JPH10509038A

JPH10509038A - 免疫、精製及び検出適用のためのたんぱく質、ペプチド及び複合物の高い水準の発現と容易な精製

Info

Publication number: JPH10509038A
Application number: JP8516180A
Authority: JP
Inventors: ダブリュヌース，マーク; ハーク−フレンショ，メアリー; ダブリュシュルツ，ジョン; エイレスリー，スコット; イーヴィラース，キャサリン
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-13
Publication date: 1998-09-08
Also published as: AU4462396A; CA2204914A1; AU707030B2; EP0791068A1; US5989554A; US6069230A; WO1996015249A1

Abstract

(57)【要約】ペプチドを製造及び精製し並びに抗体製造のためにペプチド／たんぱく質抗原を製造する方法が記載される。該方法は、融合たんぱく質及び、特に、融合たんぱく質キャリアーセグメントが少なくとも約６５アミノ酸長のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は負又は正の電荷を持つ側鎖のアミノ酸含まない融合たんぱく質を利用する。

Description

【発明の詳細な説明】免疫、精製及び検出適用のためのたんぱく質、ペプチド及び複合物の高い水準の発現と容易な精製発明の分野概括的に、本発明は組み換えＤＮＡ技術の分野に関する。特に本発明は、多様な用途ためのペプチドの製造と精製と抗体製造のための抗原製造の方法に関する。本発明はまた、組み換えＤＮＡ技術に利用する小から中サイズの高水準の発現に関する。特に、本発明は融合たんぱく質を利用する抗原製造システムに関する。本発明はまた、動物又は人の免疫システムへ抗原を提供するための方法に関する。引用例本出願で引用された例の完全な書誌的引用は特許請求の範囲の前の文中に見られる。従来技術の記載本発明は一般に分子の検出又は精製を含む市場に関する。代表的な市場は生体内及び生体外での診断薬、研究生成物、診断生成物、診断研究生成物、製薬、及び多くの工業市場を含む。これらの市場は、問題の生物分子を認識する強固な結合と特異的な親和性の配位子を必要としている。広く多様な市場においてたんぱく質の親和性認識の重要性が与えられ、ＤＮＡ技術を利用する”免疫親和性”又は”巨大分子認識”配位子の生成方法が求められる。組み換えＤＮＡ技術によるたんぱく質及びペプチドの製造は現在比較的普通のものである。ペプチドの組み換え発現は発現ベクター中への、好みのペプチドをコード化するＤＮＡ配列の挿入により度々達成される。発現ベクターは一般にホスト細胞により認識される規則的な配列を含み、そしてそれはペプチド製造のための挿入されたＤＮＡの転写と翻訳を提供する。発現ベクターは典型的には原核生物である、培養中の適当な全細胞中に挿入される。発現ベクターはまた、うまく転換されベクターを運び、そしてベクターを運ばないものからそれらを分離するために、通常は選択的な標識を含む。ペプチドは直接的に又は融合たんぱく質の形で発現される。直接的な発現は改良の無い望みのたんぱく質又はペプチドの製造を含む。しかし、発現のこの形は、特に小さいペプチドで、度々低収率と生成物の退化をもたらす。望みのペプチドの収率を増加するために採用される一つの方法は融合たんぱく質の部分としてそれを発現することである。この解決方法においては、選択のホスト中で簡単に発現される、この後キャリアーセグメントと呼ばれるリーダーたんぱく質が選択される。往々にしてこのたんぱく質は、β−ガラクトシダーゼの場合のように、ホストに本来的なものである。キャリアーセグメントをコード化する発現ベクターはその後、キャリアーセグメントに結合された望みのペプチド発現するために標準的な分子クローン化技術を用いて改良される。最も頻繁には、ペプチドはキャリアーセグメントのカルボキシ末端部に結合されるが、主に、通常のペプチド結合を通して何れの部位でも結合可能である。キャリアーセグメントを持つ融合たんぱく質としてのペプチドの発現は、新たな、好ましい特性をそれに組み込む。例えば、融合たんぱく質はペプチドのための抗体を作り又はワクチンを製造するためにホスト動物中に注入されうる。抗原として融合たんぱく質を利用する技術は公知の技術（Current Protocols，1994 ，16 章）として良く知られる。融合たんぱく質の別の好ましい特性は精製の容易さ、表面上に固定される能力、二価分子の生成を含む（Ｓａｎｔｏ，Ｃ他．１９９２）。望みの付加的な特性を持つペプチドは通常は融合たんぱく質の利用により製造されるが、化学的な合成を通して分離してペプチドを製造することもまた普及している。ペプチドはその後、化学的架橋剤を利用して精製されたキャリアーセグメントに共有結合により結合される。得られたキャリアーたんぱく質複合物は上記の融合たんぱく質として同一の応用の多くに使用されうる。例えば、ペプチドは時々免疫のためのキーホールリンペトヘモシアニン、又は検出薬としての利用のためのリン酸アルカリ化合物に共有結合により結合される。融合たんぱく質の場合、キャリアーセグメントに結合されうる分子のみがペプチドであり、そしてその結合は通常のポリペプチドバックボーンを通して存在する。第二の分子が発現の後キャリアーセグメントに化学的に結合されるとき、配位子と呼ばれる第二の分子とキャリアーセグメントへの化学結合の両方の性質は非常に広範である。化学的に許容された配位子と架橋部が意図されうる。幾つかの場合において、キャリアーセグメントを持つ配位子（ペプチド、ハプテン等）の共有結合形の結合は、有効であることを必要とされない。二つの分子は幾つかの手段により互いに結合される。この場合、二つの混合物はキャリアーたんぱく質錯体と呼ばれる。以下の節は幾つかの従来技術の融合たんぱく質を示す。例えば、Ｃｏｈｅｎ他のアメリカ特許第４，７４３，６７９号は２００近いアミノ酸（好ましくは７５近く）のリーダー配列を持つ融合たんぱく質として表皮成長因子（ＥＧＦ）の発現を開示する。融合たんぱく質が不溶の含有体としてバクテリア中に発現される。Ｋｅｃｋ他のアメリカ特許第５，３０２，５２６号は融合たんぱく質の製造と精製のための両性のリーダー配列をコード化する組み換えＤＮＡに関する。ポリペプチドはヘリックスの一方の側に親水性の電荷を持つアミノ酸残基と他の側に無極性のアミノ酸残基を持つように設計された両性のヘリックスを構成する。問題のたんぱく質をコード化する因子がヘリックスに取り付けられたときに含有体は形成される。含有体は集められ、精製される。Ｔａｒｎｏｗｓｋｉ他のアメリカ特許第５，３２２，９３０号は、ヘテロロゴウスペプチドのためのキャリアーとしてのヒトの前心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（ｐｒｏＡＴＰ）の一部を用いて融合たんぱく質としてのたんぱく質を発現する方法を記載し、そこでは、ｐｒｏＡＴＰたんぱく質の一部中に普通に存在するＧｌｕ残基のそれぞれが、Ｇｌｎに変えられる。Ｋｉｎｇｓｍａｎ他のアメリカ特許第５，００８，３７３号は、ワクチン又は診断又は精製の用途において有用な融合たんぱく質システムを記載する。融合たんぱく質は、イーストによるＴＹＡ因子配列のためにコード化されたレトロトランスポソン又はＲＮＡレトロウイルスに由来する第一のアミノ酸配列を含む。第二のアミノ酸配列は、抗原として活動する生物学的に活性なアミノ酸配列である。Ｂｏｌｌｉｎｇ他のアメリカ特許第５，３２２，７６９号は、分析においてＣＫＳ融合たんぱく質を利用する方法が記載される。Ｌｉｎ他（１９８７）は、ファージＴ７の因子１０分子からなるキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質の抗原としての利用を開示する。従来のキャリアーセグメントの主要な問題は、キャリアーセグメントはまた、抗原的であること、すなわち、キャリアーセグメントに反応して抗体が製造されることが知られていることである。つまり、望みの配位子に対する抗体の製造とキャリアーセグメントに対する抗体の製造との間に、目標セグメントに対して特異性を有する抗体のより少ない製造もたらしうる競争がある。免疫システムは通常、電荷を度々持つペプチドセグメントが剥き出しにされた表面と反応するので、キャリアーセグメント上の電荷を持つ残基の存在は抗原性を伴うそのような問題を悪化させるようである。従来のキャリアーセグメントの別の問題は、それらが補助薬の利用を往々にして必要とすることである。補助薬は多様な目的を提供する（Ｋｌｅｉｎ，１９９０）。補助薬は、抗原が引き延ばされた期間の間にゆっくりと放出される注入部位でエマルジョン、沈殿又は小さな粒子の形成を引き起こすことにより抗原を捕捉する。抗原の移動はこうして遅らされ、生物が抗原に晒されることは延長される。補助薬はまた、抗原注入部位への細胞の非特異的な移動を刺激し、免疫システムの細胞と抗原の相互作用の可能性を増大させる。さらに、補助薬は、注入部位から局所リンパ節又は脾臓への少量の連続的な抗原の配達により受容体中での抗原分散を増大させる。幾つかの補助薬はまた、アデニル酸シクラーゼ及び他の化学的メッセンジャーを活性化することによりリンパ球を刺激することを助ける。補助薬は、リンパ球捕捉機構の活性化を通してＴ−及びＢ−細胞、マクロファージ及び抗原との接触の可能性を増大する。補助薬に関する主な問題は、最も効果的な幾つかは毒性を持ち、及び／又はホスト生物中に外傷を引き起こす傾向がある。これらも処理が困難となりうる。発明の概要本発明は天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメントに関する。本発明はまた、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを有する天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる実質的に抗原性が無い融合たんぱく質キャリアーセグメントに関し、該キャリアーセグメントは、およそ５％より多くない以下のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸、システイン、トリプトファン及びメチオニンからなる。本発明は更に、第一アミノ酸配列からなるキャリアーたんぱく質複合体に関するが、ここで、第一のアミノ酸配列は少なくとも約６５アミノ酸長であり、そして、第一アミノ酸配列は、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸；及び第一のアミノ酸に配位された配位子を欠いている。更に、本発明は図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたようなアミノ酸配列又は図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕中に示されたようなアミノ酸配列に関する。更に、本発明はまた、図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたようなアミノ酸配列からなり配位子に結合された、天然には存在しない融合化合物に関する。本発明はまた、抗原のためのコード化配列を持つ単一の読み出しフレーム中のアミノ酸配列からなる発現ベクターに関するが、該発現ベクターは該アミノ酸配列と配位子によりコード化された粒子形成融合たんぱく質を発現し、該アミノ酸配列は天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列であって、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている。本発明は更に高分子量たんぱく質をホスト動物に投与するための補助薬に係り、該補助薬は天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなる。本発明はまた、ａ）融合たんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質複合体を形成するために配位子への天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなるキャリアーセグメントを融合し；ｂ）抗原を生体内又は生体外の手段で送り込み、ｃ）生体内又は生体外の手段により配位子への抗原を作りだす；段階よりなる配位子への抗体を生産する方法に関する。本発明はまた、（ａ）少なくとも一のキャリアーたんぱく質合成物が捕獲剤として固体相へ着けられ、抗原／抗体錯体の形成に適当な時間と条件のもと試験試料と接触され、そして（ｂ）信号発生化合物と分析のための特異な束縛部からなる指示薬が、反応が起きるのに十分な時間の間、該錯体と接触し、発せられた信号は試験試料中の反−分析抗体の存在を指示するものである、試験試料中の反抗原抗体の濃度を決めるための分析方法に関する。改善点は、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメントを捕獲剤として固体相に付着させることからなる。本発明は更に、（ａ）以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いており、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを持ち、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む実質的に抗原の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる免疫抗原を調製する段階と；（ｂ）ホスト脊椎動物に該キャリアーたんぱく質合成物を投与する段階とよりなる、ホスト脊椎動物に免疫抗原を接種するための方法に関する。本発明はまた、（ａ）図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたアミノ酸と該アミノ酸配列に融合された配位子からなる天然には存在しないキャリアーたんぱく質複合体からなる免疫抗原を形成する段階と；（ｂ）ホスト脊椎動物に該キャリアーたんぱく質合成物を投与する段階とよりなる、ホスト脊椎動物に免疫抗原を接種するための方法に関する。更に、本発明は、（ａ）以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いており、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを持ち、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む実質的に抗原の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる免疫抗原を形成する段階と；（ｂ）抗体／複合体錯体を形成するために、キャリアーたんぱく質複合体に抗体物質を結合する束縛条件下でキャリアーたんぱく質複合体と抗体物質を培養する段階と；（ｃ）抗体／複合体錯体を分離する段階と；（ｄ）抗体／複合体錯体から抗体を解離する段階と；（ｅ）抗体／複合体錯体から抗体を分離する段階とからなる、抗体物質溜めから抗体を免疫精製する方法に関する。更に、本発明は、（ａ）以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる融合たんぱく質を、融合たんぱく質上のペプチド結合が解裂する条件下で培養する段階と；（ｂ）望みのペプチドを分離する段階からなるペプチド製造方法に関する。更に、本発明は、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる融合たんぱく質と、そこで融合たんぱく質が単離されて競争阻害性の基体として用いられる、プロテアーゼのための解裂部位とからなるプロテアーゼ阻害剤に関する。なおさらに、本発明は、（ａ）少なくとも約６５アミノ酸長であり、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の後続アミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている、第一のアミノ酸キャリアー配列と；（ｂ）該第一のアミノ酸キャリアー配列に融合した配位子、からなる、その上でキャリアーたんぱく質合成物を吸収した固体支持物に関する。本発明はまた、酵素が活動できる配位子を含む少なくとも一のキャリアーたんぱく質合成物が固体相に付着されて、酵素が基体上で活動するのに適当な時間と条件のもと試験試料に接触され、（ｂ）固定化基体の酵素に触媒された改良に応答して信号の変化を発生することの可能な信号発生剤が、反応が十分起きる時間の間錯体に接触され、発せられた信号が試験試料中の酵素の存在を示す、試験試料中の酵素の濃度を決める分析に関する。改善点は、捕獲剤として固体相へ、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む組み換え融合たんぱく質キャリアーセグメントを付着させることからなる。本発明はまた、試験試料中の反−抗原抗体の存在を検出する用途のための試験キットに関し、該試験キットは反−抗原抗体のための少なくとも一のたんぱく質の特質を含む容器を含み、そして、改善点は反−抗原抗体に対し特異的である天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む容器からなる。本発明はまた、分離された容器：ａ．望みの抗原と特異的に反応する上記の方法に従い製造された一又はそれ以上の抗体をそこに結合した固体支持物；ｂ．結合されないたんぱく質を除く緩衝剤；ｃ．結合された分析試料の検出のための溶液；ｄ．使用のための指示書、を構成する特定の抗原を検出するための免疫分析キットに関する。本発明の利点は、特に、新規なキャリアーセグメントに関する。キャリアーセグメントの幾つかの利点は以下に示される。低い抗原性：本発明の第一の目標の一つは配位子への抗体を作ることである。配位子への抗体を作る最善の機会を持つためには、融合たんぱく質のキャリアーセグメント部は動物に対して比較的に抗原性を有すべきでない。典型的には、ホストの体中の免疫システムは、例えば、該システムに送られた抗原など外部物質を目標とする。融合たんぱく質のような抗原が体内に入るとき、免疫システムは攻撃する最も抗原活性な部位を捜し出す。キャリアーセグメントがたまたま最も活性な抗原を含むなら、免疫システムは好んでキャリアーセグメントを目標とし、選択にかかる目的の配位子セグメントに対する反応はほとんど無い。主に、キャリアーセグメントは通常３００若しくはより以上のアミノ酸であり、より大きいセグギメントである傾向があるため、このことは度々起きるケースである。キャリアーセグメントとして用いられる天然のたんぱく質には、また多くの電荷を持つアミノ酸がある。電荷を有するアミノ酸配列は疎水性のアミノ酸配列がそうであるより更に表面が晒されやくす、抗原活性である。つまり、キャリアーはより潜在的なエピトープを持ち、そして免疫システムにより外部のもの又は危険なものと、より容易に認識されることの多い残りの部分からなる。キャリアーセグメントを小さくそして抗原性においてとても低くすることにより、免疫システムは配位子を攻撃しやすくなり、配位子に対する抗体を生産しやすくなる。本発明の目的にとって、低い抗原性とは、配列：Ｈ２Ｎ−ＬｙｓＭｅｔＡｌａＧｌｕＡｓｐＡｓｐＰｒｏＴｙｒＬｅｕＧｌｙＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｎＭｅｔ（ＳＥＱ．ＩＤ．４）を持つ配位子に融合されたキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質の、鶏、ネズミ、ウサギへの３回若しくはそれ以上の注入に対応して生成された特定の抗体の５０％のより多い形成を行なうことに対するキャリアーセグメントの失敗により定義される。キャリアーセグメントの抗原性を低下させる一つの方法は、そのサイズを低下させることである。このことは、結合された配位子に融合たんぱく質全体のかなり大きい部分を形成することを許容する。典型的には、キャリアーセグメントは、長さにおいておよそ２００及び５００の間のアミノ酸を含む。しかし、セグメントの長さをおよそ１００若しくはより少ないアミノ酸のアミノ酸長に減少させ、多くの電荷を持つアミノ酸を除くことにより、キャリアーセグメントはより低下した効果のホスト生物内での免疫反応を示す。キャリアーセグメントは少なくとも６５アミノ酸の長さであるべきであり、好ましくは１００アミノ酸の長さである。少なくとも、キャリアーペプチドの長さは、原核ホスト発現生物中で効果的な発現を許容すべきである。低溶解性：本キャリアーセグメントの主な利点は、ほとんど無い又は低い溶解性であることである。このことは、低いレベルの発熱因子を含む注入可能な質の免疫抗原がクロマトグラフィーのような簡便な方法を適用することにより簡単な洗浄を用いて調製されうるので、時間と装置の両方の節約になり、素早い精製に有利である。加えて、発現時の含有体内でのペプチドの隔離は、不安定な配列をたんぱく質分解攻撃から保護する。補助薬の不要：キャリアーセグメントの付加的な利点は、低溶解性及び分裂促進効果を含む、キャリアーセグメントと複合体の多様な性質により、通常のキャリアーたんぱく質と同様に自身が補助薬として働くということである。抗体の生成のために抗原を調製する研究者の最近の典型的な方法は、公知の方法である技術を用いて配位子又はペプチドを化学的に合成し、その後、キャリアーたんぱく質として知られるより大きなたんぱく質に、それを化学的に重合させることである。キャリアーたんぱく質の機能はＴ−細胞補助を引き出すことである。Ｔ−細胞補助は動物内での効果的な抗体の反応を生じるために重要である。しかし、多くの配位子とペプチドは望みの抗原部位を提供し、Ｔ−細胞補助を引き出すための物質を許容するセグメントを含むには何れも小さすぎる。キーホールリンペットヘモシアニンのような特定のたんぱく質はＴ−細胞補助を引き出すための効果的な部位を含む技術として知られ、そのためこの目的のための小さい配位子に度々結合される。不運にも、上記したように、これらの多くはまた、抗原であり、抗体の反応を専有しうる。記載されたキャリヤーセグメントは、抗体の反応を専有することなしに必要なＴ−細胞補助を引き出し、そのため優れたキャリアーたんぱく質である。研究者が抗体の製造のための注入用の抗原の投与を最近準備する典型的な方法はそれを幾つかの数の懸濁、沈殿又は乳剤の形の中に形成することである。補助薬は幾つかの要因の結合された効果の結果として免疫反応を増大させうる。もし抗原がそれとしてホスト動物中に注入されたら、それは可溶な形であり、素早く注入部位から広がって体から洗浄される。免疫システムは注入部位に免疫細胞を導き、反応を設定する時間が必要であるため、抗原の素早い拡散と洗浄は免疫反応に対し有害である。注入部位で補足されるように抗原の形成は、免疫システムがそこに設置し反応を設定するのに十分な長さの時間、設置された抗原を維持するための試みである。ほとんどの場合、抗原は強力な免疫反応を引き出すために、その部位に十分な時間捕捉されないため、何週間かの期間を超える複数回の注入が必要となる。加えて、免疫細胞の注入場所への案内は、通常幾つかの局所的な非特異的炎症を必要とする。最後に、補助薬は免疫細胞の増殖を刺激する。キャリアーセグメントとそれを含む複合体の低溶解性は、注入部位での免疫反応を設定するために十分な条件、即ち、免疫細胞をその場所に導く幾つかの種類の非特異的な炎症反応が作りだされ、免疫反応が設定されるのに十分な時間抗原がその部位に封じ込められ、免疫細胞間の相互作用は隠され、そして免疫細胞の増殖が刺激される、条件を作りだす。もし溶解性が低すぎれば、又はもし抗原が免疫システムに受容可能でなければ、反応は全く達成されず、そのため、キャリアーセグメントの溶解性はわずかな溶解性への要求に対する封じ込めの必要と効果的な抗原拡散を釣り合わせる最適の範囲にあると考えられる。こうして、キャリアーセグメントは免疫反応を引き出すために要求される、注入部位への免疫細胞の案内、その場所への抗原の封じ込め、抗体反応を専有することのないＴ−細胞補助の引き出し、及び免疫システムへの効果的な拡散のすべての機能を提供するために設計される。従来技術を超えるこのシステムの利点は、キャリアーたんぱく質への結合を含む段階と、補助薬の形成段階への要求を排除することである。加えて、一回の抗原注入で十分な免疫反応を引き出すのに十分であることである。ほとんどの補助薬は動物及び人中の肉芽腫の形成を起こす。この理由のため、殆どの補助薬は、動物での使用は許容されるけれど、人に対しての使用は許されない（Ｋｌｅｉｎ，１９９０）。それ故、補助薬を必要としないシステムは人のみではなく、ワクチン開発の分野においても重要な利点を特別に有する。記載されたキャリアーセグメントを使用すれば、抗体イソタイプ反応もまた変化されうる。異なるイソタイプ又は種の抗体の重い側鎖は、補体を結合する能力のようなユニークな効果的な機能と、たんぱく質Ａのような有効な結合性レジンを結合するユニークな能力をもつものとして知られる。こうして、異なるイソタイプであるが同じ抗原特異性を持つ抗体は、同等でない効果的な機能とレジンと結合する結合性を有する。本発明のシステムは、異なる濃度の抗原に反応して異なる抗体イソタイププロフィールを誘発する。このことは、この技術を用いて作られた優れたイソタイプ又は種の抗体の調節を許容するシステムが開発されることを示す。優れた発現：優れた発現の特性は、確認分析及び結合性精製養生のようなその後の使用と同様に免疫処理のための十分な抗原の単離のために行なわれる小さな発酵を許容することにより融合たんぱく質の製造を単純化する。十分な量の融合たんぱく質が、抗体製造のためのホスト動物中へ注入されることのために作られるべきであると想定されるのは必然的である。通常、研究は一以上のホスト動物の注入を必要とする。本発明のキャリアーセグメントは、例えば、バクテリヤにおいて、標準培養媒体中の５ｍｇ／ｌ以上の非常に高速度で発現されることが可能であることに利点がある。別の利点は、単離される融合たんぱく質のそのままに許容しつつ、それが素早い退化無しにペプチドの蓄積を許容することである。多様な目標配位子との働き：本発明のキャリアーセグメントの別の利点は目標配位子に付着することにより比較的に非特異的であることである。そのため、実質的に幾つかの型の配位子は、キャリアーセグメントが抗原性を持たず望みのペプチドが選択的に免疫システム中に分散される有用な免疫原を製造するための抗原性の無い、殆ど不溶のキャリアーセグメントに融合されうる。抗原の広範な用途：本発明の別の利点は、本発明のキャリアーセグメントにより作られた融合たんぱく質は殆どの抗体製造種において強化された抗原性反応を作りだす。典型的な種は、ネズミ、ラット、ウサギ、鶏、ヤギ、羊、ロバ、馬、及び人のような脊椎動物を含む。融合たんぱく質は以下で検討されるように多様な経路の注入を用いて効果的であることが示される。特定の抗体の収率が高くできる：本発明の別の利点は、融合複合体のキャリアーセグメントに対して向けられた抗原に比べて、問題の配位子に対する特定の抗体の比率が高いことである。ＫＬＨ又はＢＳＡのような典型的なキャリアーは、生来抗原性であり配位子よりずっと大きなサイズである。そのため、その様な化合物を伴う免疫化の反応において製造される多くの又はほとんどの抗体は、キャリアーセグメントに対して向けられる。本発明は低い抗原性を持つ非常に小さなキャリアーセグメントを構成する。本発明で免疫システムへ送られるより数少ないエピトープとより低い抗原性エピトープとの両方があるので、配位子を免疫優性にする正味の効果がある。このことは問題の配位子に対するより強力な免疫反応をもたらす。ペプチド製造：本発明はまた、不溶な融合たんぱく質として発現されるために限定された配列の短いペプチドの多量の素早い製造を有効的に許容する。疎水性のキャリアーセグメントは分裂され除かれ、又は結合したままにされる。前に記載した用途に加え、結合されたキャリアーセグメントを放つことは、疎水表面上で広く多様な応用のための用途を有するペプチドが固定化されることを可能とする。ペプチドは、抗体の中性化、上記の直接の固定化、固定化のための他のキャリアーとの複合化、酵素分析のためのエピトープの治療薬のような基体の遺伝地図作成、及び他の応用のような他の短いペプチドが使用される全ての用途において用いられうる。従来技術において良く知られるように、融合たんぱく質はキャリアーセグメントかた分離して望みのペプチド配列を作るために多様な薬剤により製造されうる。この発明の利点は、望みのペプチドが切り離されたとき、キャリアーセグメントの低溶解性によりキャリアーセグメントの除去が容易にされることである。簡便なペプチド合成における本発明の別の利点は限定された配列の少ない量のペプチドの製造のより低いコストを持つことである。更に、本発明の工程では毒性の薬剤を必要としない。通常に合成されたペプチドのもつ問題であるとして示されたアミノ酸側鎖の改良の機会も少ない。本発明はまた、ペプチド又はたんぱく質に対する抗体を作るための最近の技術に対する重要な改善を提供する。本発明は、目標たんぱく質の完全な配列に対する知識を必要としないで、ペプチドとペプチドが由来する母たんぱく質との両方への高い結合性、特異性、及び熱望を持つ抗体を作るように、抗体に対したんぱく質のペプチド配列から作られることをより簡単にする。そのため、免疫化、多クローン性の血清からの免疫結合性、ペプチド製造及びエピトープの遺伝地図作成若しくは同定を伴う基本的な問題がすべて、ペプチド又は合成ペプチドを用いて仕事をすることに慣れていない生物学者にとって馴染みの深い装置と方法を用いる容易で、安価で、安全な方法で達成されうる。本発明の生成物は１）感染病に対する安全なワクチンの製造と、２）抗体が実験的、工業的、製剤学的及び診断的な目的のために育てられた抗体に対して限定されたたんぱく質を合成するために設計される。本発明はまた、診断分析における用途のための診断薬の製造において有用である。キャリアー配列と配位子の結合から構成される融合たんぱく質は、試験管、マイクロリッタープレートの壁、油量計等の多様な固体支持物上で分散され又は免疫化されうる。更に、この技術の利用は、標準化学的合成方法で達成可能なものより長いペプチドの生成を可能にする。本発明のこれらの及び他の様子は、以下の発明の詳細な記述、例、及び添付された図面と写真の例示の上に明確になる。図面の簡単な説明図１は本発明の好ましいキャリアーたんぱく質〔ＳＥＱ．ＩＤ．３〕のアミノ酸配列である。図２は本発明のポリリンカーセグメント〔ＳＥＱ．ＩＤ．３〕の好ましいアミノ酸配列である。図３は本発明の結合されたキャリアーセグメントとポリリンカーセグメント〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕のアミノ酸配列である。図４は本発明の融合たんぱく質の製造と使用を説明するフローチャートである。図５Ａは、例３で記載された逆相ＨＰＬＣ及び、高速原子衝突マススペクトルにより評価される本発明の方法により精製された融合たんぱく質の純度評価を示すグラフである。図５Ａ中、精製されたキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析された。望みのたんぱく質ピークは矢印により示された。酢酸の吸収によるピークが開口円で示される。図５Ｂは、例３で記載された逆相ＨＰＬＣ、及び高速原子衝突マススペクトルにより評価される本発明の方法により精製された融合たんぱく質の純度評価を示すグラフである。図５Ｂは、特に、ｐＭＫ１６０から精製された融合たんぱく質のマススペクトルである。図５Ｂ上に記載されたように、Ｍ＋１ピークの質量はｃＤＮＡ配列から予想されたものに非常に近い。図６は、例４における固体表面上のキャリアーたんぱく質複合物の免疫化を示すダイヤグラムである。図７は、例５において、本発明のキャリアーたんぱく質とｐ５０から由来するペプチドセグメントの間に作られた融合たんぱく質へのネズミの抗原反応を示し、キャリアーセグメントではなく配位子に対して向けられた専有抗体反応を表すグラフである。図８は、（初期に完全でそれぞれの急増で不完全な）Ｆｒｅｕｎｄの補助薬の存在下、１ｍｇ／ｍｌの融合ペプチドで免疫化され、例６におけるものと異なる補助薬を用いて試験されたネズミからの滴定濃度を示すグラフである。図９Ａは例７において、補助薬の存在下、２ｍｇ／ｍｌ−０．１ｍｇ／ｍｌの融合ペプチドで免疫化されたネズミからの滴定濃度を示すグラフである。図９Ｂは例７において、補助薬無しに、２ｍｇ／ｍｌ−０．１ｍｇ／ｍｌの融合ペプチドで免疫化されたネズミからの滴定濃度を示すグラフである。図１０は、例８に記載のように一回の注入で重要な抗体反応を引き出す本発明のシステムの能力を示すグラフである。図１１Ａは、例９において、ネズミの免疫化を伴う本発明のシステムを用いるネズミ中でのポリクローン化抗体の製造を示すグラフである。図１１Ｂは、例９において、ネズミの免疫化を伴う本発明のシステムを用いるウサギ中でのポリクローン化抗体の製造を示すグラフである。図１１Ｃは、例９において、ネズミの免疫化を伴う本発明のシステムを用いる鶏中でのポリクローン化抗体の製造を示すグラフである。図１２は、例１０のペプチドと全長さの目標たんぱく質に結合するために本発明のシステムを用いて作られたポリクローン化抗体の能力を示すグラフである。図１３は、例１１において、ペプチド特異的なポリクローン化抗体とポプチド特異的な柔らかい放出のポリクローン化抗体の高い割合の製造を示すグラフである。図１４は、例１２において、免疫されたネズミからの１脾部位上のキャリアーセグメントの増殖効果を示すグラフである。本発明の詳細な記載定義以下の定義は、語句の範囲と詳細の明確そして確実な理解の提供を助けるために示される：補助薬：注入の前に抗原と混合されるとき、又は同じ部位へであるが分離されて注入されるとき、抗原に対し免疫反応を非特異的に増大させる物質。補助薬は一般に５種類：油状補助薬、無機塩、合成高分子、リポソーム、及び天然物、に分類される。アミノ酸：以下のような３文字又は１文字の略号により何れも示される：略名称アミノ酸ＡＡｌａアラニンＣＣｙｓシステインＤＡｓｐアスパルチック酸ＥＧｌｕグルタミック酸ＦＰｈｅフェニルアラニンＧＧｌｙグリシンＨＨｉｓヒスチジンＩＩｌｅイソロイシンＫＬｙｓリシンＬＬｅｕロイシンＭＭｅｔメチオニンＮＡｓｎアグパラギンＰＰｒｏプロリンＱＧｌｎグルタミンＲＡｒｇアルギニンＳＳｅｒセリンＴＴｈｒトレオニンＶＶａｌバリンＷＴｒｐトリプトファンＹＴｙｒチロシン抗原：Ｔ−及びＢ−細胞の受容体により認識され、Ｔ−及びＢ−細胞の受容体の結合部位と相互作用することによりリンパ球を活性化する物質。結合活性：抗原と結合する抗体の全体傾向。結合活性は抗原と抗体の結合性、原子価、及び抗体の構造により影響される。生物学的活性：生物学的システムにおける幾つかの特異的な方法での活動又は反応の能力。キャリアーセグメント：以下に記載の融合たんぱく質を形成するためにポリペプチド鎖の通常の延長又はポリペプチド鎖への挿入として異種ペプチドの共同発現を許容し、及び／又は以下に記載のキャリアーたんぱく質を形成するためにペプチド、ハプテン、若しくは他の配位子に化学的に結合され、及び／又は以下に”共同投与”と記載されるように抗原を伴って共同投与されるたんぱく質。キャリアーたんぱく質は一般に約１０から５０ｋＤａの分子量をもち、接続可能な分子内解裂部位を有しないことが好ましい。好ましいキャリアーたんぱく質のＤＮＡ及びアミノ酸配列は図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕に示される。クローン化ビヒクル：例えば、複製、被覆たんぱく質の生成又はプロモーター若しくは結合部位の喪失等、ＤＮＡの本質的な生物学的機能の付随する損失無しに、決定可能な形にＤＮＡ配列が切り取られるような、一または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位により性格付けられるホスト細胞中で複製することができ、そして、例えば、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性等、変位細胞の同定における用途に適当な信号発生物質を含む、プラスミッド、ファージＤＮＡ、コスミッドまたは他のＤＮＡ配列。コローン化ビヒクルは度々ベクターと呼ばれる。共同投与：抗原のキャリアーセグメントの物理的な捕獲若しくは結合をもたらしながら、ホスト生物への混合物の注入により追随される、キャリアーセグメントの細かく分割された又は可溶な部位と共に望みの抗原の混合をすること。混合物の注入において、抗原は共同投与されたと見なされる。更に、同一部位へのキャリアーと抗原の連続的な注入は共同投与と見なされる。キャリアーたんぱく質錯体：二つの間の結合が本来的に共有結合的でないキャリアーセグメントとペプチド、ハプテン、又は他の配位子からなる試料。これは、他の静電的、疎水的、又は結合的相互作用、及びキレートによる一の物理的捕獲を含む。キャリアーたんぱく質複合体：二つの間の結合は共有結合的な化学結合の何れかの種類であるキャリアーセグメントとペプチド、ハプテン、又は他の配位子からなる分子。その様な分子は一般に化学的架橋剤を使用して製造される。キャリアーたんぱく質複合体のサブセットは以下に記載の融合たんぱく質である。ＤＮＡ配列：隣接ペントースの３’と５’炭素の間のホスホジエステル結合により一から他に結合されるヌクレオチドの直線状の列。エピトープ：抗体と結合する配位子表面の小さい領域。エピトープはまた抗原決定因子としても働く。発現：ポリペプチドが因子又はＤＮＡ配列により製造される工程。それは転写と翻訳の結合である。たんぱく質に関連する場合、発現は大量の望みのたんぱく質の直接的な合成を示す。過剰発現は、問題の細胞により通常製造される限度を超える量での望みのたんぱく質の製造を示す。融合たんぱく質：キャリアーセグメントと選択によるペプチドからなる、二つの間の関係がポリペオプチド鎖の通常の延長又はポリペオプチド鎖中への挿入であるキャリアーたんぱく質複合体の一種。融合たんぱく質は、融合配列をコード化する因子の発現により、又は通常のペプチド結合が形成されるような方法で二つを化学的に結合することより製造されうる。ハプテン：大きなキャリアー分子に共有結合的に付着した場合に抗体に結合して免疫反応を引き起こしうる低分子質量（典型的には４０００ダルトンより低い）の物質。ヘテロローグペプチド：選択されたホストに対して内因性でないペプチドであり、この限定はそのような過剰発現が望まれる場合には内因性ペプチドもまた含む。ヘテロローグペプチドは、一般に約１０ｋＤａより小さい分子量を持つ殆どのたんぱく質に比較して短く、グリコシル化、シアリル化、ホスホリル化等がなされる。このペプチドは、例えば、ペプチドホルモンのような生物学的活性、又は組み換えワクチン及び／若しくは免疫学的分析における用途のための抗原活性等、幾つかの形の有用な活性を示す。このペプチドは幾つかの解裂部位を省略し、又は、例えばペプチドの別の部位により若しくはグリコシル化、ホスホリル化等により覆われるペプチドの位置である、ペプチドの受容できない部分の中の部位を発現する。免疫原：免疫反応を引き出す能力のある物質。免疫的結合活性：抗体に結合する特異的な能力。封入体：封入体は、発現又は生成段階で、それが参照される時にたんぱく質の物理状態と無関係に沈殿物として位相差顕微鏡により観察可能な、ホスト中に過剰発現されたものである。封入体の更なる説明は、中で封入体の記載のための例により具体化され、”屈折体”として封入体を示すＪｏｎｅｓ他のアメリカ特許第４，５１２，９２２号中に見出されうる。イソタイプ：例えば、ＩｇＭ，ＩｇＧ２，及びＩｇＧ３等、与えられた動物中のその抗体種又は亜種中の大きな鎖の全ての分子上にある共有されたエピトープにより限定される抗体の種又は亜種。配位子：特定の受容体又は酵素と結合する分子。例としてたんぱく質、ペプチド、ハプテン、ポリサッカライド又は他の生物分子を含み、抗体と相互作用することが知られる。ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸、及び含窒素ヘテロ環状塩基からなるＤＮＡ又はＲＮＡのモノマーユニット。この塩基はグリコシディック炭素（ペントースの１’炭素）を経て糖部分と結合され、塩基と糖の結合はヌクレオシドと呼ばれる。この塩基はヌクレオチドを性格付ける。四つのＤＮＡ塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）である。四つのＲＮＡ塩基はＡ，Ｇ，Ｃ，及びウラシル（Ｕ）である。ヌクレオチド塩基配列：ＤＮＡ分子における直線状の列は通常四つのｄＮＴＰ前駆物質：ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰから調製される。ＤＮＡ中に見出された通常の四つと異なる改良塩基もまた組み込まれる。ペプチド：一つのアミノ酸のα−カルボキシル基から形成されたペプチド結合を通して、水分子に排出により隣のアミノ酸のα−アミノ基と共有結合により結合され、上記のように更に改良もされうる２−５０の天然に存在する又は合成的なアミノ酸からなる化合物。アミノ酸は、天然に存在する上記のアミノ酸、ノルロイシン等のその様なアミノ酸の化学的に合成された変体、又は天然に存在する化合物中でそれらに共有結合により結合されていることが見いだされうる他の化学的な置換基の付加により基本的なそれらの化学構造から変化されうるアミノ酸の改良形の何れかでありうる。結合のための幾つかの改良は、リン酸基、リピド基、ヌクレオチド基、及び高分子の糖を含み、そして当業者に知られた他の改良を含む。プラスミド：そのプラスミドがホスト細胞中で複製されるように無傷の”複製単位”からなる非染色体性の二本鎖ＤＮＡ。プラスミドは単細胞生物中に置かれた時に、プラスミドのＤＮＡの結果としてその生物の性質は変えられ又は変形される。例えば、テトラサイクリン耐性（ＴＥＴＲ）に対する因子を保持するプラスミドは、テトラサイクリンに対し以前は敏感であった細胞を其れに耐えるものに変形する。プラスミドにより変形された細胞は”形質転換株”と呼ばれる。組み換えＤＮＡ分子又は雑種ＤＮＡ：生細胞の外側で端と端とで連結されて正細胞中に維持されることが可能である、異なる源からのＤＮＡのセグメントを含む分子。基本的な発明基本的な発明はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体の構造に関する。キャリアーたんぱく質複合体又は錯体は、実質的に天然には存在しない不溶な第一のアミノ酸配列と、生物学的な活性又は免疫結合的な活性をもつ配位子からなる。キャリアーセグメントキャリアーセグメントの性質本発明は特に、”キャリアーセグメント”又は”セグメント”として示されるたんぱく様のキャリアーセグメントに関する。本発明記載のキャリアーセグメントは、記載の殆どの目的に対し必要はないが、自由なアミノとカルボキシル末端を持つ。キャリアーセグメントは本発明にとって重要である幾つかの特性を持つように設計されている。キャリアーセグメントは疎水性である。短いペプチド又は配位子に結合された時にキャリアーセグメントは溶解作用を支配するので、それを持つ複合体は中性の水溶液にほとんど溶けない。それを持つキャリアーセグメントと融合たんぱく質がＥ．ｃｏｉｌ中で高い水準で発現され、封入体として知られる不溶のたんぱく質の顆粒として形成される。これらの封入体中に見いだされたたんぱく質はこの技術分野で知られた技術を用いて大量に精製することが簡単である。動物中に注入された時キャリアーセグメント自身は低い抗原性を持つが、動物の免疫システムへ結合された配位子を適度に示す。キャリアーセグメントはまた、単一のアミノ酸に対して特異性を伴うプロテアーゼとして認識される多くの解裂部位を欠いており、そして例えば、尿素、ＳＤＳ，ホルミック酸、及びホルムアミド等、化学物質及び酵素による解裂を許容する幾つかの溶液中に可溶である。キャリアーセグメントの設計上記の好みの特性を持つキャリアーセグメントは幾つかの明確にされた段階の中で設計される。これらの段階とこの場合では必要とされない特別な段階を用いることにより、研究者は異なるたんぱく質を伴って始まる他のキャリアーセグメントの設計ができた。高く発現されたたんぱく質配列は発現ベクターが入手可能なものに対して同定される（この場合、ベクターｐＧＥＭＥＸ−１によりコード化されたファージＴ７の因子１０たんぱく質）。この場合の初期たんぱく質はＥ．ｃｏｉｌ中の約１００ｍｇ／ｌの培養で発現される。次に、設計されたたんぱく質配列は、後で記載するようにポリリンカーアミノ酸を数えず、７９のアミノ酸に切り詰められる。配列を小さくすれば、一緒にはじまる抗原部位を含みにくい。それ以下ではＥ．ｃｏｉｌ中で良い発現は得られない６５アミノ酸近辺で長さの最小があるように見える。切り詰められた配列は、置換する無電荷のアミノ酸又は電荷を持つアミノ酸レジン、アルギニン、アスパルチック酸、及びグルタミック酸のためのヒスチジンにより更に改良される。幾つかのトリプトファン又はシステイン残基は幾つかの電荷の無いアミノ酸に変えられ、アミノ末端のものを除いた（若し発現がＥ．ｃｏｉｌ中で達成されるなら必要）全てのメチオニンは殆どの場合がバリンである電荷を持ったアミノ酸で置換される。一般に、通常はコドンの３級塩基のみが変えられて、置き換えアミノ酸は、発現ベクターのＤＮＡ配列中の大きな変化はないものが選択される。アミノ酸配列中の他の小さな変化（一のアミノ酸挿入）は、後で記載する、発現ベクター中にキャリアーセグメントをコード化するＤＮＡのクローン化を調節するためになされる。こうして、キャリアーセグメントの顕著な設計特性は、後で記載するように、それがポリリンカーアミノ酸を数えず、約７９のアミノ酸に切り詰められ、少なくとも二つそして望ましくは以下のリストのアミノ酸：グルタミック酸、アスパルチック酸、リシン、アルギニン、メチオニン（Ｅ．ｃｏｉｌ中で翻訳の初発のために必要とされるセグメントのアミノ末端上に置かれた単一メチオニンを除く）、トリプトファン、及びシステインの全てを欠いていることである。これらのアミノ酸を欠損は無電荷のアミノ酸置換により達成される。もし出発たんぱく質がとても親水性であり、特にトレオニンやセリンのような無電荷の多くの親水性アミノ酸を含んでいたなら、引き続く上記の設計ルールは、たんぱく質を望みの低い溶解性を持つために十分な疎水性であるようにすることはない。この場合、更なる設計ルールは、望みの低い溶解性が達成されるまで、組織的に親水性のアミノ酸をロイシン、イソロイシン、バリン、及びアラニンのようなより疎水性のものと組織的に置換することである。全ての電荷を持ったアミノ酸が除去されるわけではない。ある場合、キャリアーセグメント中の一若しくはそれ以上のアミノ酸を放出することが望ましくまたは必要である。例えば、キャリアーセグメントのために発現ベクター中にペプチドコード化ＤＮＡ配列のクローン化をするために、ベクターは分解酵素が切断できる幾つかの部位を含む必要がある。そのような部位の幾つかは通常、ポリリンカーと呼ばれるものを作りながらベクター中の単一の遺伝子座中にクラスター化される。そのようなポリリンカー配列中にはＤＮＡ配列によりコード化された少ない電荷を持ったアミノ酸が度々存在する。こうして理想的なキャリアーセグメントはポリリンカー部位を除く位置で電荷を持つアミノ酸は全く無い。上記のように、望みの目的を達成するのに十分なサイズのみを持ってキャリアーセグメントは作られることが望ましい。適当なキャリアーセグメントは約６５及び１００アミノ酸長の間の長さを持つものは製造される。キャリアーセグメントの好ましいアミノ酸配列は７９アミノ酸〔ＳＥＱ．ＩＤ．＃１〕からなり、図１に示される。キャリアーセグメントのアミノ酸配列はまた、ポリリンカーセグメント（図２〔ＳＥＱ．ＩＤ．３〕）を含み、その結果、図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２．〕に示されるように、図１のキャリアーセグメントと図２のポリリンカーセグメントの結合である。上記キャリアーセグメントの直接使用後で記載するように、研究者は、問題のポリリンカーセグメント又は融合ペプチド配列を含有するためにキャリアーセグメントをコード化するＤＮＡベクターを改良することを希望するであろう。キャリアーセグメントはまた、更なるアミノ酸の付加又は改良を伴うこと無く製造され、以下に記載されるように幾つかの方法の中で有効に用いられる。キャリアーたんぱく質複合物の一部として：キャリアーセグメントは第二の化学的実在物又は配位子に融合されうる。後で記載されるように、この複合物は精製されたキャリアーセグメントへ配位子を化学的に結合することにより作られうる。こうして調製された複合物は免疫化、表面の被覆、受容体の結合、及びこの発明中の他の場所に記載された多くの他の方法のために用いられうる。補助薬として：キャリアーセグメントはまた、例えば、配位子に融合されることなくして、補助薬としての用途も持つ。キャリアーセグメントは、ホスト動物中への注入のためにたんぱく質とともに共同投与されうる。典型的には、キャリアーセグメントは高分子量のたんぱく質又は他の高分子及び生物高分子とともに最も良く働く。好ましくは、共同投与される分子の分子量はすくなくとも薬４，０００ダルトンである。キャリアーセグメントは望みの分子と混合され、動物中に共同注入される。このことは、動物の望みの分子へのより強い免疫反応の発生をもたらしつつ、キャリアーセグメントが望みの分子への特異的な免疫反応を非特異的に増大させることにおいて有効である。他とともにこの特質は、キャリアーセグメントが補助薬としてそれを顕著にする活性を明確にすることを示す。配位子配位子は第二のペプチドセグメント、ペプチドでない化学的成分若しくはハプテン、又はペプチドでない化学的実体と化学的に結合されたペプチドの両方からなる混合された合成物でありうる。キャリアーセグメントへの融合のために用いうる化学的成分の例は、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、及びそのような化合物の誘導体の等の蛍光成分；モノ及びポリサッカライド；製剤学的な薬剤；及びそのような薬剤の誘導体と代謝物；そのような薬剤の環境的に有害な化学物質や誘導体や代謝物、そのような薬剤の殺虫剤化学物質や誘導体や代謝物、及び脂質を含む。化学的成分は、後でより詳細に検討される多様な手段によりキャリアーセグメントに付着される。そのような手段は、生物分子に望みの成分を結合させるように設計された前誘導された化合物の使用、化学的架橋剤の使用、又は配位子がペプチドセグメントであるなら融合たんぱく質としての発現を含む。生物分子への配位子の結合のための広い範囲の試薬はＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（ユージン、ＯＲ）及びＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ（ロックフォード、ＩＬ）のような会社から購入可能である。これらの試薬の幾つかはまた、キャリアーセグメントへの配位子の多重複製の結合を許容する。配位子は免疫結合活性（”免疫活性”として他では知られる）又は生物学的活性の何れも有しない。配位子は例えば、抗原性、受容体結合活性、診療活性、又は投与の後ホスト動物中の与えられた遺伝子座へ移動する能力である目標決定活性等、単一の活性を有する。配位子はまた、そのような活性の二またはそれ以上の組み合わせを有する。もし配位子がペプチドであるなら、それは技術的には知られるが、まだ開発若しくは同定されていないとされるアミノ酸配列である。アミノ酸配列の例は、インターフェロン因子又はウイルス、バクテリヤ若しくは他の寄生菌のような病原菌の抗原のためにコード化する因子のようなリンホカイン因子からの誘導を含む。それはまた、得られたペプチドが上記抗原若しくはそれの断片と実質的に同じ抗原性を持つような化学合成されたコード化配列から得られる上記抗原若しくはペプチドの断片でもある。例は、Ｋｉｎｇｓｍａｎ他のアメリカ特許第５，００８，３７３号に作られ、ここで適当なアミノ酸配列の例の開示のための例により具体化される。発現ベクター図４を参照するに、問題の多様なたんぱく質の生産は、その後集められて精製され、そして、それから何れも直接に使用され、若しくは配位子Ｂに結合され、若しくは配位子Ｂ”と共に共同投与され、若しくはキャリアーセグメントＢ’を除くために分裂される、たんぱく様のキャリアーセグメントＡ若しくはキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質Ａ＋Ｂをホスト細胞中に発現することにより達成される。その工程は、適当なホスト中への変形とその後の発現上で、キャリアーセグメント又はキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質を豊富に生産する組み換えＤＮＡベクターの処理を含む。好ましいホスト細胞はＥ．ｃｏｉｌのような原核細胞であるが、本発明はまた、例えば、Ｓ．セルビシアエのようなイースト細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞のような動物細胞、又は望みのたんぱく質の生産を直接にする適当な発現ベクターを含むＣＯＳ細胞など、多様なホスト細胞中のキャリアーセグメント又はキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質の生産を含む。望みのコード化及び制御の範囲を含む適当なベクターとカセットの組立は、この技術分野で良く理解されたＤＮＡ操作（オリゴヌクレオチド合成、結紮、制限）を用いる。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは、切り裂かれ、直され、そして望みの形に帰せられる。たんぱく質コード化カセットは好みのキャリアーセグメントをコード化するように構成される。カセットによりコード化されたたんぱく質は分子量約１０キロダルトン（１０ｋＤ）であり、上記の；すなわち、簡単には、多くの電荷を持つアミノ酸の選択的な除去により低い溶解性と抗原性を有するというキャリアーセグメントの設計主旨を維持している。好ましいキャリアーセグメントたんぱく質とＤＮＡ配列は図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示される。上記設計のキャリアーセグメントのためのたんぱく質コード化カセットはその後適当な発現ベクター中に複写される。他のシステムが発現のために用いられるホスト生物に依存して使用されるが、通常はこれはプラスシドベクターである。提供された例においては、発現ベクターは、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マディソン，ＷＩ）のカタログに記載されたｐＧＥＭＥＸ−１として知られたベクターの改良である。このプラスシドベクターは、Ｂｏｌｉｖａｒ他（１９７７）によるＥ．ｃｏｉｌ種から誘導された良く知られたｐＢＲ３２２ベクターの誘導体である。キャリアーセグメントたんぱく質の発現はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターにより推進される。複写部位、制御配列、及び抗生物質抵抗性の信号発生物質を含み、ホストと交換可能な種に由来する他のプラスシドもまた用いられうる。通常用いられるここで定義された原核制御配列はリボソーム結合部位配列に沿った始まりと終わりの転写のためのプロモーターを含み、そしてベーターラクタメーセプロモーターのようなプロモーターを含む。発明の真核システム中で役立つ発現システムは適当な真核性の種から由来するプロモーターを構成する。イースト中で有用なプロモーターの分類は例えば、３ −ホスホグリセレートキナーゼ用のものを含み、グリコリチック酵素の合成用のプロモーターを含む。本発明のさらに有効な点は、キャリアーセグメントコード化ＤＮＡを含み、ポリリンカーセグメント（図４中のＣ）と呼ばれ、少なくとも一の分解エンドヌクレアーゼ酵素の認識配列に追随されるこのセグメントを含み、キャリアーセグメントの知られたリーディングフレームと分解エンドヌクレアーゼ部位のコード化ＤＮＡ内に転写終了コードンを含まない、ヌクレオチドセグメントにより追従されるものである発現ベクター構造の使用である。発現ベクターをコード化するＤＮＡは分解エンドヌクレアーゼを使用するポリリンカー中の特異な部位でその後に切断されえて、そしてＤＮＡセグメントコード化の好みのペプチド配位子がこの点で発現ベクターに導入されえることにそのようなポリリンカーセグメントは利点を有する。そのような場合、得られたベクターは問題のキャリアーセグメント又はペプチドを含む融合たんぱく質をコード化し、キャリアーセグメントをコード化するＤＮＡと配位子の間のＤＮＡの介入における読み出しフレーム中に翻訳終了コドンが無く、挿入されたＤＮＡは望みの融合たんぱく質の端で翻訳終了コドンを含むべきであることを確実にしなければならない。融合たんぱく質の生産におけるポリリンカーの適当な設計と使用に関する知識はこの技術分野では良く知られている。望みであるなら、得られた構造のアミノ酸配列の確認は、この技術分野で良く知られた方法の使用により得られたベクターのＤＮＡ配列を決定することによりなされうる。ポリリンカーの好ましいＤＮＡ配列とポリリンカー配列によりコード化されたアミノ酸は図２〔ＳＥＱ．ＩＤ．３〕に示される。初めに検討したように、ポリリンカー配列中の幾つかのコドンは電荷を持つアミノ酸をコード化する。このことは、融合たんぱく質の働きに対して有害ではない。ポリリンカーを加えて完全なベクターの好ましいＤＮＡ配列は、残りのベクターがｐＧＥＭＥＸ−１を構成する、図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕に示された配列からなり、その中で、５から９０５のＤＮＡ配列はＡＴＧコドン（Ｍｅｔ）がｐＧＥＭＥＸ−１ベクター中のＴ７プロモーター配列に近づくような方法で、図３に記載される配列で置き換えられる。ペプチドコード化オリゴヌクレオチドが望みのペプチドに端で翻訳終了因子を伴いポリリンカー中にクローン化されるときに、図３の配列のカルボキシル末端上の幾つかのアミノ酸は融合たんぱく質中に存在しないことに注意する。融合たんぱく質が例２中に記載されたＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位中にクローン化により作りだされるとき、Ｃ−末端８アミノ酸は失われている。このことは融合たんぱく質の特質にさほど影響しない。発現菌株本発明のたんぱく質は原核又は真核システム中に発現される。原核生物はＥ．ｃｏｉｌの多様な菌株により最もよく代表される。好ましいホスト菌株はＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マディソン、ＷＩ）から購入により入手可能な菌株である、ＢＬ２１（ＤＥ３）プライである。しかし、バシーリ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｓ）、シュードモナスの多様な菌株等、他の微生物菌株もまた用いられる。通常の真核発現菌株はイーストの菌株を含み、昆虫細胞中のバクロウイルス発現を含む。本発明の一つの可能な利点は、不溶な堆積物中での発現されたたんぱく質の堆積は他のやり方では細胞に対してより有害で又は有毒な融合たんぱく質の発現を許容することである。転換用いられるホスト細胞に依存して、変換はそのような細胞に合った標準的な技法を用いて行なわれる。Ｃｏｈｅｎ（１９７２）により記載されたような塩化カルシウム処理又はＭａｎｉａｔｉｓ他（１９８９）で記載されたＲｂＣｌ法が実質的に細胞壁防御を持つ原核生物とともに用いられる。好ましいホスト菌株はＢＬ２１（ＤＥ３）プライであり、用いられた変換プロトコルは製造会社（ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ．，マディソン、ＷＩ）により提案されたものである。構造確認転換後、成功した転換はアンピシリン（好みの）、テトラサイクリン、若しくは他の抗原性耐性又はこの分野で理解されるようなプラスミド構造に依存する他の信号発生物質を用いることにより選択される。形質転換株からのプラスミドはその後Ｃｌｅｗｅｌｌ他（１９６９）の方法に従い調製される。プラスミドの配列はそれからこの分野で良く知られた標準的なＤＮＡ塩基配列決定法により確認される。キャリアーセグメントと融合たんぱく質の生産と精製発現／細胞の収穫転換された発現菌株は振動フラスコ又は適当な密度の発酵器中で栽培される。その後、望みのたんぱく質の発現が適当な誘導プロトコルを使用して刺激される。好ましい場合、誘導は、Ｔ７発現菌株に対して標準的な誘導子であるイソプロピル−Ｂ−チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）の添加により達成される。ある場合は、ホストのＲＮＡポリメラーゼの活動を防御するリファンピシンにような試薬の添加が、望みのたんぱく質の生産の増大を引き起こす。更に、発現システムは発現が制御されていない場合に用いられる。細胞の収穫の時は前もって決められることも可能であり、又は実時間でたんぱく質発現をモニターすることによりチェックされること可能である。発現する細胞は遠心分離により収穫され、ブレイキングされる前に−７０°Ｃで数週間近く貯蔵され、その中に含まれるたんぱく質は精製される。キャリアーセグメント及び／又は融合たんぱく質の精製発現たんぱく質は一般に細胞中の他のたんぱく質より低溶解性であるので、この分野で知られた標準的な技法を用いて原核細胞から精製するのは比較的に容易である。第一に、細胞は緩衝剤中で酵素的又は機械的な手段により溶解される。幾つかの他の細胞溶解方法は機能するが、好ましい方法は、細胞溶解の完了し、遠心分離中顆粒化しないようにＤＮＡとＲＮＡが十分に分解される長さでの音波処理である。好ましい緩衝剤は、ｐＨ７−８のトリス緩衝液、等張性サリン、及び全ての細胞たんぱく質を還元状態で維持するためのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む。音波処理の後、殆どの脂質とたんぱく質を溶かすために混合物中に清浄剤が添加され、混合物は、１０分間１０，０００Ｇより大きい遠心分離速度を用いることが好ましい遠心分離をされる。望みのたんぱく質はその後、高い程度の純度で沈殿部分中に見いだされる。より高い純度は通常、沈殿を異なる薬剤又は清浄剤を度々含む第二の洗浄溶液中で洗浄することにより得られる。洗浄は上記のような遠心分離によって追従される新たな緩衝剤中で沈殿物が再懸濁されることにより達成される。好ましい第一の清浄剤はナトリウムデオキシコレート（ＮａＤＯＣ）であり、第二の好ましい清浄剤はトリトンＸ−１００である。清浄剤洗浄の後、沈殿物は上の緩衝剤で又は極少量清浄剤を除去するためにリン酸で緩衝されたサリン（ＰＢＳ）で洗浄され、その後、貯蔵のため又は免疫化を含む、他で記載された幾つかの方法における使用のためにある量の望みの緩衝剤の中に再懸濁される。たんぱく質の低溶解性の利点は、精製が簡単で素早く、そして極少ない特別の装置しか必要としないことである。上記方法で精製されたたんぱく質は、本発明中で期待される幾つかの又は全ての、限定されることはないが以下の；動物の免疫化における使用、補助薬としての用途、他の配位子との結合、プロテアーゼ禁止剤としての用途、酵素物質としての用途、解裂後のペプチド生産における用途等の応用のために用意ができている。精製されたキャリアーセグメントと望みの配位子からのキャリアーたんぱく質複合物の生産精製されたキャリアーセグメントは”キャリアーセグメント”中で記載した応用のために直接に使用されることが可能であり、又は以下で記載された戦略を用いて”配位子”中で記載された多様な配位子と共に誘導体化されることが可能である。これらは前誘導体化された配位子、化学結合性試薬、及び架橋剤の使用を含む。前誘導体化された配位子の使用多くの場合、望みの配位子とキャリアーセグメントとの結合は、フルオレセインイソチオシアネート、ＮＨＳ−ローダミン（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ロックフォード、ＩＬ，それぞれ製品４６１１０及び４６１０２）及びスルホローダミン１０１酸クロライド（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ミルウォーキー，ＷＩ，製品２８，４０６−８）のような、分子へのそのような化合物の付加を容易にするために生産されたそのような化合物の市販の誘導体の利用により達成されうる。これらの化合物の多くは、たんぱく質に対し望みの化学的部分を共有結合により結合するような方法で、アミノ末端、カルボキシル末端、アミノ酸セリン及びトレオニンの水酸官能基のようなたんぱく質中に見いだされる化学的な基と反応するように特別に合成されたものである。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（ユージン，ＯＲ）又はＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（ロックフォード、ＩＬ）のような多くの会社のカタログはキャリアーたんぱく質へそのような化合物を選択的に付加する多くの方法で利用可能な知られた反応性の過剰の化合物を有する。この観点でのキャリアーセグメントの一つの利点は、多くの反応性アミノ酸側鎖は存在しないので、配位子付加の部位のより選択的な局在化を得ることができることである。化学結合試薬の利用キャリアーたんぱく質複合体の形成のための別の方法は、キャリアーセグメントと配位子を溶液中で、最終生成物中に含まれること無く二つのセグメントの化学的な結合を容易にすることができる化学的実体と共に培養することである。そのような方法の一つは、自由カルボン酸部分をアミノ基の結合させる試薬の使用を経るものである。本発明で記載されたキャリアーセグメントは自由アミノ末端とカルボキシ末端を持ち、もし配位子が自由なカルボン酸基又はアミノ基の何れかをその化学構造中の何処かに含んでいるなら、そのような試薬の使用を経て配位子又はペプチドに対し結合されることが可能である。そのような結合を形成するために通常使用される試薬の一つは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ミルウォーキー，ＷＩ，製品Ｄ８，０００−２）である。ＤＣＣはそのような結合反応中で用いられるとき、キャリアーセグメントと配位子の間のアミド結合が、水分子の並行する排除を伴い、元からあったカルボキシル基とアミノ基からなって形成される。こうして、最終複合体は、該複合体を作りだすのに使用されたＤＣＣ試薬のいずれの一部分をも残すことはない。同様の特性を有した幾つかの異なる試薬が文献中に広く記載されている。架橋剤の使用キャリアーたんぱく質複合体の形成のための別の方法は、キャリアーセグメントと配位子を溶液中で、二つのセグメントの化学的な結合を容易にすることができ、最終生成物中に様々な程度に含まれる化学的実体と共に培養することである。そのような化合物の使用における科学的な関心は、異なる反応性と利益を使用者に提供し、使用者が彼らの特定の応用に対し最も有効である特定の試薬の選択することを許容する多くの異なる試薬の開発をもたらした。例はここに、多くのそのような試薬の構造と使用の記載ための、Ｔａｅ他（１９８３）によるものがある。そのような試薬はまた、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ミルウォーキー，ＷＩやＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ロックフォード、ＩＬのような供給元を通して広く購入により入手可能である。そのような試薬の例は、ジメチルスベリミデイト（ＤＭＳ）及びｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ− ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ロックフォード、ＩＬ，それぞれ製品２０６６８及び２２３１０）を含む。もし、キャリアーセグメントに結合するある化学的実体の多重複製が望まれるなら、化学的部分のキャリアーセグメントの配列内の多重複製中にある化学的基への結合にはよらないが、使用者はそのような多重誘導体化キャリアーセグメントを幾つかの方法により形成できる。使用されうるこの一つの方法は、上記の型の化学的架橋の形成のために使用されえた複数の化学的基を持つキャリアーセグメントへのペプチドセグメントの取付けを通してある。例えば、短いペプチド配列中に三若しくはそれ以上リシン残基を有するペプチド配列がキャリアーセグメントに結合されえた。上で作られた新しい融合物はその後、新しい融合化合物の構造中のこれらの三の新しい一次のアミノ基及びアミノ基へ物質を架橋する化学的実体を用いながら問題の化学的部分へ架橋される。免疫化と異なる複合体の利用これらの化学的成分への抗体を生み出すために使用されえる物質を生産することに加えて、キャリアーたんぱく質へそのような物質を結合する他の利点がある。これらの物質の多くは、マイクロタイタプレートのウェルの生産のために使用される樹脂のような特定の物質に取り付けることが難しい。抗体により特異的に結合されることを許容する方法により、それらの物質へそのような配位子を結合することの困難さは、ＥＬＩＳＡ検査のような技法を用いるそれらの測定を複雑なものにする。しかし、そのような配位子を含むキャリアーたんぱく質複合体は、抗体又は酵素による化学的部分の認識が禁止されていないような方法においては、そのような物質に対し素早く結合されえる。その結果、そのような複合体の形成の容易さと、抗体及び酵素に配位子を送るそのような複合体の能力は、免疫原としてのそれらの用途を超えて化学的に結合されたキャリアーたんぱく質複合体のための用途を許容する。ペプチド生成のためのキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質の用途本発明はまた、キャリアーセグメントと望みのペプチドの組み合わせにより製造された融合たんぱく質を用いる生物学的又は免疫学的に活性なペプチドの製造に関する。本発明のこの部分は基本的に、ペプチド結合でたんぱく質配列を配列特異的に切断する試薬を用いてキャリアーセグメントからのペプチドの遊離を許容する、介在する解裂可能なアミノ酸配列を伴うキャリアーセグメントとペプチドの組み合わせに関する。望みのペプチドはその後、水溶液に非常に溶けにくいキャリアーセグメントから、例えば濾過や遠心分離により簡単に分離される。こうして、本発明に記載したような実質的に純粋で活性なペプチドを製造する方法が提供される。他の記載が無ければ、単独で用いられる”活性”の語句は、生物学的に活性と免疫学的に活性の何れか（又は、両方）を意味することを意図する。本発明のキャリアーセグメントは使用者に、１）それはたんぱく質セグメントを解裂するための配列特異的な試薬により攻撃されえる通常のアミノ酸の幾つかを含まないこと；そして２）キャリアーセグメントの低溶解性が放出されたペプチドからのキャリアーセグメントの分離を多くの例中で簡単に達成されることを許容することの、２つの重要な利点を提供する。例えば、キャリアーセグメントの端に融合されたペプチドを持つ融合が作られ、そして望みのペプチドは一つのリシン残基も含まない場合、その後、融合たんぱく質はキャリアーセグメントと望みのペプチドの接合点で単一のリシンを用いて発現されえる。得られた融合たんぱく質は上記のように精製されえ、そしてその後、リシンのカルボキシ側で融合たんぱく質を解裂するためのトリプシン又はエンドプロテアーゼＬｙｓＣのようなこの分野で良く知られたプロテアーゼを用いて消化される。この解裂反応は、一つはそのカルボキシ末端にリシンを持つ不溶のキャリアーセグメントからなり、もう一方はほとんどの場合に水溶液中での相当程度のより大きい溶解性を持つ望みのペプチドからなる、ふたつの生成ペプチドを産する。ベクター構造融合たんぱく質は、融合たんぱく質と、キャリアーセグメントと望みのペプチドの両方の中に欠けている問題のペプチドとの間の接合点でアミノ酸が存在するように、使用者が融合たんぱく質の新しい部分をコード化するオリゴヌクレオチドを設計する、加えられた設計主旨とともに、前の章で検討された方法により作られる。前に記載されたキャリアーセグメントから欠けているように設計されたアミノ酸は、メチオニン（Ｍｅｔアミノ末端を除く）、リシン、アルギニン、トリプトファン、グルタミック酸、アスパルチック酸、及びシステインである。試薬はキャリアーセグメント中で抜かされているそれぞれのアミノ酸でのたんぱく質配列の解裂のために入手可能であり、このことは、多くの場合に解裂部位に置くことを希望するいくつかのアミノ酸のどれかを選択する贅沢を使用者に許す。ただ二つのみの反応生成物が可能であるように、ペプチド又はキャリアーセグメントの何れの中にも存在しない一つのアミノ酸を使用することが特に望ましい。発現／精製これは上記の手段を用いて達成される。融合たんぱく質の設計不溶の融合たんぱく質は、初めに、望みの解裂試薬と交換可能な試薬中に溶かされなければならない。そのような試薬はカオトロペスを含む水溶液（４Ｍ尿素、４Ｍグアニジンハイドロクロライド）、清浄剤溶液（１％ＳＤＳ，１％サルコシル）、又は混合有機酸／水溶液（５０％酢酸、７０％ホルミック酸）を含む。次に、溶液は、望みのアミノ酸で（エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ，Ｇｌｕ−Ｃ，Ｌｙｓ−Ｃ，Ａｓｐ−Ｎのような試薬を用いて）ペプチド結合の解裂の可能な化学若しくは酵素作用物質、又はＣＮＢｒ（Ｍｅｔで切断する）、ＢＮＰＳ−スカトール（Ｔｒｐで切断する）、若しくは希酸（Ａｓｐ−Ｐｒｏで切断する）のような化学試薬と共に処理される。これらの試薬の全てのために、融合たんぱく質を溶かし試薬が融合たんぱく質上で働くことを許容する溶液が入手可能である。更に、融合たんぱく質の懸濁もまた試薬とともに処理されえる。融合たんぱく質は極少量しか溶けない場合でさえ、幾分かの融合たんぱく質は溶液中にありそして／又は試薬に対し接することが可能である。反応混合物のより長い培養は、結果的に融合たんぱく質の全ての完全な解裂をもたらす。反応時間経路はＳＤＳジェルにより（融合たんぱく質の分子量の変化を観測して）、又は逆相ＨＰＬＣの何れかによりモニターされうる。キャリアーセグメントからのペプチドの分離キャリアーセグメントの固まりをペプチドから除去するために、必要とされるもの全てが、溶けている作用物質を除去し、不溶のキャリアーセグメントを分離するためのものである。溶けている作用物質の除去は、透析、濾過、蒸留、凍結乾燥、又は使用者にとって素早く入手可能な他の手段により行なわれうる。沈殿されたキャリアーセグメントの除去は濾過、遠心分離、又は沈降によりなされる。上澄みの溶液は、多くの場合にそのまま用いられえ、又はペプチド精製の技術においては標準的な方法により更に精製されえる実質的に純粋なペプチドを含む。微量に残るキャリアーセグメントの除去を望む場合、フェニル−セファロース（ＰｈａｒｍａｓｉａＣｏｒｐ．，アップサラ、スウェーデン）のような疎水レジン上の上澄みの通過は、フロースルーフラクション中でペプチドと離れるキャリアーセグメントを選択的に除去する。この方法の実質的な利点は、使用者はペプチド合成剤に触れる必要がないことであり、そして精製されたペプチドが有害な側鎖改良を含むより低い機会しかない。生物工学中心施設の最近の検査は、ペプチドが合成後に精製された時でさえ、検査したペプチドの５０−６０％が主な構造に対し改良されたペプチドを含み；合成ペプチドの有害な側鎖改良は非常に当たり前であることを示した（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｊ．他、１９９２）。これの主な原因は、合成後のアミノ酸の不完全な保護除去であると判断されている。発明の方法はこれらの基を決して付加しないので、この問題は完全に避けられている。ペプチド等価物としてのキャリアーたんぱく質複合体の使用特定プロテアーゼ禁止剤の製造前に検討したように、キャリアーセグメントが望みのペプチドに付着されたままでの又はそれから取り除かれての何れかで最善の数多くの応用がある。何れも許容できる実施例での応用は二、三ある。これらの一つは特定のプロテアーゼ禁止剤の製造である。配列の知られた望みのたんぱく質が特定の部位でたんぱく質分解的に解裂されるように観察すされるなら、解裂を妨害するための通常の方法はプロテーゼ禁止剤を添加することである。単一の禁止剤で全てのプロテアーゼの活動を完全には妨害できるものは無いので、多数の禁止剤のふるい分けが必要とされる。加えて、そのような作用物質は、同様により大きな規模で使用するには往々にして高価である。解裂部位のおよその位置が知られているなら、その後、プロテアーゼ解裂のおよその部位を測るペプチドを含む前に記載した方法を用いて多量の融合たんぱく質を作り出すことができる。この融合たんぱく質、又は融合たんぱく質から調製されたペプチドの添加は、例えば莫大に過剰なプロテアーゼ部位の添加等、集団活動による解裂から問題のたんぱく質を保護する。キャリアーセグメントを含む得られた断片はそれから前に記された幾つかの方法により簡単に除去される。たんぱく質改良酵素及びたんぱく質−たんぱく質相互作用の研究における使用キャリアーたんぱく質複合体の別の用途は、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ等のようなたんぱく質のアミノ酸側鎖を共有結合的に改良する酵素のための基体としてのものである。除去されたキャリアーセグメントと共に、これらのペプチドはそのような酵素の研究において典型的に用いられる標準的な分析の全てにおいて用いられえる。結合されたキャリアーセグメントと共に、ペプチドは実質的に不溶であり、マイクロタイタープレート中の発達分析において利点を有する固体支持物に固定されることが可能である。同様に、ペプチドはたんぱく質−たんぱく質相互作用の研究において用いられることが増えつつあり、その場合、選択されたペプチドは通常、第二のたんぱく質の選択された部位と相互作用する一のたんぱく質の一の部位である。再び、自由な又はキャリアーセグメントに結合されたペプチドの何れかがそのような研究のために用いられる。これらの研究のために記載されたシステムの一つの潜在的な利点は、既知のペプチド配列上の突然変異は、この技術分野で知られた方法を通して択一的にクローン化された配列を調製することにより、又は出発地点として単一のベクターを用いる単一の部位で、幾つかの異なる限定されたアミノ酸を置換できるアンバー抑制発現システム（交換キット、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ，マディソン、ＷＩ）を用いることにより、素早く調製され検査されることである。結合性相互作用によるたんぱく質精製における使用非常に多数のたんぱく質が特定のたんぱく質−たんぱく質相互作用領域を通して互いに相互作用する。配位子がこれらの領域の一つを含むキャリアーたんぱく質複合体は固定されて、問題のたんぱく質を選択的に結合するための結合性モードにおいて用いられる。この方法はまた、用いられたペプチドが、この技術分野で良く知られた技法を用いるペプチドを示す収集のスクリーニングにより同定される場合において用いられる。この使用における利点は、大量の望みのペプチド配列が簡単にそして高価でなく生産され、精製され、そして固定されることである。細胞選別における使用最後に、幾つかの細胞は、増殖、分化、又は他の性質に関してそれらの状態を表示するそれらの表面上の受容体を示す。ペプチド様の配位子がこれらの受容体として知られるならば、キャリアーたんぱく質複合体は混合された集合体から表示された細胞を分離するために用いられる。このことは、複合体の細かい懸濁液と共同混合された細胞を沈殿しながらの、キャリアーたんぱく質複合体で被覆された表面上の細胞の通過、又は疎水性のレジン上の通過により追随される細胞の複合物の希薄溶液との混合、により可能となる。ここで、配位子は特定の細胞型又は生育の特定段階にある細胞に選択的に結合するように適応される。免疫試薬としてのキャリアーたんぱく質複合体の使用抗体の製造本発明はまた、抗体の生産のための免疫原として使用されるように適応されることにおいても役立つ。抗体はポリクローン又はモノクローンである。モノクローン抗体はハイブリドーマ細胞により製造され、ポリクローン抗体はこの技術分野で知られた方法に従いホスト動物中で製造される。キャリアー配列の低い抗原性のため、抗体キャリアーセグメントよりもむしろ問題の配位子に対して抗体は育成されるようである。モノクローン抗体の場合、このことはより高い成就速度とその結果低いコストのスクリーニングを許容する。加えて、キャリアーたんぱく質複合体を伴う免疫化は、合成されたモノクローン抗体のエピトープが前限定されるところでの、天然たんぱく質の注入上で有効である。こうして、実験は、望みのたんぱく質の異なる配位子セグントを含む幾つかのキャリアーたんぱく質複合体を調製し、ホスト動物中に注入し、そして最高の初期ポリクローン抗体タイターを持つ動物を用いてモノクローン抗体を作ることに着手する。更に、この技術を用いる免疫原の投与量は、望みの抗体イソタイプの強化を許容する抗体イソタイプに作用する。本発明は更に、抗原性をもつ本発明の顆粒物に対して育成された抗体の製造に関する。抗体はポリクローン（例えばウサギに抗原を注入して得られた）又は本発明に従いハイブリドーマ細胞により製造されたモノクローンである。顆粒状の抗原は元来多価である。そのため、生体中の免疫化が他の形の抗原に比べてより素早く達成されうるようである。このことはヒトモノクローン抗体の製造を容易にする。ハイブリドーマ細胞は免疫化された動物からのリンホイド器官細胞と腫瘍細胞の融合により調製される。適当に分泌をするハイブリドーマ細胞がその後選択される（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７６）。本発明はまた、幾つかの配位子を融合し、合成キャリアーたんぱく質複合体を配位子に対する抗体を生成するホスト動物中に注入しながら、特定のキャリアーセグメントを活着することによる抗体の製造に関する。この発明の新規性は、配位子が本発明の特定のキャリアーセグメントに融合された場合、配位子に対する抗体が作られえることである。望みのキャリアーたんぱく質複合体がキャリアーセグメントと配位子の組み合わせにより作りだされる。抗体製造のための融合たんぱく質はキャリアーセグメントとペプチドの間の解裂セグメントの必要としない。抗体製造において、キャリアーセグメントからペプチドを分離する必要が無いので、抗原は典型的にはホスト動物にそのまま注入される。実際、キャリアーセグメントはＴ−細胞補助を引き出す必要がある。サブミリグラム量の融合たんぱく質がその後受容体動物中に注入される。キャリアーたんぱく質複合体と抗原としての錯体の投与（注入）上記のように調製された免疫原は非経口的に投与されうる。非経口投与は、例えば皮膚中に物質を注入することにより、皮内に（ＩＤ）；例えば皮膚の下等、皮下に（ＳＣ）；例えば筋肉の内部等、筋肉内に（ＩＭ）；例えば静脈の内部等、静脈内に（ＩＶ）；又は例えば腹腔の内部等、腹腔内に（ＩＰ）実行される。例えば口を通す経口投与は、免疫システムを活性化できる前に、胃内部の消化酵素が免疫原を破壊しないとき．幾つかの状況下で用いられうる。通常、免疫原は、非特異的な免疫反応を増加し、注入部位で抗原を捕獲するため補助薬中に懸濁される。しかし、本発明は付加的な補助薬の必要を回避するために十分な内在する補助薬活性を持つ。免疫原が動物体内に注入されるとき、大部分のキャリアーたんぱく質複合体は注入の地点に残っている。しかし、徐々に抗原は注入の地点から濾し取られ、血液の流れを通って局所リンパ節へ移送される。抗原は注入地点から濾し取ることにより及びその領域の細胞の活動により放出される。免疫細胞は、免疫原をリンパシステム中のその目的地まで移送されるようにする、その領域中の刺激のために、相互作用をする。上で検討したように、サブミリグラム量の免疫原は有用な免疫反応を引き出すのに十分である。この適応量水準は他の方法により調製された免疫原の投与に対し用いられるものに匹敵するが、１０μｇ程度の少量のキャリアーたんぱく質複合体は、補助薬無しで強い体液性免疫反応を引き出すことが示される。低い適応量範囲は異なる配位子に対して変化するが、このことは、この分野で知られた多くの伝統的な方法によるより、ずっと少ない量の補助薬無しの必要とされる免疫原を表す。異なるホスト動物に対してこの分野で知られた通常の免疫化計画はこの発明のキャリアーたんぱく質複合体に対して適当であるが、２００μｇの免疫原の一回の投与もまた、配位子に対する強い体液性免疫反応を引き出すのに効果的であることが示された。このことは、適応量の投薬が技術的に困難で、又は時間を浪費する時に、重要な利益を持ちうる。前に検討したように、キャリアーセグメントは配位子に対するＴ−細胞補助を引き出すためにキャリアーとして、そして結合された配位子に対する補助薬として働く。キャリアーセグメントはまた、共有結合により結合されたものよりむしろ混入された配位子上でもこれらの効果を発揮する。この場合、キャリアーたんぱく質セグメントの希薄な懸濁液は望みの免疫原と共に激しく混合され、錯体がその後ホスト動物中に注入される。ワクチン本発明に従い調製された免疫原はワクチンの調製において有用である。この場合、キャリアーたんぱく質複合体は、例えば環境的毒素からの感染物質又は配位子の抗原のアミノ酸配列の一部を含む。ワクチンは上記の特定の免疫原と、ステリルピロゲンを含まない生理学的なサリンのような生理学的に受容可能な賦形剤からなる。キャリアーたんぱく質複合体中にある配位子は、例えば、ウサギ、ネズミ、ヤギ、ラット、ハムスター、犬、猫、ウシ、羊、鶏、豚、及び人等、何れかの脊椎動物の免疫システムに対し投与されるように適応されうる。配位子をキャリアーセグメントと実質的に結合することは本発明の範囲内である。ワクチン接種のための最適の養生法は、抗体製造に対して上で検討されたものと異なる。抗体精製のためのキャリアーたんぱく質複合体への使用二つの異なる方法が融合たんぱく質を使用した抗体精製に使用されうる。融合たんぱく質からなる封入体は目標配位子に対する粗抗体試料と混合される。溶液はその後、添加された封入体を沈殿するために回転され、洗浄される。この工程は全ての抗体と融合たんぱく質に結合しない血清成分を除去する。封入体に結合する特定の抗体は、その後、この技術分野で良く知られた条件を用いて溶出され、そしてこれらの抗体は、再び封入体を沈殿しそして放出された抗体を除去することにより封入体から分離される。可溶な少量の融合たんぱく質がその後、この技術分野で知られた疎水レジンとの簡単な接触により除去される。逆に、融合たんぱく質は固体支持物に結合されえ、そして固体支持物は、融合たんぱく質と結合する特定の抗体の捕捉を許容するために粗抗体と共に培養される。これらの抗体は、この技術分野で良く知られた溶出技術を用いて、支持物から再び放出される。精製された抗体はそれから、免疫化のために用いられるペプチドによりコード化された抗原配列を含むたんぱく質の精製が可能な結合性精製マトリックスを提供するために、固体支持物の結合されえる。このことは、レジン上の抗体結合への目標たんぱく質を含む粗溶液の培養し、固体支持物の洗浄により束縛されない物質を除去し、そしてその後、レジンへの特異的な結合を持つたんぱく質を溶出することによりなされえる。そのような応用において、配位子含有物質はたんぱく質であるなら、レジンからのたんぱく質の放出の間にたんぱく質の生物学的活性を保持するのに有効である。そのような場合、それらの配位子からほとんどの抗体を放出に用いられる幾つかの条件は、問題のたんぱく質がその生物活性を保持するには過酷すぎるかもしれない。そのため、”ソフトリリース”条件として知られる比較的穏やかな条件下で放出された抗体の一部のみが、結合性レジンの生成にために用いられるべきである。これらは抗原に結合する全抗体の溜めから、融合たんぱく質から抗体を解離させるために、”ソフトリリース”条件を用いることにより分離されうる。このことは、放出された抗体の溜めが初めは穏やかな条件下で抗原から解離する抗体のみを含むことを確実にする。そのような抗体は通常、そのような抗体を生産するモノクローン細胞源の単離の後のみ分離されるので、本発明は末端使用者に対してポリクローン抗体溜めからそのような抗体の分離を容易にすることにより、別の利益を提供する。分析／診断薬本発明はまた、診断的な分析での使用のための診断薬の製造において有用である。キャリアーセグメントと配位子の組み合わせからなるキャリアーたんぱく質複合体は、試験管、マイクロタイタープレート、液溜め、油量計、膜等の多様な固体支持物上に吸収されうる。分析において利用される固体支持物はこの技術分野で良く知られている。固体支持物の例は、固体支持物の記載のための例によりここで具体化されるＢｏｌｌｉｎｇ他のアメリカ特許第５，３２２，７６９号中に見いだされえる。そのような支持のための実験物質は、ポリスチレン、ポリエチレン及びポリブチレンのような炭化水素高分子を含む。典型的には、マイクロタイタープレートは生成された抗原又はキャリアーたんぱく質複合体で被覆される。さらに、前もって、キャリアーたんぱく質複合体に対して特異的なモノクローン抗体で被覆されたマイクロタイタープレートは、それらを捕捉するために用いられうる。診断薬は多様な用途を有する。例えば、特定の分析物に対する抗体を持つと推定される検査試料及び蛍光性の酵素若しくは放射性物質で標識された抗体は固体支持物上の特定のキャリアーたんぱく質複合体と競争的に反応されて、固体支持物上の特定の抗原に結合する放射性物質で標識された抗体の量が測定される。特定のキャリアーたんぱく質複合体はまた、抗体との凝集反応のために有用である。本発明のキャリアーたんぱく質複合体を伴う使用に適する他の分析は、そのうちの幾つかが以下の章で記載され、この特定の技術分野における知識を伴うものの範囲内にある。免疫分析の型抗体及び／又はキャリアーたんぱく質複合体が、モノクローン抗体、ポリクローン抗体、及び可溶な受容体を組み合わせて用いられた本発明の工程により作られるＥＬＩＳＡ工程がまた、期待される。これに対する利点は、キャリアーたんぱく質複合体及びそれに続く抗体の製造及び精製が通常の条件下に比べ非常に素早くなされることである。キット本発明はまた、記載された工程中で利用されたキットに関する。キットは、たんぱく質精製、エピトープを地図上に示すこと、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇのような技術による検出、免疫化学（ＩＣＣ）、免疫分析、及びＥＬＩＳＡを含む広範で多様な技術における使用のために、並びにたんぱく質／たんぱく質相互作用の研究における使用のために、キャリアーたんぱく質複合体を生成し、ペプチド／たんぱく質の特定の抗体を確実に作るのに適する。基本的なキットは、天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列である本発明の融合たんぱく質キャリアーセグントを含む容器と使用のための指示書を含む。好ましくは、抗原性の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントは、少なくとも約６５アミノ酸長を有する天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列であり、該アミノ酸配列は、負若しくは正電荷を持つ側鎖の以下のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミン酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つの追従アミノ酸を欠いている。特に、癒合たんぱく質キャリアーセグメントは図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕に示されるようなアミノ酸配列又は図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕に示されるようなアミノ酸配列である。キットの第二実施例はキャリアーたんぱく質セグメントをコード化するベクターとそれの使用のための指示書を含む。そのような指示書は、鶏、ネズミ又はウサギのようなホスト動物の免疫化のために十分な量で、選択のペプチド抗原を含む融合たんぱく質の単純なクローン化、発現及び精製のためのもの、並びに抗体溜めをもたらすスクリーニングのためのものを含む。顧客は問題のペプチド配列に対応するＤＮＡ配列中でクローン化する。理想的には、製造された融合たんぱく質は、従来技術により製造されたものと競争しうる程度に又はより良く抗原反応を生成するために補助薬又は第二のキャリアーたんぱく質無しに動物中に注入されるうる。キット中の様々な試薬の量は、工程の最適感度のような要因の数に依存して変化しうる。使用のための指示書は、エンドユーザーが望みの試験を実施することができるように適切なものである。語句”使用のための指示書”により、少なくとも一の分析方法のための試薬濃度、試薬と添加混合されるための試料の相対量のようなパラメーター、試薬／試料の混合のための保持時間、温度、緩衝条件等を記載する実体的な表現を意味する。マニュアル方式の試験キット又は自動分析装置での使用のための試験キットの提供はこの発明の範囲の中にある。キットにかかる第三実施例は特定の抗原に対する抗体の検出のための方法である。そのようなキットは、少なくとも一の分析に対して十分な量で、典型的には以下の品目を含む。１．固体支持物：望みの抗体と特異的に反応する一又はそれ以上のキャリアーたんぱく質複合体をそこから結合する固体支持物。好ましくは、そこへ結合された適当なキャリアーたんぱく質複合体を持つ前もって形成されたマイクロタイタープレートである。２．結合しないたんぱく質を取り除くための緩衝剤３．結合分析物の検出のための溶液４．使用のための指示書キットにかかる第四実施例は、テスト試料中で融合たんぱく質に結合するたんぱく質の存在の検出における使用のための試験キットに関する。試験キットは、キャリアーセグメントが天然には存在しない、疎水性の、ほとんど不溶のアミノ酸配列を構成する融合たんぱく質を持つ容器と指示書からなる。時々分析物と呼ばれる抗原はここで、試験試料中で検出されるための物質である。抗原は、抗体のような天然に存在する特異的な結合部分に対して存在する物質でありうる。分析物は分析における一若しくはそれ以上の特異的な部分に結合できる物質でありうる。例以下の例は本発明の利点を説明するため及び同じものを作りそして使用することにおいて通常の技術の一つを助けるために提供される。例は、この特許により容認される開示又は保護の範囲を違ったやり方で限定する何れの点においても意図されない。例１天然に存在するたんぱく質からのキャリアーたんぱく質セグメントの形成問題の出発たんぱく質は分子量約３５ｋＤの通常のたんぱく質であるファージＴ７の因子１０たんぱく質であった。Ｐ５０試験抗原〔ＳＥＱ．ＩＤ．４〕と損なわれていない因子１０たんぱく質の試験融合が調整され、ウサギに注入された。ウサギにより大量に製造された抗体は融合たんぱく質の因子１０部分と反応し、試験抗原とは反応しなかった。この構造物（Ｌｉｎ他，１９８７の方法に従う）はここで記載された低い抗原性のために基準となれないので、因子１０たんぱく質の一の片の配列は望みの特性を得るために以下で検討されるように再設計された。ベクターのクローン化の詳細は例２の中に示された。この例は、用いされたアミノ酸の選択をもたらす設計過程を記載する。以下で記載されるように、その意図は、高く発現され不溶となりうるように短いペプチド配列を作りだすことであった。６５アミノ酸（キャリアーセグメントにポリリンカーを加えて）のたんぱく質の形成の最初の試みは成功しなかったが、設計された配列の３７の付加アミノ酸が加えられたとき、発現は成功した。ポリリンカー付加の部位（Ｐｖｕ２部位、図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕）に近いｐＧＥＭＥＸ−１アミノ酸配列の原配列は：（Ｈ₂Ｎ）−ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＴＮＱＧＫＧＶＶＡＡＧＤＫＬＡＬＦＬＫＶＦＧＧＥＶＬＴＡＦＡＲＴＳＶＴＴＳＲＨＭＶＲＳＩＳＳＧＫＳＡＱＦＰＶＬＧＲＴＱＡＡＹＬＡＰＧＥＮ−（ＣＯＯＨ）〔ＳＥＱ．ＩＤ．６〕である。図３中に示された新たな配列を設計することにおいて、本発明の記載の章中の設計指示に従う改良は以下のように作られた。たんぱく質は既に非常に疎水性であったので、アミノ酸の疎水性における大きな変化は必要とされなかった：例２確かなベクター構造物によるたんぱく質の製造ｐＭＫ１３６の生成（図３のＡＡＳ１−４１と７９−１０２からなるクローン）以下の配列のオリゴヌクレオチドが標準の手段により合成された：ＭＫ９５’ＧＧＣＴＧＡＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧＧＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．６〕ＭＫ１０５’ＧＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．７〕オリゴヌクレオイドは、二つのオリゴヌクレオイドの３’末端の３位ｂｐの重複部分を用いて、”プライマー二量体反応”によりＴａｑＤＮＡポリメラーゼと二量化されうるように設計される。重複する部位は、二量体の重複部分の保全を確認するようにユニークな一齢部位を含むように設計された。二量化反応は、５０ピコモルの各オリゴヌクレオチド、１μｌのＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、標準緩衝剤、Ｍｇ，及びヌクレオチド水準、及び３０秒間の９５°Ｃで追従される７０°Ｃでの３０秒間からなる３５回の温度サイクルの存在化でなされた。１５回の１００μｌ反応の生成物は溜められ、１０％の天然ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により二量体は精製された。二量体ＤＮＡは一晩中受動的に溶出され、フェノールで抽出され、エタノールで沈降された。二量化されたオリゴの末端は標準緩衝剤中で分解酵素Ｎｈｅ１及びＸｈｏ１で刈り込まれたが、その反応は天然のＰＡＧＥゲルにより観察された。ＰＧＥＭＥＸ−１ベクター（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ，製品＃Ｐ２２１１）は分解酵素Ｎｈｅ１及びＸｈｏ１で切断され、フェノール抽出とエタノール沈降により精製された。刈り込まれた二量体はそれからＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて切断ベクター中に連結され、それから連結生成物は、製造元の薦めるプロトコルを用いて、バクテリア菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（標準Ｔ７発現菌株、ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ，マディソン、ＷＩ、製品＃６９４５１−２）を転換するのに使用された。細胞はＬＢ−ａｍｐプレート上に着せられ、３７°Ｃで一晩生育された。コロニーはＬＢ−ａｍｐ液体培養中に浸け入れられ、そしてプラスミドは標準の技術による適正な挿入のために精製されて分析される。一つの正のクローンであるｐＭＫ１３６からプラスミドへ向かう問題の領域を横断するＤＮＡ配列は標準の技術により正確であると決定される。得られた菌株中のたんぱく質の発現はＳｔｕｓｉｅｒ他の１９９０年の批評記事中に記載された条件を用いて試験された。例はまた、発現システム中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用をカバーするＳｔｕｓｉｅｒ他のアメリカ特許第４，９５２，４９６号による。得られたクローンは、０．５ｍＭのＩＰＴＧを伴い誘導されたＬＢ−ａｍｐ媒体中で生育され、たんぱく質生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。重要なたんぱく質の発現は検出されなかった。こうして、キャリアーセグメントをコード化するベクターの製造におけるこの第一の試みは、コード化されたたんぱく質の短い長さのために多分失敗した。この場合のコード化されたたんぱく質は、Ｐｖｕ２部位の前に４１アミノ酸、そしてポリリンカーにより２４アミノ酸がコード化されて、６５アミノ酸長である。この章で作りだされたプラスミド、ｐＭＫ１３６は、成功したベクター、ｐＭＫ１４９の形成のための出発地点として用いられ、そしてそのためこの記載中に含まれる。ｐＭＫ１４４の形成（図３中に描写されたクローン）ｐＭＫ１３６中にクローン化する前に、第一段階はｐｌｙｓＳプラスミドを取り除くことである。これは、ＥｃｏＲＶを持つｐＭＫ１３６からのプラスミド試料を消化し、バクテリア菌株ＪＭ１０９（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，マディソン、ＷＩ、製品＃Ｌ２００１）中に転換し、ＬＢ−ａｍｐ上に着せられ、そしてコロニーのクロラムフェニコールに対する耐性及びアンピシリンに対する耐性の欠如を試験することにより達成される。プラスミド試料は一つのそのようなコロニーから作られ、Ｐｖｕ２とともに標準の条件下消化される（反応はアガロースゲル電気泳動により観察された）。以下の配列の二つのオリゴヌクレオチドは標準的手段により合成される：ＭＫ１５５’ＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＡＣＧＧＡＧＧＴＡＴＧ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．８〕ＭＫ１６５’ＣＡＴＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．９〕二つのオリゴヌクレオチドが室温までのゆっくりした冷却が引き続き行なわれる５分間の９５°Ｃまでの加熱によりお互いに雑種形成され、その後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて切断ベクター中に連結され、それから連結生成物は、製造元の薦めるプロトコルを用いて、バクテリア菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（標準Ｔ７発現菌株、ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ，マディソン、ＷＩ、製品＃６９４５１−２）を転換するのに使用された。細胞はＬＢ−ａｍｐプレート上に着せられ、３７°Ｃで一晩生育された。コロニーはＬＢ−ａｍｐ液体培養中に浸け入れられ、そしてプラスミドは標準の技術による適正な挿入のために精製されて分析される。一つの正のクローンであるｐＭＫ１４４からプラスミドへ向かう問題の領域を横断するＤＮＡ配列は標準の技術により正確であると決定される。同様の菌株、ｐＭＫ１４９は前述のＥｃｏＲＶ消化技術によりｐｌｙｓＳプラスミドを欠くＪＭ１０９中で作りだされた。これらの細胞からのプラスミドは全てのその後のベクタークローン化のために配列され使用された。ｐＭＫ１４４菌株中のたんぱく質の発現はＳｔｕｓｉｅｒ他（１９９０年、前記）による批評記事中に記載された条件を用いて試験された。例はまた、発現システム中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用をカバーするＳｔｕｓｉｅｒ他のアメリカ特許第４，９５２，４９６号による。得られたクローンは、０．５ｍＭのＩＰＴＧを伴い誘導されたＬＢ−ａｍｐ媒体中で生育され、たんぱく質生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。例２中で検討されたように、この菌株からの発現は良く、そして図３中に記載されたキャリアーたんぱく質セグメントであり、キャリアーセグメント／ポリリンカーセグメント発現ベクターのための発明の好ましい実施例として働く。ｐＭＫ１６０の形成（ｐＭＫ１４４のポリリンカー中へのｐ５０Ｎ−末端エピトープペプチドコード化配列の挿入）プラスミド試料は一つのそのようなコロニーから作られ、そして標準の条件下でＨｉｎｄ３及びＮｏｔ１と共に消化された（反応はアガロースゲル電気泳動んいより観察された）。以下の配列の二つのオリゴヌクレオチドが標準の手段により合成され、これらは、ペプチドとキャリアーセグメントの間の接合部（ＬｙｓＣを伴う試験解裂の使用可能）の付加的なリシンと、パプチドセグメントの端のアンバー変異停止コドンを伴い、真核性の転写因子ｐ５０のＮ−末端配列である、１５−ｍｅｒペプチドの合成をコード化した。ＭＫ１９５’ＧＧＣＣＡＡＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＴＡＧ３ ’〔ＳＥＱ．ＩＤ．１０〕ＭＫ２０５’ＡＧＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＴＴ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．１１〕二つのオリゴヌクレオチドが室温までのゆっくりした冷却が引き続き行なわれる５分間の９５°Ｃまでの加熱によりお互いに雑種形成され、その後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて切断ベクター中に連結された。連結生成物はそれから、残りの元のままのベクターを直線化する標準の条件の下でＳｐｈ１を伴い切断され、その後、連結生成物は、製造元の薦めるプロトコルを用いて、バクテリア菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（標準Ｔ７発現菌株、ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ，マディソン、ＷＩ、製品＃６９４５１−２）を転換するのに使用された。細胞はＬＢ−ａｍｐプレート上に着せられ、３７°Ｃで一晩生育された。コロニーはＬＢ−ａｍｐ液体培養中に浸け入れられ、そしてプラスミドは標準の技術による適正な挿入のために精製されて分析される。一つの正のクローンであるｐＭＫ１４４からプラスミドへ向かう問題の領域を横断するＤＮＡ配列は標準の技術により正確であると決定される。ｐＭＫ１６０菌株中のたんぱく質の発現は上記の条件を用いて試験された。ｐＭＫ１９０−２１０の形成以下の発現及び好ましい例中で用いられたこれらの構成物はクローン化とｐＭＫ１６０のために用いられたのと戦略的にとても類似する発現により作りだされた。特に、問題の、そしてＮｏｔ１−Ｈｉｎｄ３の部位中へのフレーム内のクローン化と適合する端を持つ、二つの補足的なオリゴヌクレオチドが形成された。オリゴの唯一の特別な特徴は、それらが、Ｈｉｎｄ３接合部の新たなＮｈｅ１部位を作りだすために一つの端に３つの特別なヌクレオチドを伴って設計されたことである。Ｎｈｅ１を伴う挿入されて含有するプラスミドの消化は約３００ｂｐの断片を遊離したので、これは挿入のためのスクリーニングをより簡単にさせる。一方、クローン化と発現は上記記載の標準プロトコル通りであった。図３中のキャリアーセグメント／ポリリンカー限定に対してベクターコード化たんぱく質を比較することに関する一般的な記載例の中で使用される全ての融合たんぱく質が誘導されるｐＭＫ１４４発現菌株とｐＭＫ１４９発現ベクターは融合たんぱく質のキャリアー／ポリリンカーセグメントに対するコード化されたアミノ酸配列において正確に対応しない。原ベクターにおいて、第一の転写終了コドンはアミノ酸ｌｅｕ１０２の後で出会う。例えばｐＭＫ１６０で、例において用いられた融合たんぱく質の形成において、問題のペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドはＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位中にクローン化され、望みのペプチドの最後のアミノ酸の後に停止コドンを含んだ。図３中の配列のアミノ酸９５−１０２中のこのクローン化の戦略的結果は融合たんぱく質中に発現されていない。図３中のアミノ酸９６はシステイン残基であるので、スルヒドリル反応性試薬を用いてキャリアーセグメントに配位子を結合させたければ、そのようなベクターを使用可能である。一方、ジスルフィド結合の形成に伴う問題を避けるためにポリリンカー中の何処かに停止コドンを挿入することは得策である。融合たんぱく質を含むキャリアーセグメントの発現と精製５０ｍｌのＬＢａｍｐの振動フラスコに、各発現菌株の１−５μｌのグリセロール株が蒔かれ、３７°Ｃで一晩育成された。朝に、一晩の培養液の３０ｍｌが室温で１，０００−４，０００ｘｇで５−１０分間遠心分離された。それぞれの培養液からの沈殿物はその後、前もって３７°Ｃに温められていたＬＢ−ａｍｐを含む１Ｌの培養液中に移され、０．５−１．０の６００ｎｍでの最適密度が達成されるまで（蒔かれてから３−４時間後）、振とうされながら培養された。そのとき、発現を導くためにＩＰＴＧが０．５ｍＭまで添加され、細胞は導入後３−４時間振とうがなされた。試料は希望に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために取られた。この後、細胞は１０分間以上の間の３，０００−５，０００ｘｇでの遠心分離により収穫された。細胞はその後、直接に処理され、又は使用する前に −７０°Ｃで２週間近くのあいだ貯蔵された。細胞は４０ｍｌの緩衝剤Ａ（ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ，１３０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁され、１００ｍｌの樹脂性ビーカーに移され、５分間氷水上で冷却され、その後（氷水槽中のまま）３分間、標準のマクロチップを備えたＳｏｎｉｃｓａｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓのＶＣＸ６００音波発生器で、５５％の電力設定（約３３０ワット）で０．５秒のオンと０．５秒のオフを行いながら、音波処理された。細胞破壊が極大化するするように泡立ちは避けられた。音波処理後、４．５ｍｌの２０％ナトリウムデオキシコレートが添加され、試料は再び３０秒間音波処理された。溶解産物はその後、遠心分離管に移され、４−１０ °Ｃで１０分間１５，０００−２０，０００ｘｇ（ＪＡ１８ローター）で回転された。上澄み液は捨てられ、緩衝剤Ａ中の２％のナトリウムデオキシコレートでの付加的な第二の洗浄が望みに従い行なわれ、その後、沈殿物は１ｍＭのＤＴＴと１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むｐＨ７．４のリン酸イオンで緩衝されたサリン中で簡単に音波処理されて再懸濁された。（注：若干劣る純度で微量のデオキシコレートを含む物質を得ることを望むならば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００段階は省略されてよい。）前のように試料は沈殿され、その後、賦形剤を欠いているリン酸イオンで緩衝されたサリンで少なくとも１ｘ洗浄され、それから１０ｍｌの同じ緩衝剤中に再懸濁される。精製された融合たんぱく質又はキャリアーセグメントはその後、希望するなら使用前に６カ月程度の期間の間−２０°Ｃで貯蔵され、そして、注入のために準備される。幾つかの場合、長い期間貯蔵された試料は、注入の前に細かい懸濁を再生産するために音波処理をされる必要がある。発現結果：たんぱく質は例３中の記載に従い分析された。発現結果はこの段落の後にある表１の一部の示された。表１は、融合されたペプチドのアミノ酸配列を含んで、記載された発明とそこからの幾つかの特性を用いて製造された融合たんぱく質の例、融合ペプチドの大きさと価電子数、水溶液中の溶解性と逆相ＨＰＬＣによる保持時間、細胞が導入され収穫された所での目視密度、及びｍｇ／リットル単位の融合たんぱく質の収量を提供する。表１は菌株番号、ペプチドが選択される親たんぱく質、ペプチドに結合されたアミノ酸の数、中性水溶液中の結合されたペプチドの価電子数、細胞が導入された（もし第二の番号あれば、それは収穫された）所での目視密度、及びＬＢａｍｐ培養液媒体の１リットルから分離された融合たんぱく質のミリグラム数を表示する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣによる検出されたように、ｐＭＫ１３６中のプラスミドによりコード化されたたんぱく質の測定可能な発現はほとんど又は全く無かった。より長いキャリアーセグメントベクターｐＭＫ１４４からの発現は相当に大きく（１１ｍｇ／Ｌ）、そしてそれから誘導された全ての融合たんぱく質の発現は５ｍｇ／Ｌ培養液よりも高かった（６−７１ｍｇ／リットルの範囲であり、中心値は２７ｍｇ／リットル、標準偏差は１６ｍｇ／リットル）。例３キャリアーセグメントと融合たんぱく質の純度と特性の分析たんぱく質分析：融合たんぱく質懸濁液の試料は同量の氷酢酸中に溶解され、その後５０％酢酸で１：５まで更に希釈された。希釈溶解試料はそれから、たんぱく質濃度標準として５０％の酢酸中に希釈されたウシ血清アルブミンを使用したＰｉｅｒｃｅＣｏｒｐ社のクーマジープラス分析試薬を用いて分析された。１０μｌの試料が２００μｌの試薬に添加され、その後吸収は５９５ｎｍで読み取られた。純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：融合たんぱく質懸濁液の試料が緩衝剤を充填した９倍量の４ｘラエムリＳＤＳゲル中に溶解され、９５°Ｃで５分間加熱され、その後、上記の分析により同定された２０−４０μｇのたんぱく質がＮｏｖａｘ４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に積まれる（１０ウェルのコーム）。流れる緩衝剤は溶液中に融合たんぱく質を維持するために、通常の０．１％の代わりに０．２−０．３％のＳＤＳを含む。生産者の標準の条件による電気泳動後、ゲルは標準の方法の通りに、クーマジーブルーで染色される。ゲルは、全体のたんぱく質の１０％より少ない領域での混入物の帯と共に単一の主な帯を示す。純度と保持時間のＨＰＬＣ分析：試料は酢酸中でのたんぱく質分析のためのもののように調製され、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析された。固定相はＶｙｄａｃＣ−１８ＴＰカラムで１０ｕＭのシリカ、４．６ｘ２５０ｍｍの容積である。移動相は標準であり（水／アセトニトリル中に０．１％のトリフルオロ酢酸）、流速は１ｍｌ／分、そして検出器は２５４ｎｍ、０．３ＡＵＦＳでのＵＶ吸収によるものであった。２０μｌの試料は注入され、そしてアセトニトリル２０％−６０％の４０分間での一次の勾配を伴い溶出された。結果は図５Ａと５Ｂ（ＨＰＬＣ）と数値を用いて表１（前の）に示される。保持時間は２９．６から３３．１分まで（アセトニトリル５０ −５４％）変化し；この大きさのたんぱく質に対する非常に遅い溶出はそれらの高い疎水性を示している。酢酸による注入部での大きなピークと、酢酸中の不純物によるものとして示されうる小さな背景のピーク以外のに、発現されたたんぱく質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に一致して、単一のシャープなピークとして溶出した。溶解性のＨＰＬＣ分析：幾つかの融合物の試料は、上記のたんぱく質分析により同定されたように飽和に到達するまで、イオン性のリン酸で緩衝されたサリン中で４°Ｃで数日間攪拌しながら保持がなされる。たんぱく質標準はｐＭＫ１６０からのたんぱく質の酢酸可溶化試料を、それが約１００μｇ／ｍｌであると評価されるまで、希釈することにより調製される。これは、上記のたんぱく質分析によるたんぱく質濃度の確定の後（最終濃度は９５μｇ／ｍｌ）部分標本にされる。６から０．７５μｇ／ｍｌまでの連続の２倍希釈の一系列が上記のようにＨＰＬＣにより定量分析され、ピーク高さが測定され、標準曲線がプロットされる。飽和された融合たんぱく質の試料は同一量の氷酢酸で希釈され、ｐＫＭ１６０試料に比較してＨＰＬＣにより定量分析される。ピーク溶出位置は融合物から融合物まで少しづつ変化したが、ピーク形状は、図５Ａと５Ｂ中に見ることができるように、とても均一であった。表１中に示された結果は、基本たんぱく質（上記のように広がりを持って）と融合物の溶解性は０．８−４．７μｇ／ｍｌの範囲にあることを示す。ペプチド融合物の大きさは１４−１９アミノ酸の範囲で試験され、そして中性ｐＨでの価電子数は−３から３までの範囲であった。たんぱく質の大きさのＦＡＢ−ＭＳ分析：ｐＭＫ１６０から精製された融合たんぱく質の精製された試料は、ＫｒａｔｏｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ラムゼー、ＮＪ）の、彼らのコンパクト高速原子衝撃質量スペクトロメータのデモンストレーション操作用に従った。彼らの標準の方法により分析され、図５Ｂ中に示されたように、主な種（Ｍ＋１）の検出された分子量は、ベクターの配列から導かれた１１，０８６に対し、１１，０８８であった。この差異は装置の誤差範囲内である。例４固体表面へのキャリアーたんぱく質複合体の固定間接的ＥＬＩＳＡ（図６に図示されて説明された酵素結合された免疫吸着剤分析）が、固体表面上に固定化されることのキャリアーたんぱく質複合体の能力を利用して行なわれた。簡単には、ｐ５０たんぱく質配列から誘導されリン酸緩衝されたサリン（ＰＢＳ）中に懸濁された可溶なキャリアーたんぱく質複合体が、９６のウェルのプレート上に被覆され１４−１８時間４°Ｃで培養される。プレートのウェルは０．２％から２０の間で含有されるＰＢＳを用いて４回洗浄され、その後、たんぱく質の非特異的な結合を遮るために１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミンの溶液を伴い１時間培養された。被覆され防御されたウェルはその後、室温で１．５時間様々な濃度の試料を培養することにより特定抗体の滴定濃度のために免疫グロブリン試料を分析するのに用いられた。特定の抗体結合の量は反− 鶏抗体複合物を用いて適当な基体と反応を発生させることにより検出された。比色反応の目視の密度は、ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体への特定の抗体の結合の量と直接に相関する。例５動物へのたんぱく質の注入と動物による問題の配位子に対して専制的に直接結びつく抗原反応の発生雌性ＢＡＬＢ／ｃネズミ（各グループ３匹）が、同量（１００μｌ）の完全なＦｒｅｕｎｄの補助薬中に懸濁されたｐ５０キャリアーたんぱく質複合体の注入毎の１００μｇでＩＰで免疫化された。ネズミは４週間の間隔を持って２回、不完全なＦｒｅｕｎｄの補助薬中の同量の免疫原で追加免疫された。最後の注入後２週間でネズミは安らかに殺傷され血清が集められた。血清中の特定抗体の滴定濃度は間接的なＥＬＩＳＡで分析された。キャリアーたんぱく質（基本）で被覆されたウェルからの結果はｐ５０キャリアーたんぱく質複合体（１６０／ｐ５０）で被覆された隣接するウェルからの結果と比較された。濃度毎のグループ毎に平均ＯＤとして図７中に示されたこれらの結果は、特定の抗体のほとんど大多数が問題のペプチドに対して選択的に直接結び付けられていることを表す。例６補助薬無しに抗体が製造されることを許容するシステムの能力キャリアーたんぱく質とｐ５０から誘導されたペプチドセグメントの間に作られた融合たんぱく質に対するネズミの抗原反応は様々な補助薬と共にそしてそれ無しに評価された。実験は前に示された例中に記載されたのと同じ注入のやり方を用いて管理された。６種の異なる補助薬が、同一量（１００μｇ）のｐ５０キャリアーたんぱく質複合体単独（１ｘＧｅｎｉｅ）及び２００μｇのｐ５０キャリアーたんぱく質複合体単独（２ｘＧｅｎｉｅ）での注入との比較のために用いられた。６種の異なる補助薬のグループは、追加免疫で不完全なＦｒｅｕｎｎｄの補助薬により追従された原発の免疫化を伴う完全なＦｒｅｕｎｄの補助薬（ＣＦ／ＩＦ）、原発の免疫化での完全なＦｒｅｕｎｄの補助薬と追加免疫での補助薬の無添加（ＣＦ／ｎｏｎｅ）、注入毎に０．２ｍｇのミョウバンと１μｇのサポニンの溶液（ＩＳＣＯＭ）、注入毎に０．４ｍｇのミョウバン（Ａｌｕｍ）、注入毎に２．５ｍｇの硫酸デキストラン（ＤｅｘｔｒａｎＳｕｌ）又は注入毎に０．７ｍｇポリ〔Ｉ，Ｃ〕（ＰｏｌｙＩＣ）からなる。Ｆｒｅｕｎｄの補助薬を伴う免疫化及び免疫原無しの場合が負の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いられた。全ての場合において、同一量の補助薬（１００μｌ）が免疫原と共に用いられた。補助薬無しの注入（１ＸＧｅｎｉｅ及び２ＸＧｅｎｉｅ）はまた、発熱原の無いサリン溶液を用いて量を標準に合わせられた。処理グループ毎の３匹のネズミの血清滴定濃度が最後の追加免疫の２週間後に間接的ＥＬＩＳＡにより評価された。図８中の結果は、キャリアーペプチド複合体単独で免疫化されたネズミの特定の抗体反応は補助薬中に懸濁された免疫原用いて注入されたネズミのそれに匹敵することを示す。例７広範な抗原投与量範囲を覆う抗原反応の刺激例７はキャリアーたんぱく質とｐ５０から誘導されたペプチドセグメントの間に作られた融合たんぱく質の様々な投与量に対するネズミの抗原反応に関する。ネズミは前に記載されたように４週間間隔で３回、１００μｇの抗原がＩＰで注入された。最後の注入に続く２週間後、ネズミは安らかに殺傷され血清が集められた。ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体に対する抗体の血清の滴定濃度は間接的なＥＬＩＳＡで分析された。結果は、処理グループ毎に３匹のＢＡＬＢ／ｃネズミからの血清の平均ＯＤ₄₁₀として表される。図９Ａは１００μｇ−１０μｇ（１ｍｇ／ｍｌ −０．１ｍｇ／ｍｌに対応する）のＦｒｅｕｎｄの補助薬（原発では完全で、各追加免疫では不完全）中に懸濁されたｐ５０キャリアーたんぱく質複合体で免疫化されたネズミからの抗体滴定濃度を示す。図９Ｂは補助薬無しで２００μｇ− １０μｇ（２ｍｇ／ｍｌ−０．１ｍｇ／ｍｌに対応する）の融合ペプチドで免疫化されたネズミからの抗体滴定濃度を示す。これらの結果はキャリアーたんぱく質複合体は、補助薬を伴う又は無しの広い範囲の投与量の強い免疫反応を刺激することができることを表す。補助薬のみで免疫化されたネズミ（ａｄｊ．ｏｎｌｙ）は負の対照として用いられた。例８一回の注入で有効な抗体反応を引き起こすためのシステムの能力雌性ＢＡＬＢ／ｃネズミが、キャリアーたんぱく質とｐ５０から誘導されたペプチドセグメントとの間に作られた融合たんぱく質の一回の２００μｇ（２ｍｇ１ｘ）の注入でＩＰで免疫化された。比較のため、齢と性の適合したＢＡＬＢ／ｃネズミが、全て前に記載されたような、Ｆｒｅｕｎｄの補助薬中の１００μ ｇのｐ５０たんぱく質キャリアー複合体（１ｍｇ＋）又は補助薬無しの２００μ ｇ（２ｍｇ）若しくは１００μｇ（１ｍｇ）の免疫原の３回の初めの注入で免疫化された。補助薬のみで免疫化されたネズミ（ａｄｊ．ｏｎｌｙ）は負の対照として用いられた。最後の注入に続く１０週間後、ネズミは安らかに殺傷され血清が集められた。ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体に対する抗体の血清の滴定濃度は間接的なＥＬＩＳＡで分析された。結果は、処理グループ毎に３匹のＢＡＬＢ／ｃネズミからの血清の平均ＯＤ₄₅₀として表される。図１０中に示されるように、研究の開始時に一回の注入を受けたネズミは、重大な特異的な抗体反応を１０週間後有した。滴定濃度は補助薬を伴い又は無しの多数回の追加免疫を受けた別のネズミのそれに匹敵するものであった。例９多様な脊椎動物種の免疫化と免疫経路を持つ本発明のシステムを使用するポリクローン化抗体の製造システムの多様な応用性を示すために、ネズミ、ウサギ及び鶏がＦｒｅｕｎｄの補助薬中の本発明のｐ５０たんぱく質キャリアー複合体で免疫化された。雌性ＢＡＬＢ／ｃネズミと雌性ニュージーランド白ウサギが、それぞれＩＰ及ＳＣ経路を経て３週間の間隔により３回の注入で免疫化された。最後の注入に続く２週間後、動物は安らかに殺傷され血清が集められた。卵を生む雌鶏である白色レグホンは４週間のＩＭ注入により免疫化された。卵は、卵黄からの抗体の分離のために最後の注入の後１週間後に採取された。ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体に対するそしてキャリアー（基本）セグメントに対する動物の特定の抗体の滴定濃度は例４で記載された間接的ＥＬＩＳＡにより決定された。図１１Ａは、ＩＰ経路の注入により免疫化されたネズミの血清中の問題のペプチドに対する特定の抗体の高い滴定濃度を示している、分割された決定の平均滴定濃度を示す。同じｐ５０キャリアーたんぱく質複合体を用いてＳＣ経路を経て免疫化されたウサギの特定の抗体反応は図１１Ｂ中に示された。同様に、高い滴定濃度が問題の配位子に対して達成された。同様に、ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体を用いてＩＭで免疫化された鶏の特定の抗体反応は、分子の配位子部分に対して優占的に結合された（図１１Ｃ）。まとめると、これらのデータは、異なる経路の注入を用いた多様な脊椎動物種におけるこのシステムの有効性を表す。例１０免疫原のために用いられる配位子と配位子が誘導される全長たんぱく質の両方を認識するこのシステムを用いたポリクローン化抗体の製造本発明の別の重要な用途は、ペプチド配位子がそこから誘導される全長たんぱく質に結合する抗体を製造することである。この用途を検証するために、抗体は、例６中に記載されたように多様なエキソゲノート補助薬と共に及びそれ無しにｐ５０キャリアーたんぱく質複合体を用いてネズミ中で生産された。これらのネズミの血清からの特定の抗体は、ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体に対する抗体の結合形成を隣接するウェル上に被覆された全長ｐ５０たんぱく質のそれと比較しながら、以前に記載のように間接的ＥＬＩＳＡにより評価された。図１２中に示されたように、ｐ５０キャリアーたんぱく質複合体（ペプチド）に対する抗体の結合形成はｐ５０たんぱく質（たんぱく質）のそれに匹敵した。全長たんぱく質への結合形成における実際の少しの増大は、特定の抗体の小さい部分がキャリアーたんぱく質複合体のキャリアー部分への結合形成することによるらしい。結果は、処理グループ毎の３匹のネズミの平均±ＳＤＯＤ₄₁₀として表された。例１１ペプチド特異的なポリクローン化抗体及びペプチド特異的なソフトリリースポリクローン化抗体の高比率の製造白色レグホン雌鶏（鶏）が、前に記載されたように、Ｆｒｅｕｎｄの補助薬を用いてガンマ普通鎖たんぱく質から誘導されたキャリアーたんぱく質複合体の４回の週間毎のＩＭ注入で免疫化された。卵は最後の免疫化の後数週間で採取され、ＩｇＹ抗体が逐次沈降により卵黄から精製された（ＩｇＹｆｘ）。特定の抗体は、アガロース樹脂に結合された免疫原を用いるＩｇＹフラクションの結合性クロマトグラフィーにより精製された。ソフトリリース抗体はｐＨ６．９（ソフトリリース）の２ＭのＭｇＣｌで溶出され、一方全体の特定の抗体はｐＨ３．０（ハードリリース）の３ＭのＭｇＣｌを用いて溶出された。特定抗体滴定濃度は間接的ＥＬＩＳＡにより評価された。例は結果に対し図１３に作られた。７．６％の全体の特定の抗体（ソフト及びハード−リリース）並びに１．５％の特定のソフトリリース抗体を示す。例１２ネズミの脾部分の対する融合ペプチドの分裂促進能力免疫化されてない雌性ＢＡＬＢ／ｃネズミの脾臓が取り出されて糖衣ガラススライドを用いて均散された。細胞が、１０％の胎じウシ血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０中１０⁶ｃ／ｍｌで再懸濁された。細胞懸濁液は９６ウェルの平底プレート（１００μｌ／ウェル）中で培養され、媒体単独（ｎｏｎｅ）又は５ μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ、１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ，５μｇ／ｍｌのＬＰＳ若しくは５μｇ／ｍｌのｐ５０キャリアーたんぱく質複合体を含む媒体中で３７°Ｃ、５％ＣＯ₂下で７２時間培養された。細胞増殖は７２時間の培養の後、洗浄剤溶液での細胞溶解を伴うＬＤＨ定量により評価された。例はこの実験の結果に対し図１４に作られ、それは、キャリアーたんぱく質複合体（ＣＰＧ）に対する増殖反応は免疫化されていないネズミからの脾臓細胞中のＣｏｎＡ，ＰＨＡ，及びＬＰＳに対するそれに匹敵することを示す。これはキャリアーたんぱく質複合体の生来の分裂促進活性を示す。結果は、処理グループ毎の３匹のネズミの平均±ＳＤとして表された。分析は３通り行なわれた。例１３補助薬無しでの免疫原濃度に伴うイソタイプ変化得られる抗体イソタイプ上の抗原投与量の影響を見極めるために、ＢＡＬＢ／ｃネズミが、発熱物質の含まないリン酸緩衝化されたサリン（補助薬無し）中の０．２ｍｌのｐ５０融合たんぱく質を用いて３週間の間隔で３回のＩＰで免疫化された。最後の注入後２週間で、ネズミは出血させされ、安らかに殺傷された。優占的な血清抗決定され間接的ＥＬＩＳＡにより確認された。結果に対する例は表２に作られ、そしてそれは処理グループ毎の３から６匹のネズミの優占的なイソタイプの順位序列として表される。結果は、多い量の抗原を用いる免疫化が優占的にＩｇＧ₁抗体を生成し、一方少ない量が通常優占的にＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂ抗体を生成することを示す。発明はここに示され記載された特定の構造と改良に制限されず、そこでのそのような改良された形を包含し、引用文献に続く請求の範囲内に至る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１２月１３日【補正内容】請求の範囲１．約６５から約１００アミノ残基からなり中性水溶液中で約０．８μｇ／ｍＬより大きくない溶解度を有して低い抗原性を持つ天然には存在しない疎水性で殆ど不溶のポリペプチドからなる融合たんぱく質キャリアーセグメント。２．該ポリペプチドはアルギニンと、リシンと、アスパルチック酸と、グルタミック酸と、システインと、トリプトファンとメチオニンがアミノ末端部位に置かれたときを除いて、メチオニンとからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている請求項１のキャリアーセグメント。３．該ポリペプチドは以下のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸、システイン、トリプトファン及びメチオニンの集合の中でおよそ５％より多くなく含む請求項１又は２のキャリアーセグメント。４．該ポリペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列からなる請求項１又は２又は３のキャリアーセグメント。５．該ポリペプチドはＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列からなる請求項１又は２又は３のキャリアーセグメント。６．（ａ）請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントと：（ｂ）該キャリアーセグメントに共有結合により結合されたたんぱく様の配位子と：からなる融合たんぱく質。７．（ａ）請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントと：（ｂ）該キャリアーセグメントに共有結合により結合された配位子と：からなるキャリアーたんぱく質複合体。８．（ａ）請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントと：（ｂ）該キャリアーセグメントと錯化された配位子と：からなるキャリアーたんぱく質錯体。９．請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体からなる補助薬。１０．請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントを含み、更にプロテアーゼに対する競争認識部位を含む融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体からなるプロテアーゼ阻害剤。１１．請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体からなるワクチン。１２．請求項１乃至５の何れか一項記載のキャリアーセグメントを含むその上に固定された融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体を持つ固体支持物。１３．ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。１４．ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。１５．ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：１又はＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコード化するオリゴヌクレオチド発現ベクター。１６．３’末端の最後の３つの塩基対がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：７に示されるオリゴヌクレオチドの３’末端の最後の３つの塩基対に相補的に結合され、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：７のオリゴヌクレオチド内でＰｖｕＩＩ束縛部位が限定される、ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：６に示されるオリゴヌクレオチドからなる、請求項１５のオリゴヌクレオチド発現ベクター。１７．互いに相補的に結合されてＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：８の５’末端がＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：７のＰｖｕＩＩ束縛部位の５’末端に共有結合により結合されるようにＰｖｕＩＩ束縛部位に挿入されるＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：８及びＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：９に示されるオリゴヌクレオチドから更になる、請求項１６のオリゴヌクレオチド発現ベクター。１８．請求項１５又は１６又は１７の何れか一項記載のオリゴヌクレオチド発現ベクターで転換されたホスト細胞。１９．（ａ）キャリアーセグメントに共有結合により結合され又は錯化された配位子が問題の反−抗原抗体と特異的に反応する、請求項１〜５の何れか一項記載のキャリアーセグメントを含む一又はそれ以上の融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体を含有する少なくとも一つの容器と；（ｂ）使用のための指示書と：からなる反−抗原抗体の存在を検出する使用のための試験キット。２０．（ａ）融合たんぱく質又はたんぱく質キャリアー複合体又はたんぱく質キャリアー錯体を形成するために請求項１から５の何れか一項記載の融合たんぱく質キャリアーセグメントへ配位子を共有結合により結合し又は錯化する段階と：（ｂ）そうして形成された融合たんぱく質又はたんぱく質キャリアー複合体又はたんぱく質キャリアー錯体を生体内又は生体外の何れかで抗体製造細胞に晒す段階と：からなる、与えられた配位子に対して特異的な抗体の製造方法。２１．（ａ）そこに結合され、抗原に対し特異的で請求項２０の方法により製造された抗体を有する固体支持物と；（ｂ）結合されないたんぱく質を除く緩衝剤と；（ｃ）結合された分析試料の検出のための溶液と；（ｄ）使用のための指示書と；を分離された容器に含んでなる、特定の抗原を検出するための免疫分析キット。２２．（ａ）酵素が配位子上で活動するのに適当な時間の間と条件のもとで、固定された融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体が該酵素に対して特異的な反応性を持つ配位子を含む請求項１２記載の固体支持物上を試験試料を通す段階と、（ｂ）固体支持物上の固定された融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体の酵素−触媒された改良に対して信号を発生できる信号発生剤を信号が発生されるのに十分な時間の間に通す段階と、（ｃ）発生された信号に従い該試料中の該酵素の濃度を決定する段階と、からなる、試験試料中の酵素の濃度を決めるための分析方法。２３．（ａ）抗体／複合体錯体を形成するために配位子に対して問題の抗体を結合するのに適当な条件下で問題の抗体と特異的な反応性を持つ配位子を含み、請求項１〜５の何れか一項記載のキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体と共に抗体物質の溜を培養する段階と；（ｂ）該抗体／複合体錯体を分離する段階と；（ｃ）問題の抗体を該抗体／複合体錯体から解離する段階と；（ｄ）問題の抗体を該融合たんぱく質又はキャリアーたんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質錯体から分離する段階と；からなる、抗体物質の溜から特異的な反応性の抗体を免疫精製するための方法。２４．（ａ）キャリアーセグメントとたんぱく質様の配位子との間の共有結合が解裂される条件下で請求項６記載の融合たんぱく質を培養する段階と；（ｂ）該たんぱく質様の配位子を分離する段階と；からなる、ポリペプチドの製造方法。【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年３月５日【補正内容】期間の間にゆっくりと放出される注入部位でエマルジョン、沈殿又は小さな粒子の形成を引き起こすことにより抗原を捕捉する。抗原の移動はこうして遅らされ、生物が抗原に晒されることは延長される。補助薬はまた、抗原注入部位への細胞の非特異的な移動を刺激し、免疫システムの細胞と抗原の相互作用の可能性を増大させる。さらに、補助薬は、注入部位から局所リンパ節又は脾臓への少量の連続的な抗原の配達により受容体中での抗原分散を増大させる。幾つかの補助薬はまた、アデニル酸シクラーゼ及び他の化学的メッセンジャーを活性化することによりリンパ球を刺激することを助ける。補助薬は、リンパ球捕捉機構の活性化を通してＴ−及びＢ−細胞、マクロファージ及び抗原との接触の可能性を増大する。補助薬に関する主な問題は、最も効果的な幾つかは毒性を持ち、及び／又はホスト生物中に外傷を引き起こす傾向がある。これらも処理が困難となりうる。発明の概要本発明は天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメントに関する。本発明はまた、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを有する天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる実質的に抗原性が無い融合たんぱく質キャリアーセグメントに関し、該キャリアーセグメントは、およそ５％より多くない以下のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸、システイン、トリプトファン及びメチオニンからなる。本発明は更に、第一アミノ酸配列からなるキャリアーたんぱく質複合体に関するが、ここで、第一のアミノ酸配列は少なくとも約６５アミノ酸長であり、そして、第一アミノ酸配列は、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸；及び第一のアミノ酸に配位された配位子を欠いている。更に、本発明は図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたようなアミノ酸配列又は図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕中に示されたようなアミノ酸配列に関する。更に、本発明はまた、図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたようなアミノ酸配列からなり配位子に結合された、天然には存在しない融合化合物に関する。本発明はまた、抗原のためのコード化配列を持つ単一の読み出しフレーム中のアミノ酸配列をコード化するオリゴヌクレオチド配列からなる発現ベクターに関するが、該発現ベクターは該オリゴヌクレオチド配列と配位子によりコード化された粒子形成融合たんぱく質を発現し、該アミノ酸配列は天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列であって、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている。本発明は更に高分子量たんぱく質をホスト動物に投与するための補助薬にかかり、該補助薬は天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなる。本発明はまた、ａ）融合たんぱく質複合体又はキャリアーたんぱく質複合体を形成するために配位子への天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなるキャリアーセグメントを融合し；ｂ）抗原を生体内又は生体外の手段で送り込み、ｃ）生体内又は生体外の手段により配位子への抗原を作りだす；段階よりなる配位子への抗体を生産する方法に関する。本発明はまた、（ａ）少なくとも一のキャリアーたんぱく質合成物が捕獲剤として固体相へ着けられ、抗原／抗体錯体の形成に適当な時間と条件のもと試験試料と接触され、そして（ｂ）信号発生化合物と分析のための特異な束縛部からなる指示薬が、反応が起きるのに十分な時間の間、該錯体と接触し、発せられた信号は試験試料中の反−分析抗体の存在を指示するものである、試験試料中の反抗原抗体の濃度を決めるための分析方法に関する。改善点は、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメントを捕獲剤として固体相に付着させることからなる。本発明は更に、（ａ）以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いており、少なくとも約６５アミノ酸の長さを持ち、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む実質的に抗原の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる免疫抗原を調製する段階と；（ｂ）ホスト脊椎動物に該キャリアーたんぱく質合成物を投与する段階とよりなる、ホスト脊椎動物に免疫抗原を接種するための方法に関する。本発明はまた、（ａ）図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたアミノ酸と該アミノ酸配列に融合された配位子からなる天然には存在しないキャリアーたんぱく質複合体からなる免疫抗原を形成する段階と；（ｂ）ホスト脊椎動物に該キャリアーたんぱく質合成物を投与する段階とよりなる、ホスト脊椎動物に免疫抗原を接種するための方法に関する。更に、本発明は、（ａ）以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いており、少なくとも約６５アミノ酸の長さを持ち、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む実質的に抗原の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる免疫抗原を形成する段階と；（ｂ）抗体／複合体錯体を形成するために、キャリアーたんぱく質複合体に抗体物質を結合する束縛条件下でキャリアーたんぱく質複合体と抗体物質を培養する段階と；（ｃ）抗体／複合体錯体を分離する段階と；（ｄ）抗体／複合体錯体から抗体を解離する段階と；（ｅ）抗体／複合体錯体から抗体を分離する段階とからなる、抗体物質溜めから抗体を免疫精製する方法に関する。更に、本発明は、（ａ）以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる融合たんぱく質を、融合たんぱく質上のペプチド結合が解裂する条件下で培養する段階と；（ｂ）望みのペプチドを分離する段階からなるペプチド製造方法に関する。更に、本発明は、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる融合たんぱく質と、そこで融合たんぱく質が単離されて競争阻害性の基体として用いられる、プロテアーゼのための解裂部位とからなるプロテアーゼ阻害剤に関する。なおさらに、本発明は、（ａ）少なくとも約６５アミノ酸長であり、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の後続アミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミキャリアーセグメントの幾つかの利点は以下に示される。低い抗原性：本発明の第一の目標の一つは配位子への抗体を作ることである。配位子への抗体を作る最善の機会を持つためには、融合たんぱく質のキャリアーセグメント部は動物に対して比較的に抗原性を有するべきでない。典型的には、ホストの体中の免疫システムは、例えば、該システムに送られた抗原など外部物質を目標とする。融合たんぱく質のような抗原が体内に入るとき、免疫システムは攻撃する最も抗原活性な部位を捜し出す。キャリアーセグメントがたまたま最も活性な抗原を含むなら、免疫システムは好んでキャリアーセグメントを目標とし、選択にかかる目的の配位子セグメントに対する反応はほとんど無い。主に、キャリアーセグメントは通常３００若しくはより以上のアミノ酸であり、より大きいセグギメントである傾向があるため、このことは度々起きるケースである。キャリアーセグメントとして用いられる天然のたんぱく質には、また多くの電荷を持つアミノ酸がある。電荷を有するアミノ酸配列は疎水性のアミノ酸配列がそうであるより更に表面が晒されやくす、抗原活性である。つまり、キャリアーはより潜在的なエピトープを持ち、そして免疫システムにより外部のもの又は危険なものと、より容易に認識されることの多い残りの部分からなる。キャリアーセグメントを小さくそして抗原性においてとても低くすることにより、免疫システムは配位子を攻撃しやすくなり、配位子に対する抗体を生産しやすくなる。本発明の目的にとって、低い抗原性とは、配列：Ｈ２Ｎ−ＬｙｓＭｅｔＡｌａＧｌｕＡｓｐＡｓｐＰｒｏＴｙｒＬｅｕＧｌｙＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｎＭｅｔ（ＳＥＱ．ＩＤ．４）を持つ配位子に融合されたキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質の、鶏、ネズミ、ウサギへの３回若しくはそれ以上の注入に対応して生成された特定の抗体の５０％のより多い形成を行なうことに対するキャリアーセグメントの失敗により定義される。キャリアーセグメントの抗原性を低下させる一つの方法は、そのサイズを低下させることである。このことは、結合された配位子に融合たんぱく質全体のかなり大きい部分を形成することを許容する。典型的には、キャリアーセグメントは、およそ２００及び５００の間のアミノ酸を含む。しかし、セグメントの長さをおよそ１００若しくはより少ないアミノ酸に減少させ、多くの電荷を持つアミノ酸を除くことにより、キャリアーセグメントはより低下した効果のホスト生物内での免疫反応を示す。キャリアーセグメントは少なくとも６５アミノ酸の長さであるべきであり、好ましくは１００アミノ酸の長さである。少なくとも、キャリアーペプチドは、原核ホスト発現生物中で効果的な発現を許容するために十分に長くあるべきである。低溶解性：本キャリアーセグメントの主な利点は、ほとんど無い又は低い溶解性であることである。このことは、低いレベルの発熱因子を含む注入可能な質の免疫抗原がクロマトグラフィーのような簡便な方法を適用することにより簡単な洗浄を用いて調製されうるので、時間と装置の両方の節約になり、素早い精製に有利である。加えて、発現時の含有体内でのペプチドの隔離は、不安定な配列をたんぱく質分解攻撃から保護する。補助薬の不要：キャリアーセグメントの付加的な利点は、低溶解性及び分裂促進効果を含む、キャリアーセグメントと複合体の多様な性質により、通常のキャリアーたんぱく質と同様に自身が補助薬として働くということである。抗体の生成のために抗原を調製する研究者の最近の典型的な方法は、公知の方法である技術を用いて配位子又はペプチドを化学的に合成し、その後、キャリアーたんぱく質として知られるより大きなたんぱく質に、それを化学的に重合させることである。キャリアーたんぱく質の機能はＴ−細胞補助を引き出すことである。Ｔ−細胞補助は動物内での効果的な抗体の反応を生じるために重要である。しかし、多くの配位子とペプチドは望みの抗原部位を提供し、Ｔ−細胞補助を引き出すための物質を許容するセグメントを含むには何れも小さすぎる。キーホールリンペットヘモシアニンのような特定のたんぱく質はＴ−細胞補助を引き出すための効果的な部位を含む技術として知られ、そのためこの目的のための小さい配位子に度々結合される。研究者が抗体の製造のための注入用の抗原の投与を最近準備する典型的な方法はそれを幾つかの数の懸濁、沈殿又は乳剤の形の中に形成することである。補助薬は幾つかの要因の結合された効果の結果として免疫反応を増大させうる。もし抗原がそれとしてホスト動物中に注入されたら、それは可溶な形であり、素早く注入部位から広がって体から洗浄される。免疫システムは注入部位に免疫細胞を導き、反応を設定する時間が必要であるため、抗原の素早い拡散と洗浄は免疫反応に対し有害である。注入部位で補足されるように抗原の形成は、免疫システムがそこに設置し反応を設定するのに十分な長さの時間、設置された抗原を維持するための試みである。ほとんどの場合、抗原は強力な免疫反応を引き出すために、その部位に十分な時間捕捉されないため、何週間かの期間を超える複数回の注入が必要となる。加えて、免疫細胞の注入場所への案内は、通常幾つかの局所的な非特異的炎症を必要とする。最後に、補助薬は免疫細胞の増殖を刺激する。キャリアーセグメントとそれを含む複合体の低溶解性は、注入部位での免疫反応を設定するために十分な条件、即ち、免疫細胞をその場所に導く幾つかの種類の非特異的な炎症反応が作りだされ、免疫反応が設定されるのに十分な時間抗原がその部位に封じ込められ、免疫細胞間の相互作用は隠され、そして免疫細胞の増殖が刺激され得られたペプチドが上記抗原若しくはそれの断片と実質的に同じ抗原性を持つような化学合成されたコード化配列から得られる上記抗原若しくはペプチドの断片でもある。例は、Ｋｉｎｇｓｍａｎ他のアメリカ特許第５，００８，３７３号に作られ、ここで適当なアミノ酸配列の例の開示のための例により具体化される。発現ベクター図４を参照するに、問題の多様なたんぱく質の生産は、その後集められて精製され、そして、それから何れも直接に使用され、若しくは配位子Ｂに結合され、若しくは配位子Ｂ”と共に共同投与され、若しくはキャリアーセグメントＢ’を除くために分裂される、たんぱく様のキャリアーセグメントＡ若しくはキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質Ａ＋Ｂをホスト細胞中に発現することにより達成される。その工程は、適当なホスト中への変形とその後の発現上で、キャリアーセグメント又はキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質を豊富に生産する組み換えＤＮＡベクターの処理を含む。好ましいホスト細胞はＥ．ｃｏｉｌのような原核細胞であるが、本発明はまた、例えば、Ｓ．セルビシアエのようなイースト細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞のような動物細胞、又は望みのたんぱく質の生産を直接にする適当な発現ベクターを含むＣＯＳ細胞など、多様なホスト細胞中のキャリアーセグメント又はキャリアーセグメントを含む融合たんぱく質の生産を含む。望みのコード化及び制御の範囲を含む適当なベクターとカセットの組立は、この技術分野で良く理解されたＤＮＡ操作（オリゴヌクレオチド合成、結紮、制限）を用いる。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドは、切り裂かれ、直され、そして望みの形に帰せられる。たんぱく質コード化カセットは好みのキャリアーセグメントをコード化するように構成される。カセットによりコード化されたたんぱく質は分子量約１０キロダルトン（１０ｋＤ）であり、上記の；すなわち、簡単には、多くの電荷を持つアミノ酸の選択的な除去により低い溶解性と抗原性を有するというキャリアーセグメントの設計主旨を維持している。好ましいキャリアーセグメントアミノ酸配列は図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示される。上記設計のキャリアーセグメントのためのたんぱく質コード化カセットはその後適当な発現ベクター中に複写される。他のシステムが発現のために用いられるホスト生物に依存して使用されるが、通常はこれはプラスシドベクターである。提供された例においては、発現ベクターは、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マディソン，ＷＩ）のカタログに記載されたｐＧＥＭＥＸ−１として知られたベクターの改良である。このプラスシドベクターは、Ｂｏｌｉｖａｒ他（１９７７）によるＥ．ｃｏｉｌ種から誘導された良く知られたｐＢＲ３２２ベクターの誘導体である。キャリアーセグメントたんぱく質の発現はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターにより推進される。複写部位、制御配列、及び抗生物質抵抗性の信号発生物質を含み、ホストと交換可能な種に由来する他のプラスシドもまた用いられうる。通常用いられるここで定義された原核制御配列はリボソーム結合部位配列に沿った始まりと終わりの転写のためのプロモーターを含み、そしてベーターラクタメーセプロモーターのようなプロモーターを含む。発明の真核システム中で役立つ発現システムは適当な真核性の種から由来するプロモーターを構成する。イースト中で有用なプロモーターの分類は例えば、３ −ホスホグリセレートキナーゼ用のものを含み、グリコリチック酵素の合成用のプロモーターを含む。本発明のさらに有効な点は、キャリアーセグメントコード化ＤＮＡを含み、ポリリンカーセグメント（図４中のＣ）と呼ばれ、少なくとも一の分解エンドヌクレアーゼ酵素の認識配列に追随されるこのセグメントを含み、キャリアーセグメントの知られたリーディングフレームと分解エンドヌクレアーゼ部位のコード化ＤＮＡ内に転写終了コードンを含まない、ヌクレオチド配列により追従されるものである発現ベクター構造の使用である。発現ベクターのＤＮＡは分解エンドヌクレアーゼを使用するポリリンカー中の特異な部位でその後に切断されえて、そしてＤＮＡセグメントコード化の好みのペプチド配位子がこの点で発現ベクターに導入されえることにそのようなポリリンカーセグメントは利点を有する。そのような場合、得られたベクターは問題のキャリアーセグメント又はペプチドを含む融合たんぱく質をコード化し、キャリアーセグメントをコード化するヌクレオチド塩基対と配位子の間のＤＮＡの介入における読み出しフレーム中に翻訳終了コドンが無く、挿入されたＤＮＡは望みの融合たんぱく質の端で翻訳終了コドンを含むべきであることを確実にしなければならない。融合たんぱく質の生産におけるポリリンカーの適当な設計と使用に関する知識はこの技術分野では良く知られている。望のなら、得られた構造によりコード化されたアミノ酸配列の確認は、この技術分野で良く知られた方法の使用により得られたベクターのＤＮＡ配列を決定することによりなされうる。ポリリンカー配列によりコード化されたアミノ酸は図２〔ＳＥＱ．ＩＤ．３〕に示される。初めに検討したように、ポリリンカー配列中の幾つかのコドンは電荷を持つアミノ酸をコード化する。このことは、融合たんぱく質の働きに対して有害ではない。ポリリンカーを加えて完全なベクターによりコード化された好ましいアミノ酸配列は、残りのベクターがｐＧＥＭＥＸ−１を構成する、図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕に示された配列からなり、その中で、５から９０５のＤＮＡ配列はＡＴＧコドン（例えば、図３の最初のメチオニン残基）がｐＧＥＭＥＸ−１ベクター中のＴ７プロモーター配列に近づくような方法で置き換えられる。発現菌株本発明のたんぱく質は原核又は真核システム中に発現される。原核生物はＥ．ｃｏｉｌの多様な菌株により最もよく代表される。好ましいホスト菌株はＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マディソン、ＷＩ）から購入により入手可能な菌株である、ＢＬ２１（ＤＥ３）プライである。しかし、バシーリ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｓ）、シュードモナスの多様な菌株等、他の微生物菌株もまた用いられる。通常の真核発現菌株はイーストの菌株を含み、昆虫細胞中のバクロウイルス発現を含む。本発明の一つの可能な利点は、不溶な堆積物中での発現されたたんぱく質の堆積は他のやり方では細胞に対してより有害で又は有毒な融合たんぱく質の発現を許容することである。転換用いられるホスト細胞に依存して、変換はそのような細胞に合った標準的な技法を用いて行なわれる。Ｃｏｈｅｎ（１９７２）により記載されたような塩化カルシウム処理又はＭａｎｉａｔｉｓ他（１９８９）で記載されたＲｂＣｌ法が実質的に細胞壁防御を持つ原核生物とともに用いられる。好ましいホスト菌株はＢＬ２１（ＤＥ３）プライであり、用いられた変換プロトコルは製造会社（ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ．，マディソン、ＷＩ）により提案されたものである。て使用することにおいて通常の技術の一つを助けるために提供される。例は、この特許により容認される開示又は保護の範囲を違ったやり方で限定する何れの点においても意図されない。例１天然に存在するたんぱく質からのキャリアーたんぱく質セグメントの形成問題の出発たんぱく質は分子量約３５ｋＤの通常のたんぱく質であるファージＴ７の因子１０たんぱく質であった。Ｐ５０試験抗原〔ＳＥＱ．ＩＤ．４〕と損なわれていない因子１０たんぱく質の試験融合が調整され、ウサギに注入された。ウサギにより大量に製造された抗体は融合たんぱく質の因子１０部分と反応し、試験抗原とは反応しなかった。この構造物（Ｌｉｎ他，１９８７の方法に従う）はここで記載された低い抗原性のために基準となれないので、因子１０たんぱく質の一の片の配列は望みの特性を得るために以下で検討されるように再設計された。ベクターのクローン化の詳細は例２の中に示された。この例は、用いされたアミノ酸の選択をもたらす設計過程を記載する。以下で記載されるように、その意図は、高く発現され不溶となりうるように短いペプチド配列を作りだすことであった。６５アミノ酸（キャリアーセグメントにポリリンカーを加えて）のたんぱく質の形成の最初の試みは成功しなかったが、設計された配列の３７の付加アミノ酸が加えられたとき、発現は成功した。ポリリンカー付加の部位（Ｐｖｕ２部位、図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕）に近いｐＧＥＭＥＸ−１プラスミドによりコード化された原アミノ酸配列は：（Ｈ₂Ｎ）− ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＴＮＱＧＫＧＶＶＡＡＧＤＫＬＡＬＦＬＫＶＦＧＧＥＶＬＴＡＦＡＲＴＳＶＴＴＳＲＨＭＶＲＳＩＳＳＧＫＳＡＱＦＰＶＬＧＲＴＱＡＡＹＬＡＰＧＥＮ−（ＣＯＯＨ）〔ＳＥＱ．ＩＤ．６〕である。図３中に示された新たな配列を設計することにおいて、本発明の記載の章中の設計指示に従う改良は以下のように作られた。たんぱく質は既に非常に疎水性であったので、アミノ酸の疎水性における大きな変化は必要とされなかった：例２確かなベクター構造物によるたんぱく質の製造ｐＭＫ１３６の生成（図３のアミノ酸１−４１と７９−１０２をコード化するクローン）以下の配列のオリゴヌクレオチドが標準の手段により合成された：ＭＫ９５’ＧＧＣＴＧＡＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＡＡＣＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧＧＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．６〕ＭＫ１０５’ＧＴＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．７〕オリゴヌクレオイドは、二つのオリゴヌクレオイドの３’末端の３位ｂｐの重複部分を用いて、”プライマー二量体反応”によりＴａｑＤＮＡポリメラーゼと二量化されうるように設計される。重複する部位は、二量体の重複部分の保全を確認するようにユニークな一齢部位を含むように設計された。二量化反応は、５０ピコモルの各オリゴヌクレオチド、１μｌのＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、標準緩衝剤、Ｍｇ，及びヌクレオチド水準、及び３０秒間の９５°Ｃで追従される７０°Ｃでの３０秒間からなる３５回の温度サイクルの存在化でなされた。１５回の１００μｌ反応の生成物は溜められ、１０％の天然ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により二量体は精製された。二量体ＤＮＡは一晩中受動的に溶出され、フェノールで抽出され、エタノールで沈降された。二量化されたオリゴの末端は標準緩衝剤中で分解酵素Ｎｈｅ１及びＸｈｏ１で刈り込まれたが、その反応は天然のＰＡＧＥゲルにより観察された。ＰＧＥＭＥＸ−１ベクター（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ，製品＃Ｐ２２１１）は分解酵素Ｎｈｅ１及びＸｈｏ１で切断され、フェノール抽出とエタノール沈降により精製された。刈り込まれた二量体はそれからＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて切断ベクター中に連結され、それから連結生成物は、製造元の薦めるプロトコルを用いて、バクテリア菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（標準Ｔ７発現菌株、ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ，マディソン、ＷＩ、製品＃６９４５１−２）を転換するのに使用された。細胞はＬＢ−ａｍｐプレート上に着せられ、３７°Ｃで一晩生育された。コロニーはＬＢ−ａｍｐ液体培養中に浸け入れられ、そしてプラスミドは標準の技術による適正な挿入のために精製されて分析される。一つの正のクローンであるｐＭＫ１３６からプラスミドへ向かう問題の領域を横断するＤＮＡ配列は標準の技術により正確であると決定される。得られた菌株中のたんぱく質の発現はＳｔｕｓｉｅｒ他の１９９０年の批評記事中に記載された条件を用いて試験された。例はまた、発現システム中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用をカバーするＳｔｕｓｉｅｒ他のアメリカ特許第４，９５２，４９６号による。得られたクローンは、０．５ｍＭのＩＰＴＧを伴い誘導されたＬＢ−ａｍｐ媒体中で生育され、たんぱく質生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。重要なたんぱく質の発現は検出されなかった。こうして、キャリアーセグメントをコード化するベクターの製造におけるこの第一の試みは、コード化されたたんぱく質の短い長さのために多分失敗した。この場合のコード化されたたんぱく質は、Ｐｖｕ２部位の前に４１アミノ酸、そしてポリリンカーにより２４アミノ酸がコード化されて、６５アミノ酸長である。この章で作りだされたプラスミド、ｐＭＫ１３６は、成功したベクター、ｐＭＫ１４９の形成のための出発地点として用いられ、そしてそのためこの記載中に含まれる。ｐＭＫ１４４の形成（図３中に描写されたクローン）ｐＭＫ１３６中にクローン化する前に、第一段階はｐｌｙｓＳプラスミドを取り除くことである。これは、ＥｃｏＲＶを持つｐＭＫ１３６からのプラスミド試料を消化し、バクテリア菌株ＪＭ１０９（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．，マディソン、ＷＩ、製品＃Ｌ２００１）中に転換し、ＬＢ−ａｍｐ上に着せられ、そしてコロニーのクロラムフェニコールに対する耐性及びアンピシリンに対する耐性の欠如を試験することにより達成される。プラスミド試料は一つのそのようなコロニーから作られ、Ｐｖｕ２とともに標準の条件下消化される（反応はアガロースゲル電気泳動により観察された）。以下の配列の二つのオリゴヌクレオチドは標準的手段により合成される：ＭＫ１５５’ＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＴＡＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＡＣＧＧＡＧＧＴＡＴＧ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．８〕ＭＫ１６５’ＣＡＴＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＧＴＡＣＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＴＡＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧ３’〔ＳＥＱ．ＩＤ．９〕二つのオリゴヌクレオチドが室温までのゆっくりした冷却が引き続き行なわれる５分間の９５°Ｃまでの加熱によりお互いに雑種形成され、その後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて切断ｐＭＫ１３６ベクター中に連結され、それから連結生成物は、製造元の薦めるプロトコルを用いて、バクテリア菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（標準Ｔ７発現菌株、ＮｏｖａｇｅｎＣｏｒｐ，マディソン、ＷＩ、製品＃６９４５１−２）を転換するのに使用された。細胞はＬＢ−ａｍｐプレート上に着せられ、３７°Ｃで一晩生育された。コロニーはＬＢ−ａｍｐ液体培養中に浸け入れられ、そしてプラスミドは標準の技術による適正な挿入のために精製されて分析される。一つの正のクローンであるｐＭＫ１４４からプラスミドへ向かう問題の領域を横断するＤＮＡ配列は標準の技術により正確であると決定される。同様の菌株、ｐＭＫ１４９は前述のＥｃｏＲＶ消化技術によりｐｌｙｓＳプラスミドを欠くＪＭ１０９中で作りだされた。これらの細胞からのプラスミドは全てのその後のベクタークローン化のために配列され使用された。ｐＭＫ１４４菌株中のたんぱく質の発現はＳｔｕｓｉｅｒ他（１９９０年、前記）による批評記事中に記載された条件を用いて試験された。例はまた、発現システム中のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用をカバーするＳｔｕｓｉｅｒ他のアメリカ特許第４，９５２，４９６号による。得られたクローンは、０．５ｍＭのＩＰＴＧを伴い誘導されたＬＢ−ａｍｐ媒体中で生育され、たんぱく質生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。例２中で検討されたように、この菌株からの発現は良かく、そして図３中に記載されたキャリアーたんぱく質セグメントであり、キャリアーセグメント／ポリリンカーセグメント発現ベクターのための発明の好ましい実施例として６０で、例において用いられた融合たんぱく質の形成において、問題のペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドはＮｏｔ１／Ｈｉｎｄ３部位中にクローン化され、望みのペプチドの最後のアミノ酸の後に停止コドンを含んだ。図３中の配列のアミノ酸９５−１０２中のこのクローン化の戦略的結果は融合たんぱく質中に発現されていない。図３中のアミノ酸９６はシステイン残基であるので、スルヒドリル−反応試薬を用いてキャリアーセグメントに配位子を結合させたければ、そのようなベクターを使用可能である。一方、ジスルフィド結合の形成に伴う問題を避けるためにポリリンカー中の何処かに停止コドンを挿入することは得策である。融合たんぱく質を含むキャリアーセグメントの発現と精製５０ｍｌのＬＢａｍｐの振動フラスコに、各発現菌株の１−５μｌのグリセロール株が蒔かれ、３７°Ｃで一晩育成された。朝に、一晩の培養液の３０ｍｌが室温で１，０００−４，０００ｘｇで５−１０分間遠心分離された。それぞれの培養液からの沈殿物はその後、前もって３７°Ｃに温められていたＬＢ−ａｍｐを含む１Ｌの培養液中に移され、０．５−１．０の６００ｎｍでの最適密度が達成されるまで（蒔かれてから３−４時間後）、振とうされながら培養された。そのとき、発現を導くためにＩＰＴＧが０．５ｍＭまで添加され、細胞は導入後３−４時間振とうがなされた。試料は希望に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために取られた。この後、細胞は１０分間以上の間の３，０００−５，０００ｘｇでの遠心分離により収穫された。細胞はその後、直接に処理され、又は使用する前に −７０°Ｃで２週間近くのあいだ貯蔵された。細胞は４０ｍｌの緩衝剤Ａ（ｐＨ８．０の１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ，１３０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁され、１００ｍｌの樹脂性ビーカーに移され、５分間氷水上で冷却され、その後（氷水槽中のまま）３分間、標準のマクロチップを備えたＳｏｎｉｃｓａｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓのＶＣＸ６００音波発生器で、５５％の電力設定（約３３０ワット）で０．５秒のオンと０．５秒のオフを行いながら、音波処理された。細胞破壊が極大化するするように泡立ちは避けられた。音波処理後、４．５ｍｌの２０％ナトリウムデオキシコレートが添加され、試料は再び３０秒間音波処理された。溶解産物はその後、遠心分離管に移され、４−１０ °Ｃで１０分間１５，０００−２０，０００ｘｇ（ＪＡ１８ローター）で回転された。上澄み液は捨てられ、緩衝剤Ａ中の２％のナトリウムデオキシコレートでの付加的な第二の洗浄が望みに従い行なわれ、その後、沈殿物は１ｍＭのＤＴＴと１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むｐＨ７．４のリン酸イオンで緩衝されたサリン中で簡単に音波処理されて再懸濁された。（注：若干劣る純度で微量のデオキシコレートを含む物質を得ることを望むならば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００段階は省略されてよい。）前のように試料は沈殿され、その後、賦形剤を欠いているリン酸イオンで緩衝されたサリンで少なくとも１ｘ洗浄され、それから１０ｍｌの同じ緩衝剤中に再懸濁される。精製された融合たんぱく質又はキャリアーセグメントはその後、希望するなら使用前に６カ月程度の期間の間−２０°Ｃで貯蔵され、そして、注入のために準備される。幾つかの場合、長い期間貯蔵された試料は、注入の前に細かい懸濁を再生産するために音波処理をされる必要がある。発現結果：たんぱく質は例３中の記載に従い分析された。発現結果はこの段落の後にある表２の一部の示された。表２は、融合されたペプチドのアミノ酸配列を含んで、記載された発明とそこからの幾つかの特性を用いて製造された融合たんぱく質の例、融合ペプチドの大きさと価電子数、水溶液中の溶解性と逆相ＨＰＬＣによる保持時間、細胞が導入され収穫された所での目視密度、及びｍｇ／リットル単位分析のためのもののように調製され、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析された。固定相はＶｙｄａｃＣ−１８ＴＰカラムで１０ｕＭのシリカ、４．６ｘ２５０ｍｍの容積である。移動相は標準であり（水／アセトニトリル中に０．１％のトリフルオロ酢酸）、流速は１ｍｌ／分、そして検出器は２５４ｎｍ、０．３ＡＵＦＳでのＵＶ吸収によるものであった。２０μｌの試料は注入され、そしてアセトニトリル２０％−６０％の４０分間での一次の勾配を伴い溶出された。結果は図５Ａ（ＨＰＬＣ）と数値を用いて表２（前の）に示される。保持時間は２９．６から３３．１分まで（アセトニトリル５０−５４％）変化し；この大きさのたんぱく質に対する非常に遅い溶出はそれらの高い疎水性を示している。酢酸による注入部での大きなピークと、酢酸中の不純物によるものとして示されうる小さな背景のピーク以外のに、発現されたたんぱく質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に一致して、単一のシャープなピークとして溶出した。溶解性のＨＰＬＣ分析：幾つかの融合物の試料は、上記のたんぱく質分析により同定されたように飽和に到達するまで、イオン性のリン酸で緩衝されたサリン中で４°Ｃで数日間攪拌しながら保持がなされる。たんぱく質標準はｐＭＫ１６０からのたんぱく質の酢酸可溶化試料を、それが約１００μｇ／ｍｌであると評価されるまで、希釈することにより調製される。これは、上記のたんぱく質分析によるたんぱく質濃度の確定の後（最終濃度は９５μｇ／ｍｌ）部分標本にされる。６から０．７５μｇ／ｍｌまでの連続の２倍希釈の一系列が上記のようにＨＰＬＣにより定量分析され、ピーク高さが測定され、標準曲線がプロットされる。飽和された融合たんぱく質の試料は同一量の氷酢酸で希釈され、ｐＭＫ１６０試料に比較してＨＰＬＣにより定量分析される。ピーク溶出位置は融合物から融合物まで少しづつ変化したが、ピーク形状は、図５Ａ中に見ることができるように、とても均一であった。表２中に示された結果は、基本たんぱく質（上記のように広がりを持って）と融合物の溶解性は０．８−４．７μｇ／ｍｌの範囲にあることを示す。ペプチド融合物の大きさは１４−１９アミノ酸の範囲で試験され、そして中性ｐＨでの価電子数は＋３から−２までの範囲であった。たんぱく質の大きさのＦＡＢ−ＭＳ分析：ｐＭＫ１６０から精製された融合たんぱく質の精製された試料は、ＫｒａｔｏｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ラムゼー、ＮＪ）の、彼らのコンパクト高速原子衝撃質量スペクトロメータのデモンストレーション操作用に従った。彼らの標準の方法により分析され、図５Ｂ中に示されたように、主な種（Ｍ＋１）の検出された分子量は、ベクターの配列から導かれた１１，０８６に対し、１１，０８８であった。この差異は装置の誤差範囲内である。例４固体表面へのキャリアーたんぱく質複合体の固定間接的ＥＬＩＳＡ（図６に図示されて説明された酵素結合された免疫吸着剤分析）が、固体表面上に固定化されることのキャリアーたんぱく質複合体の能力を利用して行なわれた。簡単には、ｐ５０たんぱく質配列から誘導されリン酸緩衝されたサリン（ＰＢＳ）中に懸濁された可溶なキャリアーたんぱく質複合体が、９６のウェルのプレート上に被覆され１４−１８時間４°Ｃで培養される。プレートのウェルは０．２％から２０の間で含有されるＰＢＳを用いて４回洗浄され、その後、たんぱく質の非特異的な結合を遮るために１％ｗ／ｖのウシ血清アルブミンの溶液を伴い１時間培養された。被覆され防御されたウェルはその後、室温で１．５時間様々な濃度の試料を培養することにより特定抗体の滴定濃度のために免疫グロブリン試料を分析するのに用いられた。特定の抗体結合の量は反− 鶏抗体複合物を用いて適当な基体と反応を発生させることにより検出された。比色反応の目視の密度は、ｐ５０キャリアーたんぱく質

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｇ０１Ｎ 33/531 ＡＧ０１Ｎ 33/531 33/543 ５０１Ｄ 33/543 ５０１Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シュルツ，ジョンダブリュアメリカ合衆国，ウィスコンシン州 53593，ヴェロナ，メロディ・レーン 407 番 (72)発明者レスリー，スコットエイアメリカ合衆国，ウィスコンシン州 53575，オレゴン，ヴィレッジ・ヴュー・コート 135番 (72)発明者ヴィラース，キャサリンイーアメリカ合衆国，ウィスコンシン州 53558，マクファーランド，リヴァークレスト・ドライヴ 6202番

Claims

【特許請求の範囲】１．天然には存在しない疎水性で殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメント。２．該アミノ酸配列は実質的に抗原性が無い請求項１のキャリアーセグメント。３．該アミノ酸配列は以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部位にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている請求項１のキャリアーセグメント。４．該キャリアーセグメントはおよそ５％より多くない以下のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸、システイン、トリプトファン及びメチオニンからなる請求項１のキャリアーセグメント。５．少なくとも約６５アミノ酸長の長さを有する請求項１のキャリアーセグメント。６．図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示された配列からなる請求項１のキャリアーセグメント。７．図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕中に示され配列からなる請求項１のキャリアーセグメント。８．請求項１のアミノ酸配列からなるベクター。９．請求項９のベクターを伴い転換されたホスト細胞。１０．以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部位にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを有する天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる実質的に抗原性の無い融合たんぱく質キャリアーセグメント。１１．図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示された配列からなる請求項１０のキャリアーセグメント。１２．図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕中に示された配列からなる請求項１０のキャリアーセグメント。１３．およそ５％より多くない以下のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸、システイン、トリプトファン及びメチオニンからなる少なくとも約６５アミノ酸長の長さを有する天然には存在しない、疎水性の、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる実質的に抗原性の無い融合たんぱく質キャリアーセグメント。１４．ａ．少なくとも約６５アミノ酸長であり、そして以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部位にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている第一のアミノ酸配列と；ｂ．該第一のアミノ酸配列に融合された配位子と：からなるキャリアーたんぱく質複合体。１５．融合たんぱく質は第二のアミノ酸配列の生物学的活性を示して該配位子は生物学的に活性なアミノ酸配列である請求項１４のキャリアーたんぱく質複合体。１６．該配位子は原核性の、若しくは真核性の、若しくは環境由来の源から派生したペプチドである請求項１５のキャリアーたんぱく質複合体。１７．該配位子はハプテンである請求項１４のキャリアーたんぱく質複合体。１８．該配位子はエピトープである請求項１４のキャリアーたんぱく質複合体。１９．該配位子は免疫学的結合活性を持つ請求項１４のキャリアーたんぱく質複合体。２０．請求項１４記載のキャリアーたんぱく質複合体からなる、ホスト動物への注入のための抗原２１．図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたアミノ酸配列。２２．図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕中に示されたアミノ酸配列。２３．図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示されたアミノ酸配列と該アミノ酸配列に融合された配位子からなる天然には存在しないキャリアーたんぱく質複合体。２４．該アミノ酸はカルボキシ末端でペプチドセグメントのＮ−末端に結合される請求項２３のキャリアーたんぱく質複合体。２５．以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列と配位子によりコード化された粒子形状融合たんぱく質を発現する、抗原のためのコード化配列を持つ単一の読み出しフレーム中のアミノ酸配列からなる発現ベクター。２６．請求項の該ベクターで転換されたホスト細胞。２７．天然には存在しない、疎水で、殆ど不溶のアミノ酸配列からなるホスト動物に免疫原を投与するための補助薬。２８．該アミノ酸配列は実質的に抗原性が無い請求項２７の補助薬。２９．該アミノ酸配列は以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠いている請求項２７の補助薬。３０．少なくとも約６５アミノ酸長の長さを持つ請求項２７の補助薬。３１．図１〔ＳＥＱ．ＩＤ．１〕中に示された配列からなる請求項２７の補助薬。３２．図３〔ＳＥＱ．ＩＤ．２〕中に示された配列からなる請求項２７の補助薬。３３．ａ．キャリアーたんぱく質複合体を形成するために配位子へ天然には存在しない、疎水で、殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメントを融合する段階と、ｂ．抗原を生体内又は生体外の手段で送り込む段階と；ｃ．配位子への抗体を生成する段階と；からなる、配位子への抗体を生産する製造方法。３４．ホスト動物中に融合たんぱく質を注入する生体内工程により該抗原を送り込むことからなる請求項３３に製造方法。３５．生体外で培養された細胞でキャリアーたんぱく質複合体を培養する生体外工程より該抗原を送り込むことよりなる請求項３３に製造方法。３６．請求項３３の製造方法に従い製造されたたんぱく質への抗体。３７．（ａ）少なくとも一のキャリアーたんぱく質合成物が捕獲剤として固体相へ付着され、抗原／抗体錯体の形成に適当な時間と条件のもとで試験試料と接触され、そして（ｂ）発せられた信号は試験試料中の反−分析抗体の存在を指示するものである、信号発生化合物と分析物のための特定の結合部分からなる指示薬が、反応が起きるのに十分な時間の間に該錯体と接触し、改善点は、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列からなる融合たんぱく質キャリアーセグメントを捕獲剤として固体相に付着させることからなる、試験試料中の反抗原抗体の濃度を決めるための分析方法にある。３８．キャリアーたんぱく質複合体のペプチド構造により限定されるエピトープで該抗体を同定することよりなる請求項３７分析方法。３９．ａ．以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠き、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを持ち、天然には存在しない、疎水で、殆ど不溶のアミノ酸配列を含む実質的に抗原性の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる免疫原を調製する段階と；ｂ．ホスト脊椎動物に該キャリアーたんぱく質複合体を投与する段階と：からなる、ホスト脊椎動物に免疫原を接種するための方法。４０．ａ．図１（ＳＥＱ．ＩＤ．１）中に示されたアミノ酸配列と該アミノ酸配列に融合された配位子からなる天然には存在しないキャリアーたんぱく質複合体からなる免疫原を形成する段階と；ｂ．ホスト脊椎動物に該キャリアーたんぱく質複合体を投与する段階と：からなるホスト脊椎動物に免疫原を接種するための方法。４１．ａ．以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の後続アミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つの追従アミノ酸を欠いており、少なくとも約６５アミノ酸長の長さを持ち、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む実質的に抗原性の無い融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる免疫原を形成する段階と；ｂ．抗体／複合体錯体を形成するためにキャリアーたんぱく質複合体に抗体物質を結合する束縛条件下でキャリアーたんぱく質複合体と抗体物質を培養する段階と；ｃ．抗体／複合体錯体を分離する段階と；ｄ．抗体／複合体錯体から抗体を解離する段階と；ｅ．抗体／複合体錯体から抗体を分離する段階と：からなる抗体物質溜めから抗体を免疫精製する方法。４２．請求項４１の製造方法に従う起原免疫原のサブセットに対し特異的な抗体の精製をするために、その配位子が該起原免疫原中に含まれる一部であるキャリアーたんぱく質複合体の使用。４３．ａ．以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠き、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む融合たんぱく質キャリアーセグメントからなる融合たんぱく質を、融合たんぱく質上のペプチド結合が解裂される条件下で培養する段階と；ｂ．望みのペプチドを分離する段階と：からなる、ペプチド製造方法。４４．該融合たんぱく質はキャリアーセグメント（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）中には見出されない解裂部位を含む請求項４３の製造方法。４５．該解裂部位は以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択されたアミノ酸と該キャリアーセグメント中には含まれない知られたプロテアーゼからの他の知られた解裂部位を含む請求項４３の製造方法。４６．該キャリアーセグメントを沈殿することにより解裂後に該ペプチドから該キャリアーセグメントを分離することからなる請求項４３の製造方法。４７．疎水性の表面へ該キャリアーセグメントを吸収することにより解裂後に該ペプチドから該キャリアーセグメントを分離することからなる請求項４３の製造方法。４８．天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む融合たんぱく質キャリアーセグメントとそこで融合たんぱく質が単離されて競争阻害性の基体として用いられる、プロテアーゼのための解裂部位とからなる融合たんぱく質からなるプロテアーゼ阻害剤。４９．該アミノ酸配列は以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠く請求項４８のプロテアーゼ阻害剤。５０．ａ．第一のアミノ酸配列は少なくとも約６５アミノ酸長であり、以下の負若しくは正電荷を持つ側鎖のアミノ酸：アルギニン、リシン、アスパルチック酸、グルタミック酸；又は無電荷の側鎖の以下のアミノ酸：システイン、トリプトファン及びメチオニン（アミノ末端部にあるメチオニンを除く）とからなる群から選択された少なくとも２つのアミノ酸を欠く、第一のアミノ酸キャリアー配列と；ｂ．該第一のアミノ酸キャリアー配列に融合した配位子と：からなる、その上でキャリアーたんぱく質合成物を吸収する固体支持物。５１．診断分析における使用のための請求項５０の固体支持物。５２．該配位子は問題のたんぱく質に選択的に結合するように適合される、たんぱく質の結合性精製における使用のための請求項５０の固体支持物。５３．該配位子は特定の細胞型又は特定の生育段階にある細胞に選択的に結合するように適合される、たんぱく質の結合性分離における使用のための請求項５０の固体支持物。５４．該配位子は第二のたんぱく質の選択された領域と相互作用するたんぱく質の領域を含む、選択されたたんぱく質の間の相互作用の研究における使用のための請求項５０の固体支持物。５５．（ａ）酵素が活動できる配位子を含む少なくとも一のキャリアーたんぱく質複合体が固体相に付着されて、酵素が基体上で活動するのに適当な時間と条件のもとで試験試料に接触され、（ｂ）発せられた信号が試験試料中の酵素の存在を示し、固定化基体の酵素に触媒された改良に応答して信号の変化を発生することの可能な信号発生剤が、反応が十分起きる時間の間に錯体に接触され、改善点は、捕獲剤として固体相へ、天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む組み換え融合たんぱく質キャリアーセグメントを付着させることからなる試験試料中の酵素の濃度を決める分析方法にある。５６．反−抗原抗体のための少なくとも一のたんぱく質の特質を含む容器を含み、改善点は反−抗原抗体に対し特異的である天然には存在しない疎水で殆ど不溶のアミノ酸配列を含む容器からなる試験試料中の反−抗原抗体の存在を検出する使用のための試験キット。５７．ａ．望みの抗原と特異的に反応する請求項３３の方法により製造された一又はそれ以上の抗体をそこに結合した固体支持物と；ｂ．結合されないたんぱく質を除く緩衝剤と；ｃ．結合された分析試料の検出のための溶液と；ｄ．使用のための指示書と；を分離された容器に含む、特定の抗原を検出するための免疫分析キット。