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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Impfstoff, der dazu
bestimmt ist, die Symptome von IgE-vermittelten allergischen Reaktionen
zu lindern oder die Induktion von IgE-vermittelten allergischen
Reaktionen zu verhindern. Obgleich sich die Erfindung allgemein
auf einen Impfstoff zur Verwendung bei einem Säuger bezieht, bezieht sich
eine bevorzugte Ausführungsform
davon auf einen Impfstoff zur Verwendung bei einem Menschen, und
daher wird die Erfindung nachfolgend allgemein unter Bezugnahme
auf einen derartigen Impfstoff zur Verwendung beim Menschen beschrieben.
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Hintergrund der Erfindung
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IgE
(Immunglobulin E) ist trotz seiner normalerweise sehr niedrigen
Konzentration in Humanplasma (10-400 ng/ml) eine Hauptursache für Hypersensitivitäten, die
in der menschlichen Bevölkerung
gefunden werden. Diese Eigenschaft ist durch ihre Wechselwirkung
mit den Hochaffinitätsrezeptor
für IgE
an Mastzellen und basophilen Leukozyten bedingt.
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Eine
Vernetzung von zwei IgE-Rezeptoren an der Oberfläche dieser Zelltypen durch
Allergenbindung initiiert die Freisetzung einer Reihe von physiologisch
aktiven Substanzen, zum Beispiel Histamin, PAF (Platelet Activating
Factor = thrombozytenaktivierender Faktor), Heparin, chemotaktische
Faktoren für
eosinophile und neutrophile Granulozyten, Leukotriene, Prostaglandine
und Thromboxane. Es sind diese Mediatoren, die die direkten Symptome von
IgE-vermittelten allergischen Reaktion verursachen (Typ I Hypersensitivität). Krankheitszustände, die
zu dieser Gruppe gehören,
umfassen die meisten Typen von Asthma, Fellallergien, Pollenallergien,
viele Typen von Nahrungsmittelallergien und bestimmte Ekzemtypen.
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Der
Hochaffinitätsrezeptor
für IgE
wurde sowohl auf dem Proteinlevel als auch auf dem Genlevel bei
Maus, Ratte und Mensch charakterisiert (Kinet et al. 1987; Shimizu
et al. 1988; Tepler et al. 1989; Blank et al. 1989; Kinet et al.
1989). Dieser Rezeptor ist wahrscheinlich nur an Mastzellen und
basophilen Leukozyten in unserem Körper vorhanden. Der Rezeptor
ist ein Komplex aus drei verschiedenen Untereinheiten, den sogenannten α-, β- und γ-Ketten.
Es ist die α-Kette,
die hauptsächlich
extrazellulär
lokalisiert ist, die mit dem IgE-Molekül wechselwirkt.
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Detaillierte
Studien bezüglich
der Region der Epsilon-Kette des IgE-Moleküls, die mit dem Hochaffinitätsrezeptor
IgE interagiert, haben gezeigt, dass eine Region aus 76 Aminosäuren an
der Grenze zwischen den CH2- und CH3-Domänen (CH = konstante Domänen in der
schweren Kette) für
die Interaktion zwischen dem IgE-Molekül und seinem Hochaffinitätsrezeptor
von entscheidender Bedeutung ist.
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Von
diesem Peptid wurde gezeigt, dass es in vitro fähig ist, die Interaktion zwischen
nativem IgE und seinem Hochaffinitätsrezeptor in einem Molverhältnis von
nahezu 1:1 verglichen mit der ganzen CH2-CH3-CH4-Region zu inhibieren
(Helm et al., 1988). Das Peptid hat sich auch als fähig erwiesen, eine
IgE-vermittelte Rötungsreaktion
bei Allergenstimulation zu inhibieren. In diesem Fall ist allerdings die
Konzentration das etwa Zehnfache der Konzentration, die mit nativem
IgE dieselbe inhibierende Wirkung liefert (Helm et al., 1989).
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Wenn
das IgE-Molekül
an seinen Rezeptor bindet, werden bestimmte Regionen der Epsilon-Kette
für eine
Interaktion mit anderen Molekülen,
zum Beispiel mit Antikörpern,
die gegen Epitope in derselben Region des IgE-Moleküls gerichtet
sind, blockiert werden. Dann kann der IgE-Antikörper nur entweder an einen
IgE-Antikörper,
der gegen die CH2-CH3-Region
des IgE-Moleküls
gerichtet ist, oder an den Rezeptor und somit niemals an beide diese
Moleküle
gleichzeitig binden. Antikörper,
die an Epitope außerhalb
der Region, die direkt mit dem Rezeptor interagiert bzw. wechselwirkt,
binden, werden im Gegensatz zu den vorher genannten zu einer Vernetzung
der IgE-Moleküle
führen,
die an die Oberfläche
einer Mastzelle gebunden sind. In diesem Fall wird man eine sehr
starke Freisetzung von Granula und einen anaphylaktischen Schock
bei der Person, in die ein solcher Antikörper injiziert wird, haben.
Die Antikörper,
die an den Rezeptorbindungsteil binden, werden dagegen nicht fähig sein,
diese Rezeptoren zu vernetzen, und es entsteht keine unmittelbare
Reaktion, allerdings die Wirkung der verlängerten Abnahme der Konzentration
an frei zirkulierendem IgE. Dies wird wahrscheinlich eine Granulafreisetzung verhindern,
da in dem Plasma der Person bzw. des Subjekts keine IgE-Antikörper mehr
vorliegen.
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Diese
Anti-IgE-Antikörper
werden wahrscheinlich auch permanenter IgE-produzierende B-Zellpopulation „knock
out", was die Möglichkeit
erhöht,
eine länger
andauernde Suppression der IgE-Synthese zu erhalten. Während Zeiträumen einer
kräftigen
Pollenexposition werden die Antikörper dann binden und den Pool
von IgE vollständig
eliminieren, was die Ursache für
die stark inflammatorische Reaktion von Subjekten mit Pollenallergie
ist. Eine Anzahl von Beobachtungen weist darauf hin, dass nichtallergische
Personen bzw. Subjekte eine relativ hohe Konzentration an endogenen
Anti-IgE-Antikörpern
haben, von denen angenommen wird, dass sie eine ähnliche allergieinhibierende
Wirkung haben.
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Die
Wirkung des Impfstoffs gemäß der Erfindung
basiert auf seiner Fähigkeit,
eine Immunreaktion gegen das körpereigene
IgE zu induzieren, die dann deswegen die Bindung der IgE-Antikörper an diese
Rezeptoren verhindern werden. Aufgrund dessen wird die Freisetzung
der allergieinduzierenden Substanzen, die in den Mastzellen gespeichert
sind, verhindert werden.
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Stand der Technik
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A. Rezeptorbindungsproteine und andere
Rezeptorantagonisten
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Verschiedene
Forschergruppen in der ganzen Welt arbeiten heute an der Herstellung
von kurzen Peptiden oder anderen Molekülen mit der Fähigkeit,
an den IgE-Rezeptor zu binden, und dadurch eine Bindung von Antigen-spezifischem
IgE zu verhindern (
WO-A-88/00204 und
WO-A-89/04834 ). Dann
wird erwartet, dass diese Substanzen fähig sind, als Wirkstoffe für die Behandlung
von Allergien eingesetzt zu werden.
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Das
Problem in diesem Fall ist die große Schwierigkeit beim Erhalt
eines Moleküls,
das eine Bindungsfestigkeit an dem Rezeptor hat, die der sehr starken
Interaktion zwischen dem nativen IgE-Molekül und seinem Rezeptor entspricht.
Um eine wirksame Präparation
zu erhalten, muss man wahrscheinlich mit Substanzen arbeiten, die
irreversibel an den Rezeptor binden. Allerdings sind solche Substanzen relativ
toxisch, da sie kovalent binden können und andere strukturell ähnliche
Moleküle
im Körper
blockieren können.
Von Interesse in diesem Kontext ist, dass die α-Kette des IgE-Rezeptors zu
einer größeren Genfamilie
gehört,
in der i.a. mehrere der verschiedenen IgG-Fc-Rezeptoren enthalten
sind. Diese Rezeptoren sind für
die Abwehr des Körpers
gegen i.a. bakterielle Infektionen absolut wesentlich. Moleküle, die
für eine
kovalente Bindung aktiviert sind, sind darüber hinaus oft relativ instabil
und daher müssen
sie vermutlich mehrmals am Tag und dann in relativen hohen Konzentrationen
verabreicht werden, um es möglich
zu machen, den sich kontinuierlich erneuernden Pool an IgE-Rezeptoren
an Mastzellen und basophilen Leukozyten vollständig zu blockieren.
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B. Monoklonale Anti-IgE-Antikörper zur
Behandlung von Allergie
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Eine
Biotechnologie-Firma in den USA arbeitet nach einem Modell, das
die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die gegen die IgE-Rezeptor-Bindungsregion
des humanen IgE-Moleküls
gerichtet sind, in Mäusen
involviert. Diese Antikörper werden
dann durch genetische Manipulation dahingehend, dass man die konstanten
Regionen des monoklonalen Mausantikörpers durch die entsprechenden
humanen Regionen ersetzt, „humanisiert". Dann müssen diese
Antikörper
in großem
Maßstab
in reiner Form hergestellt werden, um zur Injektion verwendet zu
werden. Die Humanisierung wird verwendet, um die Immunreaktion des
Körpers
gegen die Antikörper
zu verringern, welche ansonsten nach der zweiten oder dritten Injektion
zu einer massiven Immunkomplexbildung führen würde, die zu direkt lebensbedrohlichen
Komplikationen führen
kann.
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Für die Behandlung
von Personen mit Pollenallergie wird es wahrscheinlich notwendig
sein, diese Antikörper
während
Perioden mit hoher Pollenkonzentration einmal oder mehrmals pro
Woche zu injizieren. Das Problem mit einer Injektion von monoklonalen
Antikörpern
ist, dass sie, wenn sie „humanisiert" sind, hohe Konzentrationen
an neuen Epitopen enthalten werden, denen der Körper noch niemals vorher ausgesetzt
war, und wahrscheinlich werden relativ rasch hohe Antikörpertiter
gegen diese monoklonalen Antikörper
auftreten. Dies wird wahrscheinlich in der gleichen Weise wie bei
monoklonalen Mausantikörpern
zu lebensbedrohlichen Komplikationen durch Immunkomplexbildung führen, da
die monoklonalen Antikörper
noch die „Gerüst"-Regionen aus der
murinen V-Region
haben. Um diese Komplikationen zu vermeiden, wird es wahrscheinlich
notwendig sein, eine sehr große
Gruppe von humanisierten Antikörpern
zu verwenden, um diese im Verlauf der Behandlung sukzessive zu verändern. Selbst
wenn sie sehr genau verabreicht werden, werden sie jederzeit von
der Gefahr verfolgt werden, wann und zu welchem Ausmaß Immunkomplexe
gebildet werden.
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C. Peptid-Impfstoffe (CH4-ε)
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Eine
Forschergruppe, die von Dr. Stanworth geleitet wurde, arbeitete
nach einer Strategie, die die Verwendung eines humanen Peptids an
ein heterologes Trägerprotein
gekoppelt zur Immunisierung in Kaninchen oder Ratte involviert.
In den von ihm beschriebenen Experimenten haben sie das heterologe Antiserum
aus Kaninchen verwendet, um Ratten zu behandeln. Sie waren nicht
fähig,
durch ELISA eine Immunantwort bei Kaninchen zu detektieren, denen das
Antigen injiziert worden war, was zeigt, dass die Immunantwort selbst
mit einem nicht-Spezies-spezifischen Peptid so schwach ist, dass
sie durch eines der empfindlichsten Verfahren, die heute bekannt sind,
nicht detektierbar ist (Stanworth et al., 1990). Die Gruppe verwendet
kurze Peptide aus einer Region, die klar außerhalb des Rezeptor-bindenden (CH2-CH3)
Teil des IgE-Moleküls
ist, was sich dadurch deutlich von der vorliegenden erfindungsgemäßen Idee
unterscheidet, wie nachfolgend detailliert offenbart wird. Ein allgemeiner
Nachteil bei der Verwendung kurzer Peptide ist, dass ihnen fast
vollständig
die Fähigkeit
fehlt, eine stabile Sekundärstruktur
zu bilden, die wahrscheinlich einer der Gründe für die sehr schwache Immunantwort
im Modellsystem von Dr. Stanworth ist.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Impfstoffs, der dazu bestimmt ist, die Symptome von IgE-vermittelten
allergischen Reaktionen bei einem Säuger, einschließlich Menschen,
zu lindern oder die Induktion von IgE-vermittelten allergischen
Reaktionen in einem Säuger
zu verhindern, wobei der Impfstoff eine Immunantwort gegen das körpereigene
IgE induziert und dadurch die Bindung der IgE-Antikörper an die IgE-Rezeptoren
verhindern wird, wodurch die Freisetzung der Allergieinduzierenden
Substanzen, die in den Mastzellen gespeichert sind, verhindert werden
wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
obige Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch
einen Impfstoff gelöst,
der dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein Protein mit der gesamten Aminosäuresequenz
der konstanten CH2-CH3-Domänen
der Epsilon-Kette des IgE-Moleküls
der in Frage kommenden Säugerart
oder eine ganze Domäne
der Aminosäuresequenz
in ihrer ursprünglichen
oder in einer leicht mutierten Form enthält, wobei das Protein an ein
heterologes Trägerprotein
oder mehrere heterologe Trägerproteine
gekoppelt ist, und dass es gegebenenfalls ein Adjuvans enthält.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren für die Herstellung des Impfstoffs
und auf die Verwendung der gesamten Aminosäuresequenz der konstanten CH2-CH3-Domänen der
Epsilon-Kette des IgE-Moleküls
einer Säugerart
oder einer ganzen Domäne
der Aminosäuresequenz
in ihrer ursprünglichen
oder in einer mutierten oder multimerisierten Form für die Herstellung
eines Impfstoffs gegen IgE-vermittelte allergische Reaktionen in
der in Frage kommenden Säugerart.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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In
den beigefügten
Zeichnungen ist Folgendes gezeigt:
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1a und 1b zeigen
die Antikörperantwort
(die Menge an Anti-IgE-Antikörpern)
bei einer Gruppe von vier unterschiedlichen Rattenstämmen durch
ELISA-Messung der Antikörpertiter
gegen natives Ratten-IgE und gegen humanes IgE (als Kontrolle).
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2 zeigt
die Suppression einer IgE-vermittelten inflammatorischen Reaktion
bei einer vakzinierten Ratte im Vergleich zu einer mit Blindprobe
immunisierten Ratte nach Injektion von polyklonalem Anti-IgE-Antiserum.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Angabe, dass die Aminosäuresequenz (die
gesamte Sequenz oder Teile davon) der konstanten CH2-CH3-Domänen in „leicht" mutierter Form vorliegt,
bedeutet, dass der Hauptteil der Aminosäuresequenz noch die Sequenz
des Proteins in seiner ursprünglichen
Form ist und dass dadurch die Wirkung fast dieselbe oder möglicherweise
eine etwas reduzierte bezüglich
der ursprünglichen
Sequenz ist; somit wird das Protein, das die „leicht" mutierte Aminosäuresequenz hat, noch vom Körper toleriert
und muss daher ähnlich
seiner ursprünglichen Form
gemäß der Erfindung
an ein heterologes Trägerprotein
gekoppelt werden, um als Antigen zu wirken.
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Die
derzeit bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist die Verwendung eines Proteins, das die Aminosäuresequenz
(die ganze Sequenz oder eine ganze Domäne davon) der konstanten CH2-CH3-Domänen der
Epsilon-Kette des IgE-Moleküls
in ihrer ursprünglichen
Form hat, wobei das Protein an ein heterologes Trägerprotein
oder mehrere heterologe Trägerproteine
gekoppelt ist, und daher wird die Erfindung unten detailliert anhand
dieser bestimmten Ausführungsform
beschrieben werden.
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Die
Erfindung basiert auf einem vollständig neuen Konzept zur Lösung der
Probleme, die mit den Verfahren des Stands der Technik zur Immunisierung gegen
IgE-vermittelte allergische Reaktion verbunden sind, indem der Impfstoff
der Erfindung die Fähigkeit
hat, eine Immunantwort gegen das körpereigene IgE zu induzieren.
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Durch
Triggern des Körpers
selbst eine polyklonale Anti-IgE-Antwort bzw. -Reaktion zu erzeugen,
werden Antikörper
erhalten, die ganz artenspezifisch sind und dadurch viel weniger
immunogen sind. Diese Antikörper
werden dann den freien Pool an IgE, das im Körper zirkuliert, binden und
dadurch die Bindung an den IgE-Rezeptor verhindern. Die Tatsache,
dass die Immunantwort polyklonal ist und dadurch die Anzahl der
Moleküle
desselben Idiotyps sehr niedrig ist, wird die fast vollständige Eliminierung des
Musters einer Anti-Idiotypantwort
bewirken.
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Die
Tatsache, dass der hierin beschriebene Ansatz im Stand der Technik
noch nicht versucht wurde, ist wahrscheinlich durch das Problem
bedingt, wie eine IgG-Antwort gegen das körpereigene IgE zu erreichen
ist, da dies ein Molekül
ist, das der Körper seit
Geburt toleriert hat und somit dagegen nicht immunologisch reagiert.
Um dieses Problem zu lösen, wird
erfindungsgemäß eine Eigenschaft
des Systems, die kaum bekannt ist, die aber in einzigartiger Weise
die Probleme lösen
kann, die mit großer
Wahrscheinlichkeit die monoklonalen Projekte beeinträchtigen
werden, genutzt. Durch Kopplung der CH2-CH3-Region (des Proteins) an ein nicht-Arten-spezifisches
Protein wird die Toleranz des Immunsystems für das körpereigene IgE umgangen. Dies
führt zu
der Rekrutierung einer nicht-tolerierten T-Zellpopulation, die normalerweise
nur auf eine Antikörperantwort
gegen das fremde Molekül,
das als Träger
gewählt
wurde, entstehen würde,
die aber auch die B-Zelle
unterstützen
würde,
Antikörper
gegen ein artspezifisches Molekül
zu erzeugen. Dieser Effekt wird durch Kopplung der CH2-CH3-Region
direkt an das Trägerprotein
erreicht.
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Die
Konsequenzen dieses Phänomens
wurden in der immunologischen Gemeinschaft fast vollständig ignoriert,
was erklären
kann, warum keine andere Forschergruppe in der Welt einen ähnlichen
Ansatz versucht hat. Der Erfinder hat detailliert die Möglichkeit
der Nutzung dieses Phänomens
analysiert, da sehr wenige oder keine ähnlichen Studien durchgeführt wurden.
In den Studien, die durchgeführt
wurden, die die Kopplung von Peptiden involvieren, wurde von humanen
Peptiden zur Injektion in Kaninchen, Maus oder Ratte Gebrauch gemacht
und nicht von Peptiden aus derselben Tierart, und der Grund dafür ist die
dominierende Meinung, dass man keine starke Immunantwort gegen artenspezifische
Moleküle
erzeugen kann.
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Um
zu bestätigen,
dass gemäß der Erfindung
eine starke Immunantwort gegen ein artenspezifisches IgE bzw. Spezies-spezifisches
IgE erhalten werden kann, wurden Experimente durchgeführt, in denen
eine Gruppe von Rattenstämmen
mit einem Fusionsprotein, enthaltend ein Trägermolekül, gekoppelt an die ganzen
CH2-CH3-Domänen
des IgE der Ratte, immunisiert wurden (Beispiel 2). Bei diesen Ratten
wurde eine starke Antikörperantwort
gegen natives Ratten-IgE, das heißt die Form von IgE, die im
Plasma der Ratte zirkuliert, erhalten (nach nur 4 Wochen). Diese
Antikörperantwort
hat eine Stärke, die
nur unbedeutend niedriger ist als der Level (der Antikörperantwort),
der in ELISA-Messungen
gegen ein vollständig
nicht-Arten-spezifisches Protein, in diesem Fall humanes IgG, erhalten
wird (1).
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Der
Grund warum der Erfinder im Gegensatz zu Dr. Stanworth eine starke
Immunantwort erhält,
ist wahrscheinlich der, dass die Erfindung größerer Regionen als Peptide,
die nur eine Länge
von etwa 10 Aminosäuren
haben, verwendet, das heißt
in diesem Fall (der vorliegenden Erfindung) die ganzen CH2-CH3-Domänen oder
eine ganze Domäne davon.
Dies ist der Grund, warum eine viel größere Anzahl von Epitopen, gegen
welche Antikörper
gebildet werden können,
erhalten wird, und dass diese Epitope in derselben Konformation
wie im nativen IgE-Molekül
sind.
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Mit „heterologes
Trägerprotein" ist hier ein beliebiges
nicht-Arten-spezifisches Protein gemeint, das eher keine zu hohe
Homologie zu dem entsprechenden Protein der Art bzw. Spezies, bei
der das Protein als Träger
zu verwenden ist, besitzt. Allerdings sollten solche Proteine vermieden
werden, die normalerweise nicht in unseren Umgebungen vorkommen,
da eine sehr starke Immunantwort Probleme verursachen kann, wenn
wir diesem Protein oft ausgesetzt werden.
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Durch
Kopplung kleiner Peptide an ein heterologes Trägerprotein wird normalerweise
nur eine relative schwache Immunantwort gegen eine sehr beschränkte Region
des Moleküls
erhalten. Darüber hinaus
ergeben Peptide zu einem sehr großen Ausmaß nur eine Immunantwort, die
nur gegen das Peptid reagiert und nicht gegen die entsprechende
Region des nativen Proteins.
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Es
ist wichtig, eine sehr starke Immunantwort zu erhalten, die darüber hinaus
natives IgE erkennt, da die Bindungskonstante für die Interaktion zwischen
dem IgE-Molekül
und dem Hochaffinitätsrezeptor
sehr hoch ist und innerhalb des Bereichs von 1 × 10-8 bis
2,6 × 10-10 oder höher liegt (Froese, 1980). Um
nach Immunisierung eine polyklonale Antwort zu erhalten, werden
mehrere unterschiedliche Antikörper,
die gegen verschiedene Epitope innerhalb der CH2-CH3-Region gerichtet
sind, fähig
sein, gleichzeitig an denselben IgE-Antikörper zu binden. Dies sorgt
für den
Erhalt einer sehr hohen kombinierten Bindungsfestigkeit für freies
IgE. Dadurch werden die Anti-IgE-Antikörper verglichen mit dem Fall
eines monoklonalen Antikörpers
oder von Antikörpern,
die gegen kurze Peptide gerichtet sind, beträchtlich einfacher in der Lage
sein, um freies IgE des immunisierten Subjekts zu kompetitieren.
Dies ist von großer Bedeutung,
da die Interaktion zwischen dem IgE und dem Hochaffinitätsrezeptor
sehr stark ist. Die erfinderische Idee der Verwendung ganzer Domänen involviert
daher einen sehr großen
Vorteil und ein völlig neues
Konzept im Vergleich zu den Peptidansätzen, die früher beschrieben
wurden.
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Die
Antikörperantwort
gegen Peptide hat oft eine geringe oder keine Affinität für die entsprechende
Aminosäureregion
des nativen Proteins, was bedeutet, dass die Antikörperantwort,
die gegen ganze Domänen
erhalten wird, einen entscheidenden Unterschied im Vergleich zu
früheren
Ansätzen
auf dem Fachgebiet bringt.
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Durch
Verwendung nur der CH2-CH3-Region (und nicht wie früher beschrieben
heterologer CH4-Peptide) des IgE-Moleküls wird der Antikörper nach
Immunisierung fast ausschließlich
Antikörper gegen
die Region des IgE-Moleküls
bilden, die mit dem IgE-Rezeptor
interagiert bzw. wechselwirkt. In der Theorie gibt es die Gefahr,
dass Antikörper,
die gegen den N-terminalen Teil der CH2-Domäne oder den C-terminalen der
CH3-Domäne
gerichtet sind, zu einem anaphylaktischen Schock bei Säugern führen, in
denen diese Antikörper
gebildet werden. Allerdings wird die variable Region des Antikörpers der
Größe einer
ganzen Domäne
entsprechen und daher wird in den meisten Fällen eine sterische Hinderung
für die Rezeptorbindung
selbst mit solchen Antikörpern
erreicht. Zusätzlich
werden die Antikörper
kontinuierlich gegen eine große
Anzahl von Epitopen produziert, während die Immunantwort sich
aufbaut, und daher ist die Wahrscheinlichkeit, dass nur einer dieser
sehr wenigen Antikörper
allein ein IgE-Molekül binden
soll, sehr gering. Allerdings hat eine Reihe von Tiertests gezeigt,
dass solche Wirkungen der Immunisierung nicht detektiert werden
können
(siehe Beispiel 2 unten). Die Ratten, die hohe Gehalte an Anti-CH2-CH3-Antikörpern in
ihrem Blut haben, zeigen keinerlei Tendenz zu Symptomen eines anaphylaktischen
Schocks. Unter dem Gesundheitsgesichtspunkt können sie nicht von Tieren unterschieden
werden, die nur mit einem Adjuvans (ohne Antigen) immunisiert wurden,
oder von Tieren, die mit humanem IgG immunisiert wurden. Dies zeigt
an, dass es in Testtieren keine detektierbaren negativen Wirkungen
dieser Immunisierung gibt, selbst wenn die Tiere sehr hohe Anti-IgE-Titer
haben. Dadurch wurde erstmals gezeigt, dass man hohe Anti-IgE-Titer gegen artenspezifisches
IgE erhalten kann. Darüber
hinaus zeigen diese Ratten keine detektierbaren negativen Wirkungen
dieser Behandlung, was anzeigt, dass das Behandlungsverfahren mit
großer
Wahrscheinlichkeit auch ohne Komplikationen verwendet werden kann,
um Menschen zu behandeln. Darüber hinaus
zeigen diese Daten stark an, dass der IgE-Rezeptor-gebundene IgE-Pool
bei diesen Ratten tatsächlich
nicht existent ist. Ansonsten sollte eine starke anaphylaktische
Reaktion der Anti-IgE-Antikörper, die
fähig sind,
an die vorhergenannten äußeren Regionen
der CH2- und CH3-Domänen
zu binden, induziert werden, selbst wenn der Antikörpertiter
für solche
Antikörper
relativ niedrig ist. Der Grund ist, dass die Mastzellen selbst gegenüber sehr
niedrigen Konzentrationen an vernetzenden Antikörpern sehr empfindlich sind.
In vorgeschalteten Studien wurde gezeigt, dass die Tiere nach Immunisierung,
in denen hohe Anti-IgE-Titer auftreten, eine sehr stark verringerte
Tendenz haben, ihre Mastzellgranuli nach Anti-IgE-Antikörper-Provokation
freizusetzen (Beispiel 3; 2). Der
Erfinder führt
derzeit eine viel größere Studie
durch, die die Behandlung von Ratten, die gegenüber Hühnerovalbumin stark allergisch
gemacht worden waren, involviert. Die Resultate aus den Tests an
Ratten, die bisher durchgeführt
wurden, sind unter mehreren Aspekten sehr vielversprechend, da sie
zeigen, dass eine starke Immunantwort erhalten wird, die keine detektierbaren
negativen Wirkungen hat, und schließlich dass eine sehr stark
reduzierte Granulafreisetzung nach Zusatz eines polyklonalen Aktivators
in diesen Ratten erzielt wird.
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Ein
Impfstoff dieses Typs kann sich bestimmten Schwierigkeiten gegenüber sehen.
Ein Faktor, der die Möglichkeiten
stark beeinträchtigt,
ist die Konzentration der Substanz, die man aus dem Körper entfernen
möchte.
Hohe Konzentrationen bedeuten in diesem Fall größere Schwierigkeiten. Wenn
in diesem Kontext einer der anderen Immunglobulinisotypen ausgewählt worden
ist, sollten die Probleme wegen der im Allgemeinen viel höheren Plasmakonzentrationen
dieser Antikörper
sogar noch größer sein.
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Wegen
seiner niedrigen Plasmalevel bzw. Plasmakonzentrationen ist IgE
in diesem Kontext ideal. Die Plasmalevel bei einer normalen Population von
nichtallergischen Subjekten ist 10 bis 400 ng/ml. Diese Menge entspricht
weniger als 0,01% der gesamten Immunglobulinmenge in unserem Blut.
Diese Level sind oft bei allergischen Personen etwas erhöht, übersteigen
aber sehr selten 5 μg/ml.
Als Vergleich können
einige Tests, die bei der Maus durchgeführt wurden, hier genannt werden,
in denen durch Verwendung von Antikörpern, die gegen eine der leichten
Ketten der Immunglobuline gerichtet sind, Tiere erhalten werden,
denen dieser Typ von Immunglobulinen fast vollständig fehlt. In diesen Tests
wurde durch Injizieren monoklonaler Antikörper gegen die κ-Kette des
Immunglobulins der Maus, die etwa 95% der gesamten Immunglobulinmenge
der Maus entspricht, ein fast vollständiger Verlust dieser Antikörper im
Blut der Maus erreicht (Weiss et al., 1984). Die verbleibenden Antikörper, die
in der Maus gefunden wurden, gehören
zu fast 100% zum Ig-λ-Typ
(die ursprüngliche
Konzentration an IgE-λ ist
nur etwa 5%). Dies zeigt, dass selbst im Fall beträchtlich
höherer
Konzentrationen der aus dem Körper
zu entfernenden Substanz eine Möglichkeit
besteht, die Substanzen fast vollständig aus dem Blutkreislauf
zu entfernen.
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Eine
andere mögliche
Komplikation ist, dass nichts über
die Langzeitwirkungen der Induzierung einer starken Autoimmunität bekannt
ist. Ein Vorteil ist allerdings, dass in diesem Fall T-Zellen verwendet werden,
die gegen nicht-Arten-spezifische Moleküle gerichtet sind, um eine
Immunantwort gegen ein artenspezifisches Antigen zu erzeugen. Wenn
das Impfprogramm beendet ist, wird die Antikörperantwort gegen das körpereigene
IgE langsam auf nichtdetektierbare Level nach einigen Monaten abnehmen.
Dies erfolgt, wenn man nicht mit CH2-CH3, gekoppelt an das selbe
Trägermolekül, das beim
ursprünglichen
Impfen verwendet wird, verstärkt
(booster). Dieses Phänomen
wurde in vielen detaillierten Studien bei der Maus gezeigt, wo gezeigt
wurde, dass die sekundäre
Immunantwort gegen Haptene, gekoppelt an verschiedene Träger, vollständig abhängig von
dem ursprünglich
gewählten
Trägermolekül ist. Wenn
ein beliebiges Subjekt bzw. eine beliebige Person aus einem unwahrscheinlichen
nicht vorhersehbaren Grund negativ auf diese Immunisierung reagieren
würde,
kann die Immunisierung beendet werden und die Antikörpertiter
werden wahrscheinlich innerhalb weniger Monate nicht detektierbare
Level erreichen. Dies ist ähnlich
dem, was bei Injizieren von monoklonalen Antikörpern, die gegen körpereigenes
IgE gerichtet sind, der Fall wäre.
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Das
gekoppelte Protein, das als Hauptkomponente des Anti-Allergie-Impfstoffs
verwendet wird, kann unter technischem Gesichtspunkt auf zwei verschiedenen
Wegen hergestellt werden. Einer involviert die Produktion eines
bereits gekoppelten Proteins, eines sogenannten Fusionsproteins
in Prokaryoten- oder Eukaryotenwirtszellen. Als Prokaryotenwirtszelle
wird normalerweise das Bakterium Escherichia coli verwendet, während eine
Reihe unterschiedlicher Systeme, zum Beispiel Wirtszellen oder Zelllinien,
als Eukaryoten-Wirte verwendet werden können. Die Zelllinien können von
Insekten bis Menschen abgeleitet sein. Allerdings werden humane Zellen
zur klinischen Verwendung normalerweise vermieden, da es immer ein
Risiko der Kontamination durch humanes Virus in den Zellkulturen
gibt. Die zweite Technik basiert auf einer direkten chemischen Kopplung
des Trägerproteins
und der aktiven artenspezifischen Komponente, in diesem Fall die
ganze CH2-CH3-Region des IgE-Moleküls oder eine ganze Domäne davon.
Dann werden die Proteine getrennt produziert. Diese Technik ist
die, die normalerweise bei Immunisierungen mit synthetischen Peptiden
sowie in einer Immunisierung mit kleinen Haptenen (von Substanzen,
die keine Proteine sind) verwendet wird und basiert auf einer chemischen
Aktivierung von Trägerproteinen
mit z. B. CNBr und danach Vermischen des aktivierten Trägers mit
dem Peptid oder Proteinfragment, das man damit koppeln möchte. Diese
beiden werden kann kovalent aneinander gekoppelt bzw. gebunden.
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Die
Immunisierung wird durchgeführt,
indem löslicher
oder aggregierter Proteinimpfstoff mit einer die Immunantwort verstärkenden
Substanz (Adjuvans) vermischt wird, was dann subkutan, intraperitoneal
oder intramuskulär
injiziert wird. Die bisher untersuchten Ratten erhielten den Impfstoff
subkutan oder intraperitoneal injiziert. In diesen Tests wurde Verwendung
von Mengen von 100 μg
Antigen pro Ratte und Immunisierungsvorgang Gebrauch gemacht und
mit diesen Konzentrationen wurden sehr starke Immunantworten in
einer Gruppe verschiedener Rattenstämme erhalten (1).
Bei Menschen werden in erster Linie relativ schwache nichttoxische Adjuvantien,
zum Beispiel Alaun, verwendet werden oder als Alternative werden
Injektionen größerer Menge
an aggregiertem Fusionsprotein ohne Zusatz von Adjuvans verwendet
werden. Das aggregierte Fusionsprotein soll die Immunogenität des Proteins erhöhen.
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Darüber hinaus
werden bei Menschen wahrscheinlich beträchtlich größere Mengen des Antigens verwendet
werden, möglicherweise
in der Größenordnung
von 100 bis 500 mg reines Protein. Unter dem technischen Gesichtspunkt
involviert dies keine größeren Probleme,
da es möglich
ist, sehr große Mengen
dieses Fusionsproteins in sehr reiner Form und zu einem Preis, der
nicht zu abschreckend ist, zu erhalten. In der derzeitigen Situation
gibt es eine Reihe von Fusionsproteinvarianten in Produktion in
kleinem Maßstab
für den
humanen Impfstoff wie auch für den
Rattenimpfstoff. Allerdings wartet die Analyse des humane Impfstoffs
auf Resultate aus der sehr großen
Studie, die derzeit bei verschiedenen Rattenstämmen durchgeführt wird.
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Zu
Beginn werden wiederholte Injektionen bei einem etwa 3-Wochen-Intervall
durchgeführt,
um eine starke Immunantwort zu erhalten. Danach wird es wahrscheinlich
notwendig sein, die Immunisierungen nur wenige Wochen vor jedem
Pollenzeitraum für
ein gegen Pollen allergisches Subjekt durchzuführen, um die frühere Immunantwort
zu aktivieren und diese Antwort vor dem neuen Hochrisikozeitraum stark
zu verstärken.
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Durch
Verwendung einer Reihe heterologer Trägermoleküle, an welche artenspezifische
Proteine oder Proteinfragmente gekoppelt sind, wird sich darüber hinaus
der Prozentwert der Zahl von T-Zellen erhöhen. Diese werden die B-Zellen
unterstützen,
welche Antikörper
produzieren, die wie in diesem Fall gegen die CH2-CH3-Region des
humanen IgE-Moleküls
gerichtet sind. Durch diese Verfeinerung des Immunisierungsprotokolls
erwartet man, fähig
zu sein, die Mengen an Antigen zu reduzieren, die für die Immunisierung
verwendet werden müssen,
während die
Immunisierungswirkung aufrechterhalten wird. Dieser letztgenannte
Ansatz wird nicht von unmittelbarem Interesse sein, bis klinische
Tests bei Menschen durchgeführt
wurden, bei denen keine starken Adjuvantien verwendet werden können und
daher alle verfügbaren
Verfahren verwendet werden müssen,
um die Immunogenität
des Impfstoffs zu erhöhen.
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Wie
oben erwähnt
wurde, besteht der Zweck der Erfindung in erster Linie darin, einen
Impfstoff zur Verwendung beim Menschen herzustellen. Im Rahmen der
Erfindung liegen jedoch auch Impfstoffe für andere Säugerspezies, bei denen es wirtschaftlich wichtig
ist, gegen IgE-vermittelte allergische Reaktionen zu impfen. Beispiele
für solche
Arten sind Hunde, Pferde und Schweine.
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Die
Erfindung wird weiter unten durch die folgende spezifischen Arbeitsbeispiele
erläutert
werden.
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Beispiel 1
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Herstellung einer Fusionsprotein-Präparation
der CH2-CH3-Region der Epsilon-Kette von IgE aus Menschen und Ratte
-
In
diesem Beispiel wurde ein System genutzt, in dem das artenspezifische
Protein und das Trägerprotein
in Bakterien, in diesem Fall Escherichia coli, in gekoppelter Form
bzw. gebundener Form produziert werden. Mit Hilfe der PCR-Technik
(Polymerasekettenreaktion) wurden die cDNA-Sequenzen für die CH2-CH3-Regionen
sowohl der humanen als auch der Ratten-Epsilon-Kette von IgE kloniert
und in einen im Handel verfügbaren
Vektor für
die Produktion eines Fusionsproteins in Bakterienwirten ligiert. Der
verwendete Vektor ist ein Mitglied der sogenannten pGEX-Vektoren
der Form 1, 2 oder 3 mit unterschiedlichen Leserastern zur Ligation
von cDNA-Fragmenten (Smith und Johnson, 1988). Es wurde gezeigt,
dass dieser Vektortyp in diesem Fall hohe Ausbeuten an reinem Fusionsprotein
für eine
direkte Immunisierung liefert. In diese Vektorfamilie wird die ganze
codierende Region für
eine 26 kD Glutathion-S-Transferase (Sj26) aus dem parasitären Wurm Schistosoma
japanicum cloniert, der danach ein starker und induzierbarer bakterieller
Promotor ist. Dieser Promotor, ein sogenannter tac-Promotor, wird durch
den lac-Repressor negativ reguliert. Um große Mengen an Protein zu erhalten,
wird die Inhibierung des Promotors mittels IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid)
gezeigt. Nach Ligation des CH2-CH3-Fragments in den Vektor im C-terminalen
Teil des Sj26-Gens wird der Vektor in einen E. coli-Stamm für die Produktion
des Fusionsproteins transformiert. Eine Übernachtkultur dieses neuen
Bakteriums, das den Vektor, in welchen das gewünschte Fragment ligiert wurde,
enthält,
wird im Verhältnis
1:10 in Bakterienwachstumsmedium verdünnt und für weitere 2 Stunden wachsen
gelassen. Dann wird die Kultur während
kräftigen
Schüttelns
für weitere
4 Stunden inkubiert. Dann werden die Bakterien durch Zentrifugation
gesammelt und das Zellpellet wird 3-mal in PBS gewaschen. Nach dem
Waschen werden die Zellen in PBS + 1% Triton X-100 suspendiert, wobei jedes Mal für 5 × 15 Sekunden
beschallt wird, um die Zellwände
der Bakterien unter Freisetzung des Proteins aus den Zellen zu brechen.
Es wurde gezeigt, dass im Fall sowohl der Ratten- als auch der humanen
CH2-CH3-Fusionsproteine das Protein intrazellulär als Kristalle präzipitiert
und daher mittels einer Lösung,
die 8 M Harnstoff enthält,
zu solubilisieren ist. Dann kann das humane Protein gegen reines PBS
dialysiert werden und wird vollständig löslich. Derzeit sind Arbeiten
im Gange, um ein Protokoll für eine
Reinigung im großen
Maßstab
zu einer Reinheit von fast 100% für das humane Fusionsprotein
zu erhalten. Allerdings ist das CH2-CH3-Fusionsprotein der Ratte
unlöslicher
und das meiste Protein präzipitiert
bereits nach Dialyse für
eine halbe Stunde bis eine Stunde. In den folgenden Beispielen wird
von einer Fusionsprotein-Präparation
des Ratten-CH2-CH3 Gebrauch gemacht, die eine Reinheit von etwa
50% hat. Diese Präparationen
wurden verwendet, um die Möglichkeit
des Erhalts einer starken Antikörperantwort
gegen das ratteneigene IgE zu erhalten und die Möglichkeit der Blockierung einer
starken IgE-vermittelten
inflammatorischen Reaktion bei der Ratte zu untersuchen. Die verbleibenden
50% des Proteins in der Präparation
bestehen aus verschiedenen kontaminierenden Bakterienproteinen, wobei
ein einzelnes Protein nicht mehr als 10% des Gesamtproteins ausmacht.
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Beispiel 2
-
Immunisierung der Ratte – Messung
der Immunantwort
-
Eine
Immunisierung oder Impfung wird mit Hilfe der Fusionsprotein-Präparation
aus Beispiel 1 im Gemisch mit einer die Immunantwort potenzierenden
Substanz (Adjuvans) unter Bildung eines Impfstoffs durchgeführt. Die
Ratten, die untersucht wurden, erhielten eine Injektion mit dem
Impfstoff subkutan oder intraperitoneal mit einem Gemisch aus löslichem
und aggregiertem Protein. In diesen Tests wurden Mengen von etwa
100 μg Antigen
pro Ratte in 0,2 ml Freunds komplettem Adjuvans bzw. unvollständigem Adjuvans
pro Immunisierungsvorgang und Ratte verwendet. Mit diesen Konzentrationen und
Adjuvantien wurden in einer Gruppe unterschiedlicher Rattenstämme sehr
starke Immunantworten erhalten.
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In 1a und
b ist ein Test mit vier verschiedenen Rattenstämmen und drei Ratten pro Stamm gezeigt.
Die Antikörpertiter
gegen natives IgE wurden mittels ELISA gemessen. Dieser Assay wurde
so durchgeführt,
dass natives IgE in Beschichtungspuffer (5 μg/ml) zur Beschichtung der ELISA-Platten
verwendet wurde. Sukzessive Verdünnungen
(1/5) von Rattenserum aus den verschiedenen Testtieren wurden auf
Farbreaktion in ELISA getestet. Die Extinktionswerte bei 400 nm
sind auf den Y-Achsen in 1 gezeigt
und die unterschiedlichen 1/5-Verdünnungen sind auf den X-Achsen
mit steigenden Verdünnungen nach
rechts in der Figur gezeigt.
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Die
vier verschiedenen Rattenstämme
(Lewis, Sprague Dawley, Wistar und Brown Norway) wurden in den linken
Abbildungen bezüglich
ihrer Fähigkeit
auf CH2-CH3-Impfstoff
zu reagieren, und in den rechten Abbildungen gegen humanes IgG (als Kontrolle)
analysiert. Der verwendete Impfstoff ist das CH2-CH3 der Ratte,
das bei der Ratte vollständig dem
humanen Impfstoff entspricht. Diese Ratten wurden nur zweimal geimpft;
zu Beginn mit einer Impfung mit Freunds vollständigem Adjuvans und Proteinlösung und
dann mit einer zweiten Impfung drei Wochen später mit derselben Proteinlösung in Freunds
unvollständigem
Adjuvans. Eine Woche nach der zweiten Impfung wurden Blutproben
von den Ratten entnommen. Dann wurde der Gehalt an Anti-IgE-Antikörpern im
Blut durch einen ELISA-Assay bestimmt. Wir klar aus der Figur zu
sehen ist, antworteten drei der Stämme sehr gut auf den Impfstoff, während der
vierte Stamm ein sogenannter „Nicht-Responder" ist, was bei Verwendung,
wie in diesem Fall, von kongenen Stämmen nicht unüblich ist.
Durch diesen Ausdruck ist gemeint, dass Rattenstamm dieses Antigen
nicht für
das Immunsystem präsentieren
kann und dass es notwendig wäre,
in diesem Rattenstamm ein anderes heterologes Trägerprotein zu verwenden, um
die gewünschte
Wirkung des Allergieimpfstoffs zu erzielen. Wie aus diesen Anfangs-ELISA-Messungen
zu sehen ist, wird eine sehr starke Immunantwort nur gegen zwei
Domänen
des Ratten-IgE erzielt, die mit der nur etwas stärkeren Reaktion, die gegen
das humane IgG erhalten wird, zu vergleichen ist, welches außerdem eine
Größe hat,
die vier Domänen
entspricht. Diese Ratten, die sehr hohe Anti-IgE-Titer zeigen, zeigen keinerlei negative
Symptome. In der Praxis können sie
durch kein Kriterium von den Ratten unterschieden werden, die nur
mit reinem PBS in Freunds Adjuvans immunisiert wurden (die Kontrollen,
die in 1 als „Blindprobe" bezeichnet werden).
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Beispiel 3
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Rattenimmunisierung – Suppression einer IgE-vermittelten
inflammatorischen Reaktion
-
Studien
mit dem Ziel einer Beurteilung der Fähigkeit des Impfstoffs der
Erfindung, eine starke IgE-vermittelte inflammatorische Reaktion
zu unterdrücken,
wurden ebenfalls durchgeführt.
Als Assaysystem wurde die Tatsache genutzt, dass Anti-IgE-Antikörper die
Fähigkeit
haben, IgE-Antikörper, die
an Mastzellen der Haut gebunden sind, zu vernetzen und durch ihre
Fähigkeit,
diese IgE-Moleküle
zu vernetzen, eine starke Granula-Freisetzung zu induzieren und
dadurch eine starke inflammatorische Reaktion an der Stelle, an
der die Antikörper
injiziert wurden (in diesem Fall die Haut), hervorzurufen. In diesem
Beispiel wurde ein polyklonales Anti-IgE-Antiserum verwendet, das
gegen die ganze konstante Region von IgE gerichtet ist. Dafür sollte
dieses Serum große
Mengen an Vernetzungsantikörpern
enthalten, was auch durch die Resultate bestätigt wird. Die Stärke der
Entzündung
wird dann mittels einer Farbreaktion gemessen. Die Permeabilität und dementsprechend
die Leckage von verschiedenen Blutproteinen aus dem Blut verstärkte sich
in der Region, in der die Entzündung
verursacht worden war, stark. Je stärker die Entzündung ist,
eine umso größere blaue
Zone wird erhalten, wenn man 1% Evans Blue-Lösung in das Blut der Testratten
zwei Stunden vor Ablesen der Größe der blauen
Zone unter die Haut der Testtiere injiziert. Der Test, der in 2 schematisch
dargestellt ist, wurde so durchgeführt, dass Tierinjektionen mit
je 50 μl
einer konzentrierten Lösung
eines polyklonalen Anti-IgE-Antiserums
unter die Haut einer geimpften Ratte und einer blindimmunisierten
Ratte zwei Stunden vor Entfernen der Haut und Messung der Entzündungszonen
durchgeführt wurden.
Als Kontrolle wurden Injektionen von IgE plus Anti-IgE an einem
Punkt pro Ratte und von nur PBS an einem Punkt durchgeführt. Zwei
typische Beispiele für
diese Ratten sind in der Figur gezeigt, wobei eine der Ratten mit
CH2-CH3-Impfstoff in Freunds Adjuvans immunisiert worden war und
die andere Kontrollratte mit PBS in Freunds Aduvans immunisiert
worden war. Die Zonen der IgE plus Anti-IgE-Kontrollen haben für die zwei
Ratten eine sehr ähnliche
Größe, wohingegen
die Zonen für
Injektionen mit nur Anti-IgE-Antikörper für die geimpfte
Ratte nahezu auf null reduziert war. Anti-IgE-Antikörper rufen
starke blaue Zonen für
die mit Blindprobe immunisierten Ratten (als Kontrolle) hervor.
Dies zeigt, dass es der geimpften Ratte wahrscheinlich vollständig an
IgE-Antikörpern
an der Oberfläche
ihrer Mastzellen fehlt, was in vollständiger Übereinstimmung mit dem aus
den Immunisierungen zu erwartenden Resultat steht, wobei in diesen
Ratten hohe Konzentrationen an endogenen Anti-IgE-Antikörpern gefunden
wurden. Allerdings fehlen ihnen nicht die Mastzellen, da es möglich ist,
eine normale blaue Zone beizubehalten, indem exogenes IgE zusammen
mit den IgE-Antikörpern
zugegeben wird, und dadurch die Mastzellrezeptoren an diese Mastzellen
zu binden, die wahrscheinlich ursprünglich frei von IgE waren.
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Derzeit
wird eine Arbeit mit sehr vielversprechenden Resultaten in einem
neuen Rattenmodell durchgeführt,
bei der eine sehr starke IgE-Antwort bei Wistar-Ratten hervorgerufen
wird, die gut auf den erfindungsgemäßen Rattenimpfstoff reagieren
(siehe 1). Eine Immunisierung der
Ratten wird mit einem spezifischen Antigen, das in diesem Fall Ovalbumin
zusammen mit dem Toxin Ricin ist, nach einem neu entwickelten Protokoll
von Dr. Kerneny (Diaz-Sanchez und Kerneny, 1991) durchgeführt. Nach einer
Reihe von Wochen erhalten diese Ratten eine sehr starke IgE-Reaktion
auf Ovalbumin und darüber hinaus
ist diese Immunantwort relativ lang anhaltend. Anfängliche
Studien haben sehr gute Resultate mit diesem Protokoll ergeben.
Eine Reihe von Ratten wurde bezüglich
ihrer Fähigkeit,
eine starke inflammatorische Reaktion in der Haut nach Injektion
von 50 μl
einer Lösung,
die 5 mg pro ml Ovalbumin enthielt, zu entwickeln, analysiert. Diese
ergab blaue Zonen, die nahezu zweimal so groß wie die vorher erwähnten positiven
Kontrollen mit IgE + Anti-IgE sind, was zeigt, dass diese Ratten
gegenüber
Ovalbumin extrem allergisch sind. Dieser Rattentyp wird heute untersucht,
um die Möglichkeit
einer Blockierung allergischer Reaktionen in der Haut zu studieren
und dann die Wirkungen auf Bronchokontriktionen und andere typische
allergiebedingte Symptome zu untersuchen.
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Nachfolgend
ist eine Zusammenfassung der essentiellen Unterschiede zwischen
der vorliegenden Erfindung und dem Stand der Technik in vier Punkten
angegeben.
- 1. Die Erfindung konzentriert sich
lediglich auf die Domänen
des IgE-Moleküls,
die direkt bei der Interaktion mit dem IgE-Rezeptor involviert sind, und
nicht wie in früheren
Studien auf Regionen in der nicht-Rezeptor-interagierenden CH4-Domäne.
- 2. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung enthält artenspezifische
Proteinfragmente an einen oder mehrere heterologe Träger gekoppelt,
was es möglich
macht, eine starke Immunantwort zu erzeugen, im Gegensatz zu früheren Studien,
in denen Epsilon-Peptid von anderen Arten als die, in die das gekoppelte
Peptid injiziert wird, verwendet wurden, das heißt humane Peptide in Maus, Ratte
oder Kaninchen.
- 3. Im Gegensatz zu den monoklonalen Projekten, die in mehreren
Labors in der ganzen Welt durchgeführt werden, basiert die Erfindung
auf der Erzeugung einer polyklonalen Immunantwort auf ein artenspezifisches
Protein, was die Möglichkeiten, ein
erfolgreiches Resultat zu erzielen beträchtlich erhöht, da dadurch Immunkomplexbedingte
Komplikationen, die zu lebensbedrohlichen inflammatorischen Reaktion
führen, äußerst wahrscheinlich
vermieden werden.
- 4. Der wichtigste Unterschied ist, dass gemäß der Erfindung die CH2-CH3-Domänen oder
eine ganze Domäne
davon als Impfstoff verwendet werden. Dadurch wird eine starke polyklonale
Antwort in Tiersystemen (bereits gezeigt) gegen natives IgE erhalten,
was eine sehr wichtige Eigenschaft eines Impfstoffs dieses Typs
ist (auch gezeigt). Diese wird nur nach wenigen Wochen Immunisierung
erhalten, was einen sehr großen
Fortschritt im Vergleich zu den früheren Ansätzen, die im Fachgebiet mit
kurzen synthetischen Peptiden gemacht wurden, bedeutet.
-
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