiotypischer Antikörper, die die gleiche Spezifität wie die oben erwähnten mimotopischen Peptide entwickeln, nämlich das selektierte Epitop am IgE, kann eine Bakteriophagenabbildbibliothek verwendet werden, die den Fab Teil eines humanen Antikörperrepertoirs exprimiert. Diese Bibliothek ist konstruiert beispielsweise aus einem Pool an B Zellen, die von Tonsillen menschlicher Subjekte erhalten werden, und einem immobilisierten BSW17 Antikörper, der als Ziel für eine Bioverschiebung eingesetzt wird. Humane Phagenteilchen für eine Fab Expression werden isoliert und angereichert, die spezifisch BSW17 erkennen. Diese rekombinanten Fab Fragmente sind daher erfindungsgemäße Mimokörper und repräsentieren Antiidiotypen gegen die hochvariablen Regionen von BSW17. Bei Verwendung als ein Vakzin induzieren sie eine Immunantwort, die zur Produktion BSW17-artiger Antikörper im allergischen Patienten führt. BSW17 ist nicht-anaphylactogen und inhibitorisch für eine Bindung von IgE und IgERI und eine Synthese von IgE auf B Zellen, so dass die in einem Patienten angezogenen polyklonalen Antikörper gegen das BSW17 antiidiotypische Fab Vakzin-ähnliche Eigenschaften aufweist. Die Immunantwort ist sehr spezifisch und sicher, da im Gegensatz zur klassischen Vakzinannäherung hier keine von IgE derivierte Proteinfragmente vorhanden sind, die bei den immunisierten Patienten eine Vernetzung von Antikörpern generieren könnten, wobei Zusammensetzungen in Betracht gezogen werden können, die frei an einem Träger sind.
Die BSW17 Mimokörper sind rekombinante Antikörper und Antikörperfragmente, die bestehen aus variablen Domainen (V Domainen) und konstanten Domainen (C Domainen), die von humanem Immunglobulin G abgeleitet sind. Zwei unterschiedliche Klone (Klone 52 und 43), die unterschiedliche Mi mokörperfragmente auf ihrer Oberfläche entwickeln, sind identifiziert worden durch Bioverschiebung von Antikörperphagenbibliotheken auf einem immobilisierten BSW17 Antikörper. Die Mimokörperstruktur, die das BSW17 Epitop am humanen IgE mimt, liegt innerhalb der hypervariablen Regionen (CDR) und dazu benachbarter Gitterregionen (FR) der V Domainen. Die cDNA Sequenzen und Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Ketten von V Domainen des Klons 52 und 43 sind in den 5a bis 5d gezeigt, nämlich durch die Sequenzen ID Nr. 1 bis 8. Das dem Klon 52 entsprechende leichtkettige Konstrukt (L.C.)₂ besteht aus einem dimeren Fab ähnlichen leichtkettigen Fragment. Die volle Struktur dieser BSW17 Mimokörper ist schematisch in den 4A bis 4C gezeigt, wobei die konstanten Regionsteile hiervon so zu verstehen sind, dass davon auch geringe kleinere sterische Modifikationen umfasst werden, wie sie in allotypischen Varianten zu finden sind, wie dies oben erwähnt worden ist. Die Aminosäuresequenz jeder vollständigen schweren und leichten Kette dieser Klone ist in den 12a bis 12d durch die Sequenzen ID Nr. 35 bis 38 gezeigt.
Die erfindungsgemäßen Mimokörper verfügen über eine pharmakologische Aktivität. Sie sind daher für die Verwendung als Pharmazeutika indiziert, beispielsweise als Antigene für Vakzine. Sie sind im Wesentlichen unfähig zur Mediierung einer nicht cytologischen Histaminfreisetzung und daher zur Hervorrufung von Antikörpern mit einer starken serologischen Kreuzreaktivität mit den Zielaminosäuresequenzen der Fc Region von IgE befähigt.
Die initiale Dosis an erfindungsgemäßem Mimokörper beträgt beispielsweise etwa 0,05 mg bis etwa 5 mg, vorzugsweise etwa 1 mg. Ihre Verabreichung erfolgt beispielsweise nasal oder subkutan oder intramuskular, worauf sich wiederholte Dosen (Verstärkungsdosen) hiervon beispielsweise 14 bis 28 Tage später anschließen. Die zu verwendenden Dosen sind etwas abhängig vom Alter, Gewicht und allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und können jeweils geeignet eingestellt werden.
Eine direkte Vakzination, nämlich eine aktive Immunisation mit den erfindungsgemäßen Mimokörpern wird vorzugsweise durchgeführt durch Verwendung rekombinanter Peptide (Fab Fragment, leichte Kette oder schwere Kette), die in herkömmlicher Weise in verschiedenen Expressionssystemen, wie Bakterien, Fungi oder eukaryontischen Zellen, erzeugt werden können.
Die Verabreichung eines freien rekombinanten Mimokörpers ist bevorzugt. Möglich ist aber auch eine Erhöhung der Immunogenität des Immunogens durch eine chemische Kupplung an einen immunogenen Träger. Dabei beinhaltet die Bezeichnung immunogenes Trägermaterial Materialien, welche die Eigenschaft einer unabhängigen Hervorrufung einer immunogenen Antwort bei einem Wirtstier haben, und die kovalent gekuppelt sein können an ein Polypeptid, entweder direkt über eine Bildung von Peptidbindungen oder Esterbindungen, die frei sind an Carboxyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen im Polypeptid und entsprechender Gruppen im immunogenen Trägermaterial, oder alternativ durch Bindung über eine herkömmliche bifunktionale Brückengruppe. Zu Beispielen für solche Träger gehören Albumine tierischer Seren, Globuline tierischer Seren, Thyroglobuline von Tieren, Hämoglobuline von Tieren, Hämocyanine von Tieren, besondere das Hämocyanin von Keyhole Limpet (KLH), aus Askaris extrahierte Proteine, beispielsweise Askarisextrakte wie sie beschrieben sind in J. Immun. 111, (1973), Seiten 260 bis 268, J. Immun. 122, (1979), Seiten 302 bis 308, J. Immun. 98, (1967), Seiten 893 bis 900, und Am. J. Physiol. 199, (1960), Seiten 575 bis 578, oder gereinigte Produkte hiervon, Polylysin, Polyglutaminsäure, Copolymere von Lysin und Glutaminsäure, Lysin oder Ornithin enthaltende Copolymere und dergleichen. Vor kurzem wurden Vakzine unter Verwendung von Diphterietoxoid, wie CRM197, oder Tetanustoxoid, als immunogene Trägermaterialien hergestellt, wozu beispielsweise hingewiesen wird auf M. L. Lepow et al., J. Infectious Diseases 150, (1984), Seiten 402 bis 406, und E. Coen Beuvery et al., Infection and Immunity 40, (1983), Seiten 39 bis 45, und diese toxoiden Materialien können hierin ebenfalls verwendet werden. Im Gegensatz zu chemisch detoxifiziertem Diphterietoxin wird vorzugsweise das rekombinant mutierte Diphterietoxin CRM197 angewandt. Im CRM197 ist der Rest Glycin 52 ersetzt durch Glutaminsäure, wodurch sich ein nicht-toxisches Produkt ergibt. CRM197 ist als nicht-toxisches Trägerprotein gut charakterisiert und wird als ein registriertes humanes Vakzin verwendet. Das gereinigte Proteinderivat von Tuberkulin (PPD) kann ebenfalls im aktiven Immunisierungsschema verwendet werden, da es (1) eine Antwort von T-Zellen selbst nicht induziert, nämlich in der Tat ein Hapten von T-Zellen ist, und sich dieses trotzdem als ein vollständig prozessiertes Antigen verhält und als solches durch T-Zellen erkannt wird, (2) auch bekannt ist, dass es einer der stärksten Haptenträger in der verknüpften Erkennungsart ist, und (3) bei Menschen ohne weitere Testung verwendet werden kann.
Als Bindemittel für Haptenträger können die Mittel verwendet werden, die herkömmlich zur Herstellung von Antigenen zur Anwendung gelangen. Die kovalente Kupplung der erfindungsgemäßen Mimokörper an das immunogene Trägermaterial kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden. Für eine direkte kovalente Kupplung ist beispielsweise die Verwendung von Bis-N-succinimidylderivaten, am meisten bevorzugt von Bis-(sulfosuccinimidyl)-suberat, als Kupplungsmittel, oder von Glutaraldehyd oder Carbodiimid, besonders bevorzugt von (Dicyclohexyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, möglich.
Die Verhältnisse von Hapten, einem Bindemittel für einen Haptenträger und einem Träger können geeignet bestimmt werden, wobei aber bevorzugt ist, den Träger in einer Menge, die etwa dem 1- bis etwa 6-fachen, vorzugsweise etwa dem 1- bis etwa 5-fachen, des Gewicht des Haptens entspricht, und das Bindemittel für den Haptenträger in einer Menge von etwa dem 5- bis etwa dem 10-fachen des Mol-äquilvalents des Haptens anzuwenden. Durch die obige Kupplungsreaktion wird der Träger an das Hapten über ein Bindemittel von Hapten an den Träger gebunden, wodurch ein gewünschtes Antigen erhalten wird, das zusammengesetzt ist aus einem Peptid-Träger-Komplex eines erfindungsgemäßen Mimotops und einem Träger.
Nach beendeter Reaktion kann das erhaltene Immunogen in bekannter Weise isoliert und gereinigt werden, beispielsweise durch Dialyse, Gelfiltration oder fraktionierte Fällung.
Die vorliegende Erfindung ist im Wesentlichen gerichtet auf eine aktive Immunisation durch eine direkte Vakzinierung, wobei aber auch eine passive Immunisation in Betracht gezogen werden kann. In einer solchen Situation werden erfindungsgemäße Mimokörper an ein geeignetes und nicht-humanes Tier verabreicht und Antikörper, die hiergegen erzeugt worden sind, isoliert und gereinigt, die dann an ein humanes Subjekt zwecks Induktion einer Milderung allergischer Symptome verabfolgt werden.
Die erfindungsgemäßen Mimokörper sind indiziert für eine Verwendung als Pharmazeutika, insbesondere als Vakzine, vor allem für die Behandlung von durch IgE mediierten Krankheiten, wie Allergie, beispielsweise Asthma, atopische Dermatitis, allergische Formen von Eosinophilie, Rhinitis, chronischer Urtikaria und Lebensmittelallergien.
Unter der Bezeichnung Behandlung ist zu verstehen, dass davon auch eine prophylaktische und eine kurative Behandlung umfasst ist. Der Wirt ist vorzugsweise ein humaner Wirt, doch ist die Erfindung mutatis mutandis auch anwendbar auf im Wesentlichen irgendeinen Säuger, beispielsweise eine Katze oder einen Hund.
Erläuterung der Figuren
1: Interaktion zwischen IgE und seinem hoch affinen Rezeptor.
2: Eigenschaften des monoklonalen anti-hIgE Antikörpers BSW17.
3: Das antiidiotypische Netzwerk:
Das hIgE Epitop, welches durch BSW17 erkannt wird, und das antiidiotypische Paratop sind schematisch als schwarze Punkte gekennzeichnet. Schwarze Kreise zeigen die homologen hypervariablen Regionen des Antikörpers BSW17 (Ab1) und der polyklonalen Antikörper 3 (Ab3), die durch eine Immunisation mit dem antiidiotypischen Antikörper Ab2 induziert werden.

4: Struktur von drei rekombinanten BSW17 Mimokörpern:

A: Anti-id-BSW17, Klon 52 (SDS426), leichte Kette:	(L.C.)₂	(Seq. id. Nr. 36)
B: Anti-id-BSW17, Klon 52 (SDS427), Fab:	F_AB	(Seq. id. Nr. 35 und 36)
C: Anti-id-BSW17, Klon 43 (SDS463), Fab:	F_AB	(Seq. id. Nr. 37 und 38)

5: Anti-BSW17 Fab Klone: DNA Sequenz eines durch einen Bakteriophagen entwickelten humanen Immunglobulins und deduziert von einer Aminosäuresequenz:
Hypervariable Regionen (die Komplementarität bestimmenden Regionen, CDR) sind in Kursivschrift dargestellt.
5a: Klon 52, variable schwere Kette (Seq. id. Nr. 1 und 2), CDR1: Seq. id. Nr. 39 und 40,
CDR2: Seq. id. Nr. 41 und 42, CDR3: Seq. id. Nr. 43 und 44
5b: Klon 52, variable leichte Kette (Seq. id. Nr. 3 und 4), CDR1: Seq. id. Nr. 45 und 46,
CDR2: Seq. id. Nr. 47 und 48, CDR3: Seq. id. Nr. 49 und 50
5c: Klon 43, variable schwere Kette (Seq. id. Nr. 5 und 6), CDR1: Seq. id. Nr. 51 und 52,
CDR2: Seq. id. Nr. 53 und 54, CDR3: Seq. id. Nr. 55 und 56
5d: Klon 43, variable leichte Kette (Seq. id. Nr. 7 und 8), CDR1: Seq. id. Nr. 57 und 58,
CDR2: Seq. id. Nr. 59 und 60, CDR3: Seq. id. Nr. 61 und 62
6: Homologie der Aminosäuresequenz zwischen anti-BSW17 rFab und der Cε3 Domain von humanem IgE:

A: anti-id Fab, Klon 52 schwere Kette, hIgE, Cε3: Seq. id. Nr. 25, Klon 52: Seq. id. Nr. 26 anti-id Fab, Klon 52, leichte Kette, Anordnung 1, nämlich hIgE, Cε3: Seq. id. Nr. 27, Klon 52: Seq. id. Nr. 28, anti-id Fab, Klon 52, leichte Kette, Anordnung 2, nämlich hIgE, Cε3: Seq. id. Nr. 29 bzw. Klon 52: Seq. id. Nr. 30
B: anti-id Fab, Klon 43, schwere Kette, hIgE, Cε3: Seq. id. Nr. 31, Klon 43: Seq. id. Nr. 32 anti-id Fab, Klon 43, leichte Kette, hIgE, Cε3: Seq. id. Nr. 33 bzw. Klon 43: Seq. id. Nr. 34

Identische Reste der Anordnung der Aminosäuresequenz sind durch schwarze Kästchen gezeigt, wobei ähnliche Aminosäuren in grauen Kästchen dargestellt sind (Lipman und Pearson). Die Positionen der Reste Fcε sind am Anfang einer jeden Anordnung angegeben. Der Beitrag der hypervariablen Regionen (CDR) und der Netzwerkregionen (FR) der rekombinanten Fab Fragmente ist unterhalb eines jeden Paars an Sequenzen gezeigt.
7: Kompetitive Bindung von anti-id BSW17 rFab an mit IgE geprimte CHOα Zellen mit durch FITC markiertem BSW17
8: Bindung von durch Immunaffinität gereinigten anti-BSW17 Mimokörper Immunglobulinen vom Hasen an humanes IgE
Bestimmung der hIgE/anti-Mimokörperkomplexe durch einen Sandwich ELISA:
hIgE und durch Immunaffinität gereinigte anti-BSW17 Mimokörperpräparationen werden bei äquimolarer Konzentration vermischt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Inkubationsgemische werden dann in Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, die mit monoklonalem anti-hIgE Antikörper LE27 (1 μg/ml) als Fangantikörper beschichtet sind. Gebundenes Mimokörper IgG wird detektiert mit einem Ziegen anti-Hasen IgG-HRP.

☐: = Komplexe von hIgE und SDS410
o: = Komplexe von hIgE und SDS411

9: Immunantwort auf einen anti-BSW17 Mimokörper in Balb/c Mäusen

= Maus 1, • = Maus 2,
= Maus 3,
= Maus 4, ♦ = Maus 5

A:: anti-id-BSW17.52, leichte Kette (SDS426)
B:: anti-id-BSW17.52, Fab (SDS427)
C:: anti-id-BSW17.43, Fab (SDS463)

Die durch O. D. abgekürzten Werte repräsentierten die Ablesungen der optischen Dichte, korrigiert durch die Hintergrundbindung an nicht beschichtete Vertiefungen. Es sind Mittelwerte von Messungen im Doppel gezeigt. Die Variablen liegen allgemein bei < 0,05 O. D.
10: Inhibition einer hIgE/FcεRIα Bindung von durch Immunaffinität gereinigten anti-Mimokörper Antikörpern

A:
= BSW 17 • = anti-Klon 52, leichte Kette (SDS410) Δ = anti-Klon 52, Fab (SDS411)
= anti-Klon 52, leichte Kette (Säulendurchfluss)
B:
= BSW17 • = anti-Klon 43 Fab (SDS476)

11: PCA Scoreprofile von Rhesusaffengruppen (n = 2), die mit verschiedenen Mimokörperpräparationen immunisiert sind

A: Immunogen: anti-id-BSW17.52, leichte Kette (SDS426)

B: Immunogen: anti-id-BSW17.52, Fab (SDS427)

C: Immunogen: anti-id-BSW17.43, Fab (SDS463)
Passive kutane Anaphylaxereaktionen (PCA) an der Haut von Rhesusaffen zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Immunisation. Die PCA Scorewerte repräsentieren PCA Intensitäten, die aus den Flächen unter den Kurven (AUC) kalkuliert sind, die durch Auftragung der Durchmesser der blau gefärbten Punkte auf der Haut gegen die injizierten Konzentrationen von IgE (JW8) generiert worden sind. Die Scores sind Mittelwerte für jede Gruppe von zwei Affen, die mit der gleichen Mimokörperpräparation immunisiert sind, berechnet aus den einzelnen Affenwerten, und sind in der Tabelle 4 gezeigt. Variationen sind durch Fehlerbalken gezeigt. Die statistischen p Werte sind über den Fehlerbalken gezeigt. Die Zeitpunkte von Verstärkerinjektionen sind unterhalb der x Achse gezeigt.
12: Komplette Aminosäuresequenzen für die schwere und die leichte Kette der drei rekombinanten BSW17 Mimokörper
12a: anti-id-BSW17, Klon 52: variable und erste konstante Domainen einer schweren Kette, nämlich Seq. id. Nr. 35
12b: anti-id-BSW17, Klon 52: variable und konstante Domainen der leichten Kette kappa, nämlich Seq. id. Nr. 36
12c: anti-id-BSW17, Klon 43: variable und erste Domainen der schweren Kette, nämlich Seq. id. Nr. 37
12d: anti-id-BSW17, Klon 43: variable und konstante Domainen der leichten Kette lambda, nämlich Seq. id. Nr. 38.
Der Mimokörper (L.C.)₂ Klon 52 umfasst die leichten Ketten der 12b, nämlich Klon Seq. id. Nr. 36, die über Disulfidbrücken gebunden sind, wie dies in der 4A gezeigt ist.
Der Mimokörper Fab Klon 52 umfasst die leichte Kette der 12b, nämlich von Seq. id. Nr. 36, und die schwere Kette der 12a, nämlich Seq. id. Nr. 35, die durch Disulfidbrücken gebunden sind, wie dies in der 4B gezeigt ist.
Der Mimokörper Feb Klon 43 umfasst die leichte Kette der 12d, nämlich die Seq. id. Nr. 38, und die schwere Kette der 12c, nämlich die Seq. id. Nr. 37, die jeweils über Disulfidbrücken gebunden sind, wie dies in der 4C gezeigt ist.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden und nicht beschränkenden Beispiele weiter illustriert. Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Dabei werden die folgenden Abkürzungen verwendet.

anti-id =	anti-idiotypisch
ABTS =	[2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolin)-sulfonat]
BSA =	Rinderserumalbumin
BSW17 =	monoklonaler anti-humaner IgE Antikörper der Maus, Cε3 spezifisch
CDR =	Regionen, die die Komplementarität bestimmen
Cε3 =	dritte schwere Kette einer konstanten Region der Domain von IgE
Cε4 =	vierte schwere Kette einer konstanten Region der Domain von IgE
CεE =	mimotopes Peptid, das die Cε3 Epitopregion von BSW17 imitiert
CεM =	mimotopes Peptid, das die Cε4 Epitopregion von BSW17 imitiert
Cfu =	Kolonie-bildende Einheiten
ELISA =	Enzymverknüpfter Immunabsorbent Assay
Fab =	Antikörperfragment, dem die konstanten Regionen 2 und 3 der schweren Kette fehlen
FcεRI, IgERI =	Hochaffinitätsrezeptor für IgE
FcεRIα =	Hochaffinitätsrezeptor für IgE, α Kette
FCS =	fötales Kälberserum
FR =	Gerüstregionen
FITC =	Fluorescein, das mit Isothiocyanat konjugiert ist
HRP =	Meerrettichperoxidase
HAS =	humanes Serumalbumin
(h)IgE =	humanes Immunglobulin E
mAb =	monoklonaler Antikörper
MNC =	mononukleare Zellen
NIP =	3-Nitro-4-hydroxy-iodphenylessigsäure
p. c. =	polyklonal
Phab =	Phagen entwickelnde Fab Fragmente (Fab exprimierender Bakteriophag)
PBS =	Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCA =	passive kutane Anaphylaxe
PWM =	Kermesbeerenmitogen
r =	rekombinant
RT =	Raumtemperatur
SPR =	Oberflächenplasmonresonanz

Beispiel 1: Konstruktion von Phagenabbildbibliotheken
a) Lymphozytenquelle
Zwei männliche erwachsene Donoren werden zur Herstellung monoklonaler Zellen (MNC) aus peripherem Blut verwendet. Ein erster männlicher erwachsener atopischer Donor, der klinische Symptome einer Allergie zeigt, wird mit einer intramuskularen Injektion von 0,5 ml an Alaun-adsorbiertem Tetanustoxoid verstärkt (Te Anatoxal Bern, Schweizer Serum- und Vakzin-Institut, Bern, Schweiz). Die MNCs werden 7 Tage später unter Verwendung einer Gradientenzentrifugation nach Ficoll isoliert (Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI, USA) und dann 3 Tage in Medium RPMI-1640 gezüchtet (Seromed, Basel, Schweiz), das enthält 10³ E/ml IL-2 (Sigma, St. Louis, MO, USA), 50 μg/ml Pansorbinzellen (Staphylococcus aureus Cowan Stamm 1, Calbiochem, La Jolla, CA; USA) und Tetanustoxoid in einer Verdünnung von 1:1000 in Medium RPMI-1640. Sodann wird aus diesen Zellen eine Gesamt RNA hergestellt unter Anwendung des Phenol-Chloroform-Guanidiniumisothiocyanat-Verfahrens, wie es von P. Chomczynsi und N. Sacci in Anal. Biochem. 162, (1987), Seite 156, beschrieben ist. Der zweite männliche erwachse ne Donor ist ein hyperimmuner Rhesus D Donor, dem intravenös eine Verstärkung von 2 ml gepackten roten Blutkörperchen aus einem bekannten männlichen Donor aus der Blutgruppe 0 RhD+ gegeben wird. Die MNCs werden durch eine Gradientenzentrifugation nach Ficoll bei +18 Tagen nach der Verstärkung isoliert. Sodann werden die Zellen 3 Tage in Medium RPMI-1640 kultiviert, das 103 E/ml an IL-2 und 10 μg/ml Kermesbeeremitogen enthält (PWM, Sigma 19379, Buchs, Schweiz), bevor eine Extraktion mit RNA vorgenommen wird.
Humane Tonsillenproben werden von drei tonsillektomisierten Kindern erhalten. Die Tonsillen werden in sterilen Petrischalen in Medium RPMI-1640 mazeriert und zu kleinen Stückchen geschnitten. Gewebe, Zellen und Medium werden dann in sterile Röhrchen übertragen, wobei man das Gewebe Debris absetzen lässt und aus dem Überstand unter Verwendung unter anderem einer Gradientenzentrifugation nach Ficoll MNC isoliert. Die B Zellen werden selektiert durch Inkubation des MNC mit paramagnetischen Perlen, die mit CD19 beschichtet sind, worauf die RNA nach dem oben erwähnten Phenol-Chloroform-Guanidiniumisothiocyanat-Verfahren hergestellt wird.
Der zur Klonierung der Ketten für alle Mimokörper verwendete pComb3 Vektor wird vom Scripps Research Institute La Jolla, CA, USA erhalten, wozu auf C. F. Barbas III und R. A. Lerner in Companion Methods Enzymol. 2, (1991), Seite 119, hingewiesen wird. Zur Transformation des pComb3 Vektors wird der Stamm XL1-Blau von Escherichia coli verwendet, und der Helferphage VCSM13 wird von der Firma Stratacyte (La Jolla, CA, USA) bezogen.
b) Konstruktion von Bakteriophagbibliotheken
Es werden drei getrennte Bibliotheken konstruiert. Die erste und als BS bezeichnete Bibliothek an MNC wird aus dem ersten männlichen atopischen Donor isoliert, die zweite und als LD2 von MNC bezeichnete Bibliothek wird bei +18 Tagen nach intravenöser Verstärkung aus dem zweiten männlichen Donor geerntet, während die dritte und als CT bezeichnete Bibliothek aus der an B Zellen angereicherten Population von MNC aus den Tonsillen von Kindern isoliert wird. Eine Gesamt RNA wird aus diesen Zellen unter Verwendung des bereits erwähnten Phenol-Chloroform-Guanidiniumisothiocyanat-Verfahrens hergestellt. Von dieser RNA werden 10 μg zur Herstellung einer cDNA unter Verwendung eines Oligoprimers (dT) (400 ng) hergestellt und revers transkribiert mit einer M-MuLV Reverstranskriptase unter Anwendung der vom Hersteller (Boehringer Mannheim, Deutschland) vorgeschriebenen Bedingungen. Sodann wird eine PCR Amplifikation gemäß der Beschreibung von M. Vogel et al., E. J. of Immunol. 24, (1994), Seite 1200, durchgeführt. Kurz gesagt werden hierzu 100 μl eines PCR Reaktionsmediums verwendet, das in einem Puffer von Perkin-Elmer enthalten ist, mit 10 mM MgCl₂, 5 μl cDNA, jeweils 150 ng des geeigneten Primers 5' und 3', wobei alle vier jeweils 200 μM an dNTP und 2 E/ml einer Taq Polymerase enthalten (Perkin Elmer, NJ, USA). Die Amplifikation von PCR der schweren Ketten und der leichten Ketten des Moleküls Fab wird separat durchgeführt mit einem Satz an Primern von Stratacyte, wofür die Details später angegeben sind. Für die schwere Kette werden sechs stromaufwärts angeordnete Primer angeordnet, welche jeweils die sechs Familien der Gene VH hybridisieren, während eine Kette eines kappa Primers und eine Kette eines lambda Primers für die leichten Ketten verwendet werden. Die stromabwärts angeordneten Primer sind so abgestimmt, dass sie die Scharnierregion der konstanten Domainen γ1 und γ3 für die schwere Kette treffen. Für die leichte Kette sind die stromabwärts angeordneten Primer abgestimmt auf die konstanten Domainen kappa und lambda am 3' Ende. Die PCR Produkte der schwe ren und der leichten Kette werden getrennt zusammengefasst, einer Reinigung durch ein Gel unterzogen und mit Xho1/Spe1 und Sac1/Xba1 Restriktionsenzymen geschnitten (Boehringer Mannheim, Deutschland). Nach erfolgtem Digest werden die PCR Produkte einmal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahiert und durch ein Gelausschlussverfahren gereinigt. Die Insertion des mit Xho1/Spe1 verdauten Fd Fragments und die anschließende Ligation des mit Sac1/Xba1 der verdauten leichten Kette in den pComb3 Vektor, die Transformation zu blauen XL1 Zellen und die Produktion von Phagen werden entsprechend dem von C. F. Barbas III und R. A. Lerner in Companion Methods Enzymol. 2, (1991), Seite 119, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach einer Transformation werden die E. coli Zellproben von blauem XL1 abgezogen und auf Platten titriert, um so die Große der Bibliothek zu bestimmen. Diese Ergebnisse zeigen Expressionsbibliotheken von 1 × 10⁷, 7,7 × 10⁶ und 3 × 10⁶ cfu (Kolonie-bildende Einheiten) für BS, LD2 und CT. c) PCR Primer
Beispiel 2: Selektion von rekombinantem BSW17-spezifischen Antikörperfragmenten (Mimokörper BSW17) aus Phagenbibliotheken
Die Selektion BSW17-spezifischer Phagen wird durchgeführt anhand von vier Runden eines Verschiebens. Jede Runde umfasst zwei Vorabsorptionen an das anti-IgE mAb Le27 vor einer Absorption an das anti-IgE mAb BSW17. Diese Vorabsorption wird wie folgt durchgeführt: Zwei Immunröhrchen (Maxisorp, Nunc) werden über Nacht bei 4°C mit 4 ml Le27 (20 μg/ml) beschichtet und dann 2 h bei 37°C mit 4 ml PBS/2% Magermilch blockiert. Ein erstes Röhrchen wird auf einem Unter-und-Über-Drehtisch 30 min bei Raumtemperatur mit 4 ml Blockierlösung inkubiert, die 2 × 10¹² cfu jeder Phagenbibliothek (BS, LD2 und CT) enthält. Sodann werden die Phagen in das zweite Röhrchen übertragen, wobei das Verfahren einmal wiederholt wird. Nach der zweiten Vorabsorption werden die nicht Le27 spezifischen Phagen in ein Röhrchen gegeben, das mit 4 ml BSW17-(20 μg/ml) beschichtet und mit PBS/2% Magermilch blockiert ist, wie dies oben beschrieben ist. Nach einer Inkubation während 2 h bei Raumtemperatur auf dem Unter-und-Über-Drehtisch wird das Röhrchen der Reihe nach 10 mal mit PBS/0,1% Tween und dann 10 mal mit PBS gewaschen. Die adhärenten Phagen werden der Reihe nach eluiert mit 500 μl 0,1 M Triethylamin und dann nach dreimaliger Spülung in PBS mit 500 μl mit 0,1 M HCl auf pH 2,2 mit Glycin eingestellt, das 1 mg/ml BSA enthält. Jede Elutionsstufe wird 10 min bei Raumtemperatur durchgeführt, und die eluierten Phagen werden mit 250 μl 1 M Tris HCl, pH 7,4 bzw. mit 30 μl 2 M Tris-Base neutralisiert. Die ausgewählten Phagen werden unter Verwendung von blauen E. coli Zellen XL1 gemäß der obigen Beschreibung von Barbas und Lerner amplifiziert, bevor sie anschließend bei drei weiteren Runden einer Verschiebung verwendet werden. Nach jeder Runde einer Verschiebung wird der Titer an eluierten Phagen durch eine Bestimmung mittels cfu überwacht (Tabelle 2). Tabelle 2 Anreicherung von BSW17-spezifischen Phagen durch konsekutive Runden einer Verschiebung

Runde der Verschiebung^a) Anzahl an eluierten Phagen (cfu)

1 3 × 10⁵

2 2 × 10⁴

3 3 × 10⁵

4 5 × 10⁷

a) Für jede Runde einer Verschiebung werden 6 × 10¹² Phagenpartikel zweimal vorabsorbiert in Röhrchen, die mit 20 μg/ml Le27 beschichtet sind, worauf sich eine Inkubation in einem beschichteten Röhrchen mit 20 μg/ml BSW17 anschließt.

Beispiel 3: Nukleotidsequenz rekombinanter Mimokörper von BSW17
Plasmid DNA, die aus Phagenklonen selektiert ist, wird hergestellt unter Verwendung eines Bausatzes der Bezeichnung Nucleotrap (Machery-Nagel, Düren, Deutschland), worauf eine Nukleinsäuresequenzierung auf einem Sequenzierungssystem ABI 373A unter Anwendung eines PRISM Ready Reactin DyeDeoxy Terminator Zyklus-Sequenzierungsbausatzes durchgeführt wird (Applied Biosystems, Deutschland).
Die zur Sequenzierung der schweren Kettensequenz verwendeten Primer sind wie folgt:
Zum Erhalt der leichten Kettensequenzen werden die folgenden Primer verwendet:
Die Synthese der Primer erfolgt mit Microsynth (Balgach, Schweiz). Aus den DNA Sequenzen einer Selektion verschiedener Phagenklone werden zwei verschiedene Aminosäuresequenzen für einen BSW17-spezifischen rekombinanten Antikörper mit schweren und leichten Ketten abgeleitet (Klon 52 und Klon 43). Die Sequenzen und ihre Allokation zu hypervariablen Regionen (CDR) und die Netzwerksequenzen sind in den 5a bis 5d, nämlich Seq. id. Nr. 1 bis 8, gezeigt.
Eine Anordnung der Aminosäuresequenzen der BSW17-spezifischen rekombinanten Antikörperfragmente, die durch die Klone 52 und 43 mit humanem IgE entwickelt werden, zeigt Homologien mit Streckern der humanen Cε3 Domain, was in einer Bindung an den hoch affinen Rezeptor (6, nämlich Seq. id. Nr. 25 bis 34) involviert ist. Die Paratopen, die durch die rekombinanten Antikörperfragmente entwickelt werden, mimen daher definierte Strukturen, die in humanem IgE (Mimokörper) vorhanden sind. Die mit diesen rekombinanten Mimokörpern bei allergischen Patienten durch Vakzination gebildeten Antikörper erkennen somit humanes IgE und verhindern daher allergische Reaktionen durch Inhibition einer IgE/IgERI Bindung.
Beispiel 4: Herstellung und Reinigung rekombinanter BSW17 Mimokörper
Es werden lösliche Mimokörper, die abgeleitet sind von den Phagenklonen 43 und 52 (5) (Seq. id. Nr. 1 bis 8) erzeugt. Zur Produktion löslicher Fab Fragmente wird die Sequenz gIII, welche für das pIII Schwanzprotein des Phagenpartikels kodiert, entfernt und durch einen Hexahistidintag ersetzt, um die Reinigung des Fab Fragments durch eine Ni²⁺ Chelataffinitätschromatographie zu erleichtern.
Phagen DNA wird unter Verwendung eines Bausatzes der Bezeichnung Nucleotrap (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) hergestellt und mit Spe1 und Nhe1 digestiert. Das 4,7 kb DNA Fragment, welchem der gIII Teil fehlt, wird mit Alkaliphosphatase behandelt und durch eine Agarosegelelektrophorese gereinigt. Die linearisierte DNA wird mit einem für sechs Histidin kodierenden DNA Fragment an den 5' und 3' Enden von Spe1 bzw. Nhe1 Restriktionsstellen ligiert. Die Ligation der DNA wird in Zellen von E. coli XL1 blau transformiert und einzelne Klone, die lösliche Mimokörper produzieren, werden selektiert. Einer dieser Klone wird für eine Reinigung in großem Maßstab ausgewählt und in 1 l SB (Superbrühe) mit einem Gehalt von 50 μg/ml Carbenicillin bei 37°C bis zu einem Außendurchemsser (OD) von 1,0 bei 600 nm wachsen gelassen. Sodann induziert man die Kultur mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (Biofinex, Praroman, Schweiz) und lässt sie 4 h bei 37°C wachsen. Die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 6000 Upm während 20 min bei 4°C pelletisiert, in 30 ml Beschallungspuffer (0,1 M NaPO₄, 8 M Harnstoff, pH 8,0) resuspendiert und dann auf Eis beschallt. Hierauf werden die unlöslichen Komponenten durch Zentrifugation bei 15000 Upm während 30 min bei 4°C entfernt, wobei der Fab enthaltende Überstand auf einer 1 ml Nickel-Nitriloacetat Säule gereinigt wird. Sodann wird die Säule mit Beschallungspuffer gewaschen, um die Kontaminationen zu entfernen, worauf zwei Elutionsstufen mit einem Beschallungspuffer von pH 5,1 bzw. 4,9 folgen. Die Fraktionen werden bei einem OD von 80 nm überwacht, wobei Teile hiervon durch SDS-PAGE (12% nicht-reduzierend) analysiert werden, um so die Reinheit und Identität des Mimokörpers zu bestätigen. Anschließend werden die die Mimokörper enthaltenden Fraktionen zusammengefasst, konzentriert und gegen PBS dialysiert.
Die Reinheit der erhaltenen Mimokörperpräparationen (wie in den 4 und 12 spezifiziert) (Seq. id. Nr. 35, 36, 37, 38) wird durch einen Assay einer Probe mittels SDS-PAGE evaluiert. Proteinbande werden durch eine Anfärbung mit Coomassie blau detektiert. Die Bestimmung der Konzentration erfolgt durch einen Vergleich der mit Coomassie blau angefärbten Mimokörperbande mit bekannten Mengen eines Standardproteins (BSA) und auch durch Spektrophotometrie. Sodann werden diese Mimokörperpräparationen für einen kompetitiven Bindungsassay und für eine Immunisation von Hasen verwendet.
Beispiel 5: Inhibition einer durch BSW17 mediierten Verlagerung einer an einen Rezeptor gebundenen IgE durch rekombinante BSW17 Mimokörper
BSW17 erkennt und verlagert eine IgE Bindung an seinen hoch affinen Rezeptor. Zur Bestimmung, dass die anti-id BSW17 rFab Fragmente zu einer Inhibition dieser Verlagerungsreaktion fähig sind, wird ein kompetitiver Bindeversuch unter Verwendung von IgE, das an eine Zelloberfläche gebunden ist, an IgERI ausgesetzt. Die rekombinante Ovarzelllinie vom Chinesischen Hamster (CHO), die transfektiert ist mit DNA, die für die α-Kette von humanem IgERI kodiert, wird für den Assay verwendet [CHOα Zelllinie, U. Blank et al., Eur. J. Biol. Chem. 266, (1991), Seite 2639]. Eine Reihe an Testproben, die 5 × 10⁴ CHOα Zellen enthalten, wird in FACS Puffer (PBS, 0,3% BSA, 0,02% NaN₃) mit 48 ng IgE B11 Hybridomazellen (A. W. Zürcher et al., Immunol. Lett. 46, (1995), Seiten 49 bis 57) während 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer einmaligen Waschung mit einem FACS Puffer wird jede Probe 15 min bei Raumtemperatur mit vorgeformten Komplexen von Fluorescein-Isothiocyanat konjugiertem BSW17 (BSW17-FITC) und mit zunehmenden Mengen an anti-id BSW17 rFabs inkubiert. Diese Komplexe werden wie folgt hergestellt: 50 μl BSW17-FITC mit einer Konzentration von 1,3 nM werden mit unterschiedlichen Mengen an anti-id-BSW17 rFabs (40 nM, 200 nM, 1 μM, 4 μM und 40 μM) während 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Eine Kontrollprobe, die lediglich die CHOα Zellen enthält, wird 15 min bei Raumtemperatur mit BSW17-FITC inkubiert, um eine nicht-spezifische Bindung zu bestimmen. Die CHOα Zellen werden einmal mit einem FACS Puffer gewaschen, und die nach Zugabe von 100 μl FACS Puffer erhaltenen Zellen werden in einem FACS Calibur (Becton Dickinson) Durchflusscytometer analysiert, das mit einem Argonlaser ausgerüstet ist, der auf 488 nm getunt ist. In die vordere Streuung/Seitenstreuung der punktförmigen Auftragung werden um monomere Zellen Sperren gesetzt, wobei die Fluoreszenz quantifiziert und ausgedrückt wird als eine Mittelkanalfluoreszenz (mcf). Die Prozentmenge an positiven Zellen wird als der Prozentwert von BSW17 berechnet, der an die CHOα Zellen bindet. Wie der 7 zu entnehmen ist, nimmt die Bindung von BSW17 an CHOα Zellen ab mit zunehmenden Konzentrationen an anti-id BSW17 Fab Fragmenten, was zeigt, dass die beiden anti-id BSW17 Fab Klone fähig sind zu einer Inhibition der Bindung von BSW17 an IgE.
Beispiel 6: Immunisation von Hasen mit rekombinanten BSW17 Mimokörpern
Dieses Beispiel zeigt, dass eine Immunisierung mit entweder anti-BSW17 rFab (bestehend aus einer schweren und einer leichten Kette des Klons 52, wie dies in 4B zusammen mit den 12a und 12b gezeigt ist) (Seq. id. Nr. 35 und 36) oder mit dem rekombinanten Mimokörper, der lediglich aus der leichten Kette besteht (4A zusammen mit 12b) (Seq. Id. Nr. 26) bei Hasen eine humorale Immunantwort induziert, die mit humanem IgE kreuzreagiert. Zwei weißen weiblichen Neuseeland Hasen verabreicht man eine primäre Immunisierung subkutan mit 300 μg/ml anti-BSW17 rFab oder einem leichten Kettenfragment des Klons 52 als 1:1 Emulsion in komplettem Adjuvans nach Freund, worauf sich alle zwei Wochen eine dreimalige Verstärkung mit der gleichen Menge eines Mimokörpers, der 1:1 in unvollständigem Adjuvans von Freund emulgiert ist, anschließt. Am Tag 0 (Vorblutung) werden Seren gesammelt, und die Tiere lässt man 7 Tage nach der letzten Injektion ausbluten.
Immunserum von Hasen werden durch eine Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von humanem IgE (SUS-11 IgE) gereinigt, das chemisch vernetzt ist mit den Sepharose 4B Säulen. Durch dieses Verfahren lässt sich die anti-hIgE Fraktion aus dem Gesamtimmunglobulin isolieren, was eine akkurate Charakterisierung der therapeutisch relevanten Immunantwort in Bezug auf die Antikörpertiter und die Affinität ermöglicht.
Die Immunaffinitätsreinigung von anti-Mimokörper Antikörpern, die eine Kreuzreaktion mit humanem IgE eingehen, besteht aus zwei Stufen. In der ersten Stufe wird die IgG Fraktion aus dem Antiserum von Hasen durch eine Fällung mit Ammoniumsulfat isoliert, während in der zweiten Stufe die hIgE-spezifischen anti-BSW17 Mimokörper Antikörper an humanes IgE (SUS-11 IgE) gebunden, kovalent an CH-Sepharose 4B gekuppelt und dann eluiert, dialysiert und konzentriert werden.
Die von der Konzentration abhängige Komplexbildung der durch Immunaffinität gereinigten Immunglobuline mit humanem IgE in Lösung wird durch ELISA bestätigt: SUS-11 IgE wird mit äquimolaren Mengen von anti-Mimokörper Immunglobulinen über Nacht bei 4°C inkubiert. Die in Lösung gebildeten Komplexe werden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, die vorher mit dem monoklonalen anti-hIgE Antikörper LE127 als einfangendem Antikörper beschichtet worden sind. Eine Bindung von anti-Mimokörper IgG wird mit einem polyklonalen anti-IgG-HRP vom Hasen detektiert. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind der 8 zu entnehmen.
Beispiel 7: Immunisation von Mäusen mit rekombinanten BSW17 Mimokörpern
Rekombinante Mimokörper, die abgeleitet sind sowohl von dem Klon 43 als auch dem Klon 52, können durch anti-Mimokörper Antikörper induziert werden. Hierzu werden Immunisationen an Mäusen durchgeführt. Gruppen von jeweils fünf Balb/c Mäusen erhalten subkutan eine Injektion von 5 μg pro Maus an rekombinanten BSW17 Mimokörpern, die in E. coli Bakterien hergestellt und durch eine Nickel-affinitätschromatographie gereinigt worden sind. Hierzu wird Aluminiumhydroxid als Adjuvans verwendet.
Die Gruppe 1 wird mit einem Ansatz von SDS426 = anti-id-BSW17.52, leichte Kette, immunisiert.
Die Gruppe 2 wird mit einem Ansatz von SDS427 = anti-id-BSW17.52, Fab, immunisiert.
Die Gruppe 3 wird mit einem Ansatz von SDS463 = anti-id-BSW17.43, Fab, immunisiert.
An den Tagen 21 und 41 nach einer primären Immunisation werden den Mäusen zwei Verstärkerinjektionen von 5 μg pro Maus verabreicht. An den Tagen 0, 20, 28, 35, 42, 49 und 56 nach der Primärimmunisation werden Blutproben gezogen. Es wird ein Serum zubereitet und auf die Anwesenheit von anti-Mimokörper Antikörpern durch ELISA untersucht.
Vertiefungen von Mikrotiterplatten werden mit 1 μg/ml polyklonalem humanem IgG beschichtet und mit 1:50 verdünntem Mausserum inkubiert, das aus Blutproben hergestellt worden ist, die an den angegebenen Zeitpunkten nach der Primärimmunisation gezogen werden. Gebundene anti-Mimokörper Antikörper (ahIgG, die gegen das humane Netzwerk und konstante Regionen der Domain gerichtet sind) werden durch eine zweite Inkubation mit einer Meerrettichperoxidase detektiert, die konjugiert ist mit anti-Maus IgG (gamIgG-HRP) von einer Ziege. Die Farbreaktion wird unter Verwendung eines chromogenen ABTS Substrats entwickelt.
Dabei produzieren alle Mäuse anti-Mimokörper Antikörper nach der zweiten Verstärkung mit allen rekombinanten Mimokörperpräparationen (9).
Beispiel 8: In Hasen erzeugte Immunglobuline gegen rekombinante BSW17 Mimokörper binden mit hoher Affinität an humanes IgE
Hier wird gezeigt, dass eine Vakzination mit rekombinanten BSW17 Mimokörpern eine humorale Immunantwort mit hoher Affinität für humanes IgE induziert. Die kinetischen Parameter, die für die Bindung der durch eine Immunaffinität gereinigten anti-Mimokörper Immunglobuline an humanes IgE repräsentativ sind, werden durch eine Oberflächenplasmonresonanz (SPR) analysiert.
Es werden SPR Messungen in einem BIAcore Instrument (Biacore, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Spezifische Bindungsoberflächen werden hergestellt durch Kupplung von humanem IgE oder von IgG₃ der Maus an einen CM5 Sensorchip unter Anwendung einer Aminkupplung nach den Instruktionen des Herstellers. Unter Verwendung dieses Verfahrens werden Biomoleküle über primäre Amingruppen an die carboxymethylierte Dextranoberfläche des Sensorchips gebunden. Es werden 10 pmol an humanem Myeloma IgE oder SUS-11 IgE an separate Fließzellen des Chips gekuppelt. Von der Maus stammendes IgG₃ mAb, ABL 364 (ATCC HB 9324), wird an einer separaten Spur des gleichen Sensorchips immobilisiert. ABL 364 wird als eine Referenz für die Bestimmung einer Bindung der anti-Mimokörper Antikörper an nicht-hIgE Immunglobulinstrukturen verwendet, wobei eine Korrektur möglicher Veränderungen des Refraktionsindex durch Pufferveränderungen verursacht wird. Die dabei erhaltenen Kupplungsdichten liegen bei ~13000 RU.
Alle biomolekularen Interaktionen, die im Gerät BIAcore gemessen werden, werden bei 25°C unter Verwendung von HBS (10 mM Hepes, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA und 0,005 Volumen-% Tensid P-20) als kontinuierlichem Fließpuffer durchgeführt. Der Konzentrationsbereich eines jeden Analyts, der über die Oberfläche des Sensorchips für eine kinetische Analyse geleitet wird, beträgt 33 nM bis 499 nM. Die Fließrate liegt bei 5 μl/min. Die Analyte werden während 1200 s injiziert, worauf sich eine Injektion durch HBS während etwa 1800 s anschließt, um so die Dissoziation an gebundenem Analyt zu überwachen. Der Chip wird regeneriert mit einem Stoß an 10 mM HCl, der während 120 s erzeugt wird. Eine Überwachung der nicht-spezifischen Bindung erfolgt durch eine Passage der Analyten über die ABL 364 Kontrollspur, die von einer spezifischen Bindung vor der kinetischen Analyse zu subtrahieren ist.
Bindungskurven, die durch SPR Messungen generiert werden, werden unter Verwendung der BIAevaluation 3.0 Analysepackung analysiert. Für einen relativen Vergleich der Interaktionen zwischen dem anti-Mimokörper und dem IgE wird ein monophasisches Modell angewandt. Die für jede Kurve berechneten Assoziationskonstanten k_a, Dissoziationskonstanten k_d und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten K_D = 1/K_A (K_A = Affinitätskonstante) sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefasst:
Tabelle 3
Kinetische Konstanten (SPR/BIAcore) der Interaktion zwischen polyklonalem (p. c.) anti-Mimokörper IgE Präparationen von Hasen und hIgE

		Myeloma IgE	SUS-11 IgE
BSW17	K_a (1/MS)	n. b.	0,8 ± 0,3 × 10⁴
	K_d (1/s)	n. b.	4,2 ± 0,9 × 10^–6
	K_D (nM)	n. b.	0,53 ± 0,33
a(anti-id-BSW17.52, leichte Kette)¹⁾ (SDS410)	K_a (1/Ms)	2,1 ± 0,8 × 10⁴	2,2 ± 0,9 × 10⁴
	K_d (1/s)	1,8 ± 0,5 × 10^–4	2,3 ± 0,2 × 10^–4
	K_D (nM)	13,3 ± 6,8	10,7 ± 3,3
a(anti-id-BSW17.52, Fab)²⁾ (SDS411)	K_a (1/Ms)	4,6 ± 2,7 × 10⁴	2,5 ± 1,0 × 10⁴
	K_a (1/s)	2,3 ± 0,3 × 10^–4	1,5 ± 0,1 × 10^–4
	K_D (nM)	5.0 ± 2,2	6,0 ± 1,8
a(anti-id-BSW17.43, Fab)³⁾ (SDS476)	K_a (1/Ms)	u. d.	2,2 ± 0,4 × 10⁴
	K_d (1/s)	u. d.	1,6 ± 0,1 × 10^–5
	K_D (nM)	u. d.	0,75 ± 0,02

a = anti
n. b. = nicht bestimmt
¹⁾anti-SDS426
²⁾anti-SDS427
³⁾anti-SDS463

Hoch affine Antikörper gegen humanes IgE dürften anscheinend bei Hasen induziert werden, die mit rekombinanten BSW17 Mimokörpern immunisiert sind (K_D Werte im nanomolaren Bereich). Vom Klon 43 derivierte Fab (SDS463, 4C, anti-id-BSW17.43) hat die Fähigkeit zu einer Induktion einer Immunantwort mit sehr hoher Affinität für humanes IgE (K_D < 1 nM).
Durch Verwendung eines monoklonalen antiidiotypischen Antikörpers ist somit eine Induktion einer starken polyklonalen Antwort gegen IgE möglich, wie dies durch die humane Vakzinationsstrategie beabsichtigt ist.
Beispiel 9: In Hasen generierte Immunglobuline gegen rekombinante BSW17 Mimokörper inhibieren eine Bindung von humanem IgE an seinen hoch affinen Rezeptor
Für eine Aktivität eines antiallergischen Vakzins wird erwartet, dass eine Bindung zwischen anti-Mimokörper Antikörpern und hIgE eine Bindung von IgE an seinen hoch affinen Rezeptor verhindert. Die Cε3 Epitopenregion Val(370)–Gly(379) in Streckung von Val(370)–Asn(383) (6) (Seq. id. Nr. 25), die eine Homologie der Aminosäuresequenz mit BSW17 Mimokörper CDR zeigt, ist in einer hoch affinen Rezeptorbindung involviert. Von den IgE-spezifischen Antikörpern, die gegen die rekombinanten BSW17 Mimokörper angezogen worden sind, wird daher erwartet, dass sie ihre therapeutische Wirkung durch eine Inhibition der Bindung von IgE an seinen hoch affinen Rezeptor durch Blockierung der Bindungsdomain ausüben. Um dies zu bestätigen, werden von immunisierten Hasen erhaltene gereinigte anti-Mimokörper Antikörper bezüglich einer Inhibition einer Bindung von hIgE und FcεRIα in einer Kompetition von ELISA getestet. Als eine krankheitsrelevante Auslesung wird freies IgE gemessen durch seine Fähigkeit zur Bindung an rekombinantes FcεRIα (RIα-HSA- RIα Doppelfusionsprotein, DFP) (10).
Es folgt eine Vorinkubation von HIgE (SUS-11, 1 μg/ml in 10A und 0,1 μg/ml in 10B) bei +4°C während 16 h mit steigenden Mengen an anti-Mimokörper Immunglobulinen oder an mAB BSW17 als eine Referenz. Die im Immunaffinitätssäulendurchfluss der SDS410 Präparation vorhandenen Bulkimmunglobuline sind als eine negative Kontrolle eingeschlossen. Die dabei gebildeten Komplexe werden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, die mit 1 μg/ml des anti-IgE Antikörpers Le27 als Fangantikörper beschichtet sind, worauf sich eine Inkubation mit Meerrettichperoxidase, welche markiert ist als FcεRIα-HSA-FcεRIα Doppelfusionsprotein (DFP), während 1 h bei 37°C anschließt. Das dabei gebundene DFP wird mit einem chromogenen Substrat detektiert. Die OD Werte sind als prozentuale Bindung ausgedrückt. Eine Bindung an das Kompetitor-freie SUS-11 IgE wird als 100% festgelegt. Es sind Mittelwerte von Messungen im Duplikat gezeigt. Variationen liegen allgemein bei unter 2%.
Die oben erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine Immunisation mit BSW17 Mimokörpern bei Nagern zu spezifischen hoch affinen anti-hIgE Antikörpern führt. Diese anti-Mimokörper Antikörper inhibieren die Bindung von IgE an seinen hoch affinen Rezeptor in vitro, was den Wert für die BSW17 Mimokörpervakzinationsstrategie für die Entwicklung eines antiallergischen Vakzins indiziert.
Beispiel 10: Inhibition einer passiven kutanen Anaphylaxie durch Vakzination von Rhesusaffen mit rekombinanten BSW17 Mimokörpern
Eine Inhibition einer passiven kutanen Anaphylaxie (PCA) bei Affen kann zum Testen der antiallergischen Aktivität von Verbindungen in vivo angewandt werden.

Eine Mimokörpervakzination führt zu einer Inhibition anaphylaktischer Hautreaktionen bei Rhesusaffen. Gruppen von jeweils zwei Affen injiziert man subkutan mit 500 μg pro Tier an rekombinanten anti-BSW17 Mimokörpern. Nach der primären Immunisation werden zwei Verstärkerinjektionen verabreicht. Etwa 10 Tage nach jeder Verstärkung werden PCA Tests durchgeführt. Dabei werden Affen der Bezeichnungen VI 91, VI 92, VI 93 und VI 95 bezüglich einer PCA Reaktion wiederum drei Monate nach der Injektion der letzten Verstärkung getestet. Das Immunisationsschema ist in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1

Affen	Immunogen	Verstärkung (Tag Nr.)	PCA (Tag Nr.)
VI 91	anti-id-BSW17.52, leichte Kette (SDS426) (Figur 4A)	0, 21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI 92	anti-id-BSW17.52, leichte Kette (SDS426) (Figur 4A)	0, 21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI 93	anti-id-BSW17.52, Fab (SDS427) (Figur 46)	0, 21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI 95	anti-id-BSW 17.52, Fab (SDS427) (Figur 4B)	0, 21, 54, 92	0, 30, 61, 105, 203
VI 2	anti-id-BSW17.43, Fab (SDS463) (Figur 4C)	0, 21, 54, 112	0, 33, 64, 123
VI 75	anti-id-BSW17.43, Fab (SDS463) (Figur 4C)	0, 21, 54, 112	0, 33, 64, 123

Rhesusaffen, die mit kleinen Dosen an Ketaminhydrochlorid (10 bis 15 mg/kg, i. m.) (Ketalar^®, Parke Davis, GB), vorbehandelt sind, um sie immobilisiert zu halten, erhalten i. c. Injektionen verschiedener Dosen von IgE (JW8) (Serotec, Oxford, GB) in die Haut des Abdomens. IgE (JW8) ist ein chimärer Antikörper, der besteht aus einem Antigenbindeteil einer Maus, der spezifisch für das Hapten NIP ist, und einer humanen schweren Kette von Fcε. Zunehmende Mengen (0, 2, 10, 50, 250 ng/ml Kochsalzlösung) an IgE (JW8) werden in einer cephalocaudalen Serie mit einer Kanüle Nr. 30 in einem Volumen von 100 μl injiziert. Zwei h später erfolgt eine intravenöse Verabreichung von 25 mg pro Tier an NIP, das an BSA konjugiert ist. Die Tiere werden nach der intravenösen Verabreichung des NIP-BSA Konjugats erneut sediert. Zur Visualisation der Hautreaktion wird sofort nach der Verabreichung des Antigens ein blauer Farbstoff von Evans (1%, 0,5 ml/kg) intravenös injiziert. Die Hautreaktionen werden 20 min nach der Injektion des Antigens durch Messung von zwei Durchmessern des blauen Flecks und Berechnung ihrer Mittelwerte in mm abgelesen.
PCA wird an den angegebenen Zeitpunkten nach der primären Immunisation und der Verstärkung getestet. Die Intensität von PCA wird berechnet aus der Fläche unter den Kurven (AUC Wert), die durch Auftragung der Durchmesser der Flächen von blauer Haut gegen die injizierten Konzentrationen an IgE (JW8) generiert werden. Die dabei erhaltenen PCA Werte, die in der folgenden Tabelle 4 für jeden einzelnen Affen gezeigt sind, repräsentieren die berechneten AUC Werte.
Tabelle 4
Einfluss einer BSW17 Mimokörpervakzination auf eine passive kutane Anaphylaxie bei Rhesusaffen

A

	PCA Werte
Tage nach der Immunisation	Immunogen anti-id-BSW1:7.52, leichte Kette (SDS426) (Figur 4A)		Immunogen: anti-id-BSW17.52, Fab (SDS427) (Figur 4B
	Affe VI 91	Affe VI 92	Affe VI 93	Affe VI 95
0	11,5¹⁾ (100)²⁾	10,6 (100)	15,8 (100)	15,6 (100)
30	10,5 (91)	10,5 (99)	15,4 (97)	16,8 (108)
61	10,1 (87)	1,8 (17)	21,4 (139)	16,5 (106)
105	4,6 (40)	2,1 (20)	5,6 (35)	7,0 (45)
203	9,8 (84)	6,3 (59)	12,6 (80)	11,2 (72)

B

	PCA Werte
Tage nach der Immunisation	Immogen: Anti-id-BSW17.43, Fab (SDS463) (Figur 4C)
	Affe VI 2	Affe VI 75
0	15,8¹⁾ (100)²⁾	15,8 (100)
33	16,5 (104)	18,9 (120)
64	9,8 (62)	13,0 (82)
124	16,8 (106)	18,9 (120)

¹⁾Die PCA Werte, die aus der Fläche unter den Kurven AUC generiert sind durch Auftragung der Durchmesser der blauen Hautflächen gegen die Konzentrationen an injiziertem IgE (JW8), sind wie bereits vorher beschrieben (77).
²⁾Die PCA Intensität im Verhältnis zu den Werten einer Vorimmunisation. PCA am Tag 0 = 100%.

Werden die einzelnen Vorimmunisationswerte PCA (Werte am Tag 0) als Referenz genommen, dann antworten alle Affen auf eine Mimokörpervakzination mit BSW17 mit einer Reduktion der Intensität von PCA. Beste Ergebnisse werden erhalten mit dem Konstrukt der leichten Kette des Klons 52 (SDS426) (4A) mit Inhibitionsraten von 60 bis 83% (PCA Werte 40 und 17). Affen, die mit dem Klon 52 Fab immunisiert sind (Ansatz SDS427) (4B), supprimieren PCA um 55 bis 65% (PCA Werte 45 und 35). Eine etwas niedrigere Inhibition von PCA im Bereich von 18 bis 38% (PCA Werte 82 und 62) ist beim Klon 43 Fab (Ansatz SDS 463) (4C) zu beobachten, und zwar trotz der Überlegenheit gegenüber den Klon 52 Mimokörpern bezüglich einer Bindung an BSW 17 und einer hoch affinen anti-hIgE Induktion bei Hasen.
Im Anschluss an das Vakzinationsprotokoll wird eine Vakzination mit Mimokörpern des Klons 52 nach der dritten Verstärkungsinjektion (mit Ausnahme des Affen VI 92) wirksam, wobei sich eine partiale PCA Suppression noch immer mehr als drei Monate später beobachten lässt. Im Gegensatz dazu ist Fab des Klons 43 nach der zweiten Verstärkungsinjektion wirksam, während eine dritte Konfrontation mit einem Mimokörper keinen Einfluss zeigt.
Das mittlere PCA Auswertungsprofil für jede Gruppe von zwei Affen, die mit der gleichen Mimokörperpräparation immunisiert sind, das aus den Werten für die einzelnen Affen gemäß Tabelle 4 berechnet ist, ist in der 11 gezeigt.
Ein positives PCA Ergebnis bei vakzinierten Affen (im Verhältnis zu einzelnen Vorbehandlungswerten oder nicht behandelten Kontrolltieren) ist eine klare Indikation für die Wirksamkeit einer Mimokörpervakzination und belegt die Gültigkeit des mechanistischen Konzepts hierfür. Eine Vakzination von Rhesusaffen mit rekombinanten BSW17 Mimokörpern führt zur Erzeugung hoch affiner anti-humaner IgE Antikörper, die PCA in vivo inhibieren. Sequenzliste

Claims

Rekombinanter monoklonaler Antikörper oder Antikörperfragment, welche antiidiotypisch zum Antikörper BSW17 sind, der interferiert mit der Bindung der Cε3 Region von IgE an den hoch affinen Rezeptor für IgE, umfassend – ein Dimer zweier leichter Ketten, die die drei Komplementarität determinierenden Regionen von SEQ ID NR. 46, SEQ ID NR. 48 und SEQ ID NR. 50 umfassen, oder – ein Dimer einer leichten Kette, die die drei Komplementarität determinierenden Regionen von SEQ ID NR 46, SEQ ID NR. 48 und SEQ ID NR. 50 umfasst, und ein Dimer einer schweren Kette, die die drei Komplementarität determinierenden Regionen von SEQ ID NR. 40, SEQ ID NR. 42 und SEQ ID NR. 44 umfasst, oder – ein Dimer einer leichten Kette, die die drei Komplementarität determinierenden Regionen von SEQ ID NR 58, SEQ ID NR. 60 und SEQ ID NR. 62 umfasst, und ein Dimer einer schweren Kette, die die drei Komplementarität determinierenden Regionen von SEQ ID NR. 52, SEQ ID NR. 54 und SEQ ID NR. 56 umfasst.
Monoklonaler Antikörper oder Antikörperfragment gemäß Definition von Anspruch 1, umfassend zwei Polypeptide von SEQ ID NR. 36 oder allotypische Varianten der konstanten Region hiervon, ein Fab Fragment, umfassend Polypeptide von SEQ ID NR. 35 und SEQ ID NR. 36 oder allotypische Varianten der konstanten Region hiervon, oder ein Fab Fragment, umfassend Polypeptide von SEQ ID NR. 37 und SEQ ID NR. 38 oder allotypische Varianten der konstanten Region hiervon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen monoklonalen Antikörper oder ein Antikörperfragment gemäß Definition von Anspruch 1 entweder als eine einzelne molekulare Einheit oder als ein Proteinkonjugat, welches chemisch gekuppelt ist an ein immunogenes Trägermolekül, geeignetenfalls zusammen mit einem Adjuvans und weiteren herkömmlichen Exzipientien.
Monoklonaler Antikörper oder Antikörperfragment gemäß Definition nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Pharmazeutikum für die Behandlung von durch IgE-mediierten Krankheiten.
Polyklonale oder monoklonale Antikörper, erhalten aus einem monoklonalen Antikörper oder Antikörperfragment gemäß Definition von Anspruch 1 zur Verwendung als ein Pharmazeutikum für die Behandlung von durch IgE-mediierten Krankheiten.
Verwendung des Antikörpers BSW17, der mit einer Bindung der Cε3 Region von IgE an den hoch affinen Rezeptor für IgE interferiert, für die Identifikation eines Antikörpers oder Antikörperfragments nach Anspruch 1.