HU218899B - Eljárás IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására használható vakcina előállítására - Google Patents
Eljárás IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására használható vakcina előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU218899B HU218899B HU9400845A HU9400845A HU218899B HU 218899 B HU218899 B HU 218899B HU 9400845 A HU9400845 A HU 9400845A HU 9400845 A HU9400845 A HU 9400845A HU 218899 B HU218899 B HU 218899B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ige
- protein
- amino acid
- antibodies
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims description 15
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title claims description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 title claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 33
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 15
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 claims 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 67
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 24
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 23
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 14
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 14
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108020005719 Species specific proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000007397 Species specific proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 6
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 6
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 4
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 3
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 3
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 201000004338 pollen allergy Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003912 basophilic leucocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101000693916 Gallus gallus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 206010028164 Multiple allergies Diseases 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047623 Vitamin C deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003266 anti-allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000007885 bronchoconstriction Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000010233 scurvy Diseases 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003595 thromboxanes Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000009959 type I hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
- C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/80—Antibody or fragment thereof whose amino acid sequence is disclosed in whole or in part
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/801—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving antibody or fragment thereof produced by recombinant dna technology
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/805—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving IgE or IgD
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/81—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, immunotolerance, or anergy
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/862—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgE or IgD
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/867—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody produced via recombinant dna technology
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány az IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására használható vakcina előállítási eljárására vonatkozik. A találmány szerinti eljárással előállított vakcina ugyan általánosan emlősökön alkalmazható, a találmány azonban előnyösen emberen alkalmazható vakcina előállítására vonatkozik, ezért a találmányt az alábbiakban az emberen alkalmazható vakcinára utalva ismertetjük.
Az IgE (immunoglobulin E) a humán populációban megfigyelt hiperszenzitivitás legfőbb okozója, noha koncentrációja a humán plazmában (10-400 ng/ml) rendszerint igen csekély. Ez a sajátsága a masztocitákon (hízósejteken) és a bazofil leukocitákon levő, az IgE iránt nagy affinitású receptorral való kölcsönhatásának tulajdonítható.
Ha az ilyen típusú sejtek felületén két IgE-receptor összekapcsolódik (keresztkötés jön létre) allergiás kötés révén, akkor számos fiziológiailag aktív vegyület, mint hisztamin, PAF (vérlemezke-aktiváló faktor), heparin, az eozinofil és neutrofil granulociták kemotaktikus faktorai, leukotriének, prosztaglandinok és tromboxánok felszabadulása iniciálódik. Ezek azok a közvetítők, amelyek az IgE által közvetített allergiás reakciók (I típusú hiperszenzitivitás) direkt szimptómáit okozzák. Az e csoporthoz tartozó betegségek körébe tartozik az asztma legtöbb típusa, a szórallergia, a pollenallergia, az élelmiszer-allergia sok típusa, és az ekcéma néhány típusa.
Az IgE iránt nagy affinitású receptort jellemezték mind proteinszinten, mind génszinten egéren, patkányon és emberen (Kinet J., Metzger H., Hakimi J. és Kochan J.; A cDNA presumptively coding fór the alpha subunit of the receptor with high affinity fór immunoglobulin E. Biochemistry 26 /1987/ 4605-4610, Shimizu A., Tepler L, Benfey P., Berenstein E., Siraganian R. és Leder O.; Humán and rat mást cell highaffinity immunoglobulin E receptors: Characterization of putative alpha-chain gene procucts. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 /1988/ 1907-1911, Tepler L, Shimizu A. és Leder P.; The gene fór mást cell high affinity IgE-receptor alpha chain. J. Bioi. Chem. 264 /1989/ 5912-5915, Blank U„ Miller R„ White K., Metzger H. és Kinet J.; Complete structure and expression in transfected cells of high affinity IgE-receptor. Natúré /1989/ 187-189, Kinet I, Blank U., Ra C., White K., Metzger H. és Kochan I; Isolation and characterization of cDNAs coding fór the béta subunit of the highaffinity receptor fór immunoglobulin E, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 /1988/ 6483-6487). Ez a receptor valószínűleg csak a masztocitákon és a bazofil leukocitákon van jelen szervezetünkben. A receptor három alegység, az úgynevezett alfa-, béta- és gamma-lánc komplexe. A főleg extracellulárisan lokalizált alfa-lánc az, amely az IgE-molekulával kölcsönhatásba lép.
A nagy affinitású IgE-receptorral kölcsönhatásba lépő IgE-molekula epszilon-láncának régiójára vonatkozó részletes vizsgálatok kimutatták, hogy a CH2 és CH3 doménok (CH=konstans doménok a nehéz láncban) közötti határnál egy 76 aminosavból álló résznek döntő jelentősége van az IgE-molekula és annak nagy affinitású receptora közötti kölcsönhatás szempontjából.
Ez a peptid képesnek bizonyult a natív IgE és annak nagy affinitású receptora közötti kölcsönhatás in vitro gátlására közel 1:1 mólarányban az egész CH2-CH3-CH4 régióhoz viszonyítva (Helm B., Marsh P., Vercelli D., Padlan E., Gould H. és Geha R.; The mást cell binding site on humán immunoglobulin E. Natúré 331 /1988/ 180-183). A pepiidről bebizonyosodott az is, hogy allergén stimulációban gátolni képes az IgE által közvetített bőrpírt. Ekkor azonban mintegy 10-szer akkora koncentrációra van szükség, mint amelyben a natív IgE biztosítja ugyanazt a gátló hatást (Helm B., Kebo D., Vercelli D., Glovsky M., Gould H., Ishizaka K., Geha R. és Ishizaka T.; Blocking of passive sensitization of humán mást cells and basophil granulocytes with IgE antibodies by a recombinant humán epsilon-chain ffagment of 76 amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 /1989/ 9465-9469).
Ha az IgE-molekula rákapcsolódik a receptorára, akkor az epszilon-lánc bizonyos régiói blokkolódnak más molekulákkal való kölcsönhatás, így például az IgE-molekula azonos régiójának epitópjai ellen irányuló antitestekkel való kölcsönhatás szempontjából. Ekkor az IgE csupán vagy az IgE-molekula CH2-CH3-régiója elleni IgG-antitesthez vagy a receptorhoz kötődhet, így semmiképpen sem kötődhet egyidejűleg ehhez a két molekulához. Ezzel szemben azok az antitestek, amelyek a receptorral való közvetlen kölcsönhatás régióján kívül eső epitópokhoz kapcsolódnak, létrehozhatnak keresztkötést a masztocita felületére kötött IgE-molekulákkal. Ebben az esetben granulumok nagymértékű felszabadulása és anafilaxiás sokk figyelhető meg azon a kísérleti alanyon, akinek vagy amelynek ilyen antitestet injektáltak a szervezetébe. A receptormegkötő részhez kapcsolódó antitestek viszont nem képesek keresztkötésre a receptorokkal, és azonnali reakció nem jön létre, csak a szabadon cirkuláló IgE koncentrációjában bekövetkező jóval lassabb csökkenés hatása tapasztalható. Ez valószínűleg megakadályozza a granulumok felszabadulását, és így többé nem lesz jelen IgE-antitest a kísérleti alany plazmájában.
Ezek az anti-IgE-antitestek valószínűleg még tartósabban kiszorítják az IgE-termelő B-sejt-populációt, aminek következtében megnő az IgE-szintézis még tartósabb visszaszorításának lehetősége. A potenciális pollenveszély időszakában ezek az antitestek megkötődnek, és teljesen eliminálják az IgE-tartalékot, amely a pollenallergiás egyének erős gyulladásos reakcióját okozza. Számos megfigyelés mutatja, hogy nem allergiás egyénekben viszonylag nagy az endogén anti-IgEantitestek koncentrációja, ami feltehetőleg hasonló allergiagátló hatást eredményez.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcina hatása azon alapul, hogy a vakcina immunreakciót képes indukálni a szervezet saját IgE-anyagával szemben, ennek folytán megakadályozza az IgE-antitestek kötődését ezekhez a receptorokhoz. Ennek következtében lehetetlenné válik a masztocitákban tárolt allergiakeltő anyagok felszabadulása.
HU 218 899 Β
Az e téren meglevő ismert megoldásokat és azok hiányosságait az alábbiakban foglaljuk össze.
A) Receptormegkötő peptidek és más receptorantagonisták
Világszerte több kutatócsoport foglalkozik napjainkban rövid peptidek vagy olyan molekulák előállításával, melyek képesek rákapcsolódni az IgE-receptorra, és így képesek megakadályozni az antigénspecifikus IgE kötését. Ezektől a vegyületektől azt várják, hogy utóbb gyógyszerként alkalmasak lesznek allergia kezelésére.
Ezzel kapcsolatban problémát jelent, hogy igen nehéz olyan molekulát előállítani, amely olyan kötési erővel rendelkezik a receptor iránt, ami megfelel a natív IgE-molekula és a receptora közötti igen erős kölcsönhatásnak. Hatásos készítmény előállítása érdekében valószínűleg olyan vegyületekkel kell dolgozni, amelyek irreverzíbilisen kötődnek a receptorhoz. Az ilyen vegyületek azonban viszonylag toxikusak, mert kovalens kötéssel képesek kötődni, és blokkolják a szervezetben a szerkezetileg hasonló molekulákat. Érdemes megemlíteni ezzel kapcsolatban, hogy az IgE-recptor alfa-lánca egy olyan nagyobb géncsaládhoz tartozik, amely felöleli többek között a különböző IgG Fc-receptorokat. Ezek a receptorok abszolút lényegesek a szervezetnek többek között a bakteriális fertőzésekkel szembeni védekezése szempontjából. A kovalens kötésre aktivált molekulák ezenkívül gyakran bomlékonyak, ezért nagy valószínűséggel naponta többször, nagy koncentrációban kell őket beadni ahhoz, hogy képesek legyenek teljesen blokkolni a masztocitákon és a bazofil leukocitákon levő IgE-receptorok folyamatosan megújuló készletét.
B) Monoklonális anti-IgE az allergia kezelésére
Egy modell, mellyel egy biotechnológiai társaság foglalkozik az Amerikai Egyesült Államokban, magába foglalja olyan monoklonális antitestek egéren való előállítását, mely antitestek a humán IgE-molekula IgE-receptor-megkötő régiója ellen irányulnak. Ezeket az antitesteket azután géntechnológiai úton „humanizálják” oly módon, hogy az egér monoklonális konstans régióit a megfelelő humán konstans régiókra cserélik ki. Ezeket az antitesteket azután tiszta alakban, nagy mennyiségben kell kipreparálni, hogy injekcióként lehessen használni őket. A humanizálás célja, hogy mérsékelje a szervezet immunreakcióját az antitestekkel szemben, melyek máskülönben a második vagy harmadik injekció beadása után erőteljes immunkomplex-képződést idéznének elő, ami közvetlen életveszéllyel járó komplikációkhoz vezetne.
A pollenallergiás betegek kezeléséhez minden bizonnyal szükséges, hogy ezeket az antitesteket injekcióként hetenként egy vagy több alkalommal beadják a nagy pollenkoncentráció időszakában. A monoklonális antitestek injekciós beadásával kapcsolatban az a probléma, hogy azok, még ha „humanizálva” is vannak, nagy koncentrációban tartalmaznak új epitópokat, melyeknek a szervezet korábban nem volt kitéve, és így valószínűleg nagy antitesttiterek alakulnak ki viszonylag rövid idő alatt még az említett monoklonális termékek ellen is. Ez minden valószínűség szerint ugyanúgy, mint az egér monoklonális antitestek, életet veszélyeztető komplikációkat idéz elő immunkomplex-képződés miatt, minthogy a monoklonális termékek még mindig az egér V-régióból származó szerkezet régióit tartalmazzák. Ezeknek a komplikációknak az elkerülésére valószínűleg a humanizált antitestek széles skáláját kell használni a kezelés során, az antitesteket fokozatosan változtatva. Még ha igen nagy gonddal adagoljuk is, mindig fennáll a kockázat, hogy mikor és milyen mértékben képződik immunkomplex.
C) Peptidvakcinák (CH4-e)
Egy kutatócsoport dr. Stanworth vezetésével oly módon járt el, hogy heterológ vivőproteinre kötött humán peptidet használt immunizáláshoz nyúlban vagy patkányban. Kísérleteikben, mint leírták, nyúlból származó heterológ antiszérumot használtak patkány kezelésére. Semmilyen immunválaszt nem tudtak kimutatni az ELISA-módszerrel a nyulakban, melyekbe az antigént injektálták, ami azt jelenti, hogy immunválasz még nem faj specifikus peptidek használata esetén sem detektálható, még a jelenleg ismert legérzékenyebb módszerrel sem (Stanworth, D. R. Jones, V. M., Lewin, I. V. és Nayvar, S.; Allergy treatment with a peptide vaccin. The Láncét 336 /1990/ 1279-1281). A kutatócsoport olyan rövid peptideket használ, amelyek egyértelműen az IgE-molekula receptormegkötő (CH2-CH3) részén kívül eső régióból valók, ami világosan eltér a találmány szerinti alapgondolattól, melyet az alábbiakban még részletesen ismertetünk. A rövid peptidek használatának az a fő hátránya, hogy ezek az anyagok csaknem teljesen képtelenek stabil másodlagos szerkezeteket képezni. Feltehetően ez az egyik oka annak, hogy igen gyenge immunválaszt kaptak dr. Stanworth modellrendszerében.
A találmány célja, hogy olyan peptidvakcinát biztosítson az IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására emlősökön, köztük az emberen is, amely vakcina immunválaszt indukál a szervezet saját IgE-anyaga ellen, és ezzel megakadályozza az IgE-antitesteknek az IgE-receptorokra való kötődését, és ezáltal a masztocitákban tárolt allergiakeltő anyagok felszabadulását.
A kitűzött célt a találmány szerint olyan vakcinával éljük el, amely egy, az adott emlősfajból származó IgEmolekula epszilon-lánca konstans CH2-CH3 doménjainak teljes aminosavszekvenciájával rendelkező proteint vagy egy ilyen aminosavszekvencia 12-nél több aminosavat tartalmazó, szerkezetileg stabil egységét tartalmazza eredeti vagy mutációval módosított, vagy multimerizált alakban, mely protein adott esetben egy vagy több heterológ vivőproteinre van kötve, továbbá adott esetben egy adjuvánst tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi az ilyen vakcina előállítási eljárása, melyhez egy emlősfajból származó IgEmolekula epszilon-láncában levő konstans CH2-CH3 doménok teljes aminosavszekvenciáját vagy az aminosavszekvencia több mint 12 aminosavat tartalmazó szerkezetileg stabil egységét használjuk eredeti vagy multimerizált alakban.
A mellékelt ábrákon vizsgálati eredményeket mutatunk be a találmány szemléltetésére.
HU 218 899 Β
Az 1A. és az 1B. ábra az immunválaszt (az antiIgE-antitestek mennyiségét) mutatja négy különböző patkányfajon, az antitesttitert ELISA-módszerrel kimérve, natív patkány-IgE-anyaggal szemben, illetve kontrollként humán IgE-anyaggal szemben.
A 2. ábra az IgE által közvetített gyulladásos reakció visszaszorítását mutatja vakcinázott patkányon, öszszehasonlítva a kontrollpatkányokkal, poliklonális antiIgE-antiszérum injekció beadása után.
Konstans CH2-CH3 doménok aminosavszekvenciái (a teljes szekvencia vagy annak részei) mutációval módosított alakban lehetnek jelen, ami azt jelenti, hogy az aminosavszekvenciák közvetlen cserével vagy törlések, vagy kiegészítések útján lehetnek módosítva. Ha enyhén módosított alakról beszélünk, ezzel arra utalunk, hogy az aminosavszekvencia nagyobb része még maga a protein szekvenciája eredeti alakban, és így a hatás is csaknem azonos, vagy esetleg csekélyebb, mint az eredeti szekvenciáé; a mutációval enyhén módosított aminosavszekvenciát tartalmazó proteint tehát a szervezet még tolerálja, és így, az eredeti alakjához hasonlóan, bizonyosan rákapcsolható egy heterológ vivőproteinre, hogy a találmány szerinti vakcinában antigénként működhessen.
Ha mutációval erősen módosított alakról beszélünk, akkor arról van szó, hogy az aminosavak cseréje, törlése és/vagy kiegészítése olyan mértékű beavatkozást jelent az eredeti aminosavszekvenciába, hogy az már magában is antigénként működik, minthogy a mutáció folytán olyan új T-sejt-epitópok alakultak ki benne, amelyekkel szemben a szervezet nem toleráns; ebben az esetben nem szükséges a proteint heterológ vivőproteinre kapcsolni.
Multimerizált alakon azt értjük, hogy a protein aminosavszekvenciáját (az egész szekvenciát vagy annak egy részét) polimerizáltuk, hogy két vagy több ismétlődő egységet tartalmazó formát hozzunk létre; ezzel az eljárással új T-sejt-epitópok alakulhatnak ki a különböző egységek között, lehetővé téve ily módon is, hogy a protein multimerizált alakja magában is antigénként működjön. Ekkor sincs szükség arra, hogy a proteint heterológ vivőproteinre kapcsoljuk.
A találmány jelenleg előnyös kiviteli alakja szerint az IgE-molekula epszilon-láncában levő konstans CH2-CH3 doménok aminosavszekvenciáját (a teljes szekvenciát vagy a szekvencia egy részét) eredeti alakban tartalmazó proteint használunk, és a proteint egy vagy több heterológ vivőproteinre kötjük. A találmányt ezért a továbbiakban erre az előnyös kiviteli alakra való utalással ismertetjük részletesen.
A találmánnyal azon a teljesen új elgondoláson alapuló módon oldjuk meg az IgE által közvetített allergiás reakciók elleni immunizálásnak a technika állásából ismert módszereivel kapcsolatos problémákat, hogy a találmány révén olyan vakcinát biztosítunk, amely immunválaszt képes indukálni a szervezet saját IgE-anyaga ellen.
A szervezet bekapcsolásával, hogy maga produkáljon poliklonális anti-IgE-választ, olyan antitesteket kapunk, amelyek teljesen faj specifikusak, és így sokkal kevésbé immunogének. Ezek az antitestek azután megkötik a szervezetben cirkuláló szabad IgE-tartalékot, és megakadályozzák, hogy az IgE-receptorhoz kötődjön. Annak következtében, hogy az immunválasz poliklonális, és így az azonos idiotípusú molekulák száma igen csekély, csaknem teljesen megszűnik az antiidiotípus válasz problémája.
Az a tény, hogy az imént leírt elgondolás megvalósításával eddig nem kísérleteztek, valószínűleg annak tulajdonítható, hogy nem sikerült megoldani a szervezet saját IgE-anyagával szemben erős IgG-válasz létrehozásának kérdését. Ez ugyanis olyan molekula, amely iránt a szervezet a születéstől fogva toleránssá vált, és így nem reagál vele szemben immunológiailag. E probléma megoldására a találmány szerint az immunrendszernek azt az alig ismert, de a probléma sajátos megoldását nyújtó tulajdonságát használjuk ki, hogy nagy valószínűséggel megtámadja a monoklonális projekteket. A CH2-CH3 régiónak (a proteinnek) egy nem fajspecifikus proteinhez való kapcsolásával meghiúsítjuk az immunrendszernek a szervezet saját IgE-anyaga iránti toleranciáját. Ennek következtében helyreáll a nem tolerált T-sejt-állomány, amely normális körülmények között csak a vivőanyagként választott idegen molekulával szemben idéz elő antitestválaszt, ugyanakkor azonban segíti a B-sejteket, hogy antitesteket termeljenek egy fajspecifikus molekulával szemben. Ezt a hatást azzal érjük el, hogy a CH2-CH3 régiót közvetlenül a vivőproteinre kapcsoljuk.
Ennek a jelenségnek a következményeit csaknem teljesen figyelmen kívül hagyták az immunológiával foglalkozó szakemberek, és ez lehet a magyarázata annak, hogy eddig egyetlen kutatócsoport sem vállalkozott a kérdés ily módon való megközelítésére. E jelenség kihasználásának lehetőségét kutatva alig vagy egyáltalán nem találtunk ilyen irányú tanulmányokat a szakirodalomban. A peptidek kapcsolására kiteijedő tanulmányokban használtak humán peptideket injekcióhoz nyúlon, egéren vagy patkányon, de nem használtak azonos fajból származó peptidet. Ennek oka az az uralkodó vélemény, hogy faj specifikus molekulákkal szemben nem lehet erős immunválaszt előidézni.
Annak igazolására, hogy a találmány szerint erős immunválaszt lehet kapni fajspecifikus IgE ellen, kísérleteket végeztünk patkánytörzsek különböző csoportjain, melyeket olyan fúziós proteinnel immunizáltunk, amely egy, a patkány-IgE teljes CH2-CH3 doménjaihoz kapcsolt vivőmolekulát tartalmazott (2. példa). Ezekben a patkányokban (csak 4 hét elteltével) erős immunválaszt kaptunk a natív patkány-IgE-molekulával, vagyis az IgE-anyagnak a patkány plazmájában cirkuláló alakjával szemben. Ez az antitestválasz csak jelentéktelen mértékben csekélyebb, mint az antitestválasznak az a szintje, amelyet (mint az 1. ábrán látható) egy teljesen nem faj specifikus proteinnel, nevezetesen a humán IgG-vel szemben kaptunk, és amelyet az ELISA-módszerrel határoztunk meg.
Azt, hogy - ellentétben dr. Stanworth eredményeivel - ilyen erős immunválaszt kaptunk, azzal indokolhatjuk, hogy a találmány szerint a 10 aminosav hosszú4
HU 218 899 Β ságú pepiidnél nagyobb régiókat, például az adott esetben a teljes CH2-CH3 doménokra kiterjedő régiót használjuk. Ezzel magyarázzuk, hogy lényegesen nagyobb számban kapunk olyan epitópokat, melyek ellen antitestek képződnek, és ezek az epitópok ugyanolyan konformációval rendelkeznek, mint a natív IgE-molekulában levő epitópok.
Heterológ vivőprotein kifejezésen olyan nem faj specifikus proteint értünk, amely alig mutat túl nagy homológiát annak a fajnak a megfelelő proteinjéhez, amelyben a proteint vivőanyagként használjuk. Kerülni kell azonban az olyan proteineket, amelyek rendes körülmények között nem fordulnak elő a környezetünkben, mert egy nagyon erős immunválasz problémákat okozhat, ha gyakran vagyunk kitéve ilyen proteinnek.
Kis peptideknek egy heterológ vivőproteinre való kapcsolásával rendszerint csak viszonylag gyenge immunválaszt kapunk, amely a molekulának csupán egy igen korlátozott régiója ellen irányul. Azonkívül a peptidek túlnyomórészt olyan immunválaszt idéznek elő, amely csupán a peptid, és nem a natív protein megfelelő régiója ellen irányul.
Fontos, hogy nagyon erős immunválaszt kapjunk, amely amellett felismeri a natív IgE-t, minthogy az IgE-molekula és a nagy affinitású receptor közötti kölcsönhatás kötési állandója igen nagy, az 1 χ 10-8 és 2 χ 10-10 közötti tartományba esik,vagy azt is meghaladhatja (Froese A. CRC crit. Rév. Immunoi. 1. /1980/ 79-132). Ha az immunizálás után poliklonális választ kapunk, akkor több különböző antitest, mely a CH2-CH3 régión belül különböző epitópok ellen irányul, lesz képes egyidejűleg ugyanarra az IgE-antitestre kötődni. így igen nagy kombinált kötési erő jön létre a szabad IgE iránt. Ennek következtében az antiIgE-antitestek a monoklonális antitestekhez vagy a rövid peptidekkel szemben képződő antitestekhez viszonyítva lényegesen könnyebben fognak versenyezni az immunizált szervezet szabad IgE-molekuláiért. Ez igen fontos, mert az IgE és a nagy affinitású receptor közötti kölcsönhatás nagyon erős. Ezért a találmány alapját képező gondolat, azaz teljes doménok vagy azok szerkezetileg stabil részeinek használata igen nagy előnnyel jár, és teljesen új koncepciót jelent a fent leírt peptides elgondolásokhoz képest.
A peptidekkel szembeni antitestválasz gyakran csekély vagy semmilyen affinitással nem rendelkezik a natív protein megfelelő aminosavrégiója iránt, ami azt jelenti, hogy az az antitestválasz, amelyet egész doménokkal szemben vagy azok szerkezetileg stabil egységeivel szemben kapunk, döntő különbséget idéz elő a korábbi ismert megoldásokhoz képest.
Ha az IgE-molekulának csupán a CH2-CH3 régióját használjuk (és nem a heterológ CH4-peptideket, amint azt a korábbi tanulmányokban leírták), akkor a szervezet az immunizálás után csaknem kizárólag az IgE-molekulának az IgE-receptorral kölcsönhatásba lépő régiója ellen fog antitesteket képezni. Elméletileg fennáll az a veszély, hogy a CH2 dómén N-terminális része vagy a CH3 dómén C-terminális része ellen irányuló antitestek anafilaxiás sokkot idéznek elő azokban az emlősökben, amelyekben ezek az antitestek képződnek. Az antitest variálható régiója azonban megfelel egy egész dómén méretének, és ezért a legtöbb esetben szférikus gátlás lép fel a receptorkötéssel szemben még ilyen antitestekkel is. Emellett epitópok széles köre elleni antitestek képződnek folyamatosan az immunválasz kiépülése idején, így igen csekély annak az esélye, hogy e kisszámú antitestek közül mindössze egy legyen, amelynek egyedül kell megkötnie egy IgE-molekulát. Ugyanakkor számos állatkísérlet igazolja, hogy az immunizálásnak ilyen hatásai nem mutathatók ki (2. példa). A patkányok, melyek vérét a nagy anti-CH2-CH3-antitest-tartalom jellemzi, nem mutatnak semmilyen tendenciát semmiféle anafilaxiás sokk szimptómáira. Egészségi állapotuk szempontjából nem különböztethetők meg azoktól az állatoktól, amelyeket csak adjuvánssal immunizáltunk (amelyek nem kaptak antigént), vagy azoktól, amelyeket humán IgG-vel immunizáltunk. Ez azt jelzi, hogy a kísérleti állatokban nincsenek kimutatható negatív hatásai ennek az immunizálásnak, még akkor sem, ha az állatok igen nagy anti-IgE-titerrel rendelkeznek. Ily módon ez az első eset, hogy beigazolódott, hogy el lehet érni nagy anti-IgE-titereket fajspecifikus IgE-vel szemben. Emellett ezeken a patkányokon nem tapasztalható az említett kezeléseknek semmilyen negatív hatása, ami arra utal, hogy a kezelési eljárás nagy valószínűséggel komplikáció nélkül végrehajtható emberen is. Ezek a kísérleti eredmények jól mutatják azt is, hogy IgE-receptorhoz kötött IgE-tartalék ezekben a patkányokban gyakorlatilag nem létezik. Máskülönben a CH2 és CH3 doménok előbb említett külső régióit megkötni képes anti-IgE-antitestek erős anafilaxiás reakciója indukálódna, még akkor is, ha az antitesttiter viszonylag alacsony az ilyen antitestekre. A masztociták ugyanis igen érzékenyek a keresztkötést létesítő antitesteknek még kis koncentrációira is. Előzetes vizsgálataink során kiderítettük, hogy immunizálás után azok az állatok, amelyekben nagy az anti-IgE-titer, erőteljesen mérsékelt tendenciát mutatnak arra, hogy felszabadítsák a masztocitáikban levő granulumokat anti-IgE-antitesttel való provokálás után (3. példa, 2. ábra). Jelenleg még kiterjedtebb vizsgálatokat folytatunk, melyekben tyúkovalbuminra erősen allergiássá tett patkányokat kezelünk. A patkánykísérletek eddigi eredményei nagyon ígéretesek több szempontból, mert azt mutatják, hogy erős immunválaszt kapunk, amelynek nincs kimutatható negatív hatása, és végül azt, hogy erősen csökkentett granulumfelszabadulást érünk el, ha poliklonális aktivátort adunk ezeknek a patkányoknak.
Az ilyen típusú vakcinával kapcsolatban bizonyos nehézségeket le kell küzdeni. A lehetőségeket erősen befolyásoló tényezők egyike annak az anyagnak a koncentrációja, melyet a szervezetből el akarunk távolítani. A nagy koncentráció ebben az esetben nagyobb nehézségeket jelent. Ha bármely más immunoglobulinizotípust választottuk volna, a probléma ebből a szempontból még nagyobb lett volna, minthogy az ilyen antitesteknek általában sokkal nagyobb a plazmakoncentrációja.
Az IgE alacsony plazmaszintje miatt ideális ebből a szempontból. A plazmaszint szokásos értéke nem aller5
HU 218 899 Β giás egyének normális populációjában 10 és 400 ng/ml között van. Ez a mennyiség a vérünkben lévő összes immunoglobulin kevesebb mint 0,01%-ának felel meg. Ez a szint valamelyest megemelkedik allergiás egyéneknél, de igen ritkán haladja meg az 5 pg/ml értéket. Összehasonlításként olyan, egéren végzett kísérleteket említhetünk meg, mely kísérletekben az immunoglobulinok egyik könnyű lánca elleni antitesteket használva olyan állatokat kaptak, melyekből csaknem teljesen hiányzott az immunoglobulinoknak ez a típusa. Ezekben a kísérletekben az egér immunoglobulinjának k-lánca elleni monoklonális antitesteket az egér teljes immunoglobulinmennyisége 95%-ának megfelelő mennyiségben injektálva csaknem teljesen eltűntek ezek az antitestek az egér véréből (Weiss S., Lehmann
K., Raschke W. C. és Cohn M.; Mice completely suppressed fór the expression of immunoglobulin k Iight chain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 /1984/ 211-215). Az egérben talált visszamaradó antitestek csaknem 100%-ban lg λ típusúak voltak (az lg λ eredeti koncentrációja mindössze körülbelül 5%). Ez azt mutatja, hogy még ha jelentősen nagyobb koncentrációjú anyagot kell is eltávolítani a szervezetből, van lehetőség arra, hogy ezeket az anyagokat csaknem teljesen eltávolítsuk a vérkeringésből.
A másik lehetséges komplikáció abból adódhat, hogy semmit sem tudunk az erős autoimmunitás indukálásának hosszabb időre kiteijedő hatásáról. Ebben az esetben azonban előnyös, hogy nem fajspecifikus molekulák ellen irányuló T-sejteket használunk egy faj specifikus antigén elleni immunválasz keltésére. A vakcinálási program befejeztével a szervezet saját IgE-anyaga elleni antitestválasz néhány hónap alatt lassan kimutathatatlan szintre csökken. Ez következik be, ha nem adunk emlékeztető injekciót az eredeti vakcináláskor használt vivőanyaggal teljesen azonos vivőmolekulára kapcsolt CH2-CH3 alkalmazásával. Ez a jelenség megmutatkozott sok, egéren végzett részletes vizsgálat során, amikor is igazolódott, hogy a különböző vivőanyagokhoz kapcsolt hapténok elleni másodlagos immunválasz teljes mértékben függ attól, hogy milyen vivőmolekulát választottunk eredetileg. Ha valamely egyén valamilyen nem valószínű és előre nem látható ok miatt negatívan reagálna erre az immunizálásra, az immunizálást le lehet állítani, és az antitesttiter várhatóan néhány hónap alatt kimutathatatlan szintre csökken. Ez hasonlít ahhoz az esethez, amely akkor következne be, ha a szervezet saját IgE-anyaga ellen irányuló monoklonális antitesteket injektálnánk.
Az antiallergiás vakcina fő komponenseként használt kapcsolt proteint technikailag két különböző úton állíthatjuk elő. Az egyik lehetőség egy már kapcsolt protein, úgynevezett fúziós protein előállítása prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben. Prokarióta gazdasejtként általában Escherichia coli baktériumot használunk, de számos más rendszert, így például élesztősejteket vagy sejtvonalakat is használhatunk eukarióta gazdasejtként. A sejtvonalakat rovarokból származtathatjuk emberekre. A humán sejteket azonban általában kerüljük a klinikai gyakorlatban, mert mindig megvan a veszélye annak, hogy egy humán vírus fertőzést okoz a sejtkultúrákban. A másik módszer a vivőproteinnek és az aktív fajspecifikus komponensnek, jelen esetben az IgE-molekula CH2-CH3-régiója teljes egészének vagy egy részének közvetlen kémiai kapcsolásán alapul. Ekkor a proteineket külön-külön állítjuk elő. Általában ez a módszer használatos szintetikus peptidekkel való immunizáláskor, valamint kis hapténokkal (nem protein vegyületekkel) való immunizáláskor, és azon alapul, hogy a vivőproteint például CNBr-dal aktiváljuk kémiailag, azután az aktivált vivőanyagot összekeverjük a peptiddel vagy a proteinffagmenssel, amelyet rá akarunk kapcsolni. Ekkor ez a két anyag kovalens kötéssel összekapcsolódik.
Az imunizálást oly módon végezzük, hogy az oldható vagy aggregált proteinvakcinát összekeveqük egy immunválaszt potenciáló anyaggal (adjuvánssal), azután szubkután, intraperitoneális vagy intramuszkuláris úton injekcióval beadjuk. A patkányoknak, melyekkel eddig kísérleteztünk, szubkután vagy intraperitoneális úton adtuk be a vakcinát. Ezekben a kísérletekben patkányonként mintegy 100 pg antigént használtunk egyegy immunizálás alkalmával, és ilyen koncentrációval igen erős immunválaszt kaptunk különböző patkányfajok kísérleti csoportjainál (1. ábra). Emberen elsősorban viszonylag gyenge atoxikus adjuvánsokat, mint például Alum-adjuvánst használunk, vagy más módon eljárhatunk úgy, hogy nagyobb mennyiségű aggregált fúziós proteint injektálunk adjuváns hozzáadása nélkül. Az aggregált fúziós proteinnel az a célunk, hogy növeljük a protein immunogenicitását.
Emberen valószínűleg lényegesen nagyobb mennyiségű antigént kell használnunk, feltehetően 100-500 mg tiszta protein nagyságrendben. Technikai szempontból ez nem jelent nagyobb problémát, mert igen tiszta minőségben és nem túl elérhetetlen áron nagy mennyiségben be lehet szerezni ezt a fúziós proteint. Jelenleg számos, kis mennyiségben gyártott fúziós proteinvariáns áll rendelkezésre humán vakcina és patkányvakcina készítéséhez. A humán vakcina elemzésére azonban csak a jelenleg különböző patkánytörzseken folyó széles körű vizsgálatok eredményeinek ismeretében kerülhet sor.
Ismételt injekciókat kezdetben mintegy 3 hetes időközökben adunk be, hogy erős immunválaszt kapjunk. Ezután valószínűleg csak néhány héttel a pollenveszély időszaka előtt lesz szükséges a pollenallergiás betegen az immunizálásokat elvégezni, hogy aktiváljuk a korábbi immunválaszt, és erősen kiszélesítsük ezt a választ az új, nagyobb veszélyű időszak előtt.
Emellett, ha több heterológ vivőmolekulát használunk, melyekhez hozzákapcsoltuk a fajspecifikus proteineket vagy proteinfragmenseket, akkor megnő a T-sejtek százalékos aránya. Ezek segítik a B-sejteket, melyek - jelen esetben a humán IgE-molekula CH2-CH3régiója ellen irányuló - antitesteket termelnek. Az immunizálási eljárásnak ezzel a finomításával arra számíthatunk; hogy csökken az immunizáláshoz szükséges antigén mennyisége, miközben az immunizáció hatása változatlanul megmarad. Ez utóbbi megoldáshoz akkor fűződik majd közvetlen érdek, amikor klinikai vizsgála6
HU 218 899 Β tokát fognak emberen végezni, ahol erős adjuvánsokat nem lehet használni, és ezért minden lehetőséget meg kell ragadni arra, hogy csökkentsük a vakcina immunogenicitását.
Mint fent említettük, a találmány célja elsősorban humán célú vakcina előállítása. A találmány azonban kiterjed más emlősfajokon alkalmazható vakcinák előállítására is, melyeknek az IgE által közvetített allergiás reakciók elleni vakcinázása gazdasági szempontból fontos. Ilyen fajok lehetnek például a kutyák, a lovak vagy a sertések.
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük.
1. példa
Emberből és patkányból származó IgE epszilon-láncának CH2-CH3-régióját tartalmazó fúziós proteinkészítmény előállítása
Ebben a példában olyan rendszert használunk, amelyben a fajspecifikus proteint és a vivőproteint baktériumban, konkrétan Escherichia coli baktériumban termeljük kapcsolt formában. A humán, illetve a patkány IgE-epszilon-lánc CH2-CH3 régiójának megfelelő cDNS-szekvenciákat PCR- (polimeráz-láncreakció) technikával klónozzuk, és egy kereskedelemben kapható vektorhoz kötjük, hogy fúziós proteint termeljünk a baktérium-gazdasejtekben. Vektorként az úgynevezett pGEX-vektorok egy tagját használjuk az 1, 2 vagy 3 formában, különböző leolvasási szerkezetekkel, hogy megkössük a cDNS-fragmenseket (Smith, D. B. és Johnson, K. S.; Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusion with glutathion S-transferase. Gene 67 /1988/ 31-40). Ez a vektortípus ebben az esetben kimutathatóan nagy hozamban biztosít tiszta fúziós proteint direkt immunizáláshoz. Ebbe a vektorcsaládba a Schistosoma japonicum parazita féregből származó 26 kD glutation-S-transzferáznak (Sj26) megfelelő teljes kódolórégiót beklónozzuk egy erős és indukálható bakteriális promoter után. Ezt a promotert, egy úgynevezett tac-promotert negatívan reguláljuk a lacrepresszorral. Nagy proteinmennyiség elérése érdekében a promoter gátlását felszabadítjuk IPTG-vel (izopropil-béta-D-tiogalaktoziddal). Miután a CH2-CH3 fragmenst bekötöttük a vektorba, az Sj26 gén C-terminális részébe, a vektort egy E. coli törzsbe transzformáljuk fúziós protein termelésére. Ennek az új baktériumnak egy éjszakán át tenyésztett kultúráját, mely tartalmazza azt a vektort, melybe a kívánt fragmenst kötöttük, 1:10 arányban hígítjuk egy baktériumnövesztő közegben, és tovább hagyjuk növekedni 2 órán át. Ekkor IPTG-t adunk hozzá 100 μΜ mennyiségben, és a kultúrát további 4 órán át inkubáljuk erős rázás közben. Ezután a baktériumtömeget centrifugálással elkülönítjük, és a sejtpelletet háromszor mossuk PBS-sel. Mosás után a sejteket PBS és 1% Triton X-100 keverékében szuszpendáljuk, és 5x15 másodpercig kezeljük ultrahanggal, hogy széttörjük a baktériumok sejtfalait, és felszabadítsuk a proteint a sejtekből. Tapasztalatunk szerint a protein mind a patkány, mind a humán CH2-CH3 fúziós proteinek esetében intracellulárisan kiválik kristályos alakban, ezért oldani kell 8 M karbamidoldattal.
Ezután a humán proteint dializálhatjuk tiszta PBS-sel szemben, amikor is teljesen oldható lesz. Jelenleg folyik egy nagyméretű tisztítási eljárás kidolgozása, mellyel csaknem 100% tisztaságban lehet előállítani humán fúziós proteint. A patkány CH2-CH3 fúziós protein azonban kevésbé oldható, és a protein zöme már a dialízis után fél óra vagy egy óra elteltével kiválik. A következő példákban olyan patkány CH2-CH3 fúziós proteinkészítményt használunk, amelynek tisztasága mintegy 50%. Ilyen készítményeket használtunk annak a kérdésnek a vizsgálatára, hogy miként kaphatunk erős antitestválaszt a patkány saját IgE-anyagával szemben, valamint az IgE által közvetített erős gyulladásos reakció patkányon való blokkolásának lehetőségeit vizsgáló tanulmányunkhoz. A készítményben a proteinek másik 50%-a különböző szennyező bakteriális proteinekből áll, és egy-egy protein mennyisége nem haladja meg a teljes proteinmennyiség 10%-át.
2. példa
Patkány immunizálása - az immunválasz mérése
Az immunizáláshoz vagy vakcináláshoz egy 1. példa szerinti fúziós proteinkészítményt használtunk, melyet egy immunálaszt potenciáló anyaggal (adjuvánssal) összekeverve vakcinát készítettünk. A vizsgált patkányoknak szubkután vagy intraperitoneális úton adtuk be a vakcinát az oldható és aggregált protein keverékével. Ezekben a kísérletekben egy-egy immunizálás alkalmával egy patkánynak mintegy 100 pg antigént adtunk be 0,2 ml Freund-féle teljes adjuvánsban, illetve nem teljes adjuvánsban. Ezekkel a koncentrációkkal és adjuvánsokkal igen erős immunválaszokat kaptunk különféle patkánytörzsek kísérleti csoportjában.
Az 1 A. és 1B. ábrán mutatjuk be azoknak a kísérleteinknek az eredményeit, amelyeket négy különböző patkánytörzzsel végeztünk, mindegyik csoportban három-három patkánnyal. A natív IgE-vel szembeni antitesttitereket ELlSA-módszerrel határoztuk meg. Ezt a meghatározást úgy végeztük, hogy az ELISAlemezek bevonásához natív IgE-anyagot használtunk egy pg/ml koncentrációjú bevonópufferben. A különböző állatokból vett szérummintákat 1/5 léptékű sorozathígításban vizsgáltuk az ELISA-módszer szerinti színreakcióval. Az 1. ábra ordinátáján a 400 nm hullámhosszon mért fényelnyelést (abszorbanciát) az abszcisszán az 1/5 léptékben készített különböző hígításokat tüntettük fel, a hígítás növekedésének irányában haladva.
A vizsgált négy patkánytörzs (Lewis, Sprague Dawley, Wistar és Brown Norway) CH2-CH3 vakcinával szembeni immunválasz-képességét a bal oldali diagramokon, a humán IgG-vel szembeni immunválasz képességét mint kontrollt a jobb oldali diagramokon mutatjuk be. Vakcinaként patkány CH2-CH3 vakcinát használtunk, amely a patkány szempontjából teljesen megfelel a humán vakcinának. Ezeket a patkányokat csak kétszer vakcináltuk; kezdetben egy Freund-féle teljes adjuvánst és proteinoldatot tartalmazó vakcinával, azután a második vakcináláskor, három héttel később, ugyanolyan proteinoldatnak Freund-féle nem teljes
HU 218 899 Β adjuvánsban való oldásával. A vér anti-IgE-antitest tartalmát azután ELISA-módszerrel határoztuk meg. Amint az ábrán jól látható, a vizsgált törzsek közül három igen jól válaszolt a vakcinára, a negyedik azonban egy úgynevezett „nem válaszoló” törzs, ami nem is olyan szokatlan, ha - mint ebben az esetben is - beltenyésztett törzseket használunk. Az említett kifejezésen azt értjük, hogy ez a patkánytörzs nem képes ezt az antigént termelni az immunrendszerhez, ezért ennél a patkánytörzsnél más heterológ vivőproteint kell használni ahhoz, hogy megkapjuk az allergiás vakcinától várt hatást.
Amint ezekből a kezdeti ELISA-mérésekből kitűnik, igen erős immunválaszt kaptunk már két patkányIgE-doménnal szemben is. Ezt az eredményt azzal kell összevernünk, hogy csak kismértékben erősebb reakciót figyelhetünk meg a humán IgG-vel szemben, amely ráadásul négy doménnak megfelelő méretű. Ezeken a patkányokon, melyek igen nagy anti-IgE-titerrel rendelkeznek, nem figyelhető meg semmilyen negatív szimptóma. Gyakorlatilag semmilyen kritérium szempontjából nem különböztethetők meg azoktól a patkányoktól, amelyeket a vakpróbában csak Freund-féle adjuvánsban beadott tiszta PBS-sel immunizáltunk.
3. példa
Patkány immunizálása - az IgE által közvetített gyulladásos reakció visszaszorítása Vizsgálatokat folytattunk aziránt is, hogy meghatározzuk, mennyire képes a találmány szerinti vakcina visszaszorítani egy IgE által közvetített erős gyulladásos reakciót. A vizsgálathoz az anti-IgE-antitesteknek az adottságát használtuk ki, hogy képesek a bőr masztocitáira kötött IgE-antitestek keresztkötésére, és ezeknek az IgE-molekuláknak a keresztkötése folytán hatalmas méretű granulumfelszabadulást képesek indukálni, és így erős gyulladásos reakciót provokálnak ott, ahova injektálják őket (ebben az esetben a bőrön). Ebben a példában az IgE teljes konstans régiója ellen irányuló poliklonális anti-IgE-antiszérumot használtunk. Ezért alaposan feltételezhető, hogy a szérum nagy mennyiségű keresztkötésre képes antitestet tartalmaz, ami az eredményekkel igazolódott is. A gyulladás erősségét színreakcióval határoztuk meg. A permeabilitás és annak megfelelően különböző vérproteineknek a vérből való hiánya erősen fokozódott abban a régióban, ahol a gyulladást provokáltuk. Minél erősebb volt a gyulladás, annál nagyobb kék foltot kaptunk, ha a kísérleti patkányok vérébe 1%-os Evans Blue oldatot injektáltunk 2 órával a vizsgált állatok bőre alatti kék foltok kiértékelése előtt. A kísérletet, melynek eredményét vázlatosan a 2. ábrán szemléltetjük, oly módon végeztük, hogy 2 órával a bőr eltávolítása és a gyulladásos zónák kimérése előtt négy, egyenként 50 μΐ koncentrált poliklonális anti-IgE-antiszérumot injektáltunk egy vakcináit patkány bőre alá, valamint egy vakpróbával immunizált patkány bőre alá. Kontrollként IgE+anti-IgE injekciót adtunk patkányonként egy-egy helyre, és csupán PBS-t szintén egy helyre. Az ilyen patkányok két tipikus példáját mutatjuk az ábrán, melyek közül az egyiket
Freund-féle adjuvánsba felvett CH2-CH3 vakcinával, a másik kontrollpatkányt Freund-féle adjuvánsba felvett PBS-sel immunizáltuk. Az IgE+anti-IgE kontrollok foltjai nagyon hasonló területűek a két patkányon, míg a csupán anti-IgE-antitestekkel végzett injektálás után a folt mérete csaknem nullára zsugorodott a vakcináit patkány esetében. Az anti-IgE-antitestek egyedül erős kék foltokat idéztek elő a kontroll immunizált patkányokon. Ez arra utal, hogy a vakcináit patkány masztocitáinak felületéről valószínűleg teljesen hiányoznak az IgE-antitestek, ami teljesen összhangban van azoknak az immunizálásoknak a várható eredményeivel, amelyek során ezekben a patkányokban az endogén anti-IgE-antitestek nagy koncentrációit találtuk. Nem hiányoznak azonban a masztociták, minthogy normális kék foltot lehet fenntartani, ha exogén IgE-t adunk az anti-IgE-antitestekkel együtt, és így ismét rákötjük a masztocitareceptorokat ezekre a masztocitákra, melyek eredetileg talán mentesek voltak az IgE-től.
Jelenleg ígéretes eredményeket mutató munka folyik egy új patkánykísérleti modellel, melyben először is erős IgE-választ keltünk Wistar-patkányokban, ami jól megfelel a találmány szerinti patkányvakcinának, amint azt az 1. ábrán bemutattuk. A patkányok immunizálásához egy speciális antigént, nevezetesen ovalbumint használunk egy Ricin nevű toxinnal együtt, és egy újabb módszer szerint járunk el, melyet dr. Kemény fejlesztett ki (Diaz-Sanchez, D. és Kemény, D. M.; Generation of long-lived IgE response in high and low responder strains of rat by co-administration of ricin and antigén. Immunology 72 /1991/ 297-303). Néhány hét elteltével ezek a patkányok igen erős IgE-válaszra tesznek szert az ovalbuminnal szemben, és ráadásul ez az immunválasz viszonylag hosszú ideig tartós. Kezdeti kísérletek igen jó eredményeket adtak ezzel a módszerrel. Nagyszámú patkányt vizsgáltunk, hogy képesek-e bőrükben erős gyulladásos reakcióval válaszolni 50 μΐ térfogatú 5 mg/ml koncentrációjú ovalbuminoldat injektálására. Ez csaknem kétszer akkora kék foltokat idézett elő, mint az előbb említett pozitív kontrollok az IgE+anti-IgE kísérletben, ami azt mutatja, hogy ezek a patkányok rendkívül allergiásak az ovalbuminra. A patkányoknak ezt a típusát használjuk most arra, hogy tanulmányozzuk az allergiás reakciók blokkolásának lehetőségét a bőrben, és azután tanulmányozzuk a hatásokat a hörgő-összehúzódásra és más tipikus allergiával összefüggő szimptómára.
Az alábbiakban négy pontban összefoglaljuk a találmány és a technika állása közötti különbségeket.
1. A találmány szerinti megoldásban az IgE-molekulának kizárólag azokra a doménjaira összpontosítunk, amelyek közvetlenül részt vesznek az IgE-receptorral való kölcsönhatásban, nem pedig - mint a korábbi tanulmányokban - a receptorokkal kölcsönhatásba nem lépő C4 dómén régióira.
2. A találmány szerinti eljárással előállított vakcina fajspecifikus proteinffagmenseket tartalmaz, egy vagy több heterológ vivőanyaghoz kapcsolva, ennek folytán erős autoimmunválaszt kelt, ellentétben a korábbi tanulmányok megállapításaival, melyekben más fajból szár8
HU 218 899 Β mazó epszilon-peptideket használtak, mint amely fajba a kapcsolt peptidet injektálták, például humán peptideket injektáltak egérbe, patkányba vagy nyúlba.
3. Ellentétben a monoklonális projektekkel, melyek világszerte számos laboratóriumban folyamatban vannak, a találmány azon alapul, hogy poliklonális immunválaszt keltünk egy fajspecifikus proteinnel szemben. Ez lényegesen megnöveli a sikeres eredmény elérésének esélyét, mert így a legnagyobb valószínűséggel elkerülhetők az immunkomplexekkel kapcsolatos komplikációk, melyek az életet veszélyeztető gyulladásos reakciókhoz vezetnek.
4. A legfontosabb különbség az, hogy a találmány szerinti eljárásban egész doménokat vagy azok több, mint 12 aminosavat tartalmazó szerkezetileg stabil egységeit használjuk a vakcina előállításához. Ezáltal erős poliklonális választ kapunk a kísérletiállat-rendszerekben a natív IgE-vel szemben (amint bemutattuk), ami igen fontos tulajdonsága az ilyen típusú vakcinának (ezt szintén bemutattuk). Ezt csak egy néhány hetes immunizálás után érjük el, ami nagy előrehaladást jelent a korábban ismert rövid szintetikus peptides eljárásokhoz képest.
Claims (7)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás az IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására emlősökön használható vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként egy, az adott emlősfajból származó IgE-molekula epszilon-lánca konstans CH2-CH3 doménjának teljes aminosavszekvenciáját vagy egy ilyen aminosavszekvencia 12-nél több aminosavat tartalmazó, szerkezetileg stabil egységét használjuk eredeti vagy multimerizált alakban.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosavszekvenciát vagy annak szerkezetileg stabil egységét kapcsolt protein képzésére egy vagy több heterológ vivőproteinre kapcsoljuk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosavszekvenciát vagy annak szerkezetileg stabil egységét multimerizált alakban használjuk kiindu lási anyagként.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán IgE-ből származó aminosavszekvenciát használunk kiindulási anyagként.
- 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsolt proteint mint fúziós proteint rekombináns DNS-technológiával prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben állítjuk elő.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosavszekvenciát klónozzuk, megfelelő vektorba kötjük, a vektort eukarióta vagy prokarióta gazdasejtbe transzformáljuk, és az így előállított fúziós proteint, amely a teljes CH2-CH3 domént vagy annak szerkezetileg stabil egységét tartalmazza, tisztítjuk és adott esetben elkülönítjük, valamint adott esetben egy megfelelő adjuvánssal keveijük össze.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektor transzformálásához gazdasejtként egy bak tériumtörzset, előnyösen Escherichia colit használunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9102808A SE9102808L (sv) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | Vaccin, foer humant bruk, vars avsedda effekt aer att lindra symptomen eller foerhindra uppkomsten av ige-medierade allergiska reaktioner |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9400845D0 HU9400845D0 (en) | 1994-06-28 |
| HUT69782A HUT69782A (en) | 1995-09-28 |
| HU218899B true HU218899B (hu) | 2000-12-28 |
Family
ID=20383848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9400845A HU218899B (hu) | 1991-09-26 | 1992-09-25 | Eljárás IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására használható vakcina előállítására |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5653980A (hu) |
| EP (1) | EP0666760B2 (hu) |
| JP (2) | JP3583421B2 (hu) |
| KR (1) | KR100263359B1 (hu) |
| AT (1) | ATE189960T1 (hu) |
| AU (1) | AU677573B2 (hu) |
| CA (1) | CA2117193C (hu) |
| DE (1) | DE69230733T3 (hu) |
| DK (1) | DK0666760T4 (hu) |
| ES (1) | ES2144424T5 (hu) |
| FI (1) | FI107880B (hu) |
| GR (1) | GR3033272T3 (hu) |
| HU (1) | HU218899B (hu) |
| RU (1) | RU2120805C1 (hu) |
| SE (1) | SE9102808L (hu) |
| WO (1) | WO1993005810A1 (hu) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK96493D0 (da) * | 1993-08-26 | 1993-08-26 | Mouritsen Og Elsner Aps | Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden |
| AU707083B2 (en) * | 1993-08-26 | 1999-07-01 | Bavarian Nordic Inc. | Inducing antibody response against self-proteins with the aid of foreign T-cell epitopes |
| JP3825798B2 (ja) * | 1994-01-18 | 2006-09-27 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | ＩｇＥアンタゴニストを用いる寄生虫感染症の治療法 |
| FR2715304B1 (fr) * | 1994-01-26 | 1996-04-26 | Merieux Serums Vaccins Pasteur | Vaccin anti-allergique. |
| HUP9901109A3 (en) * | 1996-03-01 | 1999-11-29 | Novartis Ag | Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy |
| PL194221B1 (pl) * | 1997-04-15 | 2007-05-31 | Pharmexa As | Zmodyfikowana cząsteczka ludzkiego TNFalfa, dimery, oligomery lub multimery zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, wyizolowana cząsteczka DNA, wektor, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, sposób wytwarzania zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa, szczepionki przeciwko TNFalfa oraz zastosowanie przynajmniej jednej zmodyfikowanej cząsteczki ludzkiego TNFalfa |
| US7393529B2 (en) | 1998-04-09 | 2008-07-01 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods and compositions for inhibiting binding of IgE to a high affinity receptor |
| US6504013B1 (en) | 2000-02-01 | 2003-01-07 | Idexx Laboratories, Inc. | Canine allergy therapeutic recombinant chimeric anti-IgE monoclonal antibody |
| US6734287B1 (en) | 1998-04-09 | 2004-05-11 | Idexx Laboratories, Inc. | Specific binding proteins for treating canine allergy |
| EP1621209A3 (en) * | 1998-11-02 | 2006-04-19 | Resistentia Pharmaceuticals AB | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides |
| US6913749B2 (en) | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| US6602719B1 (en) | 1999-03-26 | 2003-08-05 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting analytes in fluids |
| US6511814B1 (en) | 1999-03-26 | 2003-01-28 | Idexx Laboratories, Inc. | Method and device for detecting analytes in fluids |
| US6887472B2 (en) | 2000-08-30 | 2005-05-03 | Pfizer Inc. | Anti-IgE vaccines |
| JP2003047482A (ja) * | 2001-05-22 | 2003-02-18 | Pfizer Prod Inc | 非アナフィラキシー誘発性ＩｇＥワクチン |
| EP1497654A4 (en) * | 2001-08-13 | 2006-06-07 | Chen Swey Shen Alex | IMMUNOGLOBULIN E VACCINES AND METHODS OF USE |
| CA2495251C (en) | 2002-08-14 | 2018-03-06 | Macrogenics, Inc. | Fc.gamma.riib-specific antibodies and methods of use thereof |
| EP1545607B1 (en) * | 2002-09-05 | 2008-11-19 | Resistentia Pharmaceuticals AB | Allergy vaccines |
| US20050026881A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Robinson Cynthia B. | Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with an anti-IgE antibody for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease |
| US20090263381A1 (en) * | 2003-07-31 | 2009-10-22 | Robinson Cynthia B | Combination of dehydroepiandrosterone or dehydroepiandrosterone-sulfate with an anti-ige antibody for treatment of asthma or chronic obstructive pulmonary disease |
| HUE030269T2 (hu) | 2006-06-26 | 2017-04-28 | Macrogenics Inc | FC RIIB-specifikus ellenanyagok és eljárások az alkalmazásukra |
| US20080118524A1 (en) * | 2006-10-20 | 2008-05-22 | Stefan Persson | Anti-IgE Vaccines |
| EP2865389A1 (en) | 2008-12-09 | 2015-04-29 | Pfizer Vaccines LLC | IgE CH3 peptide vaccine |
| SG174161A1 (en) * | 2009-02-25 | 2011-11-28 | Tsewen Chang | ANTI-CemX ANTIBODIES CAPABLE OF BINDING TO HUMAN mIgE ON B LYMPHOCYTES |
| EP2942061A3 (en) * | 2010-06-07 | 2016-01-13 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
| US9187553B2 (en) * | 2012-01-25 | 2015-11-17 | Swey-Shen Chen | Displaying native human IgE neutralizing FcepsilonRIa-contacting IgE B-cell epitopes by constraining super beta(b)-strands and cystine knots on thermostable protein scaffold |
| US9587034B2 (en) | 2012-04-20 | 2017-03-07 | Academia Sinica | Anti-mIgE antibodies that bind to the junction between CH4 and CεmX domains |
| JP5918851B2 (ja) * | 2012-06-18 | 2016-05-18 | 日本全薬工業株式会社 | ＩｇＥペプチドワクチン |
| US20150004161A1 (en) * | 2013-07-01 | 2015-01-01 | University Of Maryland | Fc Coupled Compositions and Methods of Their Use |
| CN111741768A (zh) | 2017-10-31 | 2020-10-02 | 合一生技股份有限公司 | 治疗IgE介导的过敏性疾病 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8616166D0 (en) * | 1986-07-02 | 1986-08-06 | Research Corp Ltd | Polypeptide competitor |
| GB8727045D0 (en) * | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| AU618317B2 (en) * | 1987-12-31 | 1991-12-19 | Tanox Biosystems, Inc. | Unique antigenic epitopes on ige-bearing b lymphocytes |
| GB8910263D0 (en) * | 1989-05-04 | 1989-06-21 | Ciba Geigy Ag | Monoclonal antibodies specific for an immunoglobulin isotype |
| GB8913737D0 (en) * | 1989-06-15 | 1989-08-02 | Univ Birmingham | A novel anti-allergy treatment |
-
1991
- 1991-09-26 SE SE9102808A patent/SE9102808L/xx not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-09-25 CA CA002117193A patent/CA2117193C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-25 RU RU94020409A patent/RU2120805C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-09-25 DK DK92920757T patent/DK0666760T4/da active
- 1992-09-25 AU AU26765/92A patent/AU677573B2/en not_active Ceased
- 1992-09-25 HU HU9400845A patent/HU218899B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-09-25 AT AT92920757T patent/ATE189960T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-09-25 KR KR1019940700753A patent/KR100263359B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-09-25 ES ES92920757T patent/ES2144424T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-25 WO PCT/SE1992/000673 patent/WO1993005810A1/en active IP Right Grant
- 1992-09-25 US US08/196,227 patent/US5653980A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-25 JP JP50558293A patent/JP3583421B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-25 EP EP92920757A patent/EP0666760B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-25 DE DE69230733T patent/DE69230733T3/de not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-03-14 FI FI941193A patent/FI107880B/fi active
-
2000
- 2000-04-19 GR GR20000400955T patent/GR3033272T3/el unknown
-
2004
- 2004-03-23 JP JP2004084530A patent/JP2004231663A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3583421B2 (ja) | 2004-11-04 |
| ES2144424T3 (es) | 2000-06-16 |
| EP0666760A1 (en) | 1995-08-16 |
| HU9400845D0 (en) | 1994-06-28 |
| EP0666760B1 (en) | 2000-03-01 |
| DE69230733T3 (de) | 2008-05-21 |
| CA2117193C (en) | 2008-06-17 |
| FI941193A (fi) | 1994-03-14 |
| JPH06510768A (ja) | 1994-12-01 |
| AU677573B2 (en) | 1997-05-01 |
| DE69230733D1 (de) | 2000-04-06 |
| AU2676592A (en) | 1993-04-27 |
| ES2144424T5 (es) | 2008-03-01 |
| SE9102808L (sv) | 1993-03-27 |
| KR100263359B1 (ko) | 2000-08-01 |
| JP2004231663A (ja) | 2004-08-19 |
| US5653980A (en) | 1997-08-05 |
| FI107880B (fi) | 2001-10-31 |
| SE9102808D0 (sv) | 1991-09-26 |
| CA2117193A1 (en) | 1993-04-01 |
| RU2120805C1 (ru) | 1998-10-27 |
| FI941193A0 (fi) | 1994-03-14 |
| GR3033272T3 (en) | 2000-09-29 |
| DK0666760T4 (da) | 2008-01-21 |
| WO1993005810A1 (en) | 1993-04-01 |
| DE69230733T2 (de) | 2000-08-03 |
| HUT69782A (en) | 1995-09-28 |
| DK0666760T3 (da) | 2000-07-31 |
| EP0666760B2 (en) | 2007-10-10 |
| ATE189960T1 (de) | 2000-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU218899B (hu) | Eljárás IgE által közvetített allergiás reakciók szimptómáinak enyhítésére vagy indukciójának meggátlására használható vakcina előállítására | |
| CA2337969C (en) | Compound and method for the prevention and/or the treatment of allergy | |
| KR100584051B1 (ko) | 알레르기에 대한 백신 접종 및 치료를 위한 펩티드임뮤노겐 | |
| Vernersson et al. | Generation of therapeutic antibody responses against IgE through vaccination | |
| JP2002518038A (ja) | アレルギー治療用免疫原としてのペプチド組成物 | |
| SK11295A3 (en) | Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them | |
| JP5138844B2 (ja) | 抗原およびＥＢＶＧｐ３５０／２２０の受容体の同時刺激によるＢ細胞活性化および免疫グロブリン分泌の増強 | |
| JP2002537403A (ja) | ＩｇＥのＣ−イプシロン−３またはＣ−イプシロン−４ドメイン由来のエピトープまたはミモトープ、その拮抗薬、及びそれらの治療的使用 | |
| EP1135158B1 (en) | Enhanced vaccines based on chimeric immunoglobulin e peptides | |
| JPH10509038A (ja) | 免疫、精製及び検出適用のためのたんぱく質、ペプチド及び複合物の高い水準の発現と容易な精製 | |
| US20030152581A1 (en) | Compound and method for the prevention and/or the treatment of allergy | |
| AU2672700A (en) | Epitopes or mimotopes derived from the c-epsilon-2 domain of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| JP2001518451A (ja) | アレルゲンの非アナフィラキシー形およびその使用 | |
| US20040115220A1 (en) | Vaccine | |
| AU757334B2 (en) | Specific binding proteins for treating canine allergy | |
| CN107849119A (zh) | 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗 | |
| US20030170229A1 (en) | Vaccine | |
| US20030147906A1 (en) | Epitopes or mimotopes derived from the C-epsilon-3 or C-epsilon-4 domains of lgE, antagonists thereof, and their therapeutic uses | |
| NO319856B1 (no) | Vaksine for a lindre symptomene ved, eller forhindre inntreden av,IgE-formidlede,allergiske reaksjoner hos et pattedyr,samt anvendelse av aminosyresekvensen fra de konstante CH2-CH3-domener i epsilonkjeden for fremstilling av en vaksine mot IgE-formidlede allergiske reaksjoner. | |
| EP1621209A2 (en) | Vaccines based on domains of chimeric immunoglobulin E peptides | |
| MXPA00011938A (en) | Peptide composition as immunogen for the treatment of allergy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |