ES2144424T5 - Vacuna que comprende parte de la region constante de ige para el tratamiento de reacciones alergicas inducidas por ige. - Google Patents
Vacuna que comprende parte de la region constante de ige para el tratamiento de reacciones alergicas inducidas por ige. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA VACUNA, PREFERENTEMENTE PARA SERES HUMANOS, CONTRA LAS REACCIONES ALERGICAS MEDIADAS POR LA IGE. LA VACUNA CONTIENE UNA PROTEINA QUE TIENE TODA LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LOS DOMINIOS CONSTANTES CH2-CH3 DE LA CADENA EPSILON DE LA MOLECULA IGE O UNA UNIDAD ESTRUCTURALMENTE ESTABLE DE DICHA SECUENCIA DE AMINOACIDOS, EN DONDE LA PROTEINA SE PUEDE ENCONTRAR OPCIONALMENTE ACOPLADA A UNA O MAS PROTEINAS DE SOPORTE HETEROLOGAS Y OPCIONALMENTE CONTIENEN UN AUXILIAR. LA VACUNA SE INYECTA, CON O SIN AUXILIAR, PARA AUMENTAR LA CONCENTRACION DE ANTICUERPOS ENDOGENOS CONTRA LA IGE EN EL PLASMA DE SUJETOS ALERGICOS. EN LA PRACTICA, LA VACUNA SE PUEDE UTILIZAR CONTRA TODOS LOS TIPOS DE ALERGIAS MEDIADAS POR LA IGE PUESTO QUE LOS ANTICUERPOS NO DEPENDEN DE LA ESPECIFICIDAD DEL ANTIGENO DE LA MOLECULA IGE PERO REDUCIRA LA RESERVA TOTAL DE IGE DEL SUJETO. POR TANTO LA VACUNA ES UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE SUJETOS QUE PADECEN DIFERENTES TIPOS DE ALERGIAS MEDIADAS POR LA IGE.LAS CONCENTRACIONES AUMENTADAS DE ANTICUERPOS CONTRA LA IGE REDUCEN LA RESERVA LIBRE DE IGE ESPECIFICA AL ANTIGENO, CON LO QUE REDUCE EN GRAN MEDIDA EL RIESGO DE UNA LIBERACION MEDIADA POR EL ALERGENO DE SUSTANCIAS FISIOLOGICAMENTE MUY ACTIVAS ALMACENADAS O PRODUCIDAS JUNTO CON LA LIBERACION DE GRANULOS DE LAS CELULAS MASTETICAS Y LEUCOCITOS BASOFILICOS.
Description
Vacuna que comprende parte de la región
constante de IgE para el tratamiento de reacciones alérgicas
inducidas por IgE.
La presente invención se refiere a una vacuna
diseñada para aliviar los síntomas o evitar la inducción de
reacciones alérgicas inducidas por IgE. Aunque la invención se
refiere generalmente a una vacuna para usar en un animal, una
modalidad preferida de la misma se refiere a una vacuna para uso en
seres humanos y, por lo tanto, la invención se describirá
posteriormente generalmente con referencia a tal vacuna para uso en
seres humanos.
La IgE (inmunoglobulina E) es, a pesar de su
concentración normalmente muy baja en el plasma humano
(10-400 ng/ml), una causa principal de las
hipersensibilidades encontradas dentro de la población humana. Esta
propiedad se debe a su interacción con el receptor de alta afinidad
para IgE sobre células cebadas y leucocitos basófilos.
El entrecruzamiento de dos receptores de IgE
sobre la superficie de estos tipos de células, mediante unión a un
alérgeno, inicia la liberación de un número de sustancias
fisiológicamente activas tales como histamina, PAF (factor de
activación de plaquetas), heparina, factores quimiotácticos para
granulocitos eosinófilos y neutrófilos, leucotrienos,
prostaglandinas y tromboxanos. Estos mediadores son los que causan
los síntomas directos de las reacciones alérgicas inducidas por IgE
(hipersensibilidad de Tipo I). Estados de enfermedad pertenecientes
a este grupo incluyen la mayoría de los tipos de asma, alergias de
la piel, alergias al polen, muchos tipos de alergias alimentarias y
ciertos tipos de eczema.
El receptor de alta afinidad para IgE se ha
caracterizado tanto en el ámbito proteínico como genético en el
ratón, la rata y el hombre (Kinet y otros 1987; Shimizu y otros
1988; Tepler y otros 1989; Blank y otros 1989; Kinet y otros 1989).
Este receptor probablemente está presente sólo sobre células cebadas
y leucocitos basófilos en nuestro cuerpo. El receptor es un
complejo de tres subunidades diferentes, las llamadas cadenas
\alpha, \beta y \gamma. Es la cadena \alpha localizada
principalmente de forma extracelular la que interactúa con la
molécula de IgE.
Estudios detallados relativos a la región de la
cadena épsilon de la molécula de IgE que interactúa con el receptor
de alta afinidad para IgE han mostrado que una región de 76
aminoácidos en el límite entre los dominios CH2 y CH3 (CH =
dominios constantes en la cadena pesada) es de importancia decisiva
para la interacción entre la molécula de IgE y su receptor de alta
afinidad.
Se ha observado in vitro que este péptido
es capaz de inhibir la interacción entre IgE natural y su receptor
de alta afinidad en una relación molar de casi 1:1 en comparación
con la región CH2-CH3-CH4 completa
(Helm y otros, 1988). También se ha observado que este péptido es
capaz de inhibir una reacción eruptiva mediada por IgE en la
estimulación con alérgenos. Sin embargo, en este caso, la
concentración es aproximadamente 10 veces la concentración que con
IgE natural proporciona el mismo efecto inhibidor (Helm y otros,
1989).
Cuando la molécula de IgE se une a su receptor,
ciertas regiones de la cadena épsilon se bloquearán para la
interacción con otras moléculas, tales como por ejemplo anticuerpos
dirigidos contra epítopos dentro de la misma región de la molécula
de IgE. A continuación, el anticuerpo de IgE sólo puede unirse a un
anticuerpo de IgG dirigido contra la región CH2-CH3
de la molécula de IgE o al receptor y así nunca a ambas de estas
moléculas simultáneamente. Los anticuerpos que se unen a epítopos
fuera de la región que interactúa directamente con el receptor, al
contrario que los mencionados previamente, darán lugar al
entrecruzamiento de las moléculas de IgE que están unidas a la
superficie de una célula cebada. En este caso se tendrá una
liberación muy fuerte de gránulos y un choque anafiláctico en el
sujeto en el que se inyecta tal anticuerpo. Los anticuerpos que se
unen a la porción que se une al receptor, por el contrario, no serán
capaces de entrecruzar estos receptores y no se produce una
reacción inmediata sino un efecto de la disminución más prolongada
de la concentración de IgE que circula libremente. Esto
probablemente evitará la liberación de gránulos ya que ya no están
presentes anticuerpos de IgE en el plasma del sujeto.
Estos anticuerpos anti-IgE
probablemente también harán caer más permanentemente la población de
células B que producen IgE lo que incrementa la posibilidad de
obtener una supresión más prolongada de la síntesis de IgE. Durante
períodos de exposición a polen potente, entonces los anticuerpos se
unirán y eliminarán completamente la reserva de IgE que es la causa
de la fuerte reacción inflamatoria de los sujetos alérgicos al
polen. Un número de observaciones indica que los sujetos no
alérgicos tienen una concentración relativamente alta de
anticuerpos anti-IgE endógenos que se cree que
tienen un efecto inhibidor de la alergia similar.
El efecto de la vacuna de acuerdo con la
invención se basa en su capacidad para inducir una respuesta
inmunitaria contra la IgE del propio cuerpo que, debido a eso,
evitará la unión de los anticuerpos de IgE a estos receptores.
Debido a eso, se evitará la liberación de las sustancias que inducen
alergia almacenadas en las células cebadas.
Varios grupos de investigación en todo el mundo
trabajan hoy en día con la preparación de péptidos cortos u otras
moléculas con la capacidad para unirse al receptor de IgE y de ese
modo evitar la unión de IgE específica para el antígeno
(WO-A-88/00204 y
WO-A-89/04834). Entonces, se espera
que estas sustancias sean capaces de usarse como fármacos para el
tratamiento de alergias.
El problema en este caso es la gran dificultad
para obtener una molécula que tenga una fuerza de unión al receptor
correspondiente a la interacción muy fuerte entre la molécula de IgE
natural y su receptor. Para obtener una preparación eficaz
probablemente hay que trabajar con sustancias que se unan
irreversiblemente al receptor. Sin embargo, tales sustancias son
relativamente tóxicas ya que pueden unirse covalentemente y
bloquear otras moléculas estructuralmente similares del cuerpo. De
interés en este contexto es que la cadena \alpha del receptor de
IgE pertenece a una familia de genes más grande en la que, entre
otras cosas, están contenidos varios de los diferentes receptores
Fc de IgG. Estos receptores son absolutamente esenciales para la
defensa del cuerpo contra, entre otras cosas, infecciones
bacterianas. Las moléculas activadas con respecto a la unión
covalente a menudo son, por otra parte, relativamente inestables y
por lo tanto probablemente tienen que administrarse varias veces al
día y a continuación en concentraciones relativamente altas para
hacer posible bloquear completamente la reserva que se renueva
continuamente de receptores de IgE sobre células cebadas y
leucocitos basófilos.
Una compañía biotecnológica de los EE.UU. de A.
trabaja de acuerdo con un modelo que implica la producción en
ratones de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la región que
se une al receptor de IgE de la molécula de IgE humana. Estos
anticuerpos se "humanizan" a continuación mediante ingeniería
genética por lo que se reemplazan las regiones constantes del
monoclonal de ratón por las regiones humanas correspondientes. A
continuación, estos anticuerpos han de prepararse en forma pura a
gran escala para usarse para inyección. La humanización se usa para
reducir la reacción inmunitaria del cuerpo contra dichos anticuerpos
que de otra manera, después de la segunda o tercera inyección,
darían lugar a una formación masiva de complejo inmunitario que pude
conducir a complicaciones que amenazan directamente la vida.
Para el tratamiento de sujetos alérgicos al
polen, probablemente será necesario inyectar estos anticuerpos una
o varias veces por semana durante períodos de alta concentración de
polen. El problema con la inyección de anticuerpos monoclonales es
que, incluso si están "humanizados", contendrán altas
concentraciones de nuevos epítopos a los que el cuerpo nunca ha
estado previamente expuesto y probablemente se producirán altas
concentraciones de anticuerpo relativamente pronto incluso frente a
dichos monoclonales. Esto, probablemente, del mismo modo que para
monoclonales de ratón, dará lugar a complicaciones que amenazan la
vida mediante la formación de un complejo inmunitario ya que los
monoclonales todavía tienen las regiones "de marco de lectura"
de la región V de múrido. Para evitar estas complicaciones
probablemente será necesario usar un grupo muy grande de anticuerpos
humanizados que han de alternarse sucesivamente durante el
transcurso del tratamiento. Incluso cuando se administran muy
exactamente, sin embargo, serán seguidos todo el tiempo por el
riesgo de cuándo y en qué extensión se formarán complejos
inmunitarios.
Un grupo de investigación conducido por el Dr.
Stanworth ha trabajado de acuerdo con una estrategia que implica el
uso de un péptido humano acoplado a una proteína portadora
heteróloga para la inmunización en el conejo o la rata. En los
experimentos descritos por él, han usado el antisuero heterólogo de
conejo para tratar ratas. No han podido detectar ninguna respuesta
inmunitaria por ELISA en conejos en los que se ha inyectado el
antígeno, lo que muestra que la respuesta inmunitaria, incluso con
un péptido no específico de una especie, es tan débil que no es
detectable por uno de los métodos más sensibles conocidos
actualmente (Stanworth y otros, 1990). Dicho grupo usa péptidos
cortos de una región que está claramente fuera de la porción que se
une al receptor (CH2-CH3) de la molécula de IgE, lo
que de ese modo difiere claramente de la idea de la presente
invención que se describirá con detalle posteriormente. Una
desventaja general cuando se usan péptidos cortos es que carecen
casi completamente de la capacidad para formar una estructura
secundaria estable lo que probablemente también es una de las
razones de la respuesta inmunitaria muy débil en el sistema modélico
del Dr. Stanworth.
El objetivo de la invención es proporcionar una
vacuna diseñada para aliviar los síntomas de la inducción de
reacciones alérgicas inducidas por IgE en un mamífero, incluyendo el
hombre, vacuna que induce una respuesta inmunitaria contra la IgE
del propio cuerpo y de ese modo evitará la unión de los anticuerpos
de IgE a los receptores de IgE, con lo que se evitará la liberación
de las sustancias que inducen la alergia almacenadas en las células
cebadas.
El objetivo anterior se alcanza de acuerdo con
la invención mediante una vacuna que se caracteriza por contener
una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos entera de los
dominios CH2-CH3 constantes de la cadena épsilon
de la molécula de IgE de la especie de mamífero en cuestión o un
domino entero de dicha secuencia de aminoácidos, en su forma
original o en una ligeramente mutada, estando la proteína acoplada a
una o más proteínas portadoras heterólogas, y conteniendo
opcionalmente un adyuvante.
La invención también se refiere a un
procedimiento para la preparación de la vacuna y al uso de la
secuencia de aminoácidos entera de los dominios
CH2-CH3 constantes de la cadena épsilon de la
molécula de IgE de una especie de mamífero o un dominio entero de
dicha secuencia de aminoácidos, en su forma original o en una mutada
o multimerizada, para la preparación de una vacuna contra
reacciones alérgicas inducidas por IgE en la especie de mamífero en
cuestión.
En los dibujos adjuntos se muestra lo
siguiente:
Las figuras 1a y 1b muestran la respuesta de los
anticuerpos (la cantidad de anticuerpos anti-IgE) en
un grupo de cuatro razas de rata diferentes mediante medida por
ELISA de las concentraciones de anticuerpo contra IgE de rata
natural y contra IgE humana (como control).
La figura 2 muestra la supresión de una reacción
inflamatoria mediada por IgE en una rata vacunada en comparación
con una rata inmunizada con un blanco con una inyección de antisuero
anti-IgE policlonal.
La afirmación de que la secuencia de aminoácidos
(la secuencia entera o partes de la misma) de los dominios
CH2-CH3 constantes está presente en forma
"ligeramente" mutada significa que la mayor parte de la
secuencia de aminoácidos todavía es la secuencia de la proteína en
su forma original y que de ese modo el efecto es casi el mismo o
posiblemente algo reducido con relación a la secuencia original;
así, la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
"ligeramente" mutada todavía es tolerada por el cuerpo y por lo
tanto, de forma similar a su forma original, debe acoplarse, de
acuerdo con la invención, a una proteína portadora heteróloga para
actuar como antígeno.
La modalidad preferida actualmente de la
invención es el uso de una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos (la secuencia entera o una parte de la misma) de los
dominios CH2-CH3 constantes de la cadena épsilon de
la molécula de IgE en su forma original, estando la proteína
acoplada a una o más proteínas portadoras heterólogas, y por lo
tanto la invención se describirá posteriormente con detalle con
referencia a esta modalidad particular.
La invención se basa en un concepto enteramente
nuevo para solucionar los problemas asociados con métodos de la
técnica anterior para la inmunización contra reacciones alérgicas
inducidas por IgE ya que la vacuna de la invención tiene la
capacidad de inducir una respuesta inmunitaria contra la IgE del
propio cuerpo.
Estimulando al cuerpo para producir por sí mismo
una respuesta de anti-IgE policlonal se obtienen
anticuerpos que son enteramente específicos de la especie y debido
a eso mucho menos inmunogénicos. Estos anticuerpos se unirán a
continuación a la reserva libre de IgE que circula en el cuerpo y de
ese modo evitan la unión al receptor de IgE. El hecho de que la
respuesta inmunitaria sea policlonal y de ese modo el número de
moléculas del mismo idiotipo sea muy bajo provocará la eliminación
casi completa del problema de una respuesta
anti-idiotípica.
El hecho de que el método descrito aquí no se
haya intentado en la técnica anterior ha de relacionarse
probablemente con el problema de cómo obtener una respuesta de IgG
fuerte contra la IgE del propio cuerpo, ya que ésta es una molécula
a la que el cuerpo ha sido tolerante desde el nacimiento y así no
reacciona contra ella inmunológicamente. Para solucionar este
problema se usa, de acuerdo con la invención, una propiedad del
sistema inmunitario que es poco conocida pero que puede solucionar
de un modo único el problema que, con mucha probabilidad, afectará
a los proyectos monoclonales. Acoplando la región
CH2-CH3 (la proteína) a una proteína no específica
de la especie se evita la tolerancia del sistema inmunitario a la
IgE del propio cuerpo. Esto conduce al reclutamiento de una
población de células T no tolerizadas que normalmente habría dado
lugar sólo a una respuesta de los anticuerpos contra la molécula
extraña seleccionada como portador pero que también ayudará a las
células B a producir anticuerpos contra una molécula específica de
la especie. Ese efecto se obtiene acoplando la región
CH2-CH3 directamente a la proteína portadora.
Las consecuencias de este fenómeno se han
ignorado casi completamente en la comunidad inmunológica, lo que
puede explicar por qué ninguno otro grupo de investigación en todo
el mundo ha intentado un procedimiento similar. El inventor ha
analizado con detalle la posibilidad de usar este fenómeno, ya que
se han realizado muy pocos o ningún estudio similar. En los
estudios que se han hecho, que implican el acoplamiento de péptidos,
se ha hecho uso de péptidos humanos para la inyección en el conejo,
el ratón o la rata y no de péptidos de la misma especie de animal,
y la razón de esto es la opinión dominante de que no se puede
producir una respuesta inmunitaria fuerte contra moléculas
específicas de la especie.
Para confirmar que, de acuerdo con la invención,
puede obtenerse una respuesta inmunitaria fuerte contra una IgE
específica de la especie, se han realizado experimentos en los que
un grupo de razas de rata se ha inmunizado con una proteína de
fusión que contiene una molécula portadora acoplada a los dominios
CH2-CH3 enteros de la IgE de la rata (Ejemplo 2).
En estas ratas se ha obtenido (después de sólo 4 semanas) una
respuesta de anticuerpos fuerte frente a IgE de rata natural, es
decir, la forma de IgE que circula en el plasma de la rata. La
respuesta de anticuerpos tiene una fuerza que es sólo
insignificantemente inferior que el nivel (de la respuesta de
anticuerpos) que se obtiene en medidas de ELISA contra una proteína
completamente no específica de la especie, en este caso IgG humana
(figura 1).
La razón por la que el inventor, en contraste
con el Dr. Stanworth, obtiene tal respuesta inmunitaria fuerte se
debe probablemente a que la invención usa regiones mayores que los
péptidos que tienen sólo una longitud de aproximadamente 10
aminoácidos, es decir en este caso los dominios
CH2-CH3 enteros o uno de sus dominios enteros. Esta
es la razón por la que se obtiene un número mucho mayor de epítopos,
contra los que pueden formarse anticuerpos, y además de que estos
epítopos estén en la misma conformación que en la molécula de IgE
natural.
Por "proteína portadora heteróloga" se
entiende aquí cualquier proteína no específica de la especie que al
contrario no posea una homología demasiado alta con la
correspondiente proteína de la especie en la que la proteína ha de
usarse como portador. Sin embargo, deben evitarse proteínas tales
que normalmente no estén en nuestra cercanía ya que una reacción
inmunitaria muy fuerte puede provocar problemas si nos exponemos a
menudo a esta proteína.
Acoplando péptidos pequeños a una proteína
portadora heteróloga, normalmente sólo se obtiene una respuesta
inmunitaria relativamente débil contra una región muy restringida de
la molécula. Además, los péptidos dan lugar en una extensión muy
grande a una respuesta inmunitaria que sólo reacciona contra el
péptido y no contra la correspondiente región de la proteína
natural.
Es importante obtener una respuesta inmunitaria
muy fuerte que, además, reconozca la IgE natural, ya que la
constante de unión para la interacción entre la molécula de IgE y el
receptor de alta afinidad es muy alta y está dentro del intervalo
de 1 x 10^{-8} a 2,6 x 10^{-10} o superior (Froese, 1980).
Obteniendo, después de la inmunización, una respuesta policlonal
varios anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes epítopos
dentro de la región de CH2-CH3 podrán unirse
simultáneamente al mismo anticuerpo de IgE. Esto proporciona la
obtención de una fuerza de unión combinada muy alta para la IgE
libre. De ese modo, los anticuerpos anti-IgE serán
capaces de forma considerablemente más fácil, en comparación con el
caso de un anticuerpo monoclonal o de anticuerpos formados contra
péptidos cortos, de competir por la IgE libre del sujeto inmunizado.
Esto es de gran importancia ya que la interacción entre la IgE y el
receptor de alta afinidad es muy fuerte. La idea de la invención de
usar dominios enteros implica por lo tanto una ventaja muy grande y
un concepto enteramente nuevo en comparación con los procedimientos
peptídicos descritos previamente.
La respuesta de los anticuerpos contra los
péptidos a menudo tiene una afinidad baja o nula para la región de
aminoácidos correspondiente de la proteína natural, lo que significa
que la respuesta de los anticuerpos obtenida contra dominios
enteros o unidades estructuralmente estables de dominios supone una
diferencia decisiva en comparación con procedimientos previos de la
técnica.
Usando sólo la región CH2-CH3 (y
no, como se describe previamente, péptidos CH4 heterólogos) de la
molécula de IgE, el cuerpo, después de la inmunización, formará
casi exclusivamente anticuerpos contra la región de la molécula de
IgE que interactúa con el receptor de IgE. En teoría, hay un riesgo
de que los anticuerpos dirigidos contra la parte
N-terminal del dominio CH2 o la parte
C-terminal del dominio CH3 puedan dar lugar a un
choque anafiláctico en los mamíferos en los que se forman estos
anticuerpos. Sin embargo, la región variable del anticuerpo
corresponde al tamaño y un dominio entero y, por lo tanto, en la
mayoría de los casos, se obtendrá un impedimento estérico para la
unión al receptor incluso con tales anticuerpos. Además, los
anticuerpos se producirán continuamente contra un gran número de
epítopos mientras que la respuesta inmunitaria crece y por lo tanto
la probabilidad de que sólo uno de estos muy pocos anticuerpos se
una a una molécula de IgE es probablemente muy baja. Sin embargo,
un número de pruebas en animales ha mostrado que tales efectos de la
inmunización no pueden detectarse (cfr. el Ejemplo 2
posteriormente). Las ratas que tienen altos contenidos de
anticuerpos anti-CH2-CH3 en su
sangre no muestran ninguna tendencia a síntomas de ningún choque
anafiláctico. Desde el punto de vista de la salud, no pueden
diferenciarse de animales que han sido inmunizados solamente con
adyuvante (sin antígeno) o de animales que han sido inmunizados con
IgG humana. Esto indica que en animales de prueba no hay efectos
negativos detectables de esta inmunización aunque los animales
tengan concentraciones de anti-IgE muy altas. De
ese modo, es la primera vez que se ha observado que pueden obtenerse
altas concentraciones de anti-IgE contra IgE
específica de una especie. Además, estas ratas no muestran ningún
efecto negativo detectable de este tratamiento indicando que el
procedimiento de tratamiento con gran probabilidad también puede
usarse, sin complicaciones, para tratar seres humanos. Es más,
estos datos indican fuertemente que la reserva de IgE unida a
receptor de IgE en estas ratas es virtualmente inexistente. Por otra
parte, debe inducirse una fuerte reacción anafiláctica de los
anticuerpos anti-IgE que son capaces de unirse a las
regiones externas mencionadas previamente de los dominios CH2 y
CH3, incluso si la concentración de anticuerpo es relativamente baja
para tales anticuerpos. Esto es debido a que las células cebadas
son muy sensibles incluso a concentraciones muy bajas de
anticuerpos que se entrecruzan. En estudios preliminares se ha
observado que, durante la inmunización, los animales en los que se
presentan altas concentraciones de anti-IgE tienen
una tendencia muy fuertemente reducida a liberar sus gránulos de
células cebadas después de la provocación con anticuerpos
anti-IgE (Ejemplo 3; figura 2). El inventor está
realizando actualmente un estudio mucho más amplio que implica el
tratamiento de ratas que se han hecho fuertemente alérgicas contra
ovalbúmina de gallina. Los resultados de los ensayos sobre ratas
realizados hasta ahora son muy prometedores desde varios aspectos,
debido a que muestran que se obtiene una fuerte respuesta
inmunitaria que no tiene efectos negativos detectables y finalmente
que se obtiene una liberación de gránulo fuertemente reducida al
añadir un activador policlonal en estas ratas.
Una vacuna de este tipo puede hacer frente a
ciertas dificultades. Un factor que afecta fuertemente a las
posibilidades es la concentración de la sustancia que es deseable
retirar del cuerpo. Altas concentraciones en este caso significan
mayores dificultades. Si en este contexto se ha seleccionado
cualquiera de los otros isotipos de inmunoglobulina, el problema
debe haber sido aún mayor debido a las concentraciones en plasma
generalmente muy superiores de estos anticuerpos.
Debido a sus bajos niveles en plasma, en este
contexto la IgE es ideal. Los niveles en plasma en una población
normal de sujetos no alérgicos son de 10 a 400 ng/ml. Esta cantidad
corresponde a menos de 0,01% de la cantidad de inmunoglobulina
total en nuestra sangre. Estos niveles a menudo se incrementan algo
en sujetos alérgicos pero muy raramente superan 5 \mug/ml. Como
una comparación, pueden mencionarse aquí algunas pruebas realizadas
en ratones, en las que, usando anticuerpos dirigidos contra una de
las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas, se han obtenido
animales que carecen casi completamente de este tipo de
inmunoglobulinas. En estas pruebas, inyectando anticuerpos
monoclonales contra la cadena k de la inmunoglobulina del ratón, se
ha obtenido lo correspondiente a aproximadamente 95% de la cantidad
de inmunoglobulina total del ratón, una pérdida casi completa de
estos anticuerpos en la sangre del ratón (Weiss y otros, 1984). Los
restantes anticuerpos encontrados en el ratón son, hasta casi 100%,
del tipo de Ig \lambda (la concentración original de Ig \lambda
es sólo aproximadamente 5%). Esto muestra que, incluso en el caso
de concentraciones considerablemente superiores de la sustancia que
ha de retirarse del cuerpo, hay una posibilidad de retirar casi
completamente dichas sustancias de la circulación.
Otra posible complicación es que no se sabe nada
acerca de los efectos a largo plazo de inducir una autoinmunidad
fuerte. Sin embargo, una ventaja es que en este caso se usan células
T dirigidas contra moléculas no específicas de la especie para
generar una respuesta inmunitaria contra un antígeno específico de
la especie. Si el programa de vacunación está terminado, la
respuesta de los anticuerpos contra la IgE del propio cuerpo
disminuirá lentamente hasta niveles no detectables después de
algunos meses. Esto se produce si no se promueve con
CH2-CH3 acoplados a exactamente la misma molécula
portadora que se usa en la vacunación inicial. Este fenómeno se ha
observado en muchos estudios detallados en el ratón, donde se ha
observado que la respuesta inmunitaria secundaria contra haptenos,
acoplados a diferentes portadores, depende totalmente de la molécula
portadora inicialmente seleccionada. Si cualquier sujeto por alguna
razón no previsible improbable reacciona negativamente a esta
inmunización, la inmunización puede terminarse y las
concentraciones de anticuerpo alcanzarán probablemente niveles no
detectables en unos pocos meses. Esto es similar a lo que sería el
caso cuando se inyectan anticuerpos monoclonales dirigidos contra
la IgE del propio cuerpo.
La proteína acoplada usada como componente
principal de la vacuna anti-alérgica puede, desde un
punto de vista técnico, prepararse de dos modos diferentes. Uno
implica la producción de una proteína ya acoplada, la llamada
proteína de fusión, en celdas huésped procarióticas o eucarióticas.
Como huéspedes procarióticos normalmente se usa la bacteria
Escherichia coli, aunque puede usarse un número de sistemas
diferentes, tales como células de levadura o líneas celulares, como
huéspedes eucarióticos. Las líneas celulares pueden derivarse desde
insectos hasta seres humanos. Sin embargo, las células humanas se
evitan normalmente para uso clínico ya que siempre hay un riesgo de
contaminación por virus humanos en los cultivos celulares. La
segunda técnica se basa en un acoplamiento químico directo de la
proteína portadora y el componente activo específico de la especie,
en este caso la región CH2-CH3 entera de la molécula
de IgE o uno de sus dominios enteros. A continuación, las proteínas
se producen separadamente. Esta técnica es la usada normalmente en
inmunizaciones con péptidos sintéticos así como en la inmunización
con pequeños haptenos (de sustancias que no son proteínas) y se basa
en la activación química de la proteína portadora con, por ejemplo,
CNBr, y a continuación la mezcladura del portador activado con el
péptido o el fragmento de proteína con el que se quiere acoplar.
Estos dos se acoplan a continuación covalentemente entre sí.
La inmunización se realiza mezclando vacuna
proteínica soluble o agregada con una sustancia potenciadora de la
respuesta inmunitaria (adyuvante) que a continuación se inyecta
subcutáneamente, intraperitonealmente o intramuscularmente. Las
ratas estudiadas hasta ahora han sido inyectadas con la vacuna
subcutáneamente o intraperitonealmente. En estas pruebas se ha
hecho uso de cantidades de aproximadamente 100 \mug de antígeno
por rata y ocasión de inmunización y con estas concentraciones se
han obtenido respuestas inmunitarias muy fuertes en un grupo de
diferentes razas de rata (figura 1). En seres humanos se usarán en
primer lugar adyuvantes atóxicos relativamente débiles, tales como
alumbre, o, como una alternativa, inyecciones de cantidades mayores
de proteína de fusión agregada sin la adición de adyuvante. La
proteína de fusión agregada pretende incrementar la inmunogenicidad
de la proteína.
Además, en seres humanos, se usarán
probablemente cantidades considerablemente mayores del antígeno,
posiblemente del orden de 100-500 mg de proteína
pura. Desde un punto de vista técnico esto no implica problemas
mayores ya que es posible obtener cantidades muy grandes de esta
proteína de fusión en una forma muy pura y a un precio que no es
demasiado disuasorio. En la situación actual hay un número de
variantes de proteínas de fusión en la producción a pequeña escala
para la vacuna humana así como para la vacuna de rata. Sin embargo,
el análisis de la vacuna humana espera los resultados del estudio
muy voluminoso que se está efectuando actualmente en diferentes
razas
de rata.
de rata.
Las inyecciones repetidas se hacen inicialmente
con un intervalo de aproximadamente 3 semanas para obtener una
respuesta inmunitaria fuerte. Posteriormente, probablemente será
necesario realizar las inmunizaciones sólo unas pocas semanas antes
de cada período de polen para un sujeto alérgico al polen, para
activar la respuesta inmunitaria previa y amplificar fuertemente
esta respuesta antes del nuevo período de alto riesgo.
Además, usando un número de moléculas portadoras
heterólogas, a las que se han acoplado proteínas o fragmentos de
proteína específicos de la especie, el número porcentual de células
T se incrementará. Esto ayudará a que las células T produzcan
anticuerpos dirigidos contra, como en este caso, la región
CH2-CH3 de la molécula de IgE humana. Mediante esta
refinación del procedimiento de inmunización se espera poder
disminuir las cantidades de antígeno que necesitan usarse para la
inmunización mientras se retiene el efecto de inmunización. Este
último procedimiento no será de interés inmediato hasta que se
realicen ensayos clínicos en seres humanos, donde no pueden usarse
adyuvantes fuertes y por lo tanto todos los métodos disponibles
deben usarse para incrementar la inmunogenicidad de
la vacuna.
la vacuna.
Según se menciona anteriormente, el propósito de
la invención es principalmente preparar una vacuna para usar en
seres humanos. Sin embargo, dentro del alcance de la invención
también hay vacunas para otras especies de mamíferos en las que es
económicamente importante vacunar contra reacciones alérgicas
inducidas por IgE. Ejemplos de tales especies son perros, caballos
y cerdos.
La invención se ilustrará adicionalmente a
continuación mediante los siguientes ejemplos de trabajo
específicos.
En este Ejemplo se ha hecho uso de un sistema en
el que la proteína específica de la especie y la proteína portadora
se producen en bacterias, en este caso Escherichia coli, en
una forma acoplada. Por medio de la técnica de PCR (Reacción en
Cadena de la Polimerasa) las secuencias de cDNA para las regiones
CH2-CH3 de la cadena épsilon de IgE tanto de ser
humano como de rata se han clonado y ligado en un vector disponible
comercialmente para la producción de una proteína de fusión en
huéspedes bacterianos. El vector usado es un miembro de los
llamados vectores pGEX de forma 1, 2 ó 3 con diferentes marcos de
lectura para la ligación de fragmentos de cDNA (Smith y Johnson,
1988). Se ha observado que este tipo de vectores, en este caso, da
altos rendimientos de proteína de fusión pura para la inmunización
directa. En esta familia de vectores la región de codificación
entera para una
glutationa-S-transferasa de 26 kD
(Sj26) del gusano parásito Schistosoma japoncium se clona
después de un promotor bacteriano fuerte e inducible. Este promotor,
el llamado promotor tac, es regulado negativamente por el represor
lac. Para obtener grandes cantidades de proteína, la inhibición del
promotor es revelada por medio de IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido).
Después de la ligación del fragmento CH2-CH3 en el
vector en la parte C-terminal del gen Sj26, este
vector se transforma en una cepa de E. coli para la
producción de la proteína de fusión. Un cultivo durante la noche de
esta nueva bacteria, que contiene el vector en el que se ha ligado
el fragmento deseado, se diluye en la relación 1:10 en medio de
crecimiento bacteriano y se deja crecer adicionalmente durante 2
horas. A continuación se añade IPTG hasta 100 \muM y el cultivo
se incuba mientras se remueve vigorosamente durante 4 horas más. A
continuación, las bacterias se recogen mediante centrifugación y el
pelet de células se lava 3 veces en PBS. Después de lavar las
células se suspenden en PBS + 1% de Triton
X-100 y se someten a ultrasonidos durante 5 x 15
segundos para romper las paredes celulares de las bacterias para
liberar la proteína de las células. Se ha observado que en el caso
de proteínas de fusión de CH2-CH3 tanto de rata
como de ser humano, la proteína se precipita intracelularmente como
cristales y por lo tanto tiene que solubilizarse por medio de una
solución que contiene urea 8 M. A continuación, la proteína humana
puede dializarse contra PBS pura y hacerse completamente soluble. En
la actualidad se está trabajando para obtener un procedimiento para
la purificación a gran escala hasta una pureza de casi 100% para la
proteína de fusión humana. Sin embargo, la proteína de fusión
CH2-CH3 de la rata es más insoluble y la mayor parte
de la proteína precipita ya después de la diálisis durante de media
hora a una hora. En los siguientes Ejemplos se ha hecho uso de una
preparación de proteína de fusión de la rata CH2-CH3
que tiene una pureza de aproximadamente 50%. Estas preparaciones se
han usado para estudiar la posibilidad de obtener una fuerte
respuesta de anticuerpo contra la IgE de la propia rata y para
estudiar las posibilidades de bloquear una reacción inflamatoria
fuerte mediada por IgE en la rata. El restante 50% de la proteína
en la preparación consiste en diferentes proteínas bacterianas
contaminantes, por lo que una sola proteína no es más de 10% de la
proteína total.
La inmunización o la vacunación se realiza por
medio de la preparación de proteína de fusión del Ejemplo 1
mezclada con una sustancia potenciadora de la respuesta inmunitaria
(adyuvante) para formar una vacuna. Las ratas que se han estudiado
se han inyectado con la vacuna subcutáneamente o
intraperitonealmente con una mezcla de proteína soluble y agregada.
En estas pruebas se ha hecho uso de cantidades de aproximadamente
100 \mug de antígeno por rata en 0,2 ml de adyuvante completo y
adyuvante incompleto de Freund, respectivamente, por ocasión de
inmunización y rata. Con estas concentraciones y adyuvantes se han
obtenido respuestas inmunitarias muy fuertes en un grupo de
diferentes razas de rata.
En la figura 1a y b se muestra un ensayo con
cuatro razas de rata diferentes y tres ratas por raza. Las
concentraciones de anticuerpo contra IgE natural se han medido por
medio de ELISA. Este ensayo se ha realizado de tal modo que se ha
usado IgE natural en tampón de revestimiento (5 \mug/ml) para el
revestimiento de las placas de ELISA. Se han probado a continuación
diluciones sucesivas (1/5) de suero de rata de los diferentes
animales de prueba con respecto a la reacción colorimétrica en el
ELISA. Los valores de absorbancia a 400 nm se representan en el eje
Y en la figura 1 y las diferentes diluciones 1/5, con diluciones
crecientes hacia la derecha en la figura, se representan en el eje
X.
Se han analizado las cuatro razas de rata
diferentes (Lewis, Sprague Dawley, Wistar y Brown Norway), en el
cuadro de la izquierda, con respecto a su capacidad para responder a
la vacuna de CH2-CH3 y, en el cuadro de la derecha,
contra IgE humana (como control). La vacuna usada es la
CH2-CH3 de la rata, que en la rata corresponde
totalmente a la vacuna humana. Esas ratas sólo han sido vacunadas
dos veces; para comenzar con una vacunación con adyuvante completo
de Freund y proteína de fusión y a continuación una segunda
vacunación tres semanas después con la misma solución de proteína
en adyuvante incompleto de Freund. Una semana después de la segunda
vacunación, se tomaron muestras de sangre de las ratas. El contenido
de anticuerpos anti-IgE en la sangre se determinó a
continuación mediante un ensayo ELISA. Como puede observarse
claramente a partir de la figura, tres de las razas responden muy
bien a la vacuna mientras que la cuarta raza es la llamada "no
respondedora", que no es inusual cuando se usan, como en este
caso, razas congénicas. Por esto, se entiende que esta misma raza
de rata no puede presentar este antígeno para el sistema inmunitario
y que, por lo tanto, sería necesario usar otra proteína portadora
heteróloga en esta raza de rata para obtener el efecto deseado de
la vacuna para la alergia.
Como puede observarse a partir de estas medidas
de ELISA iniciales, se obtiene una respuesta inmunitaria muy fuerte
contra sólo dos dominios de la IgE de rata, lo que ha de compararse
con la reacción sólo ligeramente más fuerte obtenida contra la IgG
humana que, además, tiene un tamaño correspondiente a cuatro
dominios. Estas ratas, que muestran concentraciones de
anti-IgE muy altas, no muestran ningún síntoma
negativo en absoluto. En la práctica, no pueden distinguirse,
mediante ningún criterio, de las ratas que han sido inmunizadas sólo
con PBS pura en adyuvante de Freund (los controles, marcados
"blanco" en la figura 1).
También se han realizado estudios dirigidos a
determinar la capacidad de la vacuna de la invención para suprimir
una reacción inflamatoria fuerte mediada por IgE. Como un sistema de
ensayo se ha hecho uso del hecho de que los anticuerpos
anti-IgE tienen una capacidad para entrecruzar
anticuerpos de IgE unidos a células cebadas de la piel y para
inducir, mediante su capacidad para entrecruzar estas moléculas de
IgE, una liberación de gránulos potente y de ese modo provocar una
reacción inflamatoria fuerte en el lugar en el que se han inyectado
los anticuerpos (en este caso la piel). En este ejemplo se ha hecho
uso de un antisuero anti-IgE policlonal dirigido
contra la región constante entera de IgE. Por lo tanto, este suero
debe contener grandes cantidades de anticuerpos que se entrecruzan
lo que también se confirma por los resultados. La fuerza de la
inflamación se mide a continuación por medio de una reacción
cromática. La permeabilidad y de acuerdo con esto la pérdida de la
sangre de diferentes proteínas sanguíneas se incrementaban
fuertemente en la región en la que se ha provocado la inflamación.
Cuanto más fuerte es la inflamación, mayor es la zona azul que se
obtiene si se inyecta una solución de Azul de Evans al 1% en la
sangre de las ratas de prueba dos horas antes de leer el tamaño de
la zona azul bajo la piel de los animales de prueba. La prueba, que
se muestra esquemáticamente en la figura 2, se realizó de tal modo
que se hicieron cuatro inyecciones de 50 \mul cada una de una
solución concentrada de un antisuero anti-IgE
policlonal bajo la piel de una rata vacunada y una rata inmunizada
con blanco dos horas antes de la retirada de la piel y la medida de
las zonas de inflamación. Como control se hicieron inyecciones de
IgE + anti-IgE en un punto por rata y de sólo PBS en
un punto. Dos ejemplos típicos de estas ratas se muestran en la
figura, en la que una de las ratas se inmunizó con vacuna
CH2-CH3 en adyuvante de Freund y la otra rata de
control se inmunizó con PBS en adyuvante de Freund. Las zonas de los
controles de IgE + anti-IgE tienen un tamaño muy
similar para las dos ratas, mientras que las zonas de las
inyecciones sólo con anticuerpos anti-IgE se han
reducido hasta casi cero para la rata vacunada. Los anticuerpos
anti-IgE solamente provocaban zonas azules intensas
para la rata inmunizada con blanco (como control). Esto muestra que
la rata vacunada probablemente carece completamente de anticuerpos
de IgE sobre la superficie de sus células cebadas, lo que está
completamente de acuerdo con el resultado que ha de esperarse de las
inmunizaciones, en las que en estas ratas se han encontrado altas
concentraciones de anticuerpos anti-IgE endógenos.
Sin embargo, no carecen de células cebadas ya que es posible
retener una zona azul normal añadiendo IgE exógena junto con los
anticuerpos anti-IgE y de ese modo unir de nuevo los
receptores de las células cebadas sobre estas células cebadas que
probablemente estaban libres originalmente de IgE.
En la actualidad se realiza un trabajo con
resultados muy prometedores en un nuevo modelo de ratas en el que,
para comenzar, se provoca una respuesta de IgE muy fuerte en ratas
Wistar que responden bien a la vacuna de rata de acuerdo con la
invención (cfr. La figura 1). La inmunización de las ratas se
realiza con un antígeno específico que en este caso es ovalbúmina
junto con la toxina ricina, de acuerdo con un procedimiento
desarrollado recientemente por el Dr. Kemeny
(Díaz-Sánchez y Kemeny, 1991). Después de un número
de semanas estas ratas obtienen una respuesta muy fuerte de IgE a
ovalbúmina y, por otra parte, esta respuesta inmunitaria es
relativamente prolongada. Estudios iniciales han dado resultados
muy buenos con este procedimiento. Un número de ratas se ha
analizado con respecto a su capacidad para dar lugar a una reacción
inflamatoria fuerte en la piel después de la inyección de 50 \mul
de una solución que contiene 5 mg/ml de ovalbúmina. Esto ha dado
zonas azules que son casi dos veces más grandes que los controles
positivos mencionados previamente con IgE +
anti-IgE, lo que demuestra que estas ratas son
extremadamente alérgicas a la ovalbúmina. Este tipo de ratas se usa
actualmente para estudiar la posibilidad de bloquear reacciones
alérgicas en la piel y a continuación para estudiar los efectos
sobre broncoconstricciones y otros síntomas típicos relacionados con
la alergia.
A continuación seguirá, en cuatro puntos, un
resumen de las diferencias esenciales entre la presente invención y
la técnica anterior.
1. La invención se dirige solamente a los
dominios de la molécula de IgE que están implicados directamente en
la interacción con el receptor de IgE y no, como en estudios
previos, a regiones en el dominio C4 que no interactúa con el
receptor.
2. La vacuna de la invención contiene fragmentos
de proteína específicos de una especie, acoplados con uno o más
portadores heterólogos, lo que hace posible montar una respuesta
autoinmunitaria fuerte, en contraste con los estudios previos, en
los que se ha hecho uso de péptidos épsilon de otra especie distinta
a aquélla en la que se inyecta el péptido acoplado, es decir
péptidos humanos en ratón, rata o conejo.
3. Al contrario de los proyectos monoclonales
desarrollados en varios laboratorios en todo el mundo, la invención
se basa en la generación de una respuesta inmunitaria policlonal a
una proteína específica de una especie, lo que incrementa
considerablemente las posibilidades de obtener un resultado
satisfactorio ya que de ese modo se evitarán muy probablemente
complicaciones relacionadas con el complejo inmunitario, que
conducen a reacciones inflamatorias que amenazan la vida.
4. La diferencia más importante es que, de
acuerdo con la invención, se hace uso de los dominios CH2CH3 o uno
de sus dominios enteros como vacuna. De ese modo se obtiene una
respuesta policlonal fuerte en sistemas con animales de prueba (ya
mostrados) contra IgE natural, lo que es una propiedad muy
importante de una vacuna de este tipo (también mostrada). Esto se
obtiene después de sólo unas pocas semanas de inmunización, lo que
significa un avance muy grande en comparación con procedimientos
previos realizados en la técnica con péptidos sintéticos
cortos.
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Claims (5)
1. Una vacuna para la inmunización de un
mamífero contra reacciones alérgicas inducidas por IgE,
caracterizada porque comprende, como un inmunógeno, un
conjugado inmunogénico que comprende una proteína portadora
heteróloga a la que está acoplada una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos entera de los dominios CH2CH3 constantes
de la cadena épsilon de la molécula de IgE de la especie de mamífero
en cuestión o un dominio entero de dicha secuencia de aminoácidos,
estando dicha secuencia de aminoácidos o dominio entero de la misma
en su forma original o una ligeramente mutada, permitiendo de ese
modo que dicho mamífero produzca, después de haber recibido dicho
conjugado inmunogénico a través de inyección, anticuerpos
policlonales para IgE natural, anticuerpos que son capaces de
unirse a IgE natural circulante.
2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizada porque el conjugado inmunogénico es una
proteína de fusión entre la proteína portadora y dicha secuencia de
aminoácidos entera o dominio entero de la misma.
3. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 2,
caracterizada porque la proteína de fusión se ha producido
mediante tecnología de DNA recombinante en un huésped
procariótico.
4. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 3,
caracterizada porque el huésped procariótico es
Escherichia coli.
5. Uso de la secuencia de aminoácidos entera de
los dominios CH2CH3 constantes de la cadena épsilon de la molécula
de IgE de una especie de mamífero o un dominio entero de dicha
secuencia de aminoácidos, estando dicha secuencia de aminoácidos o
dominio entero de la misma en su forma original o una ligeramente
mutada, estando la secuencia de aminoácidos acoplada a una proteína
portadora heteróloga, para la preparación de una vacuna para la
inmunización del mamífero en cuestión contra reacciones alérgicas
inducidas por IgE.
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