JP2005527490A - 筋肉内投与のための二重特異性抗体ｄｎａ構築物 - Google Patents

Abstract

多鎖タンパク質は、該タンパク質の鎖をコードする１以上のベクターを筋肉内注射することにより、また任意により該注射部位から１以上の電気パルスを印加することにより、被験体において生成しうる。この抗体生成手法は、例えば疾患治療のためにｉｎ ｖｉｖｏで多鎖タンパク質を発現させること、及び発現されたタンパク質の１以上の外来抗原決定基に対する免疫応答を誘発することなどの種々の用途を有する。

Description

本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける筋肉からの多鎖タンパク質の発現に関する。

多くの遺伝的変化が疾患（例えば、癌、筋ジストロフィー及び嚢胞性繊維症）を引き起こすことが確認されており、また細胞への機能的外来遺伝子の送達（すなわち、遺伝子送達）が治療方法として提案されている。種々の遺伝子送達手法が考慮されてきたが、そのうちの若干が成功を収めているにすぎない。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３，５７０（１９９０）参照。

ウイルスベクターは、トランスフェクション効率が比較的高く、またベクターＤＮＡを宿主ゲノムに実際に組み込むことに起因する長期発現が可能であるため、遺伝子送達に広く用いられている。しかしながら、ウイルスの使用に伴う危険性、例えば、プロト癌遺伝子の活性化、複製能力のないウイルスから野生型ウイルスへの復帰、ウイルスタンパク質の免疫原性、及び発現されたトランスジーンの免疫原性に対するウイルスタンパク質のアジュバント効果がある。

裸のＤＮＡが取り込まれて、ｉｎ ｖｉｖｏで筋肉細胞により一過性に発現されるという発見によって、遺伝子送達のための非ウイルス性運搬体の使用の重要性が増している。Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５（１９９０）；Ａｃｓａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，８１５（１９９１）参照。外来ＤＮＡの細胞取り込みとそれに続く発現の機序は明らかでない。また、導入効率は低く、最大でも数週間又は数ヶ月の一過性発現が観察されるにすぎない。遺伝子送達は将来有望な研究分野であるが、遺伝子を導入し、そしてｉｎ ｖｉｖｏにおいて遺伝子産物の有用な発現レベルを達成するための新規な方法が必要である。

発明の概要
本発明の一つの態様によれば、個体の循環中で少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成させる方法が提供される。この方法は、ポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを、個体の筋肉中に、筋肉細胞中への該ベクターの取り込みがタンパク質の分泌を引き起こすように注射することを含む。各鎖をコードするＤＮＡは、単一ベクター又は別個のベクター上に配置されていてよい。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。

いくつかの実施形態において、タンパク質は個体に対して外来の１以上の抗原決定基を含み、これによって、個体において発現されたタンパク質に対する免疫応答が生じる。個体における免疫応答としては、例えばタンパク質の外来抗原決定基の１以上に対する抗体の血清中での生成などを挙げることができる。

本発明の別の態様によれば、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むタンパク質に対する抗体を得るための手法が提供される。この手法は、ポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを、個体の筋肉中に、筋肉細胞中への該ベクターの取り込みがタンパク質の分泌を引き起こすように注射することを含む。この手法によれば、タンパク質は、個体による抗体の生成を引き起こす、個体に対して外来の１以上の抗原決定基を含む。この手法を促進するため、抗体は、個体から、好ましくは循環から得られる。各鎖をコードするＤＮＡは、単一ベクター又は別個のベクター上に配置されていてよい。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。

本発明のもう一つの態様によれば、二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを個体の筋肉内に筋肉内注射することを含む免疫処置方法であって、該二重特異性抗体が該個体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な第１結合部位及び免疫処置が望まれる抗原に対して特異的な第２結合部位を有する、上記方法が提供される。注射後に個体の筋肉細胞中にベクターが取り込まれることによって、個体の循環において二重特異性抗体の分泌が生じる。この方法を促進するため、抗原は、個体に投与されて、二重特異性抗体により抗原提示細胞に対して標的化される。各鎖をコードするＤＮＡは、単一ベクター又は別個のベクター上に配置されていてよい。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。

本発明のさらにもう一つの態様によれば、少なくとも１つの発現ベクターを個体の筋肉内に注射することを含む免疫処置方法であって、該ベクターは抗体融合タンパク質をコードするものであり、該融合タンパク質が個体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な抗体を含み、該抗体は免疫処置が望まれるポリペプチド抗原に融合しており、そして筋肉細胞中への該ベクターの取り込みによって該抗体融合タンパク質の分泌が生じる、上記方法が提供される。この方法によれば、分泌された融合タンパク質は、個体の抗原提示細胞の表面に対して抗原を標的化させるように機能する。各鎖をコードするＤＮＡは、単一ベクター又は別個のベクター上に配置されていてよい。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。

本発明のさらに別の態様によれば、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性の試験方法が提供される。この方法は、ポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを、筋肉細胞中への該ベクターの取り込みがタンパク質の分泌を引き起こすように個体の筋肉中に注射すること、次いで発現されたタンパク質の生物学的活性を試験することを含む。一つの実施形態において、生物学的活性は個体において生じるものである。別の実施形態において、発現されたタンパク質を個体から取り出し、次いでその活性を試験する。各鎖をコードするＤＮＡは、単一ベクター又は別個のベクター上に配置されていてよい。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。

図面の簡単な説明
図１は、本発明に従って免疫グロブリン発現ベクターを投与したマウスの血清における組換え免疫グロブリンの発現を示す。図１Ａは、示した抗体発現ベクターを筋肉に注射した後、注射部位にエレクトロポレーション（ＥＰ）を行った（＋）又は行わなかった（−）マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）において、６日目に発現されたキメラＩ−Ｅ^ｄ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の血清レベルを示すグラフである。図１Ｂは、ｃｏｍｂｉ発現ベクター（重鎖及び軽鎖をコードする）を筋肉に注射した後、注射部位にエレクトロポレーション（ＥＰ）を行った（＋）又は行わなかった（−）マウス（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６）において、示した日に発現されたキメラＩ−Ｅ^ｄ特異的抗体の血清レベルを示すグラフである。図１Ｃは、ｃｏｍｂｉ発現ベクターを筋肉に注射した後、注射部位にエレクトロポレーションを行ったマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂａｌｂ．Ｂ、Ｂ１０．Ｄ２及びＣ５７ＢＬ／６）において、示した日に発現されたキメラＩ−Ｅ^ｄ特異的抗体の血清レベルを示すグラフである。図１Ｄは、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを筋肉内注射により筋肉に同時投与した後、注射部位にエレクトロポレーションを行ったマウス（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ．Ｂ−１７）において、示した日に発現されたキメラＩｇＤ^ａ特異的抗体の血清レベルを示すグラフである。

図２は、本発明に従って生成された、組み立てられた抗体（assembled antibody）を示す。重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを筋肉内注射により筋肉に同時投与した後、注射部位にエレクトロポレーションを行ったマウスから、血清を取得した。キメラＩｇＤ^ａ特異的抗体を、プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに結合させ、それから溶出させることにより、血清から濃縮した。溶出物をメルカプトエタノール（ＭＥ）で処理して又は処理しないで、発現されたキメラＩｇＤ^ａ特異的抗体の重鎖（抗ヒトκ）及び軽鎖（抗ヒトＩｇＧ３）に対して特異的な抗体を用いるウェスタンブロット法を行った。

図３は、抗免疫グロブリン抗体が、本発明に従って生成された組換え抗体を発現するマウスにおいて誘導されることを示す。図１Ｃ及び１Ｄに示した２８日目の実験における動物に由来する血清を、ヒトＩｇＧ３免疫グロブリンで被覆したＥＬＩＳＡプレートで分析し、そして抗マウスＩｇＧ１（黒色棒）及びＩｇＧ２抗体（灰色棒）を用いて検出した。左側のパネルは図１Ｃからの血清を表し、一方、右側のパネルは図１Ｄからの血清を表す。結果は抗体終点力価として表され、また誤差棒は平均の標準誤差である。

図４は、本発明に従って誘導されたキメラ抗体のマウスの血清ｍＡｂ発現を示す。図４Ａは、それぞれ５０μｇのプラスミドｐＬＮＯＨ２γ２ｂＶＨＴ及びｐＬＮＯκＶＬＴ（完全マウスＩｇＧ２ｂ重鎖及びキメラ軽鎖（マウス可変ドメイン、ヒトＣκドメイン）を有する抗ＩｇＤ^ａｍＡｂを一緒にコードする）をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ．Ｂ−１７）に同時投与した後、エレクトロポレーションを行った（＋ＥＰ）又は行わなかった（−ＥＰ）マウスにおける抗ＩｇＤ^ａ特異的抗体の血清レベルを示す。ＩｇＤ^ａ特異性を有する血清マウスＩｇＧ２ｂの動態が示されている。図４Ｂは、１００若しくは１０μｇ（主グラフ）又は５０μｇ（挿入グラフ）の各々のプラスミドｐＬＮＯＨ２γ２ｂＶＨＮＰ及びλ１（これらは完全マウスＩｇＧ２ｂλ１及び抗ＮＩＰ ｍＡｂを一緒にコードする）を筋肉内注射により同時投与した後、ＥＰを行った又はＥＰを行わなかったＢＡＬＢ／ｃマウスにおける４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（ＮＩＰ）−特異的抗体の血清レベルを示す。ＮＩＰ特異性を有する血清マウスＩｇＧ２ｂの動態が示されている。各グループは３〜７マウスからなり、棒は平均の標準誤差を示す。

図５は、本発明に従って血清において発現された抗体が生物学的活性を有し、完全なＦｃ領域及び正常な糖鎖付加を有することを示す。マウスＩｇＧ２ｂ抗ＮＩＰ ｍＡｂをコードするＩｇ遺伝子（白四角）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトした細胞の上清から精製した対応のｍＡｂ（黒四角）の注射／エレクトロポレーションを行ったマウスの血清を、ヒト補体の存在下において、ＮＩＰ感作^５１Ｃｒ標識ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の溶解能について試験した。陰性対照として、補体を活性化しないマウスＩｇＧ１抗ＮＩＰ（クローンＮ１−Ｇ９ｍＩｇＧ１；黒菱形）を含ませた。細胞毒性指数（ＣＩ）を、次の式から計算した：
％ＣＩ＝［（ｃｐｍ試験−ｃｐｍ自発）／（ｃｐｍ最大−ｃｐｍ自発）］×１００

図６は、本発明の方法に従って、Ｂリンパ球様細胞マーカーＩｇＤに対する抗体は、循環中で発現させることができ、また個体においてＩｇＤ Ｂ細胞の枯渇を引き起こすことを示す。ＩｇＤ陽性Ｂ細胞の割合は、ベクターを投与しエレクトロポレーションを行ったグループにおいて低下する。

発明の詳細な説明
本発明の方法は、筋肉が、筋肉内で通常は発現されない多鎖タンパク質の発現を支持することができ、そして、このような発現が、検出可能な活性ヘテロ多量体タンパク質の全身循環中への放出と蓄積、及び／又は個体において組織により発現された抗原への吸着を引き起こすという発見に基づいている。ヘテロ多量体の種々のポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを骨格筋に注射するときに、注射部位のエレクトロポレーションと最適に組み合わせると、完全な特異性及び生物学的エフェクター機能を有する組み立てられたヘテロ多量体が生じる。低い電圧として、電流がＤＮＡ注射部位を通過するような電気パルス（１以上）を印加するｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションは、循環中でヘテロ多量体を発現させるのに有用である。

従って、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むタンパク質を個体の循環中で生成する方法が提供され、この方法は、該ポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを該個体の筋肉内に注射することを含む。この方法によれば、筋肉細胞中へのベクターの取り込みは、ポリペプチド鎖の生成及びタンパク質の分泌を引き起こす。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。

本明細書で用いられる「ポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクター」又は「重鎖及び軽鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクター」という用語は、多鎖タンパク質の異なる鎖の全て（又は免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖）をコードする単一ベクターを筋肉に筋肉内注射すること、又はそれぞれが多鎖タンパク質の鎖のうち１つをコードする別個のベクターを筋肉内注射することを意味する。後者の場合、別個のベクターを、好ましくは同時に投与する。

本発明の方法を用いた場合、筋肉で生成されるヘテロ多量体タンパク質の高く安定したレベルが可能である。例えば、ＩｇＧ２ｂクラスのマウスｍＡｂは、単一の両側筋肉投与後７カ月を超える期間にわたり、血清中で１ｍｌ当たり４００ηｇの濃度で生成された。マウスＩｇＧ２ｂの短い血清半減期（約４〜５日）は、マウスＩｇＧ２ｂが示した時間にわたり筋肉細胞により連続的に生成されることを示している。この生成レベルは、本明細書に記載する種々の手法によりさらに高めることができる。

多鎖タンパク質を筋肉から生成する本発明の方法は、タンパク質の直接投与が治療意義を有する場合の臨床計画の代替法を提供する。従って、疾患又は症状を患う個体において、該個体を治療する目的で、該疾患又は症状に対して活性を有する特定の多鎖タンパク質を発現させることができる。このような「治療用」多鎖タンパク質は当技術分野で周知であり、例えば抗体、インスリン及びヘモグロビンなどが挙げられる。例えば抗体の場合、本明細書に記載する筋肉からの発現は、例えば、Ｂリンパ腫（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、Ｃｏｌｏｍｂａｔら，Ｂｌｏｏｄ ９７，１０１−１０６（２００１））、乳癌（抗Ｈｅｒ２；Ｌｅｏｎａｒｄら，Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．８９，２６２−２７１（２００２））、及び慢性関節リウマチ（抗ＴＮＦα、Ｆｅｌｄｍａｎｎら，Ｊｏｉｎｔ Ｂｏｎｅ Ｓｐｉｎｅ ６９，１２−１８（２００２））などを含む癌及び自己免疫疾患のような適用可能な疾患を治療するための受動抗体療法の代替法又は補充法である。別の具体例としてのこのような抗体は、表１に列挙されており、それらをコードするヌクレオチド配列は公共の配列登録センターから入手可能である。ｍＡｂの受動投与と比較して、ＤＮＡ注射／エレクトロポレーションは、低コストで、感染症の危険性が少なく、そして長期効果をもって殆ど又は全く副作用なしに単回注射として適用することができる。

本発明の方法は、任意の種々の多鎖タンパク質を個体の循環中で生成するために適用することができる。好ましい実施形態において、多鎖タンパク質の鎖のそれぞれは、リガンド結合部位又は基質結合部位を形成するように相互作用する。従って、多鎖タンパク質は、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体などのような任意の種々のヘテロ多量体を構成しうる。

本発明の方法により発現させうるヘテロ多量体多鎖タンパク質は、特定のポリペプチドの複数のコピーを含むこともできる。例えば、筋肉は、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖を、Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子のための別個のプラスミドを注射した場合であっても、四量体（Ｈ＋Ｌ）_２分子として組み立てることができる。何らかの理論によって拘束されるものではないが、単一筋肉細胞はｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨ鎖及びＬ鎖を生成し、これらは分泌前に（Ｈ＋Ｌ）_２分子として集合すると考えられる。重要なことは、本発明により生成された血清ｍＡｂがその標的抗原（例えば、ＮＩＰハプテン、ＩｇＤ又はＩ−Ｅ^ｄクラスＩＩ ＭＨＣ分子）に対して予想した抗原特異性を示すので、筋肉で生成されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変領域（Ｖ領域）は正しい組み立てを有していると考えられることである。また、発現された四量体（Ｈ＋Ｌ）_２分子のＦｃ領域は、筋肉で生成されたｍＡｂが補体を活性化できたことから、正しく折り畳まれ、かつ糖鎖付加されていると考えられる。補体の活性化は糖鎖付加を必要とする（Ｔａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，２５９５−２６０１（１９８９））ので、この結果は筋肉で生成されたＩｇが適切に糖鎖付加されたことを示唆している。

免疫グロブリンの発現に加えて、本発明は、他のヘテロ多量体タンパク質、例えばクラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子のような、２つの鎖がペプチド結合ポケットを形成しているＭＨＣ分子を発現させるためにも使用できる。別の例は、基質と結合し、基質からの産物の形成を触媒する多鎖酵素である。他の実施形態において、細胞表面における受容体（これは次いで細胞内シグナル伝達に導きうる）に結合する多鎖タンパク質を、本発明において発現させうる。

これらの場合、機能性リガンド結合部位又は基質結合部位は、種々の分子力、例えばイオン結合、共有結合、疎水性結合、ファン・デル・ワールス結合及び水素結合などにより媒介される鎖の安定な会合によって形成される。本発明における多鎖タンパク質の筋肉における発現は、鎖間の相互作用を保存し、そしてリガンド結合部位又は基質結合／切断部位の特異性を維持する。

リガンド結合と基質結合との区別は絶対的なものではない。例えば、リガンド結合性及び基質結合性の両方を有する多鎖タンパク質は公知である。これらの例は酵素である。本発明の方法により、このような多鎖タンパク質は筋肉により発現されて、循環に入ることができる。

本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義的にアミノ酸残基の多量体を指す。リガンド又は基質は、任意の種類の有機又は無機分子であってよく、例えばタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質、核酸、脂質など及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これに関して、「核酸」という用語は、１本鎖又は２本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの多量体を指し、そして天然のヌクレオチドと同様に機能しうる天然ヌクレオチドの公知の類似体も包含する。

本明細書における「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又はこのような遺伝子の断片により実質的にコードされる１以上のポリペプチドから構成されるタンパク質である。明らかにされている免疫グロブリン遺伝子としては、例えばκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεとして分類され、これら自体は免疫グロブリンクラス、すなわちそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。

典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は２つの同じポリペプチド鎖対からなり、１対は「軽」鎖（約２５ｋＤ）であり、そしてもう１対は「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）である。各鎖のＮ末端は抗原認識を主に担う約１００〜１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を規定する。「軽鎖の可変領域」（Ｖ_Ｌ）及び「重鎖の可変領域」（Ｖ_Ｈ）という用語は、それぞれ軽鎖及び重鎖のこれらの領域を指す。免疫グロブリン分子の抗原認識部位又はリガンド／基質結合部位は、「超可変領域」又は「相補性決定領域（ＣＤＲ）」として知られている重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様な部分により形成され、これらの領域は、「フレームワーク領域」として知られている保存されたフランキング／連結部分の間に挿入されている。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間に互いに関連して配置され、抗原結合表面を形成する。この表面は、標的抗原又はリガンド／基質の認識及び結合を媒介する。多くの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域は、例えばＫａｂａｔら，ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，４ｔｈ ｅｄ． Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）に開示されている。「エピトープ」は、抗原の抗体結合部位と相互作用する部分である。

抗体は完全な免疫グロブリン又は多数の周知のフラグメント、例えば種々のペプチダーゼでの消化により生成されるフラグメント、及び組換えＤＮＡ技術により作製されるフラグメントとして存在する。抗体フラグメントとしては、例えばＦａｂ’単量体、Ｆａｂ’２二量体、Ｆｖフラグメント、１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）フラグメントなどが挙げられる。例えばＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９（１９８８）参照。抗体フラグメントは、軽鎖及び／又は重鎖定常領域の末端切断又は欠失部分を有する独特な抗体形態を含むことができる。変異型抗体は、定常領域又は可変領域における欠失、末端切断又は挿入により作製できる。

本発明の方法により発現させうる多鎖タンパク質は、天然に存在することが知られているものから改変（欠失、付加、変異）されていてよく、又は天然では会合することが知られていないポリペプチドから形成されてもよい。多鎖タンパク質は、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである少なくとも１つのポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーは、幾つかの主要な分子クラスを含む。例えばＷｉｌｌｉａｍｓ及びＢａｒｃｌａｙ，ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ ＧＥＮＥＳ（ｐ．３６１），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照。

本発明の方法に従って発現された、基質結合ドメインを形成する多鎖タンパク質は、基質に対して、一般的に１０^３Ｍ^−１より大きい、好ましくは１０^６Ｍ^−１より大きい、より好ましくは１０^７Ｍ^−１より大きい結合定数を有しうる。本発明の方法に従って発現された、リガンド結合ドメインを形成する多鎖タンパク質は、その予め選択したリガンドに対して、一般的に１０^６Ｍ^−１より大きい、より好ましくは１０^７Ｍ^−１又は１０^８Ｍ^−１より大きい、よりいっそう好ましくは１０^９Ｍ^−１より大きい結合定数を有しうる。

多鎖タンパク質の各ポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で周知の方法、例えばｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、その他からのクローニングにより得ることができる。さらに、対象となる多くの遺伝子の配列は、公共データベースで入手可能であり、それによりＤＮＡ増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により遺伝子の合成を行うことができる。公共データベースからの配列は、好適なｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ源に由来するＤＮＡ配列をコードする特定のポリペプチドを増幅するためのＰＣＲプライマーの調製に関する有用な情報も提供する。ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡは、動物の細胞若しくは組織から、又は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ＵＳＡ ２０１０８）のような公共寄託センターにおける細胞系から単離することができる。

多鎖タンパク質の個々のポリペプチドの発現は、本発明に従って、個々の発現ベクター又は単一の発現ベクターを用いて行うことができる。各鎖のために単一ベクターを用いる場合には、個々の筋肉細胞がベクターの各々を取り込んで発現できるように、注射又はエレクトロポレーション前にベクターを混合することができる。

「発現ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、又はポリペプチドをコードする核酸の挿入又は組み込みにより操作でき、そしてベクターが適切な環境にある場合にポリペプチドの発現を指導できる他の運搬体を指す。好適な発現ベクターは、典型的には、プロモーター、複製起点、ポリＡ認識配列、及びリボソーム認識部位又は内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などを含み、そしてエンハンサー（組織特異的）のような他の調節配列を含んでもよい。

コードする挿入核酸配列の筋肉中での効率的な転写を促進するプロモーターは、構成的プロモーター、又は所望により誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターであってよい。プロモーターは、筋肉中で正常に機能するもの、例えば骨格アクチン遺伝子プロモーター（Ｍｕｓｃａｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，４０８９（１９８７））、筋肉クレアチンキナーゼプロモーター（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，２８９６（１９８８））、ミオシン軽鎖エンハンサー／プロモーター（Ｄｏｎｏｇｈｕｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８８，５８４７（１９９１））などであってよい。筋肉中での発現に通常は関連しないプロモーターは、それが筋肉細胞中での転写を指令する限り、使用しうる。このようなプロモーターの例は、実施例に記載したように抗体の軽鎖及び重鎖の発現に用いられるウイルスプロモーター、例えばヒトＣＭＶプロモーターである。

好ましい発現ベクターは、複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を有する発現カセットを含み、この部位によって、異なるポリペプチドをコードするＤＮＡを、ベクターのプロモーター又は他の転写調節配列と機能可能なように結合させるために該ＤＮＡを該カセットにクローニングすることが容易になる。好ましい発現ベクターは、原核細胞のための複製起点及びこのような細胞におけるクローニングを補助する少なくとも１つの選択マーカーを有することができる。当業者であれば、筋肉中で発現させようとするポリペプチドのためのプロモーター、エンハンサー及び他の転写又は翻訳調節配列の適切な組み合わせを用いて、正しく配置されたベクターを選択することにより発現を最適化する方法を理解しうる。

本発明の方法は、それぞれ骨格筋、平滑筋及び心筋からの多鎖タンパク質の発現を可能にする。骨格筋の注射による発現は、この筋肉源が豊富であり、かつ利用が容易である点で好ましい。骨格筋の場合、発現ベクターは、例えばシリンジ及び針を用いる伝統的な手段で、又は針なし若しくは針を用いない注射装置により、皮膚から骨格筋中に注射することができる。このような後者の装置は周知であり、そして一般的に、皮膚に対して配置した微小開口部からの圧力補助送達を行う。ガス動力の使い捨て針なし皮下ジェット注射器については、Ｍｏｒｒｏｗらに対する米国特許第４，５９６，５５６号；Ｐａｒｓｏｎｓに対する同第４，９１３，６９９号；及びＣａｓｔｅｌｌａｎｏらに対する同第５，７３０，７２３号参照。針なしガス動力注射器は市販もされており、例えばＢｉｏｊｅｃｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）のＢＩＯＪＥＣＴ（登録商標）装置を参照されたい。別の針なし装置は、加圧ガスを用いて小粒子（例えば金粒子）を皮膚の標的領域にガス圧を利用して送達する微粒子送達装置である。微粒子送達装置の例は、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）のＰＤＳ−１０００「遺伝子銃」である。

ベクターは０．９％塩化ナトリウムで投与しうるが、発現レベルに影響を及ぼすことなく添加しうる種々の溶剤及び賦形剤がある。例えば、ショ糖は骨格筋中のＤＮＡ取り込みを高めうることが当技術分野で知られている。他の物質もまた種々の有益な理由でベクターと共に共トランスフェクトすることができる。例えば、電気透過性となった膜の穴をふさぐことが知られているＰ１８８（Ｌｅｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，４５２４（１９９２））は、トランスフェクトした筋肉繊維の生存率を高めることにより、トランスフェクション効率に有利な影響を与えることができる。

本明細書で用いられる「エレクトロポレーション」は、大きい分子が細胞膜を一過性に透過できるように、細胞に少なくとも１つの電気パルスを印加することを意味する。本発明の方法は、ベクターを筋肉中に注射した後、個体の循環中での多鎖タンパク質の発現レベルを増強するために、エレクトロポレーションを用いる。骨格筋の注射後にベクターの効率的なエレクトロポレーションを行うために好適な装置及び操作法は、Ｍａｔｈｉｅｓｅｎらに対する米国特許第６，１１０，１６１号に記載されている。その記載のように、エレクトロポレーションは、ベクターを注射した部位において、筋肉上に約１〜４ｍｍ離して電極を配置することにより行うことができる。電極の精密な位置又は設計は、注射した分子の範囲内の筋肉繊維を電流が通過できる限り、重要なものではない。

電極を所定の位置に配置したら、予め決められた振幅及び持続時間を有する１以上の矩形二極パルスを与えることにより、筋肉にエレクトロポレーションを行う。当業者であれば、所望の発現レベルを達成するために特定の状況設定に対してトランスフェクション効率を最適化することができる。例えば、電圧は、電極間の距離に応じて約０〜１５００ボルトであってよく、パルス持続時間は５μｓ〜５００ｍｓで変動してよく、パルス数は１〜３０，０００で変動してよく、そして１回（train）のパルス周波数は０．５Ｈｚ〜１０，０００Ｈｚで変動してよい。一般的に、電場強度が約５０Ｖ／ｃｍを超えるならば、所望の実験条件に応じて他のパラメーターを変動しうる。好ましい実施形態において、エレクトロポレーションは、それぞれ１，０００パルスを約１０回印加することにより行われ、各パルスは、１５０〜１７０Ｖ／ｃｍの電位及び５０ｍＡの電流制限で４００μｓの持続時間である。Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６（４），５０８（１９９９）、及びＲｉｚｚｕｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（１１），６４１７（１９９９）。パルスは一極性又は二極性であってよい。一般的に短いパルス持続時間を、より高い電場強度と組み合わせることができ、その逆も同じである。効果的なトランスフェクション効率は、一般的に高い電場強度で得られ、電場強度は下記式：
Ｅ＝Ｖ／（２ｒ ｌｎ（Ｄ／ｒ））
を用いて計算され、これはＤ＞＞ｒである場合に電線間の電場強度を与える。この式中、Ｖ＝電圧＝１０Ｖ、Ｄ＝電線中心間の距離＝０．１〜０．４ｃｍ、ｒ＝電極の直径＝０．０６ｃｍ。Ｈｏｆｍａｎｎ，“Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄｓ”，Ｅ．Ｎｅｗｕｍａｎｎ，Ａ．Ｅ．Ｓｏｗｅｒｓ及びＣ．Ａ．Ｊｏｒｄａｎ（編），ＥＬＥＣＴＲＯＰＯＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＥＬＥＣＴＲＯＦＵＳＩＯＮ ＩＮ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｐ．３８９−４０７（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ．Ｃｏｒｐ．１９８９）参照。１０ボルトにおいて、電場強度は１６３Ｖ／ｃｍ〜４３Ｖ／ｃｍ（それぞれ０．１〜０．４ｃｍの電極間）である。Ｄはｒよりもそれほど大きくないので、大きな平行板間の電場については下記式：
Ｅ＝Ｖ／Ｄ
を用いることが、より適切であろう。

これは、１００Ｖ／ｃｍ〜２５Ｖ／ｃｍ（それぞれ０．１〜０．４ｃｍの電極間）の同様な電場強度を与える。電場強度及び他のパラメーターは、トランスフェクトされる組織により影響を受け、それ故に最適条件は変動しうる。本発明に関して本明細書で確認したパラメーターに対する最適化は、簡単な実証的検定の事柄である。

一般的に、ベクターのトランスフェクションは、約２５Ｖ／ｃｍ〜２００Ｖ／ｃｍまでの範囲の電場強度を有する電流を含む１以上の電気パルスを用いて行うことができる。この範囲は２５Ｖ／ｃｍ〜３００Ｖ／ｃｍであってもよい。またトランスフェクションは、約５０μｓ〜５，０００μｓの持続時間を有する単一の矩形二極性パルスを印加することにより、又は複数の矩形二極性パルス（２〜約３０，０００）を送出することにより行うこともできる。後者の場合、二極性パルスのパルス持続時間の合計は、好ましくは約１０ｍｓ〜約１２，０００ｍｓである。二極性パルスは、少なくとも２回の形で送出することができる。電気刺激の周波数は、好ましくは約０．５Ｈｚ〜１０００Ｈｚである。

心筋は、ＤＮＡを注射した範囲の心筋中に電極を挿入することにより、又はＤＮＡを注射した心筋の範囲を回避して、心臓の外表面上若しくはその中に電極を配置することによりトランスフェクトすることができる。ＤＮＡは、静脈又は動脈を通して挿入した電極により、心臓の外部又は内部から注射することができる。この場合、電極は中空とすることができ、孔（これを通ってベクターが進んで筋肉に達する）を備えている。同様に、ＤＮＡは平滑筋を含む組織に注射することができ、そして電場を外部又は内部から印加することができる。

心筋又は平滑筋の場合、電場強度は、細胞を透過性にするのに十分な大きさであって、組織を不可逆的に損傷する強さよりも小さくする必要がある。好ましい実施形態において、パルスの付与を心臓の収縮時期と合わせることができる。例えば、心臓が拡張期中に収縮するときに電圧を印加することができる。この目的で、エレクトロポレーションパルス付与を心臓リズム（例えば心電図シグナル）で誘発させることのできるエレクトロポレーターを用いることができる。一般的に、２０〜８００Ｖ／ｃｍの範囲の電場強度を心臓又は平滑筋に印加することができるが、他のパルスパラメーターは骨格筋の場合と同じであってよい。

電気パラメーターに加えて、多鎖タンパク質の所望の発現レベルには、種々の手法により影響を与えることができ、例えば筋肉注射部位の数を増やすこと、注射１回当たりのプラスミドの使用量を増やすこと、異種若しくは同種の抗原決定基をタンパク質から除去することにより免疫原性を低減すること、又は発現についてさらに最適化したＩｇ構築物、ベクター若しくはプロモーターを用いることなどを挙げることができる。特定の設定において半減期がより長い免疫グロブリンの選択（例えばヒトにおいてヒトＩｇＧ）は、個体において筋肉で発現された抗体の濃度を高めるために用いることもできる。心筋又は平滑筋が可能なように、身体のどの部位からの骨格筋も、この目的に用いることができる。さらに、筋肉を有する任意の個体を本発明の方法に用いることができ、例えば哺乳動物（例えばヒト、ヤギ、ヒツジ、ウシ、その他）などの動物が挙げられる。

本明細書に示したように、血清中のヘテロ多量体のレベル及び持続性は、タンパク質の免疫原性により影響を受ける。ここで、マウスにおいて筋肉から発現された完全ネズミ抗体又は部分的キメラネズミ抗体（軽鎖定常領域のみ）は、抗体の完全キメラ形態（重鎖及び軽鎖ヒト定常領域の両方）よりも長く（数週間に対して数カ月間）血清中で持続したことが見出された。マウスＩｇＧ２ｂ^ａアロタイプ及びヒトＣκのような小程度の外来性は、長期の血清発現を深刻に損傷することなく、明らかに許容された。

しかしながら、発現された多鎖タンパク質に対する抗体を個体において生じさせるために免疫原性を利用することができる。従って、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むタンパク質に対する抗体を得る方法であって、該タンパク質が個体に対して外来の１以上の抗原決定基を有する、上記方法が提供される。この方法は、ポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを、個体の筋肉中に注射することを含む。この方法によれば、筋肉細胞中へのベクターの取り込みがタンパク質の分泌を引き起こす。生成した抗体を個体から得ることができる。

本発明は、抗原に対する免疫応答を生じさせる種々の手法を可能にする。それに対して免疫応答が生じる抗原は、単一の外来エピトープを有してもよく、又は複数の外来エピトープを有してもよい。このような応答は、感染性微生物因子、例えば細菌、真菌、原生動物、ウイルスなどから、個体を感染性因子に暴露することなく、個体を防御するために用いることができる。免疫処置方法は、個体を癌から保護するため、又は疾患の発症を少なくとも遅延させるか若しくは延命するために用いることができる。本明細書に開示したようにヒトにおいて免疫応答を誘発するために使用できる種々の周知の癌関連抗原が存在しする。このような抗原としては、例えば癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、モノクローナル免疫グロブリン上のイディオタイプ（Ｉｄ）決定基などが挙げられる。

一つの手法により、多鎖タンパク質のポリペプチド鎖の少なくとも１つと物理的に結合した抗原を発現させることができる。これは、抗原をコードするＤＮＡを、鎖の一方又は両方をコードするＤＮＡの一方又は両方の末端に配置することにより簡便に行うことができる。多鎖タンパク質が抗体である場合には、抗体の軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端及びＣ末端のいずれか又は両方と融合させて、抗原を発現させることができる。しかしながら、抗原をコードするＤＮＡを、抗体の重鎖又は軽鎖をコードする配列内に配置することもできる。

従って、個体を免疫処置する方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの発現ベクターを個体の筋肉中に注射することを含み、該ベクターは抗体融合タンパク質をコードする核酸を含み、該融合タンパク質は個体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な抗体を含み、該抗体は免疫処置が望まれるポリペプチド抗原に融合している。この方法によれば、筋肉細胞中へのベクターの取り込みが抗体融合タンパク質の分泌を引き起こし、分泌した融合タンパク質は個体の抗原提示細胞の表面に対して抗原を標的化させるように機能する。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。何らかの理論によって拘束されるものではないが、筋肉細胞により生成されて放出された抗体は、循環して抗原提示細胞の細胞表面に結合することができ、これによって、このような抗体と細胞上で物理的に結合した抗原が濃縮され、免疫応答が開始するものと、本発明者らは考えている。さらに、例えばＭＨＣクラスＩ分子との結合は、抗原に対するアネルギー又は免疫寛容を誘導できるだろう。好ましい実施形態において、細胞表面マーカーはＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７分子、ＩｇＤ、Ｆｃ受容体、ＣＤ４０又はＴｏｌｌ受容体である。

別の手法において、抗原は二重特異性抗体の軽鎖又は重鎖と会合している。「二重特異性抗体」は、２つの結合部位を有する４本鎖抗体であり、ここで、一方の部位はある抗原に対して特異的であり、他方の部位は別の抗原に対して特異的である。場合によっては、二重特異性抗体は、２つの異なる軽鎖及び２つの異なる重鎖を有してよく、又はそれは共通の軽鎖若しくは共通の重鎖を有してよいが、両者を有するものではない。この免疫処置手法において、二重特異性抗体は、個体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な結合部位、及び抗原に対して特異的な結合部位を有する。二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖をコードするために１以上のベクターを用いることができ、そして発現ベクターを個体の筋肉中に注射し、少なくとも１つの電気パルスを注射部位に印加することにより、免疫応答を誘発させる。

従って、個体の筋肉中に少なくとも１つの発現ベクターを注射することを含む、個体の免疫処置方法であって、該ベクターが二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードするものであり、該二重特異性抗体が、個体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な第１結合部位及び免疫処置が望まれる抗原に対して特異的な第２結合部位を有する、上記方法が提供される。この方法によれば、筋肉細胞中へのベクターの取り込みが個体の循環中で二重特異性抗体の分泌を引き起こす。この方法を促進するため、抗原が二重特異性抗体により抗原提示細胞に対して標的化されるように、抗原を個体に投与する。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために、１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。好ましい実施形態において、細胞表面マーカーはＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７分子、ＩｇＤ、Ｆｃ受容体、ＣＤ４０又はＴｏｌｌ受容体である。

別の手法において、抗体を、細胞内で効果を発揮できるシグナル伝達タンパク質と融合させることができる。このようなシグナル伝達タンパク質は当技術分野で周知であり、例えば遺伝子発現の調節タンパク質、細胞内シグナル伝達経路（例えばアポプトーシスシグナル）に関与するタンパク質、ｍＡｂ融合タンパク質が輸送されるエンドソーム中の小胞内ｐＨを高めるタンパク質などが挙げられる。

抗原は、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｕｂＱ）、腹腔内（ｉｐ）、経口投与により、又は任意の他の経路により個体に投与することができる。投与は、当技術分野で公知の任意の手段で、例えば、シリンジ及び針を用いる伝統的な手段で、又は針なし若しくは針を用いない注射装置により行うことができる。このような後者の装置は周知であり、そして一般的に、微小開口部からの圧力補助送達を行う。ガス動力の使い捨て針なし皮下ジェット注射器、又は針なしガス動力注射器を用いることができる。抗原は、加圧ガスを用いて小粒子（例えば金粒子）を筋肉の標的領域にガス圧を利用して送達する微粒子送達装置を用いて投与することもできる。微粒子送達装置の例は、Ｄｕｐｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）のＰＤＳ−１０００「遺伝子銃」である。

ここでも特別の理論に帰することなく、筋肉細胞により発現された二重特異性抗体は循環に達し、そして二重特異性抗体の１つの結合部位により抗原提示細胞の細胞表面に結合するものと、本発明者らは考えている。個体に投与された抗原は、このような抗原提示細胞の表面で濃縮することができ、これによって、抗原に対する免疫応答が増強される。

抗原は、バッファー又は他の好適な液体で製剤化した溶剤として投与することができる。抗原は、抗原をアジュバントと混合することにより、又は抗原をアジュバントと複合体化若しくは別に結合させることにより、アジュバントと共に投与することもできる。種々のアジュバントが公知であり、例えばフロイント（完全及び不完全）、ミョウバン、ムラミルジペプチド、ＢＣＧ、ＬＰＳ、Ｒｉｂｉアジュバント系（登録商標）などが挙げられる。当業者は、与えられた状況においてどの種類のアジュバントを用いるかを理解しうる。

別の実施形態において、抗原を投与する代わりに、抗原をコードするために発現ベクターが用いられ、該抗原は、筋肉注射及びエレクトロポレーションの同じ手法により二重特異性抗体と同時に発現される。抗原は、抗体鎖をコードするために用いた発現ベクター（１若しくは複数）とは別の発現ベクターによりコードされてもよいし、又は抗体鎖の少なくとも１つをコードするベクターによりコードされてもよい。抗原及び抗体は同じ動物の同一又は異なる筋肉にトランスフェクトすることができる。

上記の種々の実施形態において、臨床用途のために承認されている抗体の任意の結合特異性を含むことができる（表１参照）。

本発明の方法は、組換え抗体の生物学的特性を、該抗体を発現する形質転換又は導入細胞系を調製する必要なしに、試験するためにも使用できる。従って、個体の筋肉に、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする少なくとも１つの発現ベクターを、筋肉細胞中への該ベクターの取り込みが該抗体の分泌を引き起こすように、注射する。発現された抗体を除去する必要なしに、生物学的特性を個体内でその場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）評価することができ、又は発現された抗体を個体から得た後、他の場所で生物学的活性を試験することができる。例えば、個体が適切な腫瘍の保有者である限り、特定の腫瘍関連抗原を、個体から取り出すことなく、腫瘍治療のための生物学的特性について試験することができるだろう。好ましい実施形態において、タンパク質の発現を増強するために１以上の電気パルスを筋肉の注射部位に印加する。いくつかの実施形態において、抗体の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを、当技術分野で周知の手段により、例えば付加、欠失、末端切断及び点変異などにより変異させることができる。次いで、抗原結合特異性に対する変異の効果を、本発明の方法に従ってタンパク質を発現させることにより評価することができる。

免疫グロブリンの場合、試験すべき生物学的特性としては、例えば抗原特異性、補体活性化、Ｆｃ受容体媒介食作用、シグナル伝達カスケードの誘導などが挙げられる。個体の筋肉から直接に遺伝子を発現させることにより、組換えｍＡｂをより効果的に、かつより短時間でスクリーニングすることができる。組換え発現された抗体がｉｎ ｖｉｖｏで生物学的活性を示す能力は、本発明の方法を用いて評価することができる。実施例４（図６）は、本発明の方法に従ったＢ細胞表面マーカー（ＩｇＤ）に対して特異的な抗体の発現が、この細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで枯渇させるのに有効であることを示している。ｉｎ ｖｉｖｏで現れる他の種類の生物学的活性も、同様に評価することができる。

当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、本発明に種々の変更を行いうることを理解するであろう。以下の非限定的実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。

筋肉における発現ベクターのエレクトロポレーションによるＩ−Ｅ ^ｄ 又はＩｇＤ ^ａ に対して特異的なキメラヒト／マウス抗体の血清発現
本実施例は、２本鎖構造（この場合は、抗体分子の重鎖及び軽鎖）をコードする発現ベクターを骨格筋内に注射することにより、無傷の完全抗体の生成及び個体の循環中への抗体の放出を行いうることを示す。ベクター混合物（それぞれ抗体の重鎖若しくは軽鎖をコードする）、又は両方の種類の鎖をコードする１つのベクターを注射した筋肉のエレクトロポレーションによるフルサイズ抗体の発現を評価するために、実験を計画した。これに関して、３つの発現ベクターを調製した。すなわち、キメラ重鎖ＩｇＧ３をコードするＤＮＡを含有する重鎖ベクター構築物（マウスＶ遺伝子及びヒトＣ遺伝子）を作製し、キメラヒトκ軽鎖をコードするＤＮＡを含有する軽鎖ベクター構築物（マウスＶ遺伝子及びヒトＣ遺伝子）を作製し、そしてキメラ重鎖及びキメラ軽鎖の両方をコードするＤＮＡを含有する組み合わせベクター（「ｃｏｍｂｉ」ベクター）を作製した。

Ａ．抗体Ｖ _Ｈ 及びＶ _Ｌ 領域
マウスのＩ−Ｅ ＭＨＣクラスＩＩ分子のα鎖（抗原決定基Ｉａ．７）に対して特異的なマウスＩｇＧ２ａκ抗体を生成する１４−４−４Ｓ（ＡＴＣＣ名「ＨＢ３２」）から、軽鎖及び重鎖のＶ遺伝子を得た。Ｏｚａｔｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：５３３（１９８０）。それ故に、１４−４−４Ｓは、Ｉ−Ｅ^ｄに対して特異的なマウスＩｇＧ２ａ抗体である。

ＴＰ−３抗体については、本質的に、既にＮｏｒｄｅｒｈａｕｇら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４，７７（１９９７）に記載されたようにして、１４−４−４Ｓの軽鎖及び重鎖のＶドメインをコードする核酸をクローニングした。簡単に説明すると、１４−４−Ｓ４ハイブリドーマからｃＤＮＡを調製し、そして重鎖の場合はＣＨ−１に、又は軽鎖の場合はＣκにアニーリングする下流プライマーと組み合わせて種々の免疫グロブリンリーダー配列にアニーリングする縮重上流プライマーのセットを用いて、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を配列決定し、クローニングしたＶ領域の的確な末端にアニーリングする特定のＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは、制限酵素部位（下線及び太字）を含むように設計した。すなわち、上流Ｖ_ＬプライマーはＢｓｍＩ部位を有し、下流プライマーはＢｓｉＷＩ部位を有する一方で、上流Ｖ_ＨプライマーはＭｆｅＩ部位を有し、下流Ｖ_ＨプライマーはＢｓｉＷＩ部位を有する。プライマー配列は下記の通りである：

１４−４−４Ｓ Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域をコードするヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬ ＧｅｎＢａｎｋパブリックデータベースにおいて、それぞれ登録番号ＡＦ２９２６４６及びＡＦ２９２３９１として入手できる。

ネズミＩｇＤのアロタイプ（ＩｇＤ^ａ）に対して特異性を有するマウスモノクローナル抗体を生成する、Ｉｇ（５ａ）７．２ハイブリドーマに由来するＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域は、本質的にＬｕｎｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，６７０（１９９９）に記載されたようにして得た。

Ｂ．抗体発現ベクター
Ｎｏｒｄｅｈａｕｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４，７７（１９９７）に記載されたようにして、抗体鎖発現シャトルベクターｐＬＮＯＨ２及びｐＬＮＯκを調製した。

上記のように調製した１４−４−４ＳのＶ_ＬをＢｓｍＩ及びＢｓｉＷＩで切断し、同様に消化したｐＬＮＯκにクローニングして、１４−４−４Ｓ抗体に由来するＶ_Ｌ領域及びベクターに由来するヒトκ定常領域を有するキメラヒト／マウスκ軽鎖（１４−４−４Ｓ Ｖ_Ｌ／ヒトＣκ）を得た。また、上記のように調製した１４−４−４ＳのＶ_ＨをＭｆｅＩ及びＢｓｉＷＩで切断し、同様に消化したｐＬＮＯＨ２にクローニングして、１４−４−４Ｓ抗体に由来するＶ_Ｈ領域及びベクターに由来するヒトγ３定常領域を有するキメラヒト／マウスγ３重鎖（１４−４−４Ｓ Ｖ_Ｈ／ヒトγ３）を得た。これらの１４−４−４Ｓキメラ抗体重鎖及び軽鎖シャトルベクターは、Ｌｕｎｄｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，２１５４−２１６２（２００２）に記載されている。

Ｌｕｎｄｅら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３４，１１６７（１９９７）に記載されたようにして、１１アミノ酸、すなわち、ＭＯＰＣ３１５腫瘍のマウスミエローマタンパク質に由来する腫瘍特異的Ｔ細胞エピトープをコードするように、キメラ１４−４−４Ｓに用いたγ３重鎖配列を変異させた。Ｂｏｇｅｎ及びＷｅｉｓｓ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，３３７（１９９３）；Ｂｏｇｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６，１３７３（１９８６）；Ｂｏｇｅｎら，上記 １６，１３７９（１９８６）参照。この変異は抗体の分泌及び折りたたみに影響を及ぼさない。Ｌｕｎｄｅら，前掲、２００２。

Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４，７７（１９９７）に既に記載されたようにして、ｃｏｍｂｉベクターを調製した。簡単に説明すると、ＣＭＶプロモーター、Ｖ_Ｌ及びＣκをｐＬＮＯＫ／１４−４−４Ｓ Ｖ_Ｌから２．６ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として単離し、ｐＬＮＯＨ２のアルカリホスファターゼ処理ＢａｍＨＩ制限部位にサブクローニングした。

抗Ｉ−Ｅ^ｄ抗体ベクターと同様にして、ヒト／マウスキメラ抗マウスＩｇＤ^ａ抗体をコードするベクターを調製したが、ただし、ネズミＩｇＤのアロタイプ（ＩｇＤ^ａ）に対して特異性を有するマウスモノクローナル抗体を生成するＩｇ（５ａ）７．２ハイブリドーマから、重鎖及び軽鎖の可変領域をクローニングした。Ｌｕｎｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７，６７０（１９９９）参照。簡単に説明すると、Ｉｇ（５ａ）７．２のＶ_Ｌ（ＩｇＤ^ａ抗体）をｐＬＮＯκにクローニングして、Ｉｇ（５ａ）７．２抗体に由来するＶ_Ｌ領域及びベクターＩｇ（５ａ）７．２に由来するヒトκ定常領域（Ｖ_Ｌ／ヒトＣκ）を有する、キメラヒト／マウスκ軽鎖を得た。また、Ｉｇ（５ａ）７．２のＶ_ＨをｐＬＮＯＨ２にクローニングして、Ｉｇ（５ａ）７．２抗体に由来するＶ_Ｈ領域及びベクターＩｇ（５ａ）７．２に由来するヒトγ３定常領域（Ｖ_Ｈ／ヒトγ３）を有する、キメラヒト／マウスγ３重鎖を得た。

Ｃ．注射及びエレクトロポレーション
Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＭＨＣクラスＩＩ Ｉ−Ｅ^ｄに対して陽性）、Ｃ５７ＢＬマウス（ＭＨＣクラスＩＩ Ｉ−Ｅ^ｄに対して陰性）、Ｂ１０−Ｄ２マウス、ＢＡＬＢ．Ｂマウス及びＣ．Ｂ．−１７マウスを含む種々のマウスの四頭筋に、ベクターＤＮＡ（１００μｇ）を筋肉内注射した。０．９％ＮａＣｌに希釈したベクターＤＮＡを両方の四頭筋に注射した（５０μｇ／５０μｌ／四頭筋）。１つのグループのマウスにはｃｏｍｂｉベクターを注射した一方、別のグループのマウスには別個の重鎖及び軽鎖ベクターの混合物を注射した。注射後に、筋肉の注射部位に電極を当て、そして該部位にそれぞれ１０回の１０００パルスからなる電位を印加することにより、エレクトロポレーションを行った。この場合、２回のパルス長は２００μＳｅｃ（正２００μＳｅｃ及び負２００μＳｅｃ）、各パルスの間隔は６００μｓ、電流制限は５０ｍＡ（約１５０〜１７４Ｖ／ｃｍ）であった。より大きい動物では、電極を筋肉内に挿入してもよい。

Ｄ．アッセイ
ＥＬＩＳＡによりｍＡｂレベルを測定した。例えば、Ｌａｕｒｉｔｚｓｅｎら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，６４７−６５６（１９９１）参照。簡単に説明すると、プラスチック製マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒポリスチレン高結合）を、アジドを含むＰＢＳ中１：５０００希釈率のモノクローナル抗ヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ、Ｉ−９７６３）（キメラヒトＩｇＧ３ ｍＡｂの検出のため、抗Ｉ−Ｅ^ｄ及びＩｇＤの両方）５０μｌを加えることにより、４℃で少なくとも一夜かけて被覆し、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで処理（室温で少なくとも１０分間のインキュベーション）することにより、さらなる非特異的結合からウェルをブロッキングした。次いで、ウェルを洗浄バッファー（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回すすぐことにより、このプレートを洗浄した。

種々の日（例えば、０、７、１４、２１及び２８日）にマウスから得た血液サンプルを凝固させた。血清を分離し、０．２％ＢＳＡ及び０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（希釈バッファー）で１：５に希釈した。希釈した血清サンプルを上記のブロッキングしたマイクロタイターアッセイプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ、Ｉ−４３８９）を標準として用いた。ウェルを洗浄バッファーで４回洗浄し、ビオチニル化した抗ヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ、Ｂ−３５２３；希釈バッファー中１：２０００）又はビオチニル化した抗ヒトκ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｂ−１３９３）を加え、プレートを４℃で一夜インキュベートした。ウェルを洗浄バッファーで４回洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ；希釈バッファー中１：３０００）を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。最終洗浄の後、ホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ、ｐ−ニトロフェニルホスフェート，二ナトリウム塩、５ｍｇ／錠、１ｍｇ／ｍｌを使用）を加え、プレートを室温で１０〜３０分間インキュベートした。光学密度を４０５ｎｍで測定した。

Ｅ．結果
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中の抗体重鎖の検出により示されたキメラ抗体の量は、図１に示されている。血清中のキメラ抗体は、最初に、エレクトロポレーションの後、約３〜６日目に検出された。キメラ抗Ｉ−Ｅ^ｄＨ鎖及びＬ鎖遺伝子に関して別個のプラスミドの同時注射、並びに重鎖及び軽鎖の両方を含有する単一の「ｃｏｍｂｉ」プラスミドの注射は、ほとんど検出できない非常に少量のｍＡｂしか誘導しなかった（図１Ａ）。しかしながら、プラスミドＤＮＡを注射した後に、低い電圧、高周波電気パルスからなるｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションを注射部位の皮膚に適用した場合には、血清ｍＡｂのレベルは顕著に増大した（図１Ａ）。このように、エレクトロポレーションは、裸のＤＮＡプラスミドとして注射したＩｇ遺伝子からのｍＡｂの生成を増強した。さらに、続いて起こるｉｎ ｖｉｖｏ発現のために、Ｉｇ Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子は同一プラスミド上に存在する必要がなかった。この抗体はＥＬＩＳＡで示されるように軽鎖及び重鎖の両方から構成されていた。同一ＥＬＩＳＡにおける重鎖及び軽鎖の両方の検出により、図１Ａに示す重鎖に関する結果と同様の結果が得られた。

発現されたキメラ抗体がその抗原結合特異性を保持したという証拠は、マウスを異なる遺伝バックグラウンドでトランスフェクトすることにより得られ、Ｉ−Ｅ^ｄの組織発現（抗Ｉ−Ｅ^ｄｍＡｂにより検出された抗原）が、循環中で検出可能な発現されたキメラ抗体のレベルに影響したかどうかを測定した。この目的で、抗体１４−４−４Ｓから誘導されるγ３キメラ重鎖及び抗体１４−４−４Ｓから誘導されるヒト／マウスキメラ軽鎖の両方をコードするｃｏｍｂｉベクターを、Ｉ−Ｅ^ｄ陽性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）及びＩ−Ｅ^ｄ陰性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の骨格筋内にエレクトロポレーションを行い、循環中のキメラ抗体のレベルを測定した。図１Ｂは、Ｉ−Ｅ^ｄキメラ抗体がＩ−Ｅ^ｄを発現しないＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて検出できたが、この抗体を発現するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては検出できなかったことを示している。抗原を発現するマウスに抗体が存在しないことは、生成される抗体が抗原に対して特異的であることを示唆している。

これらの実験における制御因子はＩ−Ｅ^ｄ発現であったが、マウス系統の若干の他の遺伝的特徴ではなかったことを証明するために、ＭＨＣ−コンジェニックＢＡＬＢ．Ｂマウス（これらは、ＭＨＣ Ｈ−２ｂハプロタイプを有し、Ｉ−Ｅ^ｄを欠損する以外は、ＢＡＬＢ／ｃと同一である）、及びコンジェニックＢ１０．Ｄ２マウス（これらは、Ｂ１０．Ｄ２がＨ−２ｄハプロタイプを有し、Ｉ−Ｅ^ｄを発現する以外は、Ｃ５７ＢＬ／６とほとんど同一である）について、１４−４−４Ｓ Ｈ及びＬベクターを用いた筋肉注射／エレクトロポレーションを試験した。図１Ｃから明らかなように、ｍＡｂはＢＡＬＢ．Ｂマウス（Ｉ−Ｅ^ｄ陰性）の血清中で検出できたが、Ｉ−Ｅ^ｄを発現するＢＡＬＢ／ｃマウスの血清からは検出できなかった。Ｉ−Ｅ^ｄを発現しないマウスにおける血清１４−４−４Ｓ抗体の増加を示すこれらの結果は、血清で発現された１４−４−４Ｓキメラ抗体ｍＡｂがその抗原（Ｉ−Ｅ^ｄ）に対して特異的であることを実証している。

同様の結果が、可変Ｈ鎖及びＬ鎖がＩｇ（５ａ）７．２ハイブリドーマから誘導されたＩｇＤ^ａ抗体の発現によって得られた（図１Ｄ）。この場合、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする２つの別個のプラスミドを骨格筋内に同時注射し、エレクトロポレーションを適用した。ヒトＩｇＧ３ ＥＬＩＳＡにより、ＩｇＤ^ａを欠損し、かつＩｇＤ^ａを発現するＣ．Ｂ−１７マウスの血清中でキメラＩｇＤ^ａ抗体が示された。対照的に、キメラＩｇＤ^ａ抗体は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（これらは、ＩｇＤ^ａを発現するが、その他の点ではＣ．Ｂ−１７とほとんど同一である）の血清中で検出されなかった。Ｃ．Ｂ−１７マウスにおける抗ＩｇＤ^ａｍＡｂの血清レベルは約３００ηｇ／ｍｌに達し、これは抗Ｉ−Ｅ^ｄｍＡｂの場合よりも顕著に高かった。ＩｇＤ^ａアロタイプを発現しないマウスにおける血清Ｉｇ（５ａ）７．２抗体の増加を示すこれらの結果は、血清で発現されたＩｇ（５ａ）７．２キメラ抗体がその抗原（ＩｇＤ^ａアロタイプ）に対して特異的であることを実証している。

抗原へのｍＡｂの結合はＨ鎖及びＬ鎖の正確な会合に依存するので、図１Ｂ〜Ｄの結果は、筋肉細胞がｍＡｂを正確な特異性を有する４量体として分泌すること、及びｍＡｂが離れた組織に到達し、そこで標的抗原を発現する細胞又は組織によって吸収されることを支持する。これらの結論は、エレクトロポレーションを行った動物の血清中の免疫グロブリンの物理的分析によって支持される。簡単に説明すると、キメラ抗ＩｇＤ^ａｍＡｂの重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを筋肉に筋肉内注射することにより同時投与した後、注射部位にエレクトロポレーションを行ったマウスに由来する血清と共に、プロテインＧセファロースビーズをインキュベートした。単離した抗体を溶出させ、重鎖及び軽鎖を分離するために、メルカプトエタノールで処理を行うか又は処理を行わなかった。ゲル電気泳動及びブロッティングの後、抗ヒトＩｇＧ３又は抗Ｃκ抗体を用いてブロットを展開した。図２のウェスタンブロットは、マウスの血清中のヒトγ３重鎖がκ軽鎖に会合していることを示している。同様の結果はサンドイッチＥＬＩＳＡから得られ、これは、処置した動物の血清から捕捉された同一細胞上の重鎖及び軽鎖マーカーを確認した（ＥＬＩＳＡでは、被覆抗体として抗ヒトγ３及び検出抗体として抗ヒトＣκを用いた）。

図１Ｂ及び１Ｃから明らかなように、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて７〜１４日目に見られたＩ−Ｅ^ｄ特異的血清ｍＡｂの急激な低下は、ｍＡｂの異種部分、すなわち、ヒトγ３及びＣκ（表１）に対する免疫応答によって生じた可能性がある。この可能性を評価するために、ヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ、Ｉ−４３８９）で被覆したプレートを用い、ビオチニル化した抗マウスＩｇＧ１又はビオチニル化した抗マウスＩｇＧ２ａで抗Ｉｇ抗体を検出して、ＥＬＩＳＡを準備した。その他の点で、このＥＬＩＳＡは、以前と同じであるが、血清を連続希釈した点で異なる。

これらの結果は、抗Ｉ−Ｅ^ｄｍＡｂの低下が、注射後２８日目に検出された高い血清力価を有する、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２^ａサブクラス両方のマウス抗ヒトＩｇＧ３抗体の増加によって平行（parallel）したことを示した（図３）。マウス抗ヒトＩｇＧ３ ｍＡｂの誘導は、ｍＡｂの高い血清レベルを有したＩ−Ｅ^ｄ陰性株においてだけでなく、血清ｍＡｂがほとんど又は全く検出されなかった陽性株においても検出された（図３Ａ及びＢ）。この結果は、キメラ抗体が血清から急速に吸収されてしまったようにみえるという事実にも拘わらず、キメラＩ−Ｅ^ｄ特異的ｍＡｂがＩ−Ｅ^ｄ陽性株において十分な量で生成され、マウスを免疫感作したことを示している。また、キメラ抗ＩｇＤ^ａｍＡｂでトランスフェクトした後２８日目のマウスの血清中に、抗免疫グロブリンが存在していた（図３Ｃ）。顕著なことに、Ｃ．Ｂ−１７マウスは、Ｉ−Ｅ^ｄ抗体でトランスフェクトしたマウスと比較して、少量の抗ヒトＩｇＧ３抗体、特にＩｇＧ２ａサブクラスを生成した。この相違は、より高濃度の抗ＩｇＤ^ａキメラｍＡｂ、異なるＶ領域の使用又はＢａｌｂ／ｃバックグラウンド遺伝子の影響に関係する可能性がある。

抗体のｉｎ ｖｉｖｏ長期血清発現は異種配列の除去により達成される
免疫原性の低下によって、血清中で発現された組換え抗体の量又は発現の時間の程度を増大するかどうかを測定するために、発現されたモノクローナル抗体から異種配列を除去した。最初の実験において、ヒトγ３定常領域を除去すること、及びそれをマウスγ２ｂ定常領域で置き換えることによって、キメラＩｇＤ^ａ抗体のための重鎖ベクター（この場合、Ｖ_ＨはＩｇ（５ａ）７．２から誘導され、Ｃ_Ｈはヒトγ鎖である）を改変した。Ｉｇ（５ａ）７．２に由来する可変領域を用いて得られたベクターｐＬＮＯＨ２γ２ｂＶ_ＨＴ（Ｌｕｎｄｅら，上記、１９９９）を、対応するヒト／マウスキメラ軽鎖ベクター（ｐＬＮＯκＶ_ＬＴＬｕｎｄｅら，上記、１９９９）と共に筋肉内に同時投与した。従って、発現された抗体は完全マウス重鎖及びキメラヒト／マウス軽鎖を有する部分的キメラである。

ウェルにＮＩＰ_２．６ＳＢＡを塗布した後、トランスフェクト細胞から得られたマウスＩｇＤ抗ＮＩＰを結合させることによって、血清分析を行った。血清サンプルをアプライし、抗マウスＩｇＧ２ｂ−ビオチンを用いて、結合を測定する。

マウスＣ_Ｈ／ヒトＣκＩｇＤ^ａ特異的抗体での結果は、合理的に検出可能な発現を得るためにはエレクトロポレーションが必要だったこと、及びＩｇＤ^ａアロタイプ標的抗原を発現しないマウス（すなわち、Ｃ．Ｂ−１７マウス）において最良の発現が達成されたことを示した。Ｃ．Ｂ−１７マウスの場合、血清ｍＡｂは１〜５週間後に７５０ηｇ／ｍｌほどにも高く、次いで徐々に低下した。７カ月後でさえも、マウスの血清中に約３００μｇ／ｍｌが存在した。この抗体の完全にキメラの形態は、より低い最大発現を示し、より急速に低減した（図１Ｄと比較）。従って、抗体の異種部分を除去することにより、血清中の存在が増大され、延長された。

ハプテンＮＩＰに対して特異的なマウスＩｇＧ２ｂ抗体を発現させることにより、同様の実験を行った。ベクターｐＳＶ２ｇｐｔＶ_ＮＰ（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．２，１３７３（１９８３））にクローニングしたネズミＮＩＰ特異的抗体のＶ_Ｈ遺伝子を、ヒトγ３重鎖の上流でクローニングして、ｐＬＮＯＨ２（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４，７７（１９９７））。Ｅｉｄｅｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４５，１１９（２０００）に記載されているように、ｐＬＮＯＨ２中のヒトＩｇＧ３をコードする配列をマウスＩｇＧ２ｂ定常鎖配列で置換することにより、ベクターｐＬＮＯＨ２−γ２ｂを得た。後者の定常鎖配列は、ＢＡＬＢ／ｃから誘導したミエローマ細胞系ＭＰＣ−１１に由来する。Ｌａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，６１１（１９８２）参照。ＮＩＰに対するネズミλ軽鎖をコードするＤＮＡ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を、筋肉中にｐＬＮＯＨ２−γ２ｂと共に同時にエレクトロポレーションした発現ベクターにクローニングした。結果は、軽鎖についてはλに由来する、及び重鎖についてはγ２ｂに由来する定常領域を有する完全ネズミＮＩＰ特異的抗体が生成された。

Ｂａｌｂ／ｃマウスの筋肉内エレクトロポレーションを実施例１に記載したように行った。エレクトロポレーションの後０、３、７、１４日目、並びに４、５及び８週目に、マウスから血清を得た。本質的に実施例１に記載したように、ただし、プレートをＮＩＰ_２．６ＢＳＡ（すなわち、１分子のＢＳＡ当たり２．６分子のＮＩＰ）で被覆し、かつ検出抗体を抗ＩｇＧ２ｂ−ビオチン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号：０２０３２Ｄ）にして、血清のＥＬＩＳＡ分析を行った。ハイブリドーマ細胞系により生成された抗ＮＩＰ抗体を精製し、標準として用いた。これらのハイブリドーマ細胞はλ１遺伝子を発現するものであり、機能的なＮＩＰ特異的抗体を発現させるために、マウス筋肉のエレクトロポレーションに用いたのと同じＮＩＰ特異的重鎖構築物でトランスフェクトすることにより調製した。Ｅｉｄｅｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４５，１１９（２０００）参照。

２つの別個の実験（図４Ｂ及び挿入グラフ）において、注射しエレクトロポレーションを行ったＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中で検出されたＮＩＰ抗体の量は、ＥＬＩＳＡにおいてＮＩＰ−ＢＳＡとの結合能により測定した、マウス血清中の抗ＮＩＰ ｍＡｂの有意な量を示し、６０〜１００ηｇ／ｍｌの最大量が２〜５週間目に検出された。血清抗体のレベルは徐々に低下したが、ＤＮＡ注射の後３０週において５０ηｇ／ｍｌと多量がなお検出された（図４Ｂ、挿入）。血清中のｍＡｂの検出のためには、エレクトロポレーションが必要であった。１０及び１００μｇのプラスミド（各四頭筋にそれぞれ５０及び５μｇ）の注射により同様の結果が得られたが、これが少量となるほど変動は大きかった（主グラフ）。図４Ｂの挿入グラフのマウスには、５０μｇの全ベクターを注射した。

抗体を発現した血清による補体媒介細胞溶解
血清で発現され、抗原に結合した抗体が補体を活性化する能力を有するかどうかを測定することによって、発現された抗体の完全性を定常領域について評価した。補体媒介細胞溶解（ＣＭＬ）アッセイを記載されたように行った。Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２，５１７−５２８（１９９０）；Ａａｓｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３６，１８５−１９１（１９９１）参照。簡単に説明すると、^５１ＣＲで標識したヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）をウサギ抗ＳＲＢＣ ＮＩＰ_−１５−Ｆａｂ’フラグメントと共にインキュベートすることにより、これらの細胞をＮＩＰで感作した。本発明に従って血清中に発現されたＮＩＰネズミ抗体の連続希釈物をＮＩＰ感作^５１ＣＲ ＳＲＢＣに加えた。ヒト血清を補体供与源として用いた。組換え細胞から発現され、かつ精製された同じＮＩＰ抗体を対照として用いた。細胞毒性指数（ＣＩ）を、次の式により計算した：
％ＣＩ＝［（ｃｐｍ試験−ｃｐｍ自発）／（ｃｐｍ最大−ｃｐｍ自発）］×１００
図５の結果は、ベクターを注射してエレクトロポレーションしたマウスの血清からの抗ＮＩＰ ｍＡｂが、補体を活性化させることができ、赤血球細胞溶解を生じさせたことを示している。これらの結果は、筋肉によって生成されたＮＩＰ ｍＡｂのＦｃ領域が、補体を活性化させる能力に対して機能することを示している。

抗体を発現した血清による補体媒介細胞溶解
ＢＡＬＢ／ｃマウスに抗ＩｇＤをコードするＤＮＡを注射し又は注射せず、そしてエレクトロポレーションを行った。７日後に、血液をヘパリン溶液に集めて凝固を回避した。溶解バッファー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をサンプルに加えて赤血球細胞を溶解した。細胞を洗浄し、細胞マーカーに対する種々の抗体を含有する染色バッファー（ＰＢＳ及び０．５％ＢＳＡ）に懸濁させた。使用した抗体は、それぞれＩｇＤ及びＢ２２０（Ｂ細胞上）並びにＴ細胞受容体（Ｔ細胞上）に対して特異的である、ＦＩＴＣ−ＩｇＤ、ＰｅｒＣＰ−Ｂ２００／ＣＤ４５Ｒ及びＰＥ−ＴＣＲＣβであった。染色した後、細胞を洗浄し、固定バッファー（ＰＢＳ及び２％パラホルムアルデヒド）に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。

結果は、本発明の方法で処理した又は処理しなかったマウスの血液中のＴ細胞のＢ細胞の割合（％）として表される。５匹のマウスを各グループに用いた。図から明らかなように、マウスがベクターを投与され、かつエレクトロポレーションを受けていた場合に、血中のＩｇＤ及びＢ２２０陽性細胞が枯渇した。この場合、発現された抗体は、筋肉による生成の後に個体において生物学的に活性であった。

本発明に従って免疫グロブリン発現ベクターを投与したマウスの血清における組換え免疫グロブリンの発現を示す。 本発明に従って生成された、組み立てられた抗体（assembled antibody）を示す。 抗免疫グロブリン抗体が、本発明に従って生成された組換え抗体を発現するマウスにおいて誘導されることを示す。 本発明に従って誘導されたキメラ抗体のマウスの血清ｍＡｂ発現を示す。 本発明に従って血清において発現された抗体が生物学的活性を有し、完全なＦｃ領域及び正常な糖鎖付加を有することを示す。 本発明の方法に従って、Ｂリンパ球様細胞マーカーＩｇＤに対する抗体は、循環中で発現させることができ、また個体においてＩｇＤ Ｂ細胞の枯渇を引き起こすことを示す。

Claims (36)

1. タンパク質の生成に使用するための医薬組成物の製造における、少なくとも１つの発現ベクターの使用であって、該少なくとも１つのベクターは、（ｉ）少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むタンパク質をコードするものであり、そして、被験体の筋肉内に注射されたときに、（ｉｉ）該ポリペプチド鎖の生成及び該タンパク質の分泌を引き起こすものである、上記使用。
2. 治療用タンパク質に対して応答する疾患又は症状の治療に使用するための医薬の製造における、該治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの発現ベクターの使用であって、該少なくとも１つのベクターは、（ｉ）少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含む該治療用タンパク質をコードするものであり、そして、被験体の筋肉内に注射されたときに、（ｉｉ）該ポリペプチド鎖の生成及び該治療用タンパク質の分泌を引き起こすものである、上記使用。
3. 被験体における抗体の生成に使用するための医薬組成物の製造における、少なくとも１つの発現ベクターの使用であって、（ｉ）該少なくとも１つのベクターは、少なくとも２つの異なるポリペプチド鎖を含むタンパク質をコードするものであり、これらの鎖の少なくとも１つが抗原決定基を提示し、そして、該ベクターは、該被験体の筋肉内に注射されたときに、（ｉｉ）該被験体が該決定基に対する抗体を生成するように、該ポリペプチド鎖の生成及び該タンパク質の分泌を引き起こすものである、上記使用。
4. 被験体における抗原に対する抗体の生成に使用するための医薬組成物の製造における、少なくとも１つの発現ベクターの使用であって、（ｉ）該少なくとも１つのベクターが、二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードするものであり、該二重特異性抗体が、該被験体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的な第１結合部位及び免疫処置が望まれる抗原に対して特異的な第２結合部位を有し、該ベクターは、該被験体の筋肉内に注射されたときに、（ｉｉ）該ポリペプチド鎖の生成及び該タンパク質の分泌を引き起こし、そして該抗原は、該被験体に投与されたときに、（ｉｉｉ）該被験体が該抗原に対する抗体を生成するように、該二重特異性抗体により抗原提示細胞に標的化されるものである、上記使用。
5. 抗体の重鎖又は軽鎖に融合したペプチドに対する抗体を被験体において誘発するのに使用するための医薬組成物の製造における、少なくとも１つの発現ベクターの使用であって、（ｉ）該ベクターは該抗体の軽鎖及び重鎖をコードするものであり、該抗体が該被験体の抗原提示細胞の細胞表面マーカーに対して特異的であり、そして該ベクターは、該被験体の筋肉内に注射されたときに、（ｉｉ）該被験体が該ペプチドに対する抗体を生成するように、該ポリペプチド鎖の生成及び該ペプチドに融合した該抗体の分泌を引き起こすものである、上記使用。
6. タンパク質の生物学的活性の試験に使用するための医薬組成物の製造における、少なくとも１つの発現ベクターの使用であって、（ｉ）該ベクターは、少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質をコードするものであり、そして、該被験体の筋肉内に注射されたときに、（ｉｉ）該ポリペプチド鎖の生成及び生物学的活性を試験する該タンパク質の分泌を引き起こすものである、上記使用。
7. タンパク質が免疫グロブリンである、請求項１〜３又は６のいずれかに記載の使用。
8. 免疫グロブリンが抗体である、請求項７に記載の使用。
9. ベクターが全長の鎖をコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
10. 被験体がヒトである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
11. 免疫グロブリン又は抗体がヒト免疫グロブリンに由来する定常領域配列を有する、請求項４、５又は７のいずれかに記載の使用。
12. 免疫グロブリン又は抗体がヒト免疫グロブリンに由来する可変領域配列を有する、請求項４、５又は７のいずれかに記載の使用。
13. 免疫グロブリン又は抗体がネズミのものである、請求項４、５又は７のいずれかに記載の使用。
14. 注射がベクターを針を用いて筋肉内に導入することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
15. 注射がベクターを微粒子送達法により筋肉内に導入することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
16. 少なくとも１つのベクターが少なくとも２つのベクターであり、そして鎖の各々が別個のベクターによりコードされる、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
17. 電極による電流が注射部位から通電され、そして筋肉膜透過性を一過性に増大させるように、該電極を注射部位付近に配置するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
18. 筋肉膜透過性の一過性増大が、約２５Ｖ／ｃｍから３００Ｖ／ｃｍ未満の範囲の電場強度を有する電流を用いて達成される、請求項１７に記載の使用。
19. 筋肉が骨格筋である、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
20. タンパク質の生成が被験体において発現された該タンパク質に対する免疫応答を生じさせるように、該タンパク質が被験体に対して外来の１以上の抗原決定基を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
21. 免疫応答が、被験体の血清中でタンパク質の外来抗原決定基の１以上に対する抗体を生成することを含む、請求項２０に記載の使用。
22. 抗体が、被験体から液体源を取得することにより得られる、請求項３〜６及び２０のいずれかに記載の使用。
23. 液体が血清である、請求項２２に記載の使用。
24. 細胞表面マーカーがＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７分子、ＩｇＤ、Ｆｃ受容体、ＣＤ４０及びＴｏｌｌ受容体からなる群より選択される、請求項４及び５のいずれかに記載の使用。
25. 二重特異性抗体が別個の重鎖及び軽鎖から構成されている、請求項４及び５のいずれかに記載の使用。
26. 二重特異性抗体が単一のポリペプチドである、請求項４及び５のいずれかに記載の使用。
27. 第２結合部位がペプチド配列に対して特異的であり、そして抗原が該ポリペプチド配列を含有するように操作されている、請求項４に記載の使用。
28. 抗原が、該抗原を組換え手法により被験体において発現させることにより投与される、請求項４に記載の使用。
29. 抗原が抗体の重鎖に融合している、請求項５に記載の使用。
30. 抗原が抗体の軽鎖に融合している、請求項５に記載の使用。
31. 生物学的活性が被験体において生じる、請求項６に記載の使用。
32. タンパク質が被験体から得られ、そして生物学的活性が測定される、請求項６に記載の使用。
33. タンパク質が抗体である、請求項６に記載の使用。
34. 生物学的活性が抗原特異性である、請求項３２に記載の使用。
35. ベクターが全長の軽鎖及び全長の重鎖の各々をコードする、請求項３２に記載の使用。
36. ポリペプチドをコードする核酸が変異を有するものである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。

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