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GEGENSTAND DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Peptide. Die Erfindung betrifft besonders Zusammensetzungen
zur Verabreichung an Hunde, die aktiv eine Immunität gegenüber den
Hunde-Immunoglobin-E-Moleküle verleihen.
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STAND DER TECHNIK
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Es
wird geschätzt,
dass bis zu 30% aller Hunde an Allergien oder allergieähnlichen
Hauterkrankungen leiden. Besonders bei allergischer Dermatitis wird
geschätzt,
dass sie zwischen 3 und 15% der gesamten Hundepopulation betrifft.
Berücksichtigt
man die Verbreitung von Allergien bei Hunden, besteht ein Bedarf
für die Entwicklung
von Verfahren und Zusammensetzungen für die richtige Diagnose und
Behandlung von Allergien bei Hunden.
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Die
Bestandteile, die höchstwahrscheinlich
eine allergische Reaktion verursachen, variieren von Art zu Art.
Herkömmliche
Allergene bei Hunden beinhalten Flöhe, Pollen, Schimmelpilze und
Staub. Es wird angenommen, dass eine Allergie gegen Flöhe die häufigste
Allergie bei Hunden ist. Üblicherweise
ist der Speichel eines Flohs das Allergen und ein einzelner Flohbiss
kann einen kräftigen
Juckreiz verursachen. Eine zusätzliche
Form der Allergie bei Hunden wird Atopie genannt. Die Atopie ist
ein Zustand, in dem ein Hund gegenüber Inhalationsmitteln, wie
z.B. Pollen, Schimmelpilzen oder mikroskopischen Milben, wie sie
z.B. im Hausstaub gefunden werden, allergisch ist.
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Antikörpermoleküle spielen
bei allergischen Erscheinungsformen eine Rolle. In Säugetieren
werden die Antikörpermoleküle durch
zahlreiche Isotypen klassifiziert, die als IgA, IgD, IgE und IgM
bezeichnet werden. Antikörpermoleküle bestehen
sowohl aus schweren – als
auch leichten Kettenbestandteilen. Die schweren Ketten von Molekülen eines
bestimmten Isotyps weisen ausgedehnte Bereiche mit Aminosäuresequenzhomologien
auf und weisen umgekehrt Bereiche mit Unterschieden zu Antikörpern auf,
die zu anderen Isotypen gehören.
Die gemeinsamen Bereiche der schweren Ketten stellen Mitgliedern
jedes Isotyps allgemeine Fähigkeiten
zur Verfügung,
um an bestimmte Zelloberflächenrezeptoren
oder an andere Makromoleküle,
wie z.B. an Komplemente, zu binden. Diese Bereiche der schweren
Ketten dienen daher zur Aktivierung von bestimmten Immuneffektorfunktionen.
Dementsprechend dient die Aufteilung von Antikörpermolekülen in Isotypen zum Auftrennen
der Antikörper
entsprechend eines Satzes von Effektorfunktionen, die sie für gewöhnlich aktivieren.
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In
Menschen und Hunden ist Immunoglobulin E (hiernach als IgE bezeichnet)
an Allergien beteiligt. Das heißt,
dass IgE der Antikörpertyp
ist, der als ein wichtiger Mediator für allergische Reaktionen, welche
die Typ I Überempfindlichkeit
vom Soforttyp einschließt,
bekannt ist.
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IgE
Moleküle
binden an Mastzellen und basophile Granulozyten. Diese Bindung tritt
auf, wenn der Fc-Bereich des IgE-Moleküls an Fc-Rezeptoren auf den
Mastzellen gebunden wird. Wenn derart gebundene IgE-Antikörper dann
an ein Allergen binden, verknüpft
das Allergen mehrere IgE-Antikörper auf
der Zelloberfläche.
Diese Querverknüpfung
vermittelt Reaktionen der Typ 1 Überempfindlichkeit
vom Soforttyp und verursacht die Freisetzung von Histaminen und anderen
Molekülen,
die Symptome hervorrufen, die mit Allergien in Verbindung gebracht
werden.
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Monoklonale
Antikörper,
die unterschiedliche Empfindlichkeitsgrade gegenüber IgE und IgG von Hunden
aufweisen, sind identifiziert worden. (DeBoer, et al. Immunology
and Immunopathology, 37, 183-199 (1993)). DeBoer, et al. identifizierte
zahlreiche monoklonale Antikörper,
die eine Kreuzreaktivität
zwischen IgG und IgE aufwiesen. (siehe, z.B., DeBoer, et al., Tabelle
4 und begleitenden Text). Drei monoklonale Antikörper (A5, D9 und B3) wurden
durch DeBoer et al. identifiziert, da sie eine gewisse Affinität für IgE von
Hunden aufweisen. Von den monoklonalen Antikörpern, die von DeBoer et al.
identifiziert worden sind, erschien der Antikörper D9 als der mit dem größten Neutralisationsgrad
für die
Prausnitz-Kustner-Reaktivität
für atopisches Hundeserum.
Im Kontext der Allergie bei Hunden schlug DeBoer et al. die Verwendung
ihrer monoklonalen Antikörper
(MAbs) bei der Verwendung eines Antigen-spezifischen IgE-ELISAS
und zur Quantifizierung von IgE von Hunden vor. Zusätzlich schlugen
sie die Verwendung ihrer MAbs für
die Immunfärbung
bei Western-Blot Assays vor, um die molekulare Spezifität von IgE-Antikörpern zu
evaluieren als auch für
in vitro-Studien beim Ausstoß von
Granula aus Mastzellen.
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Beim
Menschen ist das Serumniveau an Gesamt-IgE für allergische Erkrankungen
diagnostisch. Um die Möglichkeit
zu untersuchen, dass das Serumniveau von IgE ebenso bei Allergien
in Hunden diagnostisch sein könnte,
wurden zahlreiche Studien durchgeführt. (Hill und DeBoer Am. J.
Yet. Ref., (Juli 1994) 55(7), 944-48). Publikationen, die dem DeBoer-Artikel
folgten, verwendeten einen als D9 bezeichneten monoklonalen Antikörper in
einem ELISA-Assay, das die folgende Konfiguration aufweist: D9 war
an ein Substrat gebunden, Antikörper
wurden durch D9 eingefangen und dann wurde D9, der einen Marker
aufwies, verwendet, um den eingefangenen Antikörper zu kennzeichnen. Das Hill-
und DeBoer-ELISA wurde verwendet, um die Gesamtmenge an IgE im Hundeserum
bei der Bemühung
eine Allergie bei Hunden zu diagnostizieren zu ermitteln. Im Gegensatz
zum Menschen war die Quantität
des IgE's, dessen
Existenz im Kreislauf bei Hunden bestimmt worden ist, von keinerlei
Nutzen bei der Diagnose von Allergien bei Hunden (siehe, z.B., Zusammenfassungs-
und Diskussionsabschnitte von Hill und DeBoer). Dieser Befund stand
im direkten Gegensatz zu der Situation bei der menschlichen Immunologie.
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Diese
divergenten diagnostischen Ergebnisse, die auf den IgE Niveaus im
Menschen verglichen mit solchen Niveaus bei Hunden basieren, zeigen
die Schwierigkeiten jedes Ansatzes, die Daten zwischen Tieren zweier
unterschiedlicher Gattungen zu korrelieren. Diese Schwierigkeit
wird des weiteren durch die Tatsache verschärft, dass Hunde gegen einen
anderen Satz von Antigenen allergisch sein können, als der Mensch. Flöhe sind
zum Beispiel ein ernstes Problem für Hunde, jedoch nicht für Menschen.
Darüber
hinaus weisen in Beispielen, in denen Hunde und Menschen anscheinend
allergisch gegenüber
dem gleichen Allergenextrakt sind, Studien der Doktoren Esch und
Greer aus den Greer-Laboratorien darauf hin, dass die spezifischen
Allergene in einem Allergenextrakt, das eine Erkrankung bei Hunden
hervorruft, nicht notwendigerweise die gleichen Allergene sind,
die eine Erkrankung beim Menschen verursachen. Zum Beispiel ist
bekannt, dass die immunodominanten Bestandteile von Staubmilbenextrakten
bei Hunden anders sind als bei Menschen.
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Die
genomischen Sequenzen, welche die konstanten Bereiche der schweren
Ketten von IgE beim Menschen und Mäusen kodieren, sind bekannt
(zum Beispiel, siehe Ishida et. al., „The Nucleotide Sequence of
the Mouse Immunoglobuline E Gene: Comparison with the Human Epsilon
Gene Sequence",
EMBO Journal 1, 1117-1123 (1982). Ein Vergleich der menschlichen
und Mäusegene
zeigt, dass sie innerhalb der Exons 60% Homologie besitzen und 45-50%
Homologie innerhalb der Introns mit zahlreichen Insertionen und
Deletionen.
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Patel
et al. publizierten die Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der Exons 1-4 des konstanten Bereiches der schweren Ketten im Hunde-IgE
im Artikel mit der Bezeichnung „Sequence of the Dog Immunoglobulin
Alpha and Epsilon Constant Region Genes," Immonogenetics 41, 282-286 (22. März 1995). Die
vollständige
Sequenz des konstanten Bereiches der schweren Ketten des IgE von
Hunden mit membrangebundenen Abschnitten, die durch die Exons S
und 6 kodiert werden, sind in den ebenfalls anhängigen Anmeldungen mit der
Seriennummer 08/800,698, die am 14. Februar 1997 angemeldet worden
ist, 09/146,400, die am 03. September 1998 angemeldet worden ist
und 09/146,617, die am 03. September 1998 angemeldet worden ist,
offenbart.
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Da
man vermutet, dass IgE allergische Symptome vermittelt, mag es wünschenswert
sein, die IgE-Niveaus als Mechanismus zum Lindern allergischer Symptome
zu verringern. Jedoch sind die eigenen IgE-Moleküle eines Patienten Wirtsproteine
und Immunreaktionen gegen solche Proteine werden für gewöhnlich unterdrückt. Bei
der Unterdrückung
von Immunreaktionen gegenüber
Wirtsproteinen, d.h., Toleranz gegenüber Wirtsantigenen, wird angenommen,
dass sie auf vielerlei Arten auftritt.
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Die
gegenwärtige
Hypothese für
die Unterdrückung
von T-Zellen, die gegen Wirtsantigene gerichtet sind, schließt eine
Induktion der „klonalen
Deletion" solcher
T-Zellen im Thymus ein, wobei T-Zellrezeptoren, die möglicherweise
Wirtspeptide im Zusammenarbeit mit MHC-Molekülen erkennen können, eliminiert
werden und man nur solche, die fremde Peptide und MHC-Moleküle erkennen,
expandieren lässt.
Zusätzlich
können ebenso
Suppressor-T-Zellen existieren, welche die Induktion der Immunreaktion
gegenüber
Wirtsproteinen verhindern.
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Im
Gegensatz zur Situation bei den T-Zellen glaubt man, dass es viele
B-Zellen gibt, die Rezeptoren (d.h., Oberflächenimmunoglobulin) für Wirtsproteine
exprimieren, und dass der Grund dieser Zellen Antikörper gegen
Wirtsproteine nicht herzustellen der ist, dass die T-Zellen, die
für die
Antigenpräsentation
gegenüber der
B-Zelle erforderlich sind, narmalerweise fehlen.
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Eine
B-Zelle, die Epitope (Antigen-Bindungsstellen) auf den eigenen IgE-Antikörpern eines
Patienten erkennt, ist in der Lage Antikörper zu erzeugen, für gewöhnlich IgG,
die gegen dieses Wirtsantigen, d.h. IgE, gerichtet sind. Die Existenz
solcher B-Zellen stellt daher eine einzigartige Möglichkeit
dar, um die Herstellung von Autoantikörperreaktionen zu induzieren.
Es gibt einen ungedeckten Bedarf für solche Antikörper, um
eine allergische Erkrankung zu behandeln.
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Die
Hypothese im Bezug auf die „Antigenpräsentation" schließt ein:
die Erkennung des Antigens durch Oberflächenimmunoglobulin auf der
B-Zelle, die Internalisation und Verarbeitung dieses Antigens, die
Anbindung von Peptiden, die von dem Antigen mit den MHC-Molekülen, die
auf der Oberfläche
der B-Zelle exprimiert werden, abstammen, und dann die Erkennung
der angebundenen Antigen-Peptide und MHC-Moleküle durch eine bestimmte T-Zelle.
Die T-Zelle: Die B-Zell-Wechselwirkung führt dann zur Signaltransduktion
in beiden Zellen und der Synthese und Ausarbeitung von löslichen
Zytokinen, die letztendlich zur Antikörperherstellung durch die B-Zelle
führen.
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Das
heißt,
dass in den meisten Fällen
eine Immunreaktion nur auftritt, wenn ein Antigen fremd ist; ansonsten
würde die
Internalisation und Verarbeitung der Wirtsproteine regelmäßig zur
Präsentation
von Wirtspeptid-MHC-Komplexen gegenüber den T-Zellen führen und
dadurch zu Autoimmun-Antikörpern
führen.
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Um
daher eine Antikörperreaktion
gegenüber
einem Wirtspeptid, wie z.B. IgE, zu induzieren, muss das Immunsystem
manipuliert werden, so dass es für
eine autoreaktive B-Zelle möglich
wird, zu einer Antikörpersekretierenden
B-Zelle zu werden. Es besteht ein ungedeckter Bedarf, das Immunsystem
auf diese Art zu manipulieren, insbesondere im Kontext einer allergischen
Erkrankung.
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Es
gibt im allgemeinen zahlreiche bekannte Ansätze für das Erzeugen von Antikörpern für Peptidantigene.
Zum Beispiel haben mehrfach antigenische Peptide (MAP's), die durch Dr.
James Tam (Tam, J.P., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5409-5413)
eingeführt
worden sind, zahlreiche Vorteile für das Induzieren von Anti-Peptid-Antikörpern demonstriert.
Der MAP-Ansatz ist eine verbesserte Alternative gegenüber der
konventionellen Technik ein Peptid-Antigen mit einem Proteinträger zu konjugieren.
Eine der Hauptbeschränkungen, die
mit der Verwendung von Proteinträgern
in Verbindung steht, ist die große Anzahl an Trägern relativ
zu den angebundenen Peptidantigenen. Diese relative Größenmissverhältnis kann
zu einem niedrigen Verhältnis
von Anti-Peptid-Antikörpern
im Vergleich zu Anti-Träger-Antikörpern führen. MAP's weisen für gewöhnlich 4
oder 8 Peptid-Arme auf, die von einer Lysin-Kernmatrix abzweigen,
wie es in 1A-B dargestellt ist. Das Peptid-Antigen
ist mit jedem Arm konjugiert. Daher gibt es im Vergleich zur traditionellen
Protein-Konjugation in einem MAP-System ein höheres Verhältnis von Antigen zu Träger-Molekül. Dieses
Design maximiert die Konzentration des Antigens für eine spezifische
immunogenische Reaktion. Darüber
hinaus hat sich der zentrale Lysinkern des MAP-Peptids als nicht
immunogenisch herausgestellt (Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 85, 5409-5413 (1988); Posnett, D.N. McGrath, H. und Tam,
J.P., J. Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988)). Daher sind aufgrund
von MAP-Peptiden induzierte Antikörper eine direkte Reaktion
auf das Antigen. Die genaue Kenntnis der chemischen Zusammensetzung,
Struktur und Quantität
des Peptids vor der Immunisation ist durch direktes Synthetisieren
des Antigens auf dem verzweigten Lysinkern möglich. Auch weil der MAP-Ansatz die
Notwendigkeit erübrigt,
Peptide mit Träger-Proteinen,
welche die antigenischen Determinanten verändern können, zu konjugieren, wird
die chemische Mehrdeutigkeit eliminiert. Daher glaubt man, dass
MAP's Antikörperreaktionen
von hoher Reinheit, erhöhter
Avidität,
genauer chemischer Definition und verbesserter Sicherheit induzieren.
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Fmoc-MAP-Harze
(erhältlich
bei Applied Biosystems, Foster City, Calif.) sind F-Moc kompatible
Harze, die an eine kleine Kernmatrix von verzweigten Lysinresten
gebunden sind. Die Kernmatrix umfasst zahlreiche Lysinrestniveaus,
die an dem vorherigem Lysin sowohl an den N-α als auch den N-ε-Aminogruppen gebunden ist,
wie in 1A-B dargestellt.
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Beim
experimentellen Impfstoffdesign verwendete MAP-Peptide wiesen hohe Titer von Anti-Peptid-Antikörpern auf,
die das native Protein erkennen. (Tam, J.P., (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci: U.S.A. 85, 5409-5413; Posnett, D.N., McGrath, H., und
Tam, J. P., (1988) J. Biol. Chem. 263, 1719-1725; Auriault, C., Wolowczuk, I., Gras-Masse,
H., Maguerite, M., Boulanger, D., Capron, A., und Tartar, A., (1991)
Peptide Res. 4, 6-11). Zusätzlich
ist eine erhöhte
Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit
der Antikörper-Antigenwechselwirkung als
Folge einer gesteigerten Beschichtungskapazität und Avidität in Festphasen-Immunoassays
mit MAP-Peptiden beobachtet worden. (Tam, J. P. und Zavala, F.,
(1989) J. Immunol. Meth., 124, 53-61).
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Ein
zusätzlicher
Ansatz, der für
das Erzeugen von Antikörpern
für Peptidantigene
als verwendbar bekannt ist, schließt das Anordnen mehrerer Kopien
von Peptiden auf der Oberfläche
von Pflanzenvirus-Partikeln ein. EPICOATTM-Technologie (Axis
Genetics plc., Cambridge, England) ist ein solches Beispiel. Die
EPICOATTM-Technologie basiert auf einer
chimären
Virus-Partikel (CVP)-Technologie, welche die rekombinante genetische
Modifikation von Pflanzenviren verwendet.
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Die
EPICOATTM-Technologie schließt die Insertion
eines kleinen Teils eines fremden Proteins (ein Peptid) in einen
Pflanzenvirus auf eine Art und Weise ein, dass mehrere Kopien des
Peptids auf der Oberfläche des
Viruspartikels präsentiert
werden, Die EPICOATTM-Technologie basiert
gegenwärtig
auf dem Cowpea-Mosaikvirus (CPMV), einem Pflanzenvirus, der die
Cowpea-Pflanze infiziert, und ebenso als „schwarzäugige"-Erbse
bekannt ist. Das ummodifizierte CPMV-Partikel ist ikosaedrisch und
weist einen Durchmesser von etwa achtundzwanzig μm (nm) auf. CPMV-Partikel sind
zusammengesetzt aus zwei Proteinen, die als das große und kleine
Hüllprotein
bezeichnet werden. Studien haben eine Stelle innerhalb des kleinen
Hüllproteins
aufgezeigt, welche die Präsentation
eines fremden Proteins in einer vorstehenden Position auf der Virusoberfläche ermöglicht,
wodurch bis zu 60 Kopien eines bestimmten Peptids auf jedem Viruspartikel
präsentiert
werden können.
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Bei
der EPICOATTM-Technologie werden DNA-Kopien
des genetischen Materials des Pflanzenviruses verwendet. Eine winzige
Menge der DNA, die für
das Virusprotein kodiert, einschließlich des inserierten fremden
Peptids wird auf den Blättern
von jungen Cowpea-Pflanzen zusammen mit einem Scheuerpulver aufgetragen.
Nach leichtem Reiben tritt die DNA in die Blätter ein und verwendet die
pflanzeneigenen zellulären
Mechanismen, um die Erzeugung von funktionellen Viruspartikeln zu
initiieren. Das Virus repliziert sich innerhalb der inokulierten
Blätter
und verteilt sich über
die wachsende Pflanze.
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Nach
zwei bis drei Wochen wird Pflanzmaterial, das große Mengen
des Viruses enthält,
abgeerntet. Chimäre
Viruspartikel (CVP's)
werden durch Zentrifugation und selektive Präzipitation von homogenisiertem Pflanzenmaterial
isoliert. Zwischen 1 und 2 Gramm an CVPs kann pro Kilogramm Frischgewicht
an Pflanzenmaterial erhalten werden. Cowpea-Pflanzen werden in einer kontrollierten
Umwelt im Übermaß leicht
heranwachsen, was die Erzeugung von großen Mengen an CVPs ermöglicht.
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Es
ist berichtet worden, dass Peptide mit einer Größe von bis zu sechsunddreißig Aminosäuren erfolgreich
in CVPs inkorporiert worden sind. Die sich daraus ergebenden Partikel
sind mit einem thermischen Inaktivierungspunkt bei 65°C sehr robust.
Bei den CVPs stellte sich heraus, dass sie einem sauren pH- als
auch proteindegradierenden Enzymen widerstehen. Es ist berichtet
worden, dass die exprimierten Peptide dazu in der Lage sind, spezifische
Immunreaktionen in Tieren hervorzurufen. Es ist angenommen worden,
dass die Oberflächenpräsentation
von Peptiden die Erkennung durch das Wirtsimmunsystem steigern könnte und
einen Weg zur Entwicklung von rekombinanten Spaltvakzinen und Immunotherapeutika
bereitstellen könnte.
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DeBoer
et al., 1993 (Veterinary Immunology and Immunopathology, 37 (1993)
183-199) haben eine Reihe von Mäuse-Hybridomazelllinien
erzeugt, die monoklonale Antikörper
mit Spezifität
für Immunoglobulin E
und G von Hunden herstellten. Diese monoklonalen Antikörper wurden
auf ihre Fähigkeit
getestet, eine umgekehrte kutane anaphylaktische Reaktion in der
Haut von Hunden zu induzieren, um die Prausnitz-Küstner-Reaktivität des atopischen
Hundeserums zu neutralisieren, um als Ligand bei der Immunoaffinitätschromatographie
zu dienen und um an IgE und anderen Ig-Unterklassen in zahlreichen
ELISA-Systemen zu binden. Einige der so hergestellten monoklonalen
Antikörper
waren spezifisch für
IgE vom Hund.
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Konieczny
et al., 1997 (Immunology 1997, 92, 577-586) berichtet über die
Isolation von cDNA's,
die für
wesentliche allergene Proteine kodieren und ihre Nukleotide und
abgeleiteten Aminosäuresequenzen
präsentieren.
Beide Proteine (VEG-Proteine und MUP) sind Mitglieder der Lipocalin-Familie
der kleinen ligandenbindenden Proteinen. Rekombinanten Formen dieser
Proteine wurden erzeugt und auf Immunoglobulin-E-Reaktivität getestet. Zusätzlich waren
beide rekombinanten Proteine in der Lage, IgE querzuvernetzen und
die Histaminfreigabe aus peripheren Blutleukozyten in vitro auszulösen.
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Burt
et al., 1987 (Molecular Immunology, Vol. 24, Nr. 4, s. 379-389,
1987) beschreiben die Herstellung von polyklonalen Antisera mit
vorbestimmten Spezifitäten
für einen
Bereich von Ratten-IgE-Epitopen durch Immunisieren von Hasen-KLH-Konjugaten von fünf verschiedenen
synthetischen Peptiden, die unterschiedliche Sequenzen in der CH3-
und CH4-Domäne
im Ratten-IgE repräsentieren.
Die Antipeptidseren wurden in funktionellen Assays getestet, die
zur Untersuchung der Art der Wechselwirkung zwischen Ratten-IgE
und seinem Rezeptor auf Ratten-Mastzellen entworfen worden ist.
Jedes Antipeptidserum konnte die Bindung von IgE an Mastzellen inhibieren
und konnte darüber
hinaus die Sekretion von Histamin aus Zellen, die mit IgE in Ratten auf
eine „Anti- IgE" induzierte Art und
Weise sensibilisiert worden sind, initiieren.
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Presta
et. al., 1993 (Journal of Immunology, Vol. 151, 2623-2632, Nr. 5,
1993) beschreiben die Humanisierung eines Mausantikörpers, der
die Fähigkeit
besitzt, das Anbinden von IgE an seinen hochaffinen Rezeptor zu
blockieren, der jedoch nicht an IgE bindet, wenn er einmal an den
Rezeptor gebunden ist, da dies eine Histaminfreigabe auslösen würde. Abwandlungen
des humanisierten Antikörpers
wurden evaluiert, um die Bedeutung von Resten im Gerüst auf die
Antikörperbindung
zu untersuchen und um zu bestimmen, welche geladenen Reste im CDR
mit IgE wechselwirken. Man fand heraus, dass nur fünf Veränderungen
in den Resten im menschlichen Gerüst erforderlich waren, um ein
Anbinden vergleichbar mit dem des ursprünglichen Mausantikörpers bereitzustellen.
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Offenbarung der Erfindung
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Offenbart
ist ein spezifisches Bindungsprotein, das an natives, freies oder
an eine B-Zelle gebundenes Hunde-IgE Exon 3 spezifisch bindet und
das nicht an das IgE Exon 3 bindet, wenn das IgE an einem Rezeptor auf
einer Mastzelle gebunden ist. Das oberflächengebundene IgE kann IgE
sein, das auf der Oberfläche
einer B-Zelle von Hunden exprimiert wird.
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Offenbart
ist ein spezifisches Bindungsprotein, das an ein isoliertes und
gereinigtes Peptid spezifisch bindet, das ein zwei Peptid-Bindungen
entfernt von einem Tyrosin-Arginin-Paar angeordnetes Leucin umfasst, z.B.,
SEQ ID NO:1 Leucin-Platzhalter-Platzhalter-Tyrosin-Arginin,
SEQ ID NO:2 Tyrosin-Arginin-Platzhalter-Platzhalter-Leucin
oder SEQ ID NO: 3 Leucin-Platzhalter-Platzhalter-Tyrosin-Arginin-Platzhalter-Platzhalter-Leucin.
Das Peptid kann aus von fünf
bis 71 Aminosäuren
bestehen.
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Offenbart
ist ein Antikörper,
der an ein bestimmtes Epitop bindet und der gegen ein isoliertes
und gereinigtes Peptid gerichtet ist, dass eine Aminosäuresequenz
oder eine konservative Variante davon umfasst, die umfasst: SEQ
ID NO: 4 Thr-Leu-Leu-Glu-Tyr-Arg-Met; ebenso offenbart ist ein rekombinantes
Bindungsmolekül,
das an das bestimmte Epitop, das durch den Antikörper gebunden ist, spezifisch
bindet.
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Offenbart
ist ein Antikörper,
der an ein bestimmtes Epitop bindet und der gegen ein isoliertes
und gereinigtes Peptid gerichtet ist, das eine Aminosäuresequenz
oder eine konservative Variante davon umfasst, die umfasst: SEQ
ID NO:5 Gly-Met-Asn-Leu-Thr-Trp-Tyr-Arg-Glu-Ser-Lys; ebenso offenbart
ist ein rekombinantes Bindungsmolekül, das an das bestimmte Epitop,
das durch den Antikörper
gebunden ist, spezifisch bindet.
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Ebenso
offenbart ist ein spezifisches Bindungsprotein, das gegen ein mehrfach
antigenisches Peptid, das mehrere Kopien eines isolierten und gereinigtes
Peptids, das ein zwei Peptidbindungen entfernt von einem Tyrosin-Arginin-Paar
angeordnetes Leucin umfasst, gerichtet ist; das spezifische Bindungsprotein
bindet spezifisch an ein bestimmtes Epitop. Das isolierte und gereinigte
Peptid kann 5-71 Aminosäuren
aufweisen. Ebenso offenbart ist ein rekombinantes Bindungsmolekül, das an
das bestimmte Epitop, das durch das Bindungsprotein gebunden ist,
spezifisch bindet.
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Offenbart
ist ein spezifisches Bindungsprotein, das an ein isoliertes und
gereinigtes Peptid, das ein Cystein, das zwei Peptidbindungen entfernt
von einem Prolin-Histidin-Paar angeordnet ist, das drei Peptidbindungen
entfernt von einem Cystein angeordnet ist, umfasst, spezifisch bindet.
Das Peptid kann die Form aufweisen: SEQ ID NO: 6 Cystein-Platzhalter-Platzhalter-Prolin-Histidin-Platzhalter-Platzhalter-Platzhalter-Cystein. Die
Cysteine können
durch eine Reduktionsreaktion, die das Peptid zyklisiert und zu
Cystin werden lässt,
eine kovalente Bindung ausbilden. Das Peptid kann 9 bis 71 Aminosäuren umfassen.
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Offenbart
ist ein Antikörper,
der an ein bestimmtes Epitop bindet und der gegen ein isoliertes
und gereinigtes Peptid gerichtet ist, das die Aminosäuresequenz
oder eine konservative Variante davon aufweist, die umfasst: SEQ
ID NO: 7 Serin-Valin-Threonin-Leucin-Cystein-Prolin-Asparagin-Prolin-Histidin-Isoleucin-Prolin-Methionin-Cystein-Glycin-Glycin-Glycin. Die
Cysteine können
durch eine Reduktionsreaktion, die das Peptid zyklisiert und zu
einem Cystin werden lässt,
eine kovalente Bindung ausbilden. Ebenso offenbart ist ein rekombinantes
Bindungsmolekül,
das mit dem bestimmten Epitop, das durch den Antikörper gebunden
ist, spezifisch bindet.
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Offenbart
ist ein Antikörper,
der an ein bestimmtes Epitop bindet und der gegen ein isoliertes
und gereinigtes Peptid gerichtet ist, das die Aminosäuresequenz
oder ein konservative Variante davon aufweist, die umfasst: SEQ
ID NO:8 Serin-Alanin-Cystein-Prolin-Asparagin-Prolin-Histidin-Asparagin-Prolin-Tyrosin-Cystein-Glycin-Glycin-Glycin.
Die Cysteine können
durch eine Reduktionsreaktion, die das Peptid zyklisiert, wobei
die Aminosäure
in Cystin umgeändert
wird, eine kovalente Bindung ausbilden. Ebenso offenbart ist ein
rekombinantes Bindungsmolekül,
das an ein bestimmtes Epitop, das durch den Antikörper gebunden
ist, spezifisch bindet.
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Offenbart
ist ein spezifisches Bindungsprotein, das an ein isoliertes und
gereinigtes Peptid, das ein Cystein, das eine Peptidbindung von
einem Prolin-Histidin-Paar angeordnet ist, das eine Peptidbindung
von einem Prolin angeordnet ist, das zwei Peptidbindungen von einem
Cystein angeordnet ist, umfasst; das Peptid kann die Form aufweisen:
SEQ ID NO: 9 Cystein-Platzhalter-Prolin-Histidin-Platzhalter-Prolin- Platzhalter-Platzhalter-Cystein.
Die Cysteine können
durch eine Reduktionsreaktion, die das Peptid zyklisiert und zu einem
Cystin werden lässt,
eine kovalente Bindung ausbilden. Das Peptid kann von 9 bis 71 Aminosäuren umfassen.
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Offenbart
ist ein Antikörper,
der an ein bestimmtes Epitop bindet und der gegen ein isoliertes
und gereinigtes Peptid gerichtet ist, das die Aminosäuresequenz
oder eine konservative Variante davon aufweist, die umfasst: SEQ
ID NO: 10 Serin-Alanin-Cystein-Histidin-Prolin-Histidin-Leucin-Prolin-Lysin-Serin-Cystein-Glycin-Glycin-Glycin.
Die Cysteine können
durch eine Reduktionsreaktion, die das Peptid zyklisiert und zu
einem Cystin werden lässt,
eine kovalente Bindung ausbilden. Ebenso offenbart ist ein rekombinantes
Bindungsmolekül,
das an das bestimmte Epitop, das durch den Antikörper gebunden ist, spezifisch
bindet.
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In Übereinstimmung
mit der Erfindung können
spezifische Bindungsproteine Antikörper sein, entweder polyklonale
oder monoklonale. Zum Beispiel kann der monoklonale Antikörper 8H.8
oder 15A.2 sein. In Übereinstimmung
mit der Erfindung wird der Antikörper
an ein bestimmtes Epitop binden; ebenso offenbart sind rekombinante
Bindungsmoleküle,
die an das bestimmte Epitop, das durch einen Antikörper in Übereinstimmung mit
der Erfindung gebunden ist, spezifisch binden.
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Ebenso
offenbart ist in Übereinstimmung
mit der Erfindung die Verwendung eines spezifischen Bindungsproteins
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
oder Prophylaxe einer Allergie bei Hunden. In einer bevorzugten
Verwendung umfasst diese pharmazeutische Zusammensetzung weiter
ein Verdünnungsmittel.
Weiterhin ist die Verwendung eines spezifischen Bindungsproteins
für die
Herstellung eines Kits einer pharmazeutischen Zusammensetzung offenbart,
wobei das Kit eine erste Dosis dieses spezifischen Bindungsproteins
und eine Booster-Dosis dieses spezifischen Bindungsproteins umfasst.
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DEFINITIONEN
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cDNA Klon:
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Eine
Duplex-DNA-Sequenz, die eine RNA repräsentiert, die in einem Klonierungsvektor
getragen wird.
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Klonierung:
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Die
Auswahl und Vermehrung einer einzelnen DNA-Spezies.
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Klonierungsvektor:
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Eine
Plasmid-, Phagen-DNA- oder andere DNA-Sequenz, die sich in einer
Wirtszelle replizieren kann und eine exogen zugefügte DNA-Sequenz
für den
Zweck der Amplifikation oder Expression der zugegebenen DNA-Sequenz
tragen kann.
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Codon:
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Ein
Triplet von Nukleotiden, das eine Aminosäure oder ein Terminationssignal
repräsentiert.
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Konservative Varianten:
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Konservative
Varianten von Nukleotidsequenzen beinhalten Nukleotidsubstitutionen,
die zu keinen Abänderungen
in der Aminosäuresequenz,
die durch solche Nukleotide kodiert wird, führen, als auch Nukleotidsubstitutionen,
die Substitutionen konservativer Aminosäuren zur Folge haben, z.B.
Aminosäuresubstitutionen,
die den Charakter des von den Nukleotiden translatierten Polypeptids
nicht im wesentlichen beeinflussen. Zum Beispiel wird der Charakter
eines von IgE abgeleiteten Peptids nicht im wesentlichen beeinflusst,
wenn die Substitutionen die spezifische Bindung des Peptids an einen
Hunde-Ige-Rezeptor oder andere Hunde-IgE-Bindungsliganden ausschließen.
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Konservative
Varianten von Aminosäuresequenzen
beinhalten Aminosäuresubstitutionen
oder -deletionen, die den Charakter des abgewandelten Polypeptids
relativ zum Startpeptid nicht im wesentlichen beeinflussen. Zum
Beispiel ist der Charakter des Polypeptids nicht im wesentlichen
beeinflusst, wenn die Substitutionen oder Deletionen nicht die spezifische
Bindung des abgewandelten Peptids an einem spezifischen Bindungspartner
des Startpeptids ausschließen.
per Begriff Mimotop bezieht sich auf eine konservative Variante einer
Aminosäuresequenz,
gegen die eine Antikörperspezifität erzielt
worden ist. Das Mimotop umfasst eine Variante des Epitops des Startpeptids,
so dass es in der Lage ist, Antikörper zu binden, die mit dem
Original-Epitop querreagieren.
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DNA-Sequenz:
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Eine
lineare Serie von Nukleotiden, die über Phosphodiester-Bindungen
zwischen dem 3' und
5' Kohlenstoff benachbarter
Pentosen miteinander verbunden sind.
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Expression:
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Der
von einem strukturellen Gen durchlaufene Prozess zur Erzeugung eines
Polypeptids. Es ist eine Kombination von Transkription und Translation.
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Expressionskontrollsequenz:
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Eine
DNA-Sequenz von Nukleotiden, welche die Expression von strukturellen
Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie mit diesen Genen operativ
verknüpft
ist.
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Exon:
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Ein
zusammenhängender
DNA Bereich, der einen Abschnitt eines Polypeptids kodiert. Die
Bezugnahme auf alle Exons, z.B. „DNA-Sequenz von Exon 6", bezieht sich auf
das komplette Exon oder jeden Abschnitt davon.
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Genom:
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Die
vollständige
DNA einer Substanz, Es beinhaltet inter alia die strukturellen Gene,
die für
die Polypeptide der Substanz als auch den Operator, Promoter und
Ribosombindende- und wechselwirkende Sequenzen, wie z.B. die Shine-Dalgarno-Sequenzen,
kodiert.
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Nukleotid:
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Eine
monomerische Einheit von DNA oder RNA, die aus einem Zuckerrest
(Pentose), einem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen
Base besteht. Die vier DNA-Basen sind Adenin („A"), Guanin („G"), Cytosin („C") und Thymin („T"). Die vier RNA-Basen sind A, G, C und
Uracil („U"). A und G sind Purine und
C, T und U sind Pyrimidine.
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Phage oder Bakteriophage:
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Bakterielle
Viren, von denen viele DNA-Sequenzen beinhalten, die in einer Proteinhülle oder
Ummantelung („Kapsid") enkapsidiert sind.
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Plasmid:
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Eine
autonome, selbstreplizierende, extrachromosomale, zirkuläre DNA.
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Polymerase Kettenreaktion
(PCR):
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Ein
Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-DNA-Sequenz, die in einer
Mischung von DNA-Sequenzen enthalten ist, durch Verwendung von Oligonukleotid-Primern,
welche die Ziel-DNA-Sequenz in sich wiederholenden Zyklen der DNA-Synthese
der Target-DNA-Sequenz flankieren.
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Polypeptid:
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Eine
lineare Serie von Aminosäuren,
die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und
Carboxyl-Gruppen von benachbarten Aminosäuren verbunden sind.
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Leserahmen:
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Die
Gruppierung von Codons währen
der Translation von mRNA in Aminosäuresequenzen. Die Sequenz GCTGGTGTAAG
kann zum Beispiel in drei Leserahmen oder Phasen translatiert werden,
von denen jeder eine unterschiedliche Aminosäuresequenz hervorbringt:
GCT
GGT TGT AAG-Ala-Gly-Cys-Lys
G CTG GTT GTA AG-Leu-Val-Val
GC
TGG TTG TAA A-Trp-Leu-(STOP).
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Rekombinantes DNA-Molekül:
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Eine
Hybrid-DNA-Sequenz, die mindestens zwei Nukleotidsequenzen umfasst,
wobei die erste Sequenz normalerweise nicht in der Natur zusammen
mit der zweiten gefunden wird.
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Spezifische Bindung:
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Die
Bindung einer Substanz an eine andere bei einer größeren Bindungsaffinität als der
Hintergrundbindung. Zwei Substanzen, die eine spezifische Bindung
aufweisen, werden als spezifische Bindungspartner oder als ein spezifisches
Bindungspaar bezeichnet. Ein Antikörper und sein Antigen sind
ein Beispiel für
ein spezifisches Bindungspaar.
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Spezifisches Bindungsmolekül:
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Ein
Molekül,
das eine spezifische Bindung zu seinem korrespondierenden Bindungspartner
aufweist, um ein spezifisches Bindungspaar auszubilden. Sowie es
hier verwendet wird, deckt diese Definition eines spezifischen Bindungsmoleküls monoklonale und
polyklonale Antikörper,
antigenbindende Fragmente dieser Antikörper, Hybridantikörper, einkettige
Antikörper
und rekombinante Moleküle,
die an einen Liganden spezifisch binden können, ab.
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Strukturelles Gen:
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Eine
DNA-Sequenz, die durch ihre Matrize oder Boten-DNA („mRNAII") eine Sequenz von
Aminosäuren
kodiert, die für
ein spezifisches Polypeptid charakteristisch sind.
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Transkription:
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Synthese
von RNA auf einer DNA-Matrize.
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Translation:
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Synthese
von Peptiden auf der mRNA-Matrize.
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Beschreibung der Figuren
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1A zeigt die Kernstruktur eines MAP-Proteins
mit vier Armen, d.h., ein 4-MAP-Protein; 1B zeigt
die Kernstruktur eines MAP-Proteins mit acht Armen, d.h., ein 8-MAP-Protein.
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2 zeigt
Daten, welche die Bindungscharakteristika verschiedener monoklonaler
Antikörper
mit oberflächengebundenem
IgE (z.B., analog zu IgE, das auf der Oberfläche von B-Zellen exprimiert
wird); IgE-Rezeptor (z. B., analog zum Fc-Rezeptor auf Mastzellen);
und mit einer Kombination von IgE, wenn es durch den IgE-Rezeptor
gebunden ist, vergleichen. Daher wurde jeder untersuchte Bestandteil
auf einer festen Oberfläche
immobilisiert.
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3 zeigt
die Fähigkeit
des rekombinanten Exons 3, das Anbinden von konjugiertem Antikörper 8H.8 oder
konjugiertem Antikörper
15A.2 an eine feste Phase mit IgE zu inhibieren. Die Daten für 8H.8 werden
durch gepunktete Säulen
dargestellt, die Daten für
15A.2 werden durch schwarze Säulen
dargestellt.
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4 zeigt
die Fähigkeit
von gelöstem
gereinigtem IgE vom Hund, den monoklonalen Antikörper 8H.8 (2,5 μg/ml) oder
den monoklonalen Antikörper
15A.2 (2,5 μg/ml)
vor dem Anbinden an eine feste Phase mit IgE vom Hund zu inhibieren.
Die Daten für
8H.8 werden durch gepunktete Säulen
dargestellt die Daten für 15A.2
werden durch schwarze Säulen
dargestellt.
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5 zeigt
die Fähigkeit
des monoklonalen Antikörpers
15A.2 oder monoklonalen Antikörpers
8H.8 das IgE vor dem Anbinden an einen rekombinanten IgE-Rezeptor,
der auf einer festen Phase immobilisiert ist, zu inhibieren, wie
durch den monoklonalen Antikörper
D9 detektiert wurde.
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6 zeigt
die Aminosäuresequenzen
der New England Biolabs PhDc7c-Phagen-Display-Bibliothek, die durch
den monoklonalen Antikörper
15A.2 gebunden wurden. Diese Sequenzen werden in Ausrichtung mit der
Proteinsequenz des IgE's
von Hunden dargestellt.
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7 zeigt
die Ausrichtung des 15A.2 Bindungsbereiches von sieben unterschiedlichen
Säugetieren: Hund,
Mensch, grüne
Meerkatze, Katze, Schwein, Maus und Pferd.
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8 zeigt
die Fähigkeit
eines Phagen, der 15A.2 Mimotop-Peptide freisetzt, das sie das Anbinden von
Hunde-IgE an den 15A.2 monoklonalen Antikörper auf der festen Phase inhibieren
können.
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9 zeigt
die Fähigkeit
einer spezifischen 15A.2 Mimotop-Peptidsequenz, die an die feste
Phase gebunden ist, das sie den 15A.2 monoklonalen Mimotop-Antikörper binden
kann.
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10A und 10B zeigen
die Fähigkeit
eines 15A.2 Mimotop-Peptids, das sie das Anbinden des 15A.2 monoklonalen
Antikörpers
an das IgE von Hunden auf der festen Phase verhindern können.
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11 zeigt
die Fähigkeit
des monoklonalen Antikörpers
8H.8 und des monoklonalen Antikörpers 15H.2,
dass sie an gereinigtes IgE vom Hund, das auf einer festen Phase
immobilisiert ist, binden können.
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12 zeigt
Daten einer Studie, welche die Fähigkeit
des Antikörpers
15A.2, der an einen Signalrest konjugiert ist, an feste Phasen mit
zahlreichen darauf immobilisierten Peptiden binden zu können, auswertet.
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13 zeigt
Daten einer Studie, welche die Fähigkeit
eines monoklonalen Antikörpers
14K2, der dafür bekannt
ist, das er an das Exon 4 des IgE's vom Hund bindet, an verschiedenen
auf einer festen Phase immobilisierten Peptiden binden zu können, auswertet.
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14 zeigt
Daten einer Studie, welche die Fähigkeit
eines monoklonalen Antikörpers
15A.2, der dafür
bekannt ist, das er an das Exon 3 des IgE's vom Hund bindet, an verschiedenen
auf einer festen Phase immobilisierten Peptiden binden zu können, auswertet.
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15 zeigt
Daten einer Studie, welche das Anbinden des monoklonalen Antikörpers 8H.8
oder eines polyklonalen Antikörpers,
der gegen rekombinantes IgE (Re-hu IgE) gerichtet ist, an eine feste
Phase mit dem Peptid E3a.5 oder einem substituierten Peptid E3a.5
(bezeichnet als Peptid S3a.5), das darauf immobilisiert ist, binden
zu können,
vergleicht.
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16 zeigt
Daten einer Studie, welche die Fähigkeit
des Antikörpers
8H.8, der mit einem Signalrest konjugiert ist, an feste Phasen mit
verschiedenen darauf immobilisierten Peptiden binden zu können, auswertet.
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17 zeigt
die Fähigkeit
polyklonaler Anti-Humaner-IgE-Antikörper an
verschiedene auf einer festen Phase immobilisierten Peptide zu binden.
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WEGE ZUR AUSFÜHRUNG DER
ERFINDUNG
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Vorgeschlagener Wirkmechanismus
von monoklonalen Anti-IgE-Antikörpern bei
der Verursachung von persistenter Serum-IgE-Depletion
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Eine
Hypothese in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung ist, dass monoklonale Anti-IgE-Antikörper die
IgE-Niveaus durch
direktes Binden des vorhandenen zirkulierenden IgE's, wonach der gebundene
Komplex aus dem Kreislauf entfernt wird, beeinflussen.
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Darüber hinaus
wird angenommen, dass monoklonale Anti-IgE-Antikörper die IgE-Niveaus durch
Beeinflussung der Herstellung von neuem IgE durch B-Zellen beeinflussen.
Gedächtnis-B-Zellen,
Zellen die nach Interaktion mit einem Antigen und einer T-Zelle
zu Antikörper-herstellenden
Zellen (d.h. „Gedächtnis IgE-B-Zellen") werden, sind beim
Regenerieren von Serum-IgE beteiligt und diese Zellen enthalten
IgE als ihre Zelloberflächen-Rezeptoren.
Daher ist es möglich,
dass monoklonale Anti-IgE-Antikörper
an IgE auf diesen Antikörper-produzierenden
Zellen binden und mit deren Funktion wechselwirken, wie z.B. durch
Herabregulieren oder durch einen oder mehrere Mechanismen, welche
zur Zellzerstörung
führen.
Zwei allgemeine Wege sind vorgeschlagen worden, wie die Bindung
eines monoklonalen Antikörpers
an eine Gedächtnis-B-Zelle
mit der Produktion von IgE wechselwirken könnte.
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Zuerst
könnte
die Aktivierung einer Gedächtnis-B-Zelle
ebenso die Involvierung eines als CD23 bezeichneten Oberflächen-IgE-Bindungsfaktors
erfordern. Das Anbinden von bestimmten monoklonalen Antikörpern an
das Zelloberflächen-IgE könnte das
Anbinden von CD23 ausschließen
und könnte
dadurch zu einer Unfähigkeit
führen,
eine IgE-Reaktion zu bewirken.
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Zweitens
könnte
die IgE-Antikörper-Herstellung
durch eine Gedächtnis-IgE-B-Zelle
durch das Anbinden eines monoklonalen Antikörpers, der gegen den Rezeptor
für das
IgE-Molekül,
der auf der Oberfläche
der Gedächtnis-B-Zelle
angeordnet ist, gerichtet ist oder diesen blockiert, verringert
oder eliminiert werden.
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In
Abwesenheit eines monoklonalen Antikörpers, der zur Eliminierung
oder Inaktivierung der Gedächtnis-IgE-B-Zelle
führt,
wäre es
jedoch zu erwarten, dass die Gedächtnis-IgE-B-Zellen regeneriert
würden,
was letztendlich zur Regenerierung des zirkulierenden IgE's führt.
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Die
Serum-Niveaus von IgE sind in Patienten erhöht, die allergische Erkrankungen
erfahren. Wie hier offenbart wird, wenn Antikörper erzeugt wurden, die an
eine IgE-Art spezifisch binden und diese Antikörper an einen Patienten verabreicht
wurden, der ein Mitglied der Art ist („passive Immunisierung"), dass die Serum-Niveaus
an IgE des Patienten abfielen. Gemäß dem Verständnis des Durchschnittsfachmanns
werden die spezifischen Bindungsproteine in Übereinstimmung mit der Erfindung
in pharmakologisch geeigneten Dosierungen verabreicht und können mit
geeigneten biokompatiblen Verdünnungsmitteln
verabreicht werden. Ebenso hierin offenbart sind ein Verfahren und
dazugehörige
Zusammensetzungen, die dazu dienen, eine Reaktion auf ein Wirtspeptid,
wie z.B. ein IgE-Molekül,
zu induzieren, wobei das Immunsystem so manipuliert wird, um es
einer autoreaktiven B-Zelle zu ermöglichen, zu einer Antikörpersekretierenden
B-Zelle („aktive
Immunisierung")
zu werden.
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Rezeptoren
sind auf Mastzellen vorhanden, die an IgE aus dem Kreislauf binden.
Wenn sich das IgE an die Rezeptoren auf den Mastzellen gebunden
hat, können
sich die IgE-Moleküle
quervernetzen. Nach dem Vernetzen dieser IgE-Moleküle wird
die Mastzelle induziert, Histamin freizusetzen. Histamin ist eine
Substanz, die das Erkennbarwerden von allergischen Symptomen induziert.
Im allgemeinen tritt die Quervernetzung durch das Anbinden der IgE-Moleküle an ein
Antigen ein, z.B. ein Allergen. Jedoch könnte ein monoklonaler Antikörper, der
an IgE bindet, als ein Mittel zum Quervernetzen von IgE, dass an
die Oberfläche
der Mastzellen gebunden worden ist, dienen.
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Für allergische
Individuen wird es, wenn Anti-IgE-Antikörper im Kreislauf vorhanden
waren, einfach sich vorzustellen, dass das Anbinden solcher Auto-Anti-IqE
an IgE-Moleküle auf Mastzellen
für das
Quervernetzen der IgE-Moleküle auf diesen
Zellen dienen und sogar in Abwesenheit eines Allergens eine permanente allergische
Reaktion erschweren könnte.
Dieser Vorgang ist im Rahmen einer Behandlung einer Allergie eindeutig
unerwünscht.
Ein Antikörper,
der diese Funktion erzielt, wäre
daher für
die Verwendung als ein Therapeutikum in Übereinstimmung mit der Erfindung
nicht bevorzugt. Daher ist ein Antikörper, der eine solche Quervernetzung
erzielt, nachteilig und wird in Übereinstimmung
mit der Erfindung nicht bevorzugt.
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Es
gibt zwei Ansätze
für die
Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die IgE als Ziel haben,
die jedoch IgE-Moleküle,
die an eine Mastzelle gebunden worden sind, nicht quervernetzen.
Als erstes werden monoklonale Antikörper erzeugt, die gegen ein
Epitop eines IgE-Moleküls,
das nur zugänglich
ist, wenn das IgE sich im Kreislauf befindet, gerichtet ist. Da
der monoklonale Antikörper
nur an IgE binden kann, wenn es sich im Kreislauf befindet, wird
es nicht in der Lage sein, an IgE zu binden, dass an die Oberfläche einer
Mastzelle gebunden worden ist.
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Ein
alternativer Ansatz zum Erzeugen von Anti-IgE-Antikörpern wurde von Stanworth et
al. angenommen, z.B. U.S. Patent Nr. 5,601,821, das am 11. Februar
1997 erteilt worden ist. Die Antikörper von Stanworth sind als
mit IgE auf Mastzellen quervernetzend offenbart, jedoch auf eine
Art und Weise, welche nicht die Histamin-Freigabe induziert.
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Stanworth
hat ein Epitop auf dem menschlichen IgE-Molekül offenbart, dass verfügbar oder
zugänglich
sein muss, nachdem IgE-Moleküle
auf der Oberfläche
einer Mastzelle quervernetzt worden sind, damit die Mastzelle Histamine
freisetzen kann. Demnach offenbarte Stanworth einen Antikörper, der
an dieses bestimmte Epitop bindet. Daher werden monoklonale Antikörper, die
gegen dieses IgE-Epitop gerichtet sind, dazu dienen, das IgE querzuvernetzen,
werden es der Mastzelle jedoch nicht ermöglichen, Histamin freizusetzen.
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Der
Ansatz, der in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verfolgt wird, ist die Entwicklung von
Antikörpern
entweder ex vivo monoklonal oder in vivo anti-Wirtsantikörper, die gegen Epitope gerichtet sind,
die gegenüber
im Kreislauf befindlichen IgE zugänglich sind, die jedoch nicht
zugänglich
sind, wenn solches IgE auf Mastzellen gebunden ist.
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Passive Immunität
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Monoklonale Antikörper 15A.2
und 8H.8
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Der
monoklonale Antikörper
15A.2 bindet an IgE vom Hund. Der monoklonale Antikörper 15A.2
wurde durch Immunisieren von Mäusen
mit affinitätsgereinigtem
IgE vom Hund erhalten. Das durch 15A.2 gebundene Epitop ist konformativ,
nicht linear. Wie durch die in 2 dargestellten
Daten gezeigt, bindet 15A.2 nicht an den IgE-Rezeptor; noch bindet
es an IgE, wenn dieses an einen Rezeptor gebunden ist. Jedoch zeigte
15A.2 eine Affinität
für freies
IgE. Es bindet an rekombinante Fusionsproteine des Exons 3 von Hunden
in Enzymimmunoassays (ELISA) und über Western-Blot, jedoch nicht
an andere rekombinante Fusionsproteine des IgE's von Hunden.
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Experimente
zur Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 15A.2 zeigten, dass 15A.2
nicht an IgE bindet, dass bereits durch den IgE-Rezeptor auf Mastzellen
gebunden war. Daher erschien es, dass der Zugang zu dem durch 15A.2
gebundenen Epitop durch IgE, dass an den Fc-Rezeptor auf Mastzellen
bindet, gehindert wurde. Dementsprechend wird 15A.2 IgE, dass an
Mastzellen gebunden ist, nicht quervernetzen. Dieser Befund wurde
durch Bindungsstudien mit einem hierin diskutierten rekombinanten
Rezeptor nachgewiesen.
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Der
monoklonale Antikörper
8H.8 bindet ebenso an IqE von Hunden. Der monoklonale Antikörper 8H.8
wurde durch Immunisieren von Mäusen
mit einer verkürzten
Version des Exons 3 des IgE-Moleküls von Hunden, bezeichnet als
Exon 3a, erhalten. Exon 3a enthält
die C-terminalen 71 Aminosäuren
des Volllängen-Exons
3. Vorherige Studien (Daten sind hier nicht dargestellt) hatten
gezeigt, dass die Immunisierung der. Mäuse mit dem Volllängen-Exon
3 keine Antikörper
mit spezifischer Wirksamkeit, wie z.B. der schließlich mit dem
8H.8 Antikörper
gefundenen, erzeugten.
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Experimente
zur Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers 8H.8 zeigten, dass anders
als monoklonale Antikörper,
die durch Immunisieren mit allen anderen rekombinanten IgE-Sequenzen
erhalten worden sind, 8H.8 ebenso an natives IgE von Hunden binden
würde.
Zusätzlich,
wie bei 15A.2 und wie in 2 dargestellt, fand man heraus,
dass 8H.8 nicht an IgE bindet, dass bereits durch den IgE-Rezeptor
auf Mastzellen gebunden worden war. Daher schien es, dass der Zugang
zu dem durch 8H.8 gebundenen Epitop ebenso durch IgE, das an den
Fc-Rezeptor auf Mastzellen bindet, beeinträchtigt wurde. Demzufolge wird
8H.8 an Mastzellen gebundenes IgE nicht quervernetzen. Dieser Befund
wurde durch Bindungsstudien mit einem hierin diskutierten rekombinanten
Rezeptor nachgewiesen.
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Kompetitive
Assays wurden zwischen einem Antikörper, 8H.8 oder 15A.2, und
löslichem
Exon 3 durchgeführt,
um das Inhibitionsniveau der Bindung dieser Antikörper gegenüber affinitätsgereinigtem
nativem IgE, dass auf der festen Phase eines ELISAS immobilisiert
wurde, zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser Studie werden in 3 dargestellt.
In 3 ist zu sehen, dass das Erhöhen der Konzentration von rekombinantem Exon
3, das Anbinden des monoklonalen Antikörpers 8H.8 inhibierte, jedoch
nicht den Antikörper
15A.2 inhibierte.
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Zusätzlich wurde
die Fähigkeit
dieser monoklonalen Antikörper,
dass Anbinden von IgE an einen rekombinanten IgE-Rezeptor auf einer festen Phase eines
ELISAS zu verhindern, untersucht.
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Zusätzlich wurden
kompetitive Assays mit dem Antikörper
8H.8 durchgeführt
und analoge Assays wurden mit 15A.2 durchgeführt, wobei der Antikörper sich
in Konkurrenz mit affinitätsgereinigtem
IgE von Hunden in Lösung
und IgE auf der festen Phase eines ELISAS befand. Daten von diesen
Assays sind in 4 dargestellt.
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Diese
Studien wiesen daraufhin, dass 15A.2 eine hohe Affinität für lösliches
natives IgE von Hunden aufwies, da bei Erhöhung der Konzentration von
löslichem
IgE die Bindung von 15A.2 an immobilisiertes Immunoglobulin zusehendst
fiel, was darauf hinwies, dass 15A.2 nun an das lösliche IgE
bindet. Demgegenüber war
zu sehen, dass der Antikörper
8H.8 eine viel geringere Affinität
für lösliches
IgE aufwies, da zunehmende Fluorkonzentrationen des löslichen
IgE's die Fähigkeit
von 8H.8 an das immobilisierte IgE zu binden nicht inhibierten.
Demnach deuten die Daten darauf hin, dass lösliches IgE beim Inhibieren
von 8H.8 an IgE, dass auf einer festen Phase immobilisiert ist,
unwirksam ist. Demnach war die Affinität von 8H.8 für lösliches
IgE von Hunden niedriger als die Affinität dieses monoklonalen Antikörpers für IgE auf
einer festen Phase.
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Diese
Studien deuteten weiter daraufhin, dass 8H.8 eine niedrige Affinität für lösliches
natives IgE von Hunden aufwies, da zunehmende hohe Konzentrationen
des löslichen
IgE's die Fähigkeit
von 8H.8 an das immobilisierte IgE zu binden, nicht inhibierten.
Im Gegensatz dazu kann man sehen, dass der Antikörper 15A.2 eine viel höhere Affinität für lösliches
IgE aufweist, da beim Erhöhen
der Konzentration des löslichen
IgE's die Bindung
von 15A.2 an das immobilisierte Immunoglobulin zusehends fiel, was
darauf hinweist, dass 15A.2 nun an das lösliche IgE bindet. Daher deuteten
die Daten darauf hin, dass lösliches
IgE beim Inhibieren des 8H.8 vor dem Anbinden an IgE, das auf einer
festen Phase immobilisiert ist, unwirksam ist. Daher war die Affinität von 8H.8
für lösliches
IgE von Hunden niedriger, als die Affinität dieses Monoklonalen für IgE auf
einer festen Phase.
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Um
den Befund weiter zu substantiieren, dass 15A.2 eine höhere Affinität für lösliches
natives IgE hat und dass 8H.8 eine niedrige Affinität für lösliches
natives IgE hat, wurden Studien durchgeführt, in denen 8H.8 verwendet
worden ist und analoge Studien wurden mit 15A.2 vorgenommen, um
das Ausmaß zu
bestimmen, mit dem jeder Antikörper
das Anbinden des löslichen
IgE an einen rekombinanten IgE-Rezeptor auf einer festen Phase inhibiert.
Ein markierter Antikörper
D9 wurde als Mittel zum Detektieren in den in 5 dargestellten Studien
verwendet. Der monoklonale Antikörper
D9 ist dafür
bekannt, dass er an IgE bindet, wenn dieser an einen Rezeptor gebunden
ist. Für
die in 5 dargestellten Studien lag das native IgE bei
einer Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter. Wie in 5 dargestellt,
war 15A.2 beim Inhibieren des Anbindens des nativen IgE's an einen rekombinanten
IgE-Rezeptor bei Antikörperkonzentrationen
von 190 Nanogramm pro Milliliter wirksam. Im Gegensatz dazu waren
3,125 Nanogramm pro Milliliter an 8H.8 notwendig, um das Anbinden des
nativen IgE's an
den rekombinanten IgE-Rezeptor zu inhibieren. Da mehr 8H.8 als 15A.2
erforderlich war, um das Binden des nativen IgE's an den rekombinanten Rezeptor zu inhibieren,
wurde deutlich, dass 8H.8 eine niedrigere Affinität für das lösliche IgE
hatte. Es erscheint daher, dass wenn eine ausreichende Konzentration entweder
von 8H.8 oder 15A.2 bereitgestellt wird, dass die Antikörper das
Anbinden des löslichen
IgE's an den IgE-Rezeptor
inhibieren.
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Wie
durch die in 2 dargestellten Daten darüber hinaus
deutlich wird, wurde die Avidität
der 8H.8-Bindung für
natives IgE von Hunden stark erhöht,
wenn das IgE immobilisiert war. Diese Studien legten nahe, dass
8H.8 eine niedrige Affinität
für lösliches
natives IgE von Hunden hatte, dass jedoch, wenn das IgE auf einer
Oberfläche
immobilisiert wurde oder es auf der Oberfläche einer Gedächtnis-B-Zelle
exprimiert wurde, die Avidität
für das
Anbinden von 8H.8 an natives IgE von Hunden stark erhöht war.
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Dementsprechend
nahm man in Bezug auf diese Befunde an, dass der Bereich innerhalb
des nativen IgE's,
der durch 8.H8 erkannt wird, teilweise verdeckt sein könnte, insbesondere
wenn das IgE im Serum vorliegt. Eine teilweise abgesonderte Aminosäuresequenz
des IgE könnte
nicht leicht gegenüber
dem nativen Immunsystem des Hundes und seinen normalen produktiven
Mechanismen exponiert sein. Da außerdem das Volllängenexon
3 nicht zur Bildung von Antikörpern
mit einer 8H.8-ähnlichen
Spezifität
führten,
könnte
die Volllängensequenz
Suppressorpeptide enthalten, die eine Auto-Anti-IgE-Reaktion, die gegen das durch
den 8H.8 Antikörper
erkannte Epitop spezifisch ist, herabregulieren oder eliminieren
kann. Beide Mechanismen könnten dazu
dienen, die Erzeugung einer Autoimmunreaktion gegenüber Wirtsantigenen
zu verhindern.
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Die
Folgerungen aus diesen Befunden sind, dass ein 8H.8 Antikörper, wenn
er als ein Therapeutikum für
Allergien in Hunden verwendet wird, bevorzugt eher an IgE auf Gedächtnis-B-Zellen binden würde als
an IgE in Lösung.
Darüber
hinaus weist 8H.8 eine geringe Bindungs-Affinität für IgE auf, wenn es durch einen Fc-Rezeptor
auf Mastzellen gebunden ist.
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Die
Phagen-Display-Technologie wurde verwendet, um das durch den 8H.8
Antikörper-gebundene Epitop
zu kartieren. Ein bevorzugtes Verfahren für die Durchführung der
Phagen-Display-Technologie
wird durch die Verwendung eines Ph.D. Phagen-Display-Peptid-Bibliothek-Kits
(New England BioLabs, Beverly Mass.) bewerkstelligt. Man fand heraus,
dass ein 7-Aminosäure-Peptid
(Thr-Leu-Leu-Glu-Tyr-Arg-Met) die kompetitive Bindung des monoklonalen
Antikörpers
8H.8 sowohl an natives als auch an rekombinantes IgE vom Hund inhibierte.
Diese Sequenz enthielt 6 Aminosäuren,
die in Ausbildung und/oder Distanzverhalten mit dem C-terminalem
Bereich des Exons 3 übereinstimmten.
Ein 11-Aminosäurepeptid,
dass von diesem Bereich (Gly-Met-Asn-Leu-Thr-Trp-Tyr-Arg-Glu-Ser-Lys),
genannt E3a.5, synthetisiert worden ist, inhibierte ebenso den monoklonalen
Antikörper
8H.8 vor dem kompetitiven Binden an natives oder rekombinantes IgE.
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Es
wird angenommen, dass die Antikörperreaktionen
mit spezifischer Wirksamkeit, wie z.B. der von 8H.8, für gewöhnlich nicht
auftreten, auch nicht nach dem Auftreten von Ereignissen, die Auto-Anti-IgE-Reaktionen
gegenüber
anderen Epitopen induzieren würden,
da das 8H.8 Epitop nur teilweise für die Erkennung zugänglich ist.
Nichtsdestotrotz wird angenommen, dass Antikörper für ein 8H.8-Typ Epitop, die
durch Peptidimmunisierung in Übereinstimmung
mit der Erfindung erzeugt worden sind, an das teilweise zugängliche
Epitop binden, so wie es der monoklonale Antikörper 8H.8 tut.
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Es
wird weiterhin angenommen, dass der Bereich innerhalb des nativen
IgE's, der durch
15A.2 erkannt wird, als ein Immunogen dienen könnte, um Auto-Anti-IgE-Reaktionen
zu induzieren und Antikörper
erzeugen könnte,
die an IgE+ B-Zellen
binden und die IgE-Synthese herabregulieren könnten. Die Auswirkungen dieser Befunde
sind, dass ein 15A.2 Antikörper,
wenn er als ein Therapeutikum für
Allergien bei Hunden verwendet wird, das Anbinden von IgE an Mastzellen
verhindern und möglicherweise
die Synthese von IgE durch B-Zellen beeinflussen
würde.
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Die
Phagen-Display-Technologie wurde verwendet, um das durch den 15A.2-Antikörper gebundene Epitop
zu kartieren. Wie oben bereits erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren
für die
Durchführung
der Phagen-Display-Technologie durch die Verwendung eines Ph.D.
Phagen-Display-Peptid-Bibliothek-Kits (New England BioLabs, Beverly
Mass.) erreicht. 6 stellt die Aminosäuresequenzen
der PhDc7c-Bibliothek dar, die durch den monoklonalen Antikörper 15A.2
gebunden worden sind. Diese Sequenzen werden in Ausrichtung mit
der Proteinsequenz des IgE's
von Hunden dargestellt. 7 stellt die Ausrichtung des
15A.2-Epitops aus sieben verschiedenen Säugetieren dar: Hund, Mensch,
grüne Meerkatze,
Katze, Schwein, Maus und Pferd.
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8 stellt
die Fähigkeit
unterschiedlicher Phagen dar, die 15A.2 Mimotop-Peptiden ausweisen,
das IgE von Hunden daran zu Hindern den monoklonalen Antikörper 15A.2
auf der festen Phase zu binden. 466 μl biotinylierter Antikörper 15A.2
(10 μg/ml)
wurden mit 466 μl
Phagen aus einer frischen Übernachtkultur
vermengt. In jede Kammer einer Mikrotiterplatte wurden 100 μl der Mischung
zugegeben. Man ließ die
Antikörper und
Phagen für
2 ½ Stunden
binden. Die Kammern wurden dann mit Strepavidin beschichtet. Die
Platten wurden dann dreimal mit Standardwaschpuffer gewaschen, um lose
gebundenes Material zu entfernen. Eine Verdünnungsreihe mit IgE von Hunden
wurde vorbereitet, wobei mit einer Konzentration von 1 μg/100 μ1 PBS, 0,1%
Tween begonnen wurde. Man gab 100 μl verdünntes IgE pro Kammer hinzu
und ließ es
für 10
Minuten binden. Die Konkurrenzreaktion wurde durch fünffaches
Waschen der Platten mit Waschlösung
gestoppt. Die Platte wurde dann mit HRPO verknüpftem monoklonalem Antikörper D9,
der an die Domäne
4 von IgE bindet, entwickelt, um das IgE in der festen Phase sichtbar
zu machen. Ein Signalverlust weist darauf hin, dass der Phase die
Konkurrenz des IgE's
von Hunden erfolgreich abwies. Tabelle 1 zeigt die Konzentrationen
der Reaktanden an den zahlreichen Punkten auf der x-Achse von 8.
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Unter
Verwendung der New England Biolabs PhD12 Phagen-Display-Bibliothek fand man heraus, dass
ein 12 Aminosäurepeptid
(SEQ ID NO: 11 Val-Thr-Leu-Cys-Pro-Asn-Pro-His-Ile-Pro-Met-Cys) den monoklonalen
Antikörper
15A.2 daran hinderte, sowohl natives als auch rekombinantes IgE
vom Hund kompetitiv zu binden. Diese Sequenz enthielt 4 Aminosäuren, die
in ihrer Ausbildung und/oder ihrem Distanzverhalten mit dem N-terminalen
Bereich von Exon 3 übereinstimmten.
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9 zeigt
die Fähigkeit
des monoklonalen Antikörpers
15A.2, ein synthetisches Peptid zu binden. Das Peptid der SEQ ID
NO: 12 Ser-Val-Thr-Leu-Cys-Pro-Asn-Pro-His-Ile-Pro-Met- Cys-Gly-Gly-Gly-Lys
wurde synthetisiert und am Epsilon-Kohlenstoff des Lysin-Restes biotinyliert.
Diese Sequenz entspricht dem Isolat M13-48. Das Peptide wurde auf
eine Art und Weise behandelt, um eine Reduktion und Zyklisierung
der Cysteine zu fördern,
um ein zyklisches Peptid auszubilden. Eine Verdünnungsreihe des Peptids wurde
zubereitet und an mit Strepavidin-beschichteten Mikrotiter-Platten
(5 μg Strepavidin
pro Kammer) gebunden. Das gebundene Peptid wurde mit dem HRPO konjugierten
monoklonalen Antikörper
15A.2 detektiert. 9 zeigt die Ergebnisse dieses
Experiments. Dieses Festphasen-spezifische Mimotop-Peptid 15A.2
band den monoklonalen Antikörper
15A.2 in konzentrationsabhängiger
Weise.
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10A und 10B zeigen
die Fähigkeit
eines Mimotop-Peptids
15A.2 die Bindung des monoklonalen Antikörpers 15A.2 an IgE von Hunden
auf der festen Phase vorzubeugen. Platten wurden mit IgE von Hunden
in einer Konzentration von 1 μq/ml
beschichtet. Man gab eine Verdünnungsreihe
des synthetischen Peptids zum HRPO konjugiertem monoklonalem Antikörper 15A.2
(Endkonzentration 1 μg/ml)
und ließ es
für zwei
Stunden binden. Man gab 100 μl
der 15A.2/Peptidmixtur in die Kammern und ließ sie dann für 1 Stunde binden.
Die Reaktion wurde durch sechsfaches Waschen der Platten mit Waschpuffer
gestoppt. Die Platten wurden mit HRPO-Substrat entwickelt, die Reaktionen
mit dem Stopp-Mix gestoppt und die O.D. der Platten wurde mittels
eines Plattenlesers gemessen.
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Abgesehen
von der aktiven Immunisierung mit dem Antikörper 15A.2 oder 8H.8 zur Induktion
einer Auto-Anti-IgE-Produktion
in vivo umfasst diese Erfindung auch ein spezifisches Bindungsmolekül, dass
einen Liganden des Typs, der durch 15A.2 oder 8H.8 gebunden wird,
spezifisch bindet als auch die therapeutische oder prophylaktische
Verwendung davon. Daher umfasst die Erfindung einen monoklonalen Antikörper, der
für eine
konservative Variante einer durch 15A.2 gebundenen Sequenz, für eine konservative
Variante einer durch 8H.8 gebundenen Sequenz oder für eine native
Sequenz des IgE's
von Hunden bis zu 100 Aminosäuren
vom C-terminalem Abschnitt des Exons 3 spezifisch ist. Die spezifischen
Bindungsmoleküle
der Erfindung können in
einem Verfahren in Übereinstimmung
mit der Erfindung für
die Behandlung für
oder als Prophylaxe für
allergische Symptome, d.h., passive Immunisierung, verwendet werden.
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Daher
führt die
Verabreichung entweder eines Antikörpers in Übereinstimmung mit der Erfindung,
wie z.B. 15A.2 oder 8H.8, oder eines Peptids in Übereinstimmung mit der Erfindung,
wie z.B. das 7, 11 oder 22 Aminosäure-Peptid, an einen Hund zu
einer Verminderung der weiteren IgE-Herstellung. Dies kann zum Beispiel
durch das Anbinden des Antikörpers
15A.2 oder 8H.8 an die Gedächtnis-B-Zelle
und Vorbeugung der weiteren IgE-Herstellung auftreten. Für ein Peptid
würde seine
Verabreichung zur Herstellung von Antikörpern vergleichbarer Spezifität und Wirksamkeit
wie 15A.2 oder 8H.8 führen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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11 stellt
die Ergebnisse der Bindungsstudie dar, in der der Antikörper 8H.8
und der Antikörper 15A.2
getrennt voneinander untersucht worden sind, um ihre Fähigkeit
zu bestimmen an eine feste Phase, die affinitätsgereinigtes IgE von Hunden,
das darauf immobilisiert ist, aufweist, zu binden. Diese Ergebnisse
zeigten, dass diese 8H.8 und 15A.2 an natives IgE banden, wenn sie
auf einer festen Phase immobilisiert waren. Die Ergebnisse dieser
Studie legen nahe, dass die Bindung jeder dieser Antikörper an
das oberflächengebundene
IgE von vergleichbarer Affinität
war. Um zu bestimmen, ob die Affinität der Bindung jedes Antikörpers tatsächlich vergleichbar
war, wurden weitere Studien durchgeführt.
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12 zeigt
die Ergebnisse der Studie, in der der Antikörper 8H.8, der mit einem Signalrest
konjugiert ist, bei unterschiedlichen Konzentrationen mit festen
Phasen reagierte, die zahlreiche Peptide aufwiesen, die darauf immobilisiert
waren. Die durch (⧫)
dargestellten Daten spiegeln eine feste Phase wieder, die IgE von Hunden
aufweist, das darauf immobilisiert ist; durch (∎) dargestellte
Daten zeigen eine feste Phase, die das darauf immobilisierte E3a.5
aufweist; durch (π)
dargestellte Daten zeigen eine feste Phase, die ein darauf immobilisiertes
verlängertes
Peptid E3a.5 aufweist, durch ein (X) dargestellte Daten spiegeln
Daten für
eine feste Phase wieder, die ein darauf immobilisiertes ungeordnetes
(scrambled) Peptid aufweist, durch (*) dargestellte Daten zeigen
Daten für
eine feste Phase, die das darauf immobilisierte 7-Aminosäurepeptid,
dass durch die Phagen-Display-Technologie
identifiziert worden ist, an das SH8 bindet, aufweist. Dadurch wird
deutlich, dass 8H.8 an jede feste Phase bindet, mit der Ausnahme
der festen Phase, die das ungeordnete (scrambled) Peptid E3a.5 aufweist.
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Der
monoklonale Antikörper
14K2 ist bekannt dafür,
dass er ausschließlich
an das Exon 4 des IgE's von
Hunden bindet. Diesen monoklonalen Antikörper ließ man mit zahlreichen festen
Phasen reagieren, die unterschiedliche Peptide aufwiesen, die darauf
immobilisiert waren. Die durch (⧫)
dargestellten Daten spiegeln eine feste Phase mit IgE von Hunden
wieder, das darauf immobilisiert ist; die durch (∎) dargestellten
Daten zeigen eine feste Phase, die E3a.5 aufweist, das darauf immobilisiert
ist; durch (π) dargestellte
Daten zeigen eine feste Phase, die das darauf immobilisierte erweiterte
Peptid E3a.5 aufweist; durch (X) dargestellte Daten spiegeln Daten
für eine
feste Phase wieder, die ein darauf immobilisiertes (scrambled) Peptid
E3a.5 aufweist; und durch einen (*) dargestellte Daten zeigen Daten
für eine
feste Phase, welche das darauf immobilisierte 7-Aminosäurepeptid,
dass durch die Phagen-Display-Technologie identifiziert worden ist,
an das 8H.8 bindet, aufweist. Dadurch wird deutlich, dass 14K2 nur
an eine feste Phase bindet, die das gesamte Hunde-IgE-Molekül, das darauf
immmobilisiert ist, aufweist. Diese Daten werden in 13 dargestellt.
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Man
glaubt, dass der monoklonale Antikörper 15A.2 nur an Hunde-IgE
Exon 3 bindet. 14 stellt Daten für Studien
dar, welche die Bindung von 15A.2 an zahlreiche Peptide evaluiert.
Die durch (⧫)
dargestellten Daten spiegeln eine feste Phase mit IgE von Hunden
wieder, das darauf immobilisiert ist; die durch (∎) dargestellten
Daten zeigen eine feste Phase, die E3a.5 aufweist, das darauf immobilisiert
ist; durch (π)
dargestellte Daten zeigen eine feste Phase, die das darauf immobilisierte
erweiterte Peptid E3a.5 aufweist; durch (X) dargestellte Daten spiegeln
Daten für
eine feste Phase wieder, die ein darauf immobilisiertes (scrambled)
Peptid E3a.5 aufweist; durch einen (*) dargestellte Daten zeigen
Daten für
eine feste Phase, welche das darauf immobilisierte 7-Aminosäurepeptid,
dass durch die Phagen-Display-Technologie identifiziert worden ist,
an das 8H.8 bindet, aufweist. Diese Bindungsstudien zeigten, dass
15A.2 nur an eine feste Phase band, die das gesamte Hunde-IgE-Molekül, das darauf
immobilisiert ist, aufwies. Diese Daten weisen darauf hin, dass
15A.2 nicht das gleiche Epitop bindet, wie das durch 8H.8 gebundene.
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15 zeigt
Daten von Studien, welche die Bindung von 8H.8 oder polyklonalen
Antikörpern,
die gegen rekombinantes menschliches IgE erzeugt worden sind, gegen
das Peptid E3a.5 oder gegen das Peptid E3a.5 mit einer Aminosäuresubstitution,
die das Peptid analoger zu einer Sequenz im menschlichen Genom macht,
die für
menschliches IgE kodiert, das Peptid S3a.5 genannt wird, vergleichen.
In 15 zeigen die durch (⧫) wiedergespiegelten Daten
substituiertes 3a.5 verglichen mit 8H.8; durch (∎) dargestellte
Daten spiegeln substituiertes Peptid 3a.5 und Re-Hu IgE wieder:
durch (π)
dargestellte Daten spiegeln das Peptid E3a.5 und 8H.8 wieder und
die durch (X) dargestellten Daten spiegeln Daten in Bezug auf das
Peptid E3a.5 und polyklonales Re Hu IgE wieder. Diese Daten weisen
darauf hin, dass nur 8H.8 auf einer festen Phase an E3a.5 gebunden
worden ist, keine andere Kombination zeigte eine Anbindung.
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16 zeigt
die Daten von Studien, welche die Bindung von 8H.8 an zahlreiche
Peptide, die auf einer festen Phase immobilisiert worden sind, vergleicht.
Durch (⧫)
dargestellte Daten spiegeln Daten für eine feste Phase wieder,
die IgE von Hunde aufweist, das darauf immobilisiert ist; die durch
(∎) dargestellten Daten spiegeln Daten für eine feste
Phase wieder, die ein erweitertes Peptid E3a.5 aufweist, das darauf
immobilisiert ist; durch (π)
dargestellte Daten spiegeln Daten für eine feste Phase wieder,
die das darauf immobilisierte menschliche IgE aufweist und durch
(X) dargestellte Daten spiegeln Daten für eine feste Phase wieder,
die ein darauf immobilisiertes 8H.8 Peptid aufweisen. Dementsprechend
wird deutlich, dass 8H.8 an IgE von Hunden, erweitertes Peptid E3a.5
oder das sieben Aminosäurepeptid,
dass durch die Phagen-Display-Technologie als das Bindungsepitop
von 8H.8 identifiziert worden ist, bindet, wenn jedes dieser Peptide
auf einer festen Phase immobilisiert war. Zusätzlich wird deutlich, dass
8H.8 nicht an menschliches IgE bindet.
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17 zeigt
Daten von Studien, welche die Fähigkeit
von polyklonalen Anti-humanen-IgE-Antikörpern an feste Phasen, die
zahlreiche darauf immobilisierte Peptide aufweisen, zu binden vergleicht.
Durch (⧫)
dargestellte Daten spiegelt Daten für eine feste Phase wieder,
die darauf immobilisiertes IgE von Hunden aufweist; durch (∎)
dargestellte Daten spiegeln Daten für eine feste Phase wieder,
die ein erweitertes Peptid E3a.5 aufweist, das darauf immobilisiert
ist; durch (π)
dargestellte Daten spiegeln Daten für eine feste Phase wieder,
die darauf immobilisiertes menschliches IgE aufweist und durch ein
(X) dargestellte Daten spiegeln Daten für eine feste Phase wieder,
die ein darauf immobilisiertes 8H.8 Peptid aufweist. Dadurch wurde
deutlich, dass die Anti-humanen-IgE-polyklonalen Antikörper an
menschliches IgE banden, wenn es auf einer festen Phase immobilisiert
war. Es wurde ebenso deutlich, dass das polyklonale Antiserum eine
begrenzte Bindung an das erweiterte Peptid E3a.5 zeigte, wenn die
polyklonalen Antikörper
in sehr hohen Konzentrationen vorlagen; man glaubt, dass dies ein
Bindungsartefakt in Folge der hohen Antikörperkonzentration ist. Dadurch
fand man heraus, dass Antikörper
für menschliches
IgE nicht spezifisch an das IgE von Hunden oder an Peptide in Übereinstimmung
mit der Erfindung binden.
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Beispiel 2
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Die
Aminosäuresequenzen
für das
durch 8H.8 gebundene Epitop, die 11-Aminosäuresequenz, die in den hier
dargestellten Immunisierungsstudien verwendet worden ist als auch
analoge Sequenzen für
Katzen und menschliche IgE-Sequenzen
werden in Tabelle 2 dargestellt. Zusätzlich wurde eine substituierte
Sequenz vom Hund zubereitet, die eine Aminosäuresubstitution aufweist, die
das Peptid analoger zu dem menschlichen Peptid machte.
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Alle
Peptide in Tabelle 2 wurden auf einer festen Phase angeordnet und
Studien wurden durchgeführt, um
festzustellen, ob 8H.8 an das oberflächengebundene Peptid binden
würde.
Man fand heraus, dass 8H.8 an eine Oberfläche mit dem darauf gebundenen
Mimotop-Peptid band und an eine Oberfläche mit dem darauf gebundenen
11-Aminosäure-Peptid.
Man fand heraus, dass 8H.8 nicht an das humane Peptid, das Katzen-Peptid
oder an die Hunde-Sequenz, die eine Aminosäuresubstitution aufwies, die
es analoger zur humanen Sequenz machte, band, wenn jedes dieser
Peptide an die Oberfläche
gebunden war.
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Abschluss
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Wenn
nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie sie üblicherweise
von einem Durchschnittsfachmann, dem diese Erfindung zugeordnet
wird, verstanden werden. Ebenso können alle Verfahren und Materialien,
die zu den hierin beschriebenen vergleichbar oder äquivalent
sind, in der praktischen Durchführung
oder beim Testen der Erfindung verwendet werden, die bevorzugten
Verfahren und Materialien werden nun beschrieben.
