JPS61501705A

JPS61501705A - Ｔ細胞及びｂ細胞決定基の両者を含む合成ｂ型肝炎ウイルスワクチン

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Publication number: JPS61501705A
Application number: JP60501248A
Authority: JP
Inventors: ミリツチ　デイヴイツド　アール; チリ　フランク　ヴイ
Original assignee: スクリツプス　クリニツク　アンド　リサ−チ　フアウンデ−シヨン
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1985-03-06
Publication date: 1986-08-14
Also published as: US4599231A; ZA851666B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】５ｅｒＬｅｕＡｓｎＰｈｅＬｅｕＧ１ｙＧ１ｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＣｙｓＬｅｕＧ］ｙＧｌｎＡｓｎ　；ＶａｌＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｙＡｓｎ　；ＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧｌｎＡｓｎＳｅｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＡｓｎ［１ｉｓＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＴｈｒＣｙｓＰｒｏＧ　１ｙＴｙｒ＾ｒｇＴｒｐＭｅｔＣｙｓＬｅｕＡｒｇＡｒｇＰｈｅｌｌｅ　；ＬｅｕＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｓｐＴｙｒＧｌｎＧｌｙＭｅｔＬｅｕＰｒｏＶａｌＣｙｓＰｒｏＬｅｕ　；及びＴｈｒＬｙｓＰｒｏＳｅｒＡｓｐＧｌｙＡｓｎＣｙｓＴｈｒＣｙｓＩＩｅＰｒｏＩＩｅＰｒｏＳｅｒより成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ少くとも一つの合成ポリペプチドを含み、該合成ポリペプチドは、生理的に許容される希釈剤に含めて宿主に皮肉投与されると宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該増殖は皮肉投与部位における紅斑及び硬化により指示されるものであるところの診断系。

２３、Ｂ型肝炎ウィルスに対しすでに免疫化された宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発する方法において、（ａｌ　左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて５ｅｒＬｅｕＡｓｎＰｈｅＬｅｕＧ１ｙＧ１ｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＣｙｓＬｅｕＧ１ｙＧｌｎＡｓｎ　；ＶａｌＣｙｓＬｅｕＧＩｙＧｌｎＡｓｎ　；ＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧＩｎＡｓｎＳｅｒＧ］ｎ５ｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＡｓｎＨｉｓＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＴｈｒＣｙｓＰｒｏＧｌｙＴｙｒ＾ｒｇＴｒｐＭｅｔＣｙｓＬｅｕＡｒｇＡｒｇＰｈｅｌｌｅ　ｉＬｅｕＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｓｐＴｙｒＧＩｎＧｌｙＭｅｔＬｅｕＰｒｏＶａｌＣｙｓＰｒｏＬｅｕ　；及びＴｈｒＬｙｓＰｒｏＳｅｒＡｓ　ｐＧ　１　ｙＡｓ　ｎＣｙｓＴｈ　ｒＣｙｓ　Ｉ　］ｅＰｒｏ　Ｉ　ＩｅＰｒｏＳｅｒより成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドを用意すること、及び世）上記合成ポリペプチドの有効量を生理的に許容される希釈剤に含めて宿主に投与することを含む方法。

２４６段階ｔａｌの後でかつ段階（１））の前に上記合成ポリペプチドを担体に結合して接合体を形成することの段階を含む請求の範囲第２３項に従う方法。

２５、宿主におけるＢ型肝炎うイルス抗体の存在を測定する方法において、ｆａｔ　左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて５ｅｒＬｅｕＡｓｎＰｈｅＬｅｕＧ１ｙＧｌｙＴｈｒＴｈｒＶａｌＣｙｓＬｅｕＧＩｙＧ］ｎＡｓｎ　；ＶａｌＣｙｓＬｅｕＧＩｙＧｌｎＡｓｎ　；ＣｙｓＬｅｕＧ］ｙＧ１ｎＡｓｎＳｅｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＡｓｎＨ４ｓＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＴｈｒＣｙｓＰｒｏＧ　ＩｙＴｙｒＡｒｇＴｒｐＭｅｔＣｙｓＬｅｕＡｒｇＡｒｇＰｈｅｌｌｅ　；しｅｕＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｓｐＴｙｒＧｌｎＧＩｙＭｅｔＬｅｕＰｒｏＶａｌＣｙｓＰｒｏＬｅｕ　；及びＴｈｒＬｙｓＰｒｏＳｅｒＡｓｐＧＩｙＡｓｎＣｙｓＴｈｒＣｙｓｌｌｅＰｒｏｌｌｅＰｒｏＳｅｒ　；より成る群から選ばれたアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドを用意すること、及び（ｂｌ　生理的に許容される希釈剤に溶解又は分散した上記合成ポリペプチドの有効量を皮肉投与して、宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発することを含み、上記増殖及び宿主におけるＢ型肝炎ウィルス抗体の存在は皮肉投与部位における紅斑及び硬化により指示されるところの方法。

明細書Ｔ細胞及びＢ細胞決定基の両者を含む合成Ｂ型肝炎ウィルスワクチン説明技術分野本発明は、天然の病原関連蛋白質とくにＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＴ細胞及びＢ細胞決定基部分のアミノ酸残基配列にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ化学的に合成されたポリペプチドに関する。このポリペプチドは、ポリマーとして又は担体に結合した接合体として宿主に投与されると、Ｂ型肝炎ウィルスに対してプライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）宿主における胸腺由来細胞の増殖を誘発する。

背景本発明は、ＤＮＡ及び／又は蛋白質配列から導かれた情報に基づく新規な合成抗原の製造、及びワクチン、診断剤などの製造におけるこれら抗原の使用に関する。より詳しくは本発明は、単独で、ポリマーとして又は担体に接合して使用され、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のＴ細胞及びＢ細胞決定基部分に免疫学的に対応する、合成抗原ポリペプチドに関する。

ウィルス性肝炎は、人類の最も重大な克服されていない病気の一つとして位置付けられている。ウィルス性肝炎という一般的言葉は、主にＡ型肝炎（感染型肝炎）及びＢ型肝炎（血清肝炎）を云い、なお他の既知のウィルスたとえば黄熱病ウィルス、エプスタイン−パールウィルス及びサイトメガロウィルスもヒトで肝炎を起しうる。肝炎はと（に、その肝臓への集中的攻撃の点で知られている（ブリーフ、後出）が、しかしこの病気は他の器官にも影響を及ぼす。

１９６５年に、ブランバーブ（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ）は、ある人間血液中で循環している抗原を発見した〔ジャーナル　オブ　アメリカンメディカル　アソシエーシシン（Ｊ、　Ａｓ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　）　、１９１．５４１　（１９６５）及びＡｎｎ、　ｒｎｔ、　Ｍａｄ、、６６．　９２４　（１９６７）　）。

この物質は続いてプリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）により、作用因に慢性的に感染している人により豊富に作られるＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）であることが発見された〔プロシーデインダス　オブ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６０．　８１４　（１９６８）　）。

ＨＢｓＡｇは、多くの免疫化学的研究の対象であった。血清学的研究は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のいくつかの系統が、−又は二基上の決定基を共通に持つことを示し、これは土と名付けられた。名系統はまた、二つの別の決定基−先又はＬ、及びヱ又は工を持つ。すなわち、ウィルスタイプの四つの可能なタイプがある：プチドに関連し〔ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら、Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．＋　１１７．１４０４　（１９７６）　、及びシー（Ｓｈｉｈ）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２０．５２０　（１９７８））、この全２２６アミノ酸配列はＨＢＶのＳ遺伝子〔ティオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）ら、サイエンス、２１３．４０６　（１９８１））のヌクレオチド配列から確立されている〔バレンヅエア（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）ら、ネイチア（ロンドン）・２８０．８１５　（１９７９）；ガリバート（Ｇａｌｉｂｅｒｔ）ら、ネイチア（ロンドン）、２８１．６４６　（１９７９）；及びバセツク（Ｐａｓｅｋ　）　ら、ネイチア（ロンドン）、２８２．５７５　（１９７９））。

この感染を受ける危険の増大している人達のためにＢ型肝炎ワクチンに対する緊急なニーズがある。これらの人達としては、保健及び実験室用具、及び（１）維持血液透析；（２）繰返しの輸血または血液製剤の投与；（３）免疫抑制又は細胞障害剤による処置及び（４）悪性腫瘍又は免疫応答の抑制に関連する病気の処置を必要とする人が挙げられる。加えて、ワクチンは、Ｂ型肝炎感染が広がっている成る熱帯に住む人にとうて必要である。

しかしＡ型及びＢ型肝炎ウィルスは、細胞培養基中で十分に増殖せず、ワクチン製造のための実験室で育てたウィルスの供給源はない、実際、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）を組織又はは器官中で継続的に転写する試みは何度も失敗しており、これが慣用のワクチンの開発への進展を妨げてきた〔ズッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ）、Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｅｔ、、　２　７　０　、２０５　（１９７５））　。

古典的にはワクチンは、殺した又は弱めた生物を適当な、補剤と共に宿主に導入して、望ましくは宿主におけるこの生物の病原的作用を避けながら、この生物に対する正常な免疫応答を開始することにより作られた。このアプローチは、いくつかの知られている制限を持っている。これらワクチンは複雑であり、対象とする抗原決定基のみでなく、多くの関連する及び関連しない存寄な物質を含み、その多くは、いくらかの又は総ての人において、宿主における望ましくない反応を誘発する。

たとえば、古典的方法で作られたワクチンは、望む免疫応答にとって妨害的である競争抗原、関連しない免疫応答を起す抗原、器官又は培養基からの核酸、未知の組成及び由来のエンドトキシン及び成分を含むかも知れない。複雑な物質から発生されたこれらワクチンは、対象の抗原からさえ競争応答を誘発する可能性を本質的に持っている。

過去に、抗原は、天然物質からの誘導、担体へのハブテンのカップリング、及び組換えＤＮＡ技術を含むいくつかの方法により得られてきた。セラ（Ｓｅｌａ）ら、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ＋６８．１４５０　（１９７１）ｉサイエンス、１６６．１３６５（１９６９）ｉ及びＡｄｖ、　Ｉｍｍｕｍ、　、　５．１２９　（１９６６））はまた、ある合成抗原を記述している。

ある「合成」抗原は、小さな分子（たとえばジニトロフェノール）を担体（たとえばウシ血清アルブミン）に接合することにより、即ち接合された小さな分子に対する抗体の産生、を起す抗原を作ることにより調製された。担体分子は、小さな分子自体が注射された動物の免疫系により認識されえない故に、しばしば必要である。この方法はまた、上述のセラの文献に記載されるように、既知蛋白質のポリペプチドフラグメントを担体に接合することにより抗原を作る別個の例でも採用された。

このハプテン−担体法は、免疫応答の性質の研究において良く役立ったが、診断又は治療の分野で役立つ抗原の生産においてはあまり用いられていない、その欠点の一つの理由は、この方法により病原（たとえばＢ型肝炎ウィルス）から有用な抗原決定基を選択し構築するためには、成功の合理的機会を持つために病原の全蛋白質配列を決定しなければならないことである。この課題の困難性の故に、これはほどんど行なわれていない。

組変えＤＮＡ技術は、ワクチン技術への新しいアプローチを開き、製造が単一特異性の遺伝子で開始されるという利点を持つ。

しかしこの利点の多くは、大腸菌又は他の生物における実際の生産では失われる。この手順においては、遺伝子物質がプラスミドに導入され、これが次に大腸菌に導入され、これが望む蛋白質を代謝の他の生成物と一緒に、すべて栄養物と混った状態で作る。

このアプローチは、望む蛋白質が形質転換大腸菌中で発現されるかどうかの不確実さにより複雑にされる。

また、望む蛋白質が作られるとしても、蛋白質が回収できるかどうか又はそれが大腸菌増殖のプロセスで破壊されないかという不確実さがある。たとえば、異種の又は変化された蛋白質が大腸菌により消化されることは、良く知られている。

たとえ蛋白質が興味を持った十分な量で存在しても、それはなお大腸菌代謝の他の生成物たとえば非所望の蛍白質、エンドトキシン、核酸、遺伝子及び未知の又は予測できない物質のような有害な物質から分離されなけれならない。

最後に、たとえ望む蛋白質を大腸菌の代謝の他の総ての生成物から分離できた（又は進歩した、必然的に極めて高価な方法により可能になる）としても、ワクチンはなお非所望の抗原決定基を含む全蛋白質から成り、かかる決定基のいくつがが不都合な応答を起すことは知られている。実際、さもなくばワクチンであると考えうる成る蛋白質が、ワクチンとしてのこの物質の使用を妨げる重大な交差反応又は副反応を誘発する抗原決定基を含むことが知られている。

また、ハイブリドーマ技術を用いて、ウィルス遺伝子生成物に対する抗体を作ることも知られている。基本的にはハイブリドーマ技術は、抗原の複雑な混合物から出発して、プロセスの終りに単一特異性抗体を作ることを可能にする。対照的に本発明は逆のプロセスであり、我々は比較的高純度の抗原決定基から出発して、望む抗原性生成物の精製の必要性を避けるものである。

ハイブリドーマ抗体は、低い親和力及び低い結合定数を示し、従って限られた価値を持つと知られている。またハイブリドーマ技術では、悪性腺癌である細胞による抗体の産生に依存し、これは分離技術、純度及び安全性に注意を要する。

ハイブリドーマ生産は、＆１ｌｖｅｔ培養又はマウスへの導入に依存し、この結果明らかに生産は高価でありかつロフト間の必然的バラつきがある。

また、実験をそれで始めなければならない複雑な混合物を少ししか含まない、又は少ししか免疫原性でなくかつより強い支配的抗原により隠される分子へと抗体を分泌するハイブリドーマを作ることは困難である。

アーノン（Ａｒｎｏｎ　）　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ％　６８．１４５０　（１９７１）、アタシ（Ａｔａｓｓｉ）　、イミュノケミストリ−（Ｉｎ＋ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　、１２．４２３　（１９７５）　、及びピアス（Ｖｙａｓ）ら、サイエンス、１７８．１３００　（１９７２）の従来の研究は、短い線形アミノ酸配列は一般に天然の蛋白質構造物と反応性の抗体を誘発しないようであることを示しているとこれら著者により解釈されてきた。多くの分子の多くの領域に関して、抗原決定基は、線形配列ではかなり離れているが折りたたまれた蛋白質においては互に近いアミノ酸残基から得られると考えられた。抗体を誘発するために用いられるポリペプチドの正確な三次元配置が、配列において互に近いアミノ酸に関係する抗原にとってさえも、多くの場合極めて重要であると考えられた。

たとえば、セラは、抗リゾチーム応答を誘発するために、かなり精巧なループ構造を合成することが必要であると考えた。アタシは、多くの精巧な分子を作り、各々は目標蛋白質の三次構造を模倣することを意図された。またピアスは、Ｂ型肝炎表面抗原の三次元配置が天然構造物と反応性の抗体を誘発するにおいて極めて重要な因子であると結論した。

サツトクリフｘ　（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ　）ら、ネイチア、２８７．８０１（１９８０）は、線形ポリペプチドに対する抗体が天然の分子と反応することを発見し、最近の研究は、比較的短い化学的に合成されたポリペプチドが蛍白質の露出される表面のほとんど任意の領域と反応性抗体を誘発できることを示している〔グリーン（Ｇｒｅｅｎ　）ら、セル（’Ｃｅ１ｌ）　、２８．４７７　（１９８２））、また、アミノ酸配列は現在、核酸配列決定技術により迅速に決定できるので、合成ポリペプチドは従来不可能であった正確なワクチンを作るために合成できる。すなわち、精巧な生合成は、不必要、不経済かつ邪魔である。

ピアスの米国特許第４．４１５，４９１号明細書は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原の土決定基に対応する一連のペプチドを開示する。宿主の保護に関するデータは示されていないが、ペプチドは肝炎ワクチン製造に有用であると述べられている。

ＨＢＶのための最近のワクチンは、慢性的にＨＢＶに感染した提供者の血漿から精製され、不活性化されたウィルス表面コート（ｊｌＢｓＡｇ）のサブウィルス成分より成る〔マンコリフェ（ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ　）　ら、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　％　２．４７０　（１９８０）　）　。

治療テストは、このＨＢｓＡｇワクチンの安全性と有効性を実証したが、そのようなワクチンは供給が限られており、また比較的高価であけ、と（にＨＢＶ病が広がっている国にとっては高価である。

従って、化学的に合成されたポリペプチドは、ＨＢＶワクチン接種計画のコスト及び安全性の点でかなりの利点を与える。ＨＢＶのＳ遺伝子の種々の領域のヌクレオチド配列から予定される合成ポリペプチドに対する抗血清が天然ＨＢｓＡｇと反応することは、ラジオイムノ沈降により　〔レルナー（Ｌｅｒｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７８．３４０４（１９８１））及び抗ＨＢｓＡＨのための市販の固相ラジオイムノアッセイ〔ゲリン（Ｇｅｔｉｎ　）ら、ウィルス肝炎（Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　）　、スムネス（Ｓｚｍｕｎｅｓｓ）ら編、４９−５５　（１９８２））により知られている。

病原関連蛋白質は、配列が病原関連蛋白質の決定基ドメインの配列に対応する合成ポリペプチドの生産により、免疫学的に模倣されうろことが最近判った。そのような発見は、サノトクリフエら、不イチア、２８７．８０１　（１９８０）及びレルナーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、７８．３４０３　（１９８１）により報告されている。

また、ゲリン（Ｇｅｔｉｎ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０．２３６５　（１９８３）は、ＨＢｓＡｇの決定基部分のアミノ酸配列、とくに残基１１０〜１３７に対応するアミノ酸配列を持つ、担体に結合された合成ポリペプチドで免疫化して、Ｂ型肝炎ウィルスからの限られた保護を最近発表した。

しかし合成ＨＢｓＡｇワクチンの構築は、Ｂ細胞（抗体生産性エピトープに対応する合成ポリペプチドに加えて、非重なりＴ細胞決定基に対応する合成ポリペプチドを必要とするかも知れない。

このような背景により、免疫系の三つの細胞成分は、Ｂ細胞（滑液ｊｌ　（ｂｕｒｓａ　）又は骨髄由来リンパ細胞）、Ｔ細胞（胸腺由来リンパ細胞）及びマクロファージである。Ｂ細胞は血液及びリンパ液中で循環し、抗体の生産に関係する。Ｔ細胞は、Ｂ細胞による反応を増強又は抑圧する。

一方、マクロファージは、Ｂ及びＴ細胞に抗原を与えかつ濃厚化することに関係する。また、マクロファージは、細胞分割又は分化を高め又は抑えることによってＴ及びＢ細胞両者のタイプ及び強さを調節するいくつかの生物学的活性調節物を分泌する。マクロファージは、非特異的であり、任意の外来抗原に反応する。

しかし、Ｔ及びＢ細胞は抗原特異性であり、特定の抗原に特異的である細胞膜レセプターを介して反応する。

マウスにおいて、ＲＢｓＡｇに対する抗体のインビボ生産は、少くとも二つの免疫応答（Ｉｒ）遺伝子により調節され、その一つはマウスＨ−２複合体のＩ−Ａサブ領域（Ｉｒ−ＨＢｓ　−１）にあり、一つはＩ−Ｃサブ領域（Ｉｒ−ＨＢｓ　−２）にある。丈決定基に対応する化学的合成ポリペプチドによる免疫化は、高応答と無応答マウス系統とを区別しない〔ミリヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）ら、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．．１３０．１４０１　（１９８３））、このことは、Ｉｒ制限が、分子の追加的な、たぶん非重なりの、領域のＴ細胞認識を通して起ることを示唆する。

マウスにおける主要組織適合性複合体とＨＢｓＡｇに対する免疫応答性の間の連結が、ＨＬＡ−ＤＲフェノタイプと最近のテスト的ＨＢｓＡｇワクチンへの無応答性の間の関係の報告により、ヒトの免疫応答へ拡張された。すなわち、合成ＨＢｓＡｇワクチンの構築は、Ｂ細胞エピトープに加えて、異型交配されたヒト株のエピトープ認識における遺伝子多様性を有するために、Ｔ細胞決定基の十分な多様性を必要とするであろう。

下記の情報が、合成１（ＢｓＡｇワクチンを開発するにおいて極めて価値があろう：（１）天然ＨＢｓＡｇの高度に限られた領域（すなわち約６つのアミノ酸）を表わす合成ペプチドフラグメントが、Ｈ−２結合遺伝子によって、天然ＨＢｓＡｇと同様に、調節されるＴ細胞増殖反応を誘発するかどうか１（２１７細胞認識部位が抗体結合部位と重なるかどうか；（３）複数のＴ細胞認識部位がＨＢｓＡｇ上にあるかどうか、そしてもしそうなら、認識される部位が反応する系統のＨ−２ゲツタイブに依存するかどうか；（４１ＬＨＩ！されるＴ細胞部位が体液応答の特異性及び量を決めるかどうか：及び（５）ヒトＨＢｓＡｇをプライムされたＴ細胞がマウスにおいてＴ細胞増殖を誘発したのと同じ決定基により活性化されるかどうか。

本発明のまとめ本発明は、特別の特徴及び特性を持つある合成ポリペプチド、及びこの合成ポリペプチドを利用する生成物及び方法に関する。

本明細書において、「ペプチド」と「ポリペプチド」という云葉が互換的に用いられる０本明細書で「合成ポリペプチド」という云葉は、天然に生じた蛋白質及びそのフラグメントを含まない、化学的に構築された（生物学的に構築され及び減成されるのと対比的な）アミノ酸残基の鎖を意味する。そのような合成ポリペプチドは、宿主において抗ポリペプチド抗体の産生を誘発できる。

本発明に従う合成ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原よりも短いアミノ酸残基配列を持ち、しかしＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）の少くとも一つの決定基部分のアミノ酸残基配列に免疫学的に対応するアミノ酸残基配列を含む。

ポリペプチドは、単独で、ポリマー（合成マルチマー）として、又は担体たとえばキイホールリンベントヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）などに結合された接合体として用いられ、生理学的に許容される動量で宿主動物に導入されると、宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発できる。

ワクチンは、下記のポリペプチド、そのポリマー、又はそれの担体に結合された接合体の−又は二基上を用意し、生理的に許容される希釈剤中に有効量のポリペプチドを溶解又は分散することにより作られる。

ワクチンで用いられる好ましい合成ポリペプチドの配列は、左から右へかつアミン末端からカルボキシ末端の方向に書いてＰｈｅ　（Ｉ　Ｉｓ）　ＰｒｏＧ　ＩｙＳｅｒＳｅｒ　（Ｔ　ｈ　ｒ）　ＴｈｒＴｈｒＳｅｒＴｈｒＧ　ｌｙＰｒｏｃｙｓＡｒｇ（Ｌｙｓ）ＴｈｒＣｙｓＭｅｔ（Ｔｈｒ）ＴｈｒＴｈｒ（Ｐｒｏ）ＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｈｒ（Ａｓｎ）ＳｅｒＭｅｔＴｙｒ（Ｐｈｅ）ＰｒｏＳｅｒＣｙｓ　；Ｍｅｔ（Ｔｈｒ）ＴｈｒＴｈｒ（Ｐｒｏ）ＡｌａＧｌｎＧｌｙＴｈｒ（Ａｓｎ）ＳｅｔＮｅｔＴｙｒ（Ｐｈｅ）ＰｒｏＳｅｒＣｙｓ　；及びＣｙｓＰｒｏＬｅｕＰｈｅ　（Ｉ　１ｅ）ＰｒｏＧｌｙｓｅｒｓｅｒ　（Ｔｈｒ）ＴｈｒＴｈｒＳｅｒＴｈｒＧｌ　ｙＰｒｏＣｙｓＡｒｇ　（Ｌｙｓ）ＴｈｒＣｙｓＭｅ　ｔ　（Ｔｈｒ）　ＴｈｒＴｈｒ　（Ｐｒｏ）　Ａ　ＩａＧｌｎＧｌｙＴｈｒ（Ａｓｎ）ＳｅｒＭｅｔＴｙｒ（Ｐｈｅ）ＰｒｏＳｅｒＣｙｓを含む、ＨＢｓＡｇのＢ細胞決定基部分（以下では、Ｂ型細胞刺激及びプライム部分とも云う）のアミノ酸残基配列（又はその一部）を含む。上式で、カッコ内の各アミノ酸残基は、直前のアミノ酸残基の代替物であり、配列中の特定のアミノ酸残基の上のカッコ内の数字は、Ｂ型肝炎ウィルス表面蛋白質のアミノ末端に対する当該特定のアミノ酸残基の位置を示す、そのようなポリペプチドはＢ型肝炎ウィルスと免疫反応できる抗体の産生を誘発し、宿主を感染から保護する。

ワクチンで用いられる好ましい合成ポリペプチドはまた、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いてＳｅｒＬｅｕＡｓ　ｎ　ＰｈｅＬｅｕＧ　１　ｙＧ　１　ｙＴｈｒＴｈｒＶａ　ＩＣｙｓ　ＬｅｕＧ　ＩｙＧ　ｌ　ｎ　Ａｓｎ　；ＶａｌＣｙｓＬｅｕＧｌｙＧＩｎＡｓｎ；ＣｙｓＬｅｕＧＩｙＧｌｎＡＳｎＳｅｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＡｓｎＨｉｓＳｅｒＰｒｏＴｈｒＳｅｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＴｈｒＣｙｓＰｒｏＧ　ｌｙＴｙｒＡｒｇＴｒｐＭｅｔＣｙｓＬｅｕＡｒｇＡｒｇＰｈｅｌ　ｌｅ；ＬｅｕＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｓｐＴｙｒＧｌｎＧｌｙＭｅｔＬｅｕＰｒｏＶａｌＣｙｓＰｒｏＬｅｕ　；及びＴｈｒＬｙｓＰｒｏＳｅｒＡｓｐＧ　ＩｙＡｓｎＣｙｓＴｈｒＣｙｓ　Ｉ　ｌ　ｅＰｒｏ　Ｉ　１ｅＰｒｏｓｅｒを含む、Ｔ細胞の増殖を誘発するＨＢｓＡｇのＴ細胞決定基部分（以下ではＴ細胞増殖部分とも云う）のアミノ酸残基配列（又はその一部）を含む。この式において、配列中の特定のアミノ酸残基の上のカッコ内の数字は、Ｂ型肝炎ウィルス表面蛋白質のアミノ末端に対する当該特定のアミノ酸残基の位置を示す。

加えて、本発明のＢ型肝炎ウィルスに対するワクチンは、アミノ末端から約位置１０７〜１５４．１１０〜１５４又は１２５〜１５４のＢ型肝炎ウィルスによりコードされる天然の病原関連蛋白質のアミノ酸残基配列に免疫学的にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの有効量、及び生理学的に許容しうる希釈剤を含むことができる。ワクチンは、宿主に導入されたとき、宿主において抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発できる。そのような抗体は、Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応でき、ワクチンは宿主をＢ型肝炎つィルス感染から保護できる。

たとえば１１合成ポリペプチドは、左から右へかアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式％式％により表わされるアミノ酸残基配列を含むことができる。上式で、カッコ内の各アミノ酸残基は直前のアミノ酸残基の代替物である。

上述の合成ポリペプチドの各々は、単独のモノマー形態で又は担体分子たとえばＫＬＨ又は破傷風トキソイドに接合されて用いることができる。合成ポリペプチドはまた、マルチマー形で用いることができる。

マルチマー形で用いられるとき、各ポリペプチドは、ポリマーの多数の繰返し単位の一つである。一つのａｍにおいて、マルチマーは、一つのポリペプチドのアミノ末端のアミン基と第二のポリペプチドのカルボキシル末端のカルボキシル基の間に形成されたアミド結合によって頭尾的に互に結合された少くとも二つのポリペプチドを含む。別のマルチマーのＧ様においては、ポリペプチドは、ポリペプチド繰返し単位がポリペプチド繰返し単位のＣｙｓ残基の間に形成されたポリペプチド間シスチンジスルフィド結合により互に結合されているポリマーの多数の繰返し単位の一つである。

別の態様では、本発明は、宿主におけるＨＢｓＡｇに対する細胞介在免疫応答の存在及びＢ型肝炎ウィルスの存在を測定するための診断系であって、ＨＢｓＡｇのＴ細胞決定基のアミノ酸残基配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ上述したような合成ポリペプチドを含む診断系を包含する。このポリペプチドは、有効量でかつ生理的に許容される希釈剤と共に宿主に皮フ内投与されると、宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発できる。この増殖は、皮フ内投与の部位で紅斑（発赤）及び硬化（皮）の硬化）により示され予めＢ型肝炎ウィルスに免疫化された宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発する方法、及び宿主におけるＢ型肝炎ウィルスの存在を測定する方法も開示する。この方法は、本明細書で述べたようなＴ細胞増殖性ポリペプチドを用意すること、及びポリペプチドの有効量を宿主中に後者の方法に従い生理的に許容される希釈剤と共に皮フ内投与することを含み、宿主における胸腺由来細胞の増殖及びＢ型肝炎ウィルスの存在は、皮フ投与の部位における紅斑及び硬化により示される。

本発明は、いくつかの利点及び利益を与える。本発明の利点の一つは、合成ポリペプチドの使用が、その対応する全蛋白質の存在の必要性を除去することである。このポリペプチド自体が、宿主を病気から守るに十分なワクチンを提供する。

従って、バクテリアからのバクテリア帯白質の使用するに足りる量の生産に伴う不純物たとえば細胞デブリス及び毒素は、本発明の生成物には存在しない。

また、Ｂ細胞及びＴ細胞決定基の両者を持つＢ型肝炎ウィルス合成ワクチンは、接受者における胸腺由来細胞の増殖を刺激するための、ヒトで用いるに適当な担体の選択の必要がない。

本発明の別の利点は、合成ポリペプチドに対して生じた血清中の抗体は、Ｂ型肝炎ウィルスに伴う抗原性蛋白質及びポリペプチドと免疫反応し、これの存在を検出できることである。

本発明のさらに別の利点及び利益は、以下の詳細な説明、実施例及び請求の範囲から当業者には明らかとなろう。

図面の簡単な説明本開示の一部を成す図面において；第１図は、核酸配列からパセフク（Ｐａ５ｅｋ　）ら、ネイチア、２８２．５７５　（１９７９）によ翻訳されたＨＢｓＡｇ／！！ＬＬ蛋白質の２２６アミノ酸配列を示す。本発明に従う合成のために選ばれた蛋白質の領域は、太いアンダーラインにより示されている。三つの刊行されたヌクレオチド配列決定と同じでない残基は、細くアンダーラインされている〔バセックら、同上；バレンズエラら、ネイチア、２８０．８１５−８１９　（１９７９）；及びガリバートら、ネイチア、２８１．６４６−６５０　（１９７９））。下記の一文字及び三文字コード（第２図参照）は、表示するアミノ酸に対応する：Ａ、ＡＪａ（Ｌ−アラニン）　；　Ｃ５Ｃｙｓ　（Ｌ−システィン）　；　Ｄ、Ａｓｐ　（Ｌ−アスパラギン酸）　；　Ｅ、Ｇｉｎ　（Ｌ−グルタミン酸）　；　Ｆ、Ｐｈｅ　（Ｌ−フェニルアラニン）　；　Ｇ、　Ｇｌｙ（グリシン）　；　Ｈ，Ｈｉｓ　（Ｌ−ヒスチジン）；１．Ｔｉｅ（Ｌ−イソロイシン）　；　’ｒｉ、　Ｌｙｓ　（Ｌ−リジン）　；　Ｌ、Ｌｅｕ　（Ｌ−ロイシン）：Ｍ、　Ｍｅｔ　（Ｌ−メチオニン）；Ｎ１＾ｓｎ　（Ｌ−アスパラギン）−ＰＳＰｒｏ　（Ｌ−プロリン）　；　Ｑ、Ｇｉｎ　（Ｌ−グルタミン）；ＲｌＡｒｇ（Ｌ−アルギニン）　；　Ｓ、Ｓｅｒ　（Ｌ−セリン）　；　Ｔ、　Ｔｈｒ（Ｌ−スレオニン）　；　Ｖ、Ｖａｌ　（Ｌ−バリン）；賀、Ｔｒｐ（Ｌ−トリプトファン）；及びＹＳＴｙｒ　（Ｌ −チロシン）。

第２図は、各アミノ酸に対して慣用の三文字コードを用いて、１．５．５ａ１６．４９．４９ａ、７１．７２．７２ａ１及び７３と名付けられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。これら配列は、左から右へかつポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端の方向に読まれる。ポリペプチド１．５．５ａ及び６は、各々、ＨＢｓＡｇの残基４８−８１．３８−５２．４７−５２、及び９５−１０９に対応する。ポリペプチド４９及び７２は、斂艶提供者（ポリペプチド４９）〔ガリバートら、ネイチア（ロンドン）、ペプチド７２及び７３）〔バレンズエラら、ネイチア（ロンドン）、２８０．８］５−８］９　（１９７９））からのＨＢＶ　ＤＮＡのＳ遺伝子配列から予定されるようなＨＢｓＡｇの残基］、１（１１３７に対応する（ペプチド７３は残基１０７−１３７に対応する）。ポリペプチド７２及び７３におけるアンダーラインした残基は、これら配列とポリペプチド４９の配列の間のアミノ酸の可変性の位置を示す。ポリペプチド４９ａ及び７２ａは、各々、ポリペプチド４９及び７２のＣ末端１２アミノ酸より成る（残基１２５−１．３７）、ポリペプチド７１は、ＨＢｓＡｇの残基１４０−１５４に対応する。

第３図は、自然なＨＢｓＡｇ　；　Ｐ　２５　（ＨＢｓＡｇの１−２２６残基サブユニツト）；Ｐ２５の下記のトリブチイック（ｔｒｙｐｔｉｃ　）（）リプシン分解の）フラグメント１Ｐ２５−１　（残基１−１２２）及びＰ２５−２　（残基１２３−２２６）、及びＰ７３、Ｐｌ２、Ｐｄ２、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ５ａ及びＰ２（残基１４０−１４８）によりインビトロに誘発されたＨＢｓＡｇ（ａｄ又は斂サブタイプ）によりプライムされたボブリテアル（ｐｏｐｌｉｔｅａｌ　：腋窩）リンパ節細胞におけるマウスＣ，Ｈ，Ｑ系統Ｔ細胞増殖応答を示す、ここで、数字の前の文字Ｐは、ペプチドつまりポリペプチドを意味する。増殖は、トリチウム化チミジン（’ＨＴｄＲ）を細胞ＤＮＡに入れ７分（ｃｐｓ　）を与える増殖を誘発し、免疫原ＨＢｓＡｇ上粒は、３３、０００ｃｐｍを与える増殖を誘発した。

第４図は、自然のＨＢｓＡｇ、　Ｐ　２５　（１−２２６残基）；Ｐ２５の下記のトリブチイックフラグメント：Ｐ２５−１　（残基１−２２２）及びＰ２５− ２　（残基１２３−２２６）；及びＰ７３、Ｐｌ２、Ｐｄ２、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ５ａ及びＰ２により誘発されたマウスＢ１．Ｏ，Ａ系統Ｔ細胞増殖応答を示す。増殖応答投与量及び測定手段は、第３図におけると同じである。免疫原ＨＢｓＡｇ／ａｄ及びＨＢｓＡｇ／４ｚにより誘発された増殖応答は、各々、８７２４ｃｐ −及び１１，４４４ｃｐｍであった。第３回及び第４図の評価の詳細は、第■部及び第７部で述べられる。

本発明の詳細な説明 ■序ｔｌＢｓＡｇのｄ（Ｐｌ２）及び、Ｌ（Ｐ　４９　）決定基のアミノ酸残基配列にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドは、レルナーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８．３４０３（１９８１）により合成された。これらポリペプチドは、抗天然ＨＢｓＡｇ抗体を結合するそれらの能力により示されるように自然の決定基の抗原特異性を有する。また、キイホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合されたＰｄ２による免疫化は、マウス同系交配レスポンダ−系統における高力価抗り応答を誘発する。

ミリヒ（Ｍｉｌｉｃｈ　）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３０，１４０１　（１９８３）。

しかし、遊離の（接合されていない）Ｐｄ２は、抗り産生を少ししか又は全く誘発しない。同様に、遊離のＰｌ２は、極めて少しの抗Ａ応答を誘発する。実際、ＨＢｓＡｇの非接会合Ｈｄプチド近似物の誘発された免疫原性（接合されたものと比べて）は、多数の研究者により扱われた。

従って、ＫＬＨ及び破傷風トキソイドのような蛋白質担体分子が、これら合成決定基のために非特異的Ｔ細胞ヘルパー機能を与える手段として用いられてきた。

Ｔ細胞及びＢ細胞決定基の両者を持つ合成ＨＢｓＡｇワクチンを構築するために、ＨＢｓＡｇのＴ細胞及びＢ細胞決定基を同定することが先ず必要である。

ＲＢｓＡｇに対するマウス免疫応答はＨ−２結合Ｉｒ遺伝子により調節されること、及びこの調節はＴ細胞レベルで発現されることが知られている。ノンレスポンダ−ハブロタイブは、Ｔ−ヘルパー細胞機能の欠陥により特徴づけられ、一方、ＨＢｓＡｇ特異的Ｂ細胞レパートリ−は完全である。ＨＢｓＡｇの遊離の接合されていない合成ペプチド近似物の低下された免疫原性に加えて、Ｐｌ２（残基１１０−１３７）又はＰｄ２（残基１１０−１３７）による免疫化は、高レスボンダー系統とノンレスボンダー系統を区別しなかった。

これらの結果は、Ｐｌ２及びＰｄ２は天然の構造のＢ細胞エピトープを表わすが、適当なＴ細胞決定基を欠くことを示している。

すなわち、これらＢ細胞エピトープ単独による免疫化は、必要なＩｒ制限されたＴ細胞ヘルパー機能を発生しない。

Ｔ細胞決定基を同定するために、ＨＢｓＡｇの特異的Ｔ細胞増殖評価において本明細書で述べるように多数のＨＢｓＡｇ合成ペプチドがスクリーンされた。マウスがインビボで自然のＨＢｓＡｇ／ａｄ又はＨＢｓＡｇ／ａＪＬで免疫化され、ポプリテアルリンパ節（ＰＬＮ）細胞が採取され、インビトロで自然のＨＢｓＡｇ又は一連の合成ポリペプチドで攻撃された。

いくつかのポリペプチドが、インビトロでＨＢｓＡｇプライムされたＰＬＮ細胞の増殖を刺激すると判った。とくに、第１及び２図のポリペプチドＰ５（残基３８−５２）　、Ｐ５ａ　（残基４７−５２）、Ｐ６（残基９５−１０９）、及びＰｌ１（残基１４ｏ−１５４）は、封又は肛サブタイプのＨＢｓＡｇでインビボにプライムされたマウスＰＬＮ細胞のＴ細胞増殖を刺激する。

また、少くともポリペプチドＰＬ（残基４８−８１）及びＰ５は、ヒト末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ）におけるＴ細胞増殖を誘発する。

Ｐｌ、Ｐ５、Ｐ５ａ、Ｐ６及びＰｌ１は、自然ＨＢｓＡｇと交叉反応性の抗体の産生を誘発せず、またこれらは自然抗Ｈａｓ抗体を結合しないことに留意しなければならない、逆に、Ｐｌ２及びＰｄ２はＴ細胞増殖を誘発せず（又はせいぜい極少しのみ誘発し）、しかし適当な特異性の抗ＨＢｓを結合し、Ｂ型肝炎に対するいく分の保護を与える。

これらの結果は、同じＨＢｓＡｇポリペプチド上におけるＴ細胞及びＢ細胞決定基のための明瞭な座の存在を示す。本発明に従い、Ｂ細胞決定基杆ましくは合成り細胞決定基と共に合成Ｔ細胞決定基を用いることは、有力な合成抗原を与える。

Ｈ−２コンジェニック組換えマウス系統におけるＨＢｓＡｇに対する免疫応答の従来の遺伝子分析は、ＨＢｓＡｇ上の「担体決定基」の存在を示す。なぜなら、総てのＨＢｓＡｇ決定基に対する免疫応答への主な影響は単一のＩｒ遺伝子座にマツプされるからである。ポリペプチド５．５ａ、及び６は、自然の分子上のそのような担体決定基に対応する。これらポリペプチドは、固有の担体として機能し、これらが接合される任意のかつ総ての合成り細胞エピトープのための機能的Ｔ細胞ヘルプを与える。

すなわち本発明の一つの面は、ここで述べるＴ細胞増殖性ポリペプチドたとえばポリペプチド１．５．５ａ、及び６の少くとも一つの有効量を、活性成分として含むワクチンに向けられる。そのようなワクチンは、宿主動物（又はヒト）がＨＢｓＡｇＢ細胞アクチ細胞アーチベーター全なＨＢｓＡｇ分子又は４９．４９ａ、７２及び７２ａと呼ばれるようなポリペプチドにより免疫化された（これらにプライムされた）後に、宿主動物に導入されることができる。

より好ましくは、本発明のＴ細胞増殖性ポリペプチドは、プライム性Ｂ細胞刺激免疫原たとえばポリペプチド４９．４９ａ、７２及び７２ａと共に宿主動物に投与される。

より好ましいＴ細胞増殖性、およびＢ細胞刺激性かつプライム性ポリペプチドは、一つのワクチンの別々の成分として宿主に導入されることができ、ここで各々はそれ自身の担体に結合され又は活性なポリペプチド繰返し単位のホモポリマーである。より好ましくは、両タイプのポリペプチドは、単一の担体に結合され、従ってワクチン中で単一の活性成分を構成する。天然分子のＴ細胞及びまたＢ細胞決定基のアミノ酸配列にほぼ対応するアミノ酸配列を持つコポリマー化したポリペプチド繰返し単位を含む合成ＨＢｓＡｇワクチンは、ヒトにおける免疫化のために適当な蛋白質担体分子を選択することを試みるよりもはるかに好ましいアプローチである。

また、ｌｌＢｓＡｇに関連する合成ポリペプチドの免疫原性の昂進は、合成１（ＢｓＡｇワクチンの開発における基本的局面である。ここで述べる高度に免疫原性の合成ＨＢｓＡｇワクチンは、現在のヒト血漿由来ワクチンに比べて望ましい医学的ならびに経済的利点を持つ。

■　検討この研究からのデータは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）の限られた領域；と（に残基４８−８１　（合成ペプチドＰＩに対応）、残基３８−５２　（合成ペプチドＰ５に対応）、残基９５−１０９（合成ペプチドＰ６に対応）、残基４７−５２　（合成ペプチドｐｓａに対応）及び残基１４０−１５４　（合成ペプチドＰ７１に対応）がＨＢｓＡｇプライムされたＴ細胞により優先的に認識される部位であることを示す。

合成ペプチドＰ１、Ｐ５、Ｐ５ａ、Ｐ６及びＰ７１はＴ細胞増殖応答を誘発するけれど、これらペプチドは天然分子を認識する抗体を対応して誘発又は結合しない。このことは、複雑な蛋白質抗原に応答するにおけるＢ細胞とＴ細胞の間に存在しうる決定基特異性の相違を示す。

そのような相違は、下記の文献に記載されるように種々の抗原系で観察されている：セニノク（Ｓｅｎｙｋ）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１３３．１２９４　（１９７１）；　）−マス　（Ｔｈｏｍａｓ　）　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１２６．１０９５　（１９８１）；ベルコヮ−（Ｂｅｒｋｏｗｅｒ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ−、７９，４７２３（１９８２）、キブス（Ｋｉｐｐｓ　）　ら、Ｊ、　Ｉｎ＋＋ｅｕｎｏ１．＋　１２４．１３４４　（１９８０）。

対照的に、他の研究者達は、下記文献に記載されるように、抗原に対する類領のＴ及びＢ細胞のレセプター特異性を発表した：ライニング（Ｔｗｉｎｉｎｇ　）　ら、Ｍｏ１．　ｆｎｕｎｏｌ、　１８．４４７（１９８１）ｉラジヱウスキイ（Ｒａｊｅｗｓｋｙ　）ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＩｌｍＩＩＩｕｎｏ１．＋　４．１１１（１９７４）；ベッカ−（Ｂｅａｋｅｒ　）ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｔｍ＋ｗｕｎｏ１．、　５．２６２　（１９７５）。しかし、Ｔ及びＢ細胞ｍ！部位が決して重ならない又は常に重なるという仮定は、従ってあまりに単純すぎる。

ＨＢｓＡＨに関して、Ｃ３Ｈ，Ｑ　（Ｈ−２ｑ）又は車にＣ，Ｈ，Ｑ　、及びＢ１０．Ｔ　（６Ｒ）（Ｈ−２ｑ）又はＢ１０．Ｔ　（６Ｒ）マウス系統は、優先的にＨＢｓＡｇのアミノ末端フラグメント〔とくにＰ　２５　Ｒ［ｌｌＡｇポリペプチドサブユニットの残基１−１２２　（Ｐ２５−１））及び構成要素ペプチドＰ５、Ｐ５ａ及びＰ６を認識する。マウス系統Ｃ，）１．Ｑ及びＢ１０．Ｔ　（６Ｒ）は、増殖応変の程度に基いて、レスボンダー系統又はハイレスポンダ− 系統と本明細書で呼ばれる。

一方、Ｂ１０．Ａ　（Ｈ−２”　）又はＢ１０．Ａ　７ウス系統Ｔ細胞の増殖応答は、ＨＢｓＡｇのカルボキシ末端〔と（にＰ２５の残基１２３−２２６　（Ｐ２５−２））及びＰ７２合成ペプチド（これらはＨＢｓＡｇ上の抗体結合部位としても働く）に殆ど専ら向けられる。マウス系統Ｂ１０．Ａは、増殖応答がＣ，Ｉｌ、Ｑ又はＢ１０．Ｔ　（６Ｒ）よりも小さいので中程度レスボンダー系統と呼ばれる。

マウス系統ＳＪＬ　（Ｈ−２’　）又はＳＪＬは、ＦＩＢｓＡｇでの免疫化に対し応答を与えないことが見い出され、従ってノンレスポンダ−と呼ばれる。

従って、多重Ｔ細胞認識部位がＨＢｓＡｇ上に存在するようであり、Ｔ増殖性細胞の選択的活性化は、応答する系統のマウスの主要組織適合性複合体（Ｈ−２）ハブロタイブに依存する。Ｉｒ−ＨＢｓ−１は、総てのＨＢｓＡｇ　ヘの応答を調節する；一方、Ｉｒ　−［ＩＢｓ　−２の影響は、サブタイプ特異的である。

（Ｔｒ遺伝子及びサブ領域についての一般的記述としては、バッハ（Ｂａｃｈ　）、免疫学における免疫応答の遺伝子制御（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅｓｉｎ　Ｉｓｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　、ａｈ、２４．６７７−７０３　（Ｊｏｈｎ　ｗｉｊｅｙ　＆５ｏｎｓ、ニューヨーク、１９８２を参照されたい、引用することにより、これの記載をここに取り込む。）ここで用いられる系統において、ＨＢｓＡｇ　Ｐ　２５ポリペプチドサブユニツトのアミノ末端フラグメントＰ２５−１及び合成ペプチドＰ５ａ又はＰ５に対する陽性Ｔ細胞増殖応答は、総てのＨＢｓＡｇ決定基に対する抗ＨＢｓ抗体産生の昂進を示した。対照的に、Ｂ１０．Ａマウス系統のＴ細胞増殖パターンは、サブタイプ特異性に限られる一次抗ＨＢｓ抗体産生の低減に対応する。

合成ペプチドＰ５、Ｐ５ａ及びＰ６のアミノ末端フラグメント上の部位（単数又は複数）は、土、見及び−ｙ−エピトープに対し特異性のＢ細胞クローンに機能的ヘルプを与えることができるＴヘルパー細胞により認識されかつＩ−Ａサブ領域により制限されるＴ細胞「担体決定基」として働く、「担体決定基」の認識の不存在下では、Ｉ−Ｃサブ領域により制限されるサブタイプ特異性ヘルパー又はサプレッサーＴ細胞の影響が観察される。　Ｂ１０．Ａ系統は最小の二次抗土抗体応答を行うので、サブタイプ特異性子細胞はまた、配置釣上エピトープに対し特異性のＢ細胞クローンにヘルプを与える。

これらの観察は、合成ＨＢｓＡｇワクチンの開発の点で、とくにヒトのＨＢｓＡｇプライムされたＴ細胞がマウスＴ細胞と同じエピトープを認識する可能性の点で重要な示唆を持つ。

とくに、マウスにおける主要組織適合性複合体とＨＢｓＡｇに対する免疫応答性の調節の間の連結が、ヒトの免疫応答性に拡張された。ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ａｍｅｒ、　Ａｓ５ｏｃ、　Ｂｌｏｏｄ　Ｂａｎｋｓｓ４（１９８１）は、ヒト主要組織性複合体のＤＲ遺伝子座（ＩＩＬＡ−ＤＲ）における特定のフェノタイプと最近のテスト的ＨＢｓＡｇワクチンへの応答性の間の関連を報告している。

従って、合成ＨＢｓＡｇワクチンの構築は好ましくは、Ｂ細胞決定基に加えて、異型交配されたヒト集団のエピトープ認識における遺伝子多様性に順応するために十分な多様性のＴ細胞決定基を含む。

■結果Ａ、マウスＢ細胞エピトープの同定マウス抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を誘発し、かつこれに結合するＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）のポリペプチド配列が同定された。

ＨＢｓＡｇ　ａサブタイプ■（ＨＢｓＡｇ上匹）の多数のポリペプチド配列が、合成ポリペプチド合成のために選ばれた。これらのポリペプチドＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ５ａ、Ｐ６、Ｐ４９、Ｐ４９ａ、Ｐ７１、Ｐ７２、Ｐ７２ａ及びＰ７３は第１図に示されている。

ペプチドは、本明細書の第■部に記載され、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）ら、Ｊ、　Ａｍ、ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ、、　８５．２１４９　（１９６３）及びホーテン（ｌ（ｏｕｇｈｔｅｎ　）ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ、１６．３１１（１９８０）記載のように、固相法により化学的に合成された。合成ポリペプチドの各々に対し特異的な抗ポリペプチド抗体は、合成ポリペプチドがＫＬＨに接合され水及び補剤をも含むワクチンとしてラビットに導入されたとき、産生された。

ＨＢｓＡｇ　ａａサブタイプｄ　（ＨＢｓＡｇ／ａｄ）及びＨＢｓＡｇ群主サブタイすエ（ＨＢｓＡｇ／ｑ）のプールされた精製された調製物は、ロバートルーイ（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｌｏｕｉｅ　）博士（カッターラボラトリーズ（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　、バークレー、カリフォルニア）から得た。合成ペプチドに対する抗体は、本明細書記載のように赤血球凝集反応評価（ＨＡ）によりＨＢｓＡｇ／ａｄ及びＨＢｓＡｇ／ａＪＬに対する反応性について分析された。丈又はＬ特異性のマウス抗天然ＨＢｓＡｇ抗体に結合する固相ポリペプチドの能力はまた、下記のように測定された。

ポリペプチドＰ７３　（残基１０７−１３７＞　、Ｐ７２　（残基１１０−１３７）及びＰ７２ａ　（残基１２５−１３７）は、封サブタイプの天然ＨＢｓＡｇと交叉反応性の抗体の産生を誘発した。一方、ポリペプチドＰ４９（残基１１０ −１３７）及びＰ４９ａ（１２５−１３７）は、■サブタイプの主に天然ＨＢｓＡｇに交叉反応性の抗体産生を誘発した。（第１表参照）表　１ＨＢｓＡ　のム　ペプチド升゛　におけるＢ細胞エピトープの西Ｐ７３　１：１２８０　ｉ：４ｏ　１：５１２　１：３２Ｐ７２　ｉ：１ｅｏ　Ｏ１：１０２４　０Ｐ　７２　ａ　１　：　１６０　０　ＮＯ’　ＮＤＰ　４９　１　：　８０ ’　１　：　１．６０　１　：　３２　１　：　１２８Ｐ　４９　ａ　Ｏ１：　１．６０　０　１　：　６４Ｐ６　０　０　０　０Ｐ５　０　０　ｔ’ｓ　０Ｐ５ａ　ＯＯＯＯＰ４　０　０　１：４　０Ｐ３　０　０　１：１６　ｉ：ａＰ２　０　０　０　０ｐ１０　０　１：１６　０１、抗ペプチド抗血清はラビットにおいて作られた；そして総てのペプチドは、Ｐ７３、Ｐ７２及びＰｌを除いて、キイホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合された。マウスで〔ミリヒら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１３０．１４０１　（１９８３））及びチンパンジーで（ゲリン（Ｇｅｔｉｎ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ−Ｓｃｔ、ＵＳＡ８０．２３６５　（１９８３）　）作られた抗ペプチド抗血清は、天然ｔ（ＢｓＡｇに対し同じ特異性を示す。

２、　ペプチド（５μｇ／＜ぼみ）はポリスチレン微小力価プレートに吸収された。

３、　抗８Ｂｓ／ｄ及びＬは、各々、ＨＢｓＡｇ／ａｄ又はＨＢｓＡｇ／ＨによりＢ１０．Ｓ　（９Ｒ）マウスを免疫化することにより作られた。このＨ−２組換え系統は、サブタイプ特異的抗体応答のみを作る。

４゜　ＮＤ−測定されず。

５、共通上決定基に対し特異的でない。

ポリペプチドＰ７２及びＰ７２ａは、アミノ酸残基位置においてポリペプチドＰ４９及びＰ４９ａに対応し、しかし第１図及び第２図に示すアミノ酸置換を含まない、抗Ｐ４９抗体は、ＨＢｓＡｇの両サブタイプと反応するが、ＨＡ抑止分析は、交叉反応性が共通上決定基に向けられていすに、天然１（ＢＳＡｇ／６ｄ、Ｐ４９及ヒＰ７２上にありしかし天然ＨＢｓＡｇ／ｕ上には無い決定基に向けられていることを示した。

加えて、互又はＬ特異性のマウス抗天然ＨＢｓＡｇ抗体に結合する合成ポリペプチドの上述の一連のものの能力が調べられた。第１表に示されるように、Ｐ７２は抗１１Ｂｇ’／　ｄを結合し、しかし抗■Ｂｓ／−χ−に結合しなかった；一方、Ｐ４９は抗ＨＢｓ　／ｌ及び抗ＨＢｓ　／±をある程度結合した（たぶん共通上決定基に関係しない交叉反応性決定基を通して）。Ｐ４９ａが、肛サブタイプとのみ反応する抗ポリペプチド抗体の産生を誘発しそして抗）ＩＢｓ／　Ｙを結合し、しかし抗ＨＢｓ／ｄを結合しないという事実は、このポリペプチドの１特異性を示す。アミノ末端アミノ酸の付加を持つＰ７２に同じＰ７３は、主として工時異性を示した；しかし免疫原性研究において、小さな交叉反応性成分が観察された。）（Ａ抑止分析が、この成分は両サブタイプ（すなわち拭上）に共通の決定基に特異的であることを示唆したことは興味深い。この測定で用いられた合成ポリペプチドの残りは、非変性条件においてＨＢｓＡｇと交叉反応性の抗ペプチド抗体を誘発せず、抗天然ＨＢｓＡｇ抗体を極少しでも結合せず又は結合されなかった。

これらの結果は一般に、ゲリンら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８０．２３６５　（１９８３）の報告する結果と一致し、互及びＬサブタイプ特異性抗体結合部位が各々合成ポリペプチドＰ７２ａ及びＰ４９ａ内に局在することを確認する。これら合成ポリペプチドは、ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列の残基１２５−１３７に対応し、そしてＰ４９ａは４つの残基でＰ７２ａと異るが、ベターリン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　）ら、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、、２５７．１０４１４（１９８２）は、残基１３１及び１３４におけるアミノ酸置換がサブタイプ特異性を与えることを示唆した。

多数の他の合成ポリペプチドとの抗天然ＨＢｓＡｇの少しのかつ低い力価の活動性は、ＨＢｓＡｇ減成生成物に向けられた特異性をおそらく含む抗血清の複雑性によるかも知れない、この見解を支持して、ペプチドＰ３、Ｐ４及びＰ６に対する抗血清は天然ＨＢｓＡｇと反応しないが、にも拘らず変性ＲＢｓＡｇを結合する（レルナーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡｓ　７８．３４０３　（１９８１））。

Ｐ７３の「主類似の」活動は、Ｐ７２へのシスティン残基の付加により説明されうる。なぜなら領内ジスルフィド結合の導入により作られた残基１２２〜１３７に対応する合成ペプチドの環状形が、配置依存性土エピトープを含むと報告されているからである〔イオネスクーマロ（Ｉｏｎｅｓｃｕ−Ｍａｔｌｏ　）　ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１３０．１９４７　（１９８３））　。

Ｂ、マウスＴ細胞エピトープの同定天然ＨＢｓＡｇプライムされたマウスＴ細胞により認認されるＨＢｓＡｇのポリペプチドが同定された。

天然ＨＢｓＡｇ／ａｄｗは、ベターリンら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　２５６．６９７５　（１９８１）記載のように、単一の治療保有者の血漿から精製された。Ｐ　２５（ＨＢｓＡＨのポリペプチドサブユニット）、及び、Ｐ２５ −１　（残基１−１２２）及びＰ２５−２　（残基１２３−２２６）と呼ばれるＰ２５の二つのトリブティクフラグメントは、同じ）ｌＢｓＡｇ／ａｄｗ陽性提供者から、ペダーリンら（前出）記載のように準備のポリアクリルアミドゲル電気泳動により調製された。合成ポリペプチドＰ７３、Ｐ７２、Ｐ４９、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ５ａ、Ｐ２及びＰＬ（第１図参照）は、本明細書記載の方法に従って作られた。これらポリペプチド及び合成ペプチドは、凍結真空乾燥され、培養基に怒 −濁され、そしてガンマ照射（５０００ラド）により殺菌された。

用いた培養基は、オリジナルなりリックの培養基〔クリック（Ｃ１１ｃｋ　）ら、Ｃｅ１ｌ　Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．、３．２６４（１９７２）記載〕であり、これは１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　Ｃ４（−２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸〕及び１（Ｉｇ／ｍ１のゲンタミンの添加及び胎児ウシ血清の代りに０．５％シンジェニック正常マウス血清の使用により変更された。Ｐ２５、Ｐ２５−１及びＰ２５−２は、培養基に完全には溶解しなかった。培養基に懸濁されたポリペプチド及び合成ペプチドは、本明細書で抗原と呼ばれ、採取されたボプリテアルリンパ節（ＰＬＮ）細胞と共に下記のように培養された。

ミリヒら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３０．１３９５　（１９８３）記載のように、Ｃ，Ｈ，口（Ｈ−２ｑ）は、ＨＢｓＡｇでの免疫化後に共通主サブタイプ及び↓ＺＬ決定基の両者に対し初期（１０日）ＴｇＧ抗体を作る近親交配マウス株である。５匹のＣ，１１，Ｑマウスの群が、完全なフロイントのアジュバント及び１６μｇのＨＢｓＡｇ／ａｄ又は＋ｌＢｓＡｇ／、ｑ　（上述のように得た）のプールした精製した調製物のエマルジョンを用いて後足裏に免疫化された。１２日後にポプリテアルリンパ節（ＰＬＮ）細胞を採取し、上述のように作られた抗原と共にインビトロで培養された（２．５Ｘ１０ｈ細胞／　ｍ　ｊ！　）。

抗原は、投与範囲に亘って培養でテストされたが、第３図に示す増殖応答は下記のインビトロ投与量に対応する：天然ＨＢｓＡｇ（１，０μｇ／ｍｆｆ１）；Ｐ２５、Ｐ２５−１．Ｐ２５−２　（１０μｇ／ｍｌ）；及び合成ペプチドＰ７３、Ｐ７２、Ｐ４９、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ５ａ及びＰ２　（１００μｇ／ｍｆ）。

免疫化後１３日までに採取されたＰＬＮ細胞のＨＢｓＡｇ特異性増殖応答は、ミリヒら−Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３０．１４０１　（１９８３）記載のように、Ｔ細胞を増殖することによった。従って、分画しないＰＬＮ細胞が測定で用いられた。

ＨＢｓＡｇ特異性は、ＣＦＡプライムされたＰＬＮ　Ｔ細胞における抗原誘発増殖がないことにより例証された。増殖は、トリチウム化チミジンＭＨＴｄＲ）をＤＮＡに入れることにより測定され、抗原により誘発された応答のパーセントとして表現された。

評価は、少くとも三回の別々の実験で繰返えされた。

Ｔ細胞増殖応答は、合成ポリペプチドにより誘発されたもののパーセントとして表現される。ＣＨ３，０マウスからのＨＢｓＡｇ／ａｄプライムされたＰＬＮ　Ｔ細胞は、インビトロで天然のＨＢｓＡｇ／ａｄｗ及び、はぼ同様に、用いられた合成ポリペプチドに対して応答し、天然ＨＢｓＡｇ／Ｈ（共通群特異性決定基に向けられた増殖を示す（第３ａ図））に対しては本質的により少し応答した。

ポリペプチドＰ２５は、天然ＨＢｓＡｇ／封しくこれからＰ２５が調製された）と同程度にＴ細胞増殖を誘発した。数μｇ　／　ｍ　１．のＰ２５が必要であった（天然の抗原は１．０μｇ／ｍｌ）が、Ｐ２５調製物は培養基に完全には溶解せず、有効投与量は１０μｇ／ｍｌよりかなり少なかったであろう。このことは、Ｐ２５が天然抗原よりも約３００倍効率悪く抗ＨＦｌ５抗体を結合するので興味ある。

Ｐ２５−１は、１０μｇ／ｍｆｆ１でＰ２５−２よりも良い増殖応答（６７％対４５％）を誘発し、２．５μｇ　／　ｍ　１でかなり大きい増殖応答（５３％対１３％）を誘発した。この系統におけるＰ２５−２に比べてＰ２５−１により誘発された優れた増殖応答は、合成ポリペプチドＰ７３及びＰ７２　（Ｐ２５−２の要素）が最小の増殖応答を誘発し；一方、Ｐ６（残基９５−１０９）、Ｐ５− （３８−５２）及びＰ５ａ　（４７−５２）（Ｐ２５−１の要素）がＨＢｓＡｇ／ａｄプライムされたマウスにおいてかなりの増殖を誘発したという事実により確認された（第３ａ図）。合成ポリペプチドによるＴ細胞増殖の誘発は、天然ＨＢｓＡｇに比べて、重量基準で１、　Ｏ０倍過剰、モル基準で１０４倍過剰を要求した。

Ｐ６、Ｐ５及びＰ５ａは天然ＨＢｓＡｇと交叉反応性の抗体の産生を誘発せず、またそれらが天然抗）ＩＢｓを結合せず、そして逆にＰ７３及びＰ７２は、Ｃ，Ｈ，Ｑマウスにおいて最小のＴ細胞増殖しか誘発せず、しかし抗ＨＢｓ／ｄを誘発しかつ結合することが強調されなければならない（第１表参照）。これらの結果は、同じＨＢｓＡｇポリペプチド上での明瞭なＴ細胞及びＢ細胞決定基の存在を示す。ポリペプチドＰ５ａは、長さにおいて僅かに６アミノ酸であるが、ポリペプチドＰ５よりも大きい程度でＴ細胞増殖を誘発した。このことはたぶん、Ｐ５ａがＨＢｓＡｇのアミノ末端フラグメン）　（Ｐ２５−１）の極端に親水性の領域から導かれ、ポリペプチドＰ５よりもかなり良く食塩水中に溶解するためであろう。

先に述べたように、ポリペプチドの他の大きな疏水性部分は、主にカルボキシ末端フラグメント（Ｐ２５−２）に位置する抗体結合領域に対応する。

Ｔ細胞応答のサブタイプ特異性を測定するために、Ｃ，Ｈ，Ｑマウスはまた、ＵサブタイプのＨＢｓＡｇでインビボでプライムされた。

封サブタイプの天然ｔｌＲｓＡｇに対する及びａｄｗ−誘導Ｐ２５＆びトリブチイックフラグメントＰ２５．−１およびＰ２５−２に対する増殖応答はぐ　）ＩＢｓＡｇ／ａｄプライムされたマウスに比べて低減された。

しかし、合成ポリペプチドＰ６、Ｐ５およびＰ５１に対する応答は、ＨＢｓＡｇ／ａｄプライム後に誘発された応答にほとんど等しかった（第３ｂ図）。ポリペプチドＰ７３及びＰ７２は、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ　／ＨプライムされたＴ細胞のために刺激性でなく、Ｐ−４９は１ＢｓＡＨのどのサブタイプによるプライム後に増殖応答を誘発しなかった。

これらの結果は、Ｐ７３及びＰ７２がＴ細胞及びＢ細胞レベルでサブタイプ特異的決定基を表わすことを示す。一方、Ｐ６、Ｐ５及びＰ５ａは、両サブタイプ上に存在する共通Ｔ細胞認識部位を表わす。このことは、アミノ酸配列と一致する。なぜなら、Ｐ６及びＰ　５　ａ　＠ｌ域は常に、今日までに決定されたＨＢｓＡｇ配列中にあり、一方、Ｐ７２ｆ＋Ｉ域は可変であり、この領域でのアミノ酸置換はサブタイプ特異性を指令するからである。ゲリンら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８０．２３６５　（１９８３）及びレルナーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　７８．３４０３　（１９８１）。

これら応答のＨＢｓＡｇ特異性は、ＨＢｓＡｇ及びその関連フラグメントに応答してのＣＦＡプライムされたＰＬＮ　Ｔ細胞における増殖のないことにより例証された。

ポリペプチド７１ＨＢｓＡｇに対してプライムされた宿主における胸腺由来細胞の増殖を刺激又は誘発するポリペプチドＰ７１　（残基１４０−１５４）の能力がまた研究された。マウス系統Ｃ，Ｈ，Ｑは、ＨＢｓＡｇＢｓＡｇサブタイプＢｓＡｇＢｓＡｇサブタイプ免疫化された。ノンレスボンダーマウス系統（ＳＪＬ）のマウスは、ＨＢｓＡｇＢｓＡｇサブタイプ接種された。（表２参照）。

表２トリチウム化チミジン（’ＨＴｄＲ）導入（ｃｐｓ）　’１、対照培養基からのバックグラウンド読み値について較正後のカウント７分（ｃｐｌｌ）の変化免疫化は、ミルヒら、Ｊ、　ｌａｕｗｕｎｏｌ、　、１３０　、１３９５　（１９８３）記載のように行われた。五匹のＣ３Ｈ，Ｑマウスの群が、完全なフロイントのアジュバント及びＨＢｓＡｇ／ａｄ又はｌ（ＢｓＡｇ／鮫（前述のように得た）のプールした精製した調製物の１６μｇのエマルジヨンを用いて後足裏に免疫化された。１２日後に、ボプリテアルリンパ！ｆｆ（ＰＬＮ）細胞を採取し、前述した変更したクリックの培養基中でポリペプチドＰ７１の存在下でインビトロで（２，５Ｘ１０６細胞／ｍ１）培養された。

表２に述べたように、Ｒ７１は溶液１ｍｊ！当り０．０３〜１００μｇのＲ７１の投与範囲で培養において用いられた。　ＨＢＳＡｇ特異性は、ＣＦＡプライムされたＰＬＮ　Ｔ細胞における抗原誘発増殖のないことにより例証された。増殖は、後に詳述するようにＤＮＡ中へのトリチウム化チミジン（’ＨＴｄＲ）の導入により測定された。

ポリペプチドＰ７１は、ノンレスポンダ−３Ｊ　Ｌ　ＨＢｓＡｇプライムされたＴ細胞における測定しうる効果を持たなかったことに留意されたい。しかし表２に示すデータは、Ｒ７１が天然ＨＢｓＡｇ分子のカルボキシ末端領域におけるＴ細胞決定基として働きうろことを示す。このことは、研究したレスボンダー系統の各ｋにおけるＴ細胞増殖を誘発するＲ２５．−２（残基１２３−２６６）の能力と一致する。

Ｃ、マウスＴ細胞認識部位におけるＨ−２制限の役割の決定Ｂ１０．Ａは、ミリヒら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５９．４１（１９８４）記載のように（引用することによりこれをここに組込む）、−次免疫化後に抗ＨＢｓＡｇｄ！Ｌサブタイプ特異的応答のみを行う近親交配マウス系統である。五匹の８１０．Ａマウスの群は、ＨＢｓＡｇ／ａｄ又はＨＢｓＡｇ／ａＪＬでインビボでプライムされた。第４図参照、免疫化手順、培養基条件及び調製、インビトロ抗原の濃度、及びＴ細胞増殖テス　ト　は、第８部で上述したのと同じである。

ハイレスボンダー〇Ｈ，Ｏ系統は、Ｒ２５−１、Ｒ６及びＲ５をＴ細胞レベルで優先的に認識し、−次免疫化後に高力価抗ＨＢｓ／土及び抗ＨＢｓ／ｄ又はＬを作るので、−次免疫化後にサブタイプ特異的抗ＨＢｓ／ｄ又はＬのみを作る中程度レスポンダ−系統においてこれら抗原に対するＴ細胞応答を調べるのは興味があった。

Ｂ１０．Ａ系統は、そのような系統を代表する。

ＨＢｓＡｇ／ａｄでプライムされたＢ１０．Ａ　ＰＬＮ　Ｔ細胞は、天然）ＩＢｓＡｇ／ａｄに応答したが、しかし天然ＨＢｓＡｇ／鮫には全く応答しなかった（第３ａ図）、Ｒ２５は、Ｂ１０．＾　ＨＢｓＡｇ／ａｄプライムされたＰＬＮ　Ｔ細胞に対して刺激性であったが、トリブチイックフラグメントＰ２５−１及びＲ２５−２に対する応答は、Ｃ３Ｈ，［１系統におけるとは対照的に、Ｒ２５ −１よりもＲ２５−２に対する優先的応答を示した。対応して、ポリペプチドＰ７３及びＲ７２はかなりの増殖を示し、一方、ポリペプチドＰ６、Ｒ５及びＰ５ａば、天然ｔ（ＢｓＡｇ／ａｄ又はＨＢｓＡｇ／ａ２．でプライムされたＢ１０．Ａ　ＰＬＮＴ細胞に対してほとんど非刺激性であった。

ＨＢｓＡｇ／■でプライムされたＢ１０．Ａマウスは、ｌ（ＢｓＡｇ／Ｈプライムされたマウスにおける最小のＴ細胞増殖応答しか示さなかった。

これらの結果は、Ｂ１０．Ａ　ＨＢｓＡｇプライムＴ細胞が、Ｃ３１＋、Ｑ　？ウス系統の場合と同様に、群特異的領域よりもポリペプチドのサブタイプ特異的領域（Ｒ２５−２及びＲ７２）を優先的に認識することを示す、互特異的増殖応答を刺激する及び抗天然）ＩＢｓ／ｄを誘発する及び結合するＲ７２の能力は、領域１１０−１３７が８１０、ＡマウスにおけるＴ細胞及びＢ細胞の両者により認識されることを明らかに示す。

上述の知見のペプチド免疫原性及びインビボ抗ＨＢｓ抗体産生への妥当性を見るために、Ｃ，１１，Ｑ及びＢ１０．ＡマウスをＲ７２で免疫化し、工決定基の類憤性、及び血清抗ペプチド及び抗ＨＢｓ力価をとりあえず測定した。

表３に示すように、天然ＨＢｓＡｇ／ａｄによる免疫化後に、Ｃ，Ｈ，Ｑ系統はサブタイプ及び群特異的抗ＨＢｓを作った。　Ｂ１０．Ａ系統は、抗ｆｌＢｓ／ｄのみを作り、かつＣ，）１．Ｑ系統よりも低い程度であった。

しかし、Ｒ７２での一次免疫化後に、Ｒ１０，Ａ系統はＣ３１’１．Ｑ系統に比べて３２倍大きい抗Ｐ７２応答及び２０倍高い抗ＨＢｓ／ｄ応答を作った。

表３ＣｓＨ，Ｑ　ＨＢｓＡｇ／ａｄ　＜１　’　）　−−１：２，５６０　１：３２０Ｐ７２（１°）０　０　０Ｐ７２（２”　）１：６４０　１：８　０Ｐ７２（３”）　１：６４０　１：８　０Ｂ１０．Ａ　ＨＢｓＡｇ／ａｄ　（１”）　−−１：３２０　０Ｐ７２（１＠）　１：１６０　０　０Ｐ７２（２”）　１：２．５６０　１：２０　０Ｐ７２（３’）、１：２０，４８０　１：１６０　０】、六匹のマウスの群が、ＣＦＡ中の天然ＨＢｓＡｇ　／赳の４．０μｇ又はペプチドＰ７２の１００μｇで腹膜内的に免疫化された。

ペプチド投与マウスは、同じ二次（２”）及び三次（３”）免疫化を各々２週間及び４週間の間隔で与えられた。

２、　プールされた血清抗体力価は、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定され、免疫化前血清のカウントの二倍を与えるための最高血清希釈として表現される。

担体蛋白質に接合されたＲ７２で免疫化されたＣ３Ｈ，Ｑマウスが激しい抗Ｐ７２及び抗ＲＢｓ／ｄ応答を作ったことに留意しなけれを誘発することをＲ７２ができないことと一敗する。これらの結果は、Ｃ，Ｉｌ、Ｑ系統のハイレスボンダー状態がＰ７２により示されるようなサブタイプ特異的丈決定基のＴ細胞認識を通して達成されないことを示す。対照的に、ＨＢｓＡｇ／ａｄ免疫化後にｐ７２ｉ＝発Ｔ細胞増殖を示すＢ１０．Ａ株は、抗Ｐ７２及び抗）ＩＢｓ／ｄ抗体のかなりの濃度の産生を伴いＰ７２免疫化に反応できた。従って・ＨＢｓＡｇの合成ペプチド近似物の免疫原性は、Ｔ細胞及びＢ細胞決定基両者のための要件に依存する：、そしてＴ細胞決定基の認識は、応答するマウス系統のＨ−２ゲツタイブにより指令される。

Ｄ、マウスにおいてＨＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞増殖を誘発し、ヒトワクチン接受ＨＢｓＡｇプライムされたＴ細胞により認識される合成ペプチドの決定ＤＭ及びＰＷと名付けられた、二人のヒトＨＢｓＡｇ／ａｄワクチン接受者からの末梢血液リンパ細胞、及びＣＬと名付けられた免疫化されていない提供者からのものを、天然ＨＢｓＡｇ／ａｄ、天然ＨＢｓＡｇ／ａｄ及び一連の）Ｉ［ｌｓＡｇの合成ペプチド近似物に対するＴ細胞応答性について比較した。

表４から判るように、−人のＨＢｓＡｇワクチン接受者からの末梢血液リンパ細胞（ＤＭ）は、両サブタイプの天然ＨＢｓＡｇに対し及びポリペプチドＰ７２及びＰ５に対して応答した。しがし天然ＨＢｓＡｇ／ａｄ及びポリペプチドＰ７２により誘発された応答は、ＨＢｓＡｇ／！！ｉ及びポリペプチドＰ５により誘発された応答よりも、刺激指数及び投与応答の点でかなり大きがった。

対照的に、ＰＷからのＰＢＬは、天然ＨＢｓＡｇサブタイプの両者に対して等しく十分に応答し、対応してポリペプチドＰＬ（残基４Ｂ−８１）及びＰ５は増殖応答を誘発した。一方、ポリペプチド７２は誘発しなかった。テストされた他の合成ペプチドは刺激性でな（、抗原のどれも非免疫化対照（ＣＬ）から得たＰＢＬを刺激しなかった。

マウスモデルの知見と同様に、Ｔ細胞特異性の少くとも二つのパターンが、ヒト応答において観察された。一つのパターンは、明瞭な決定基のＴ細胞認識の特性を示し、抗ＨＢｓ抗体の産生を誘発せず又はこれに結合しない。別のパターンは、Ｂ細胞決定基と重なりうるサブタイプ特異的領域のＴ細胞による認識を含む。

■、材料及び方法Ａ材料Ｃ，Ｈ，Ｑ及びＢ１０．Ａ近親交配マウス系統及びニューシーラントホワイトラビットは・スクリップスクリニック（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ）研究所・ラ　ジョラ、カリフォールニア、から得られた。Ｂ１’Ｏ，Ｔ（６Ｒ）系統は、ツー　マクデビット（Ｈｕｇｈ　ＭｃＤｅｖｉｔｔ　）博士、スタッフォード大学、パロアルト、カリフォールニア、により提供された。研究開始時に６〜１２週齢のメスマウスが総ての研究で用いられた。

ＨＢｓＡｇ／ａｄ及び８ＢｓＡｇ／、Ｈのプールされた調製物は、ロバートルーイ　（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｌｏｕｉｅ）博士、カッターラボラトリーズ、バークレイ、カリフォルニア、により提供された。これら調製物は、超遠心分離、硫酸アンモニウム沈降、ペプシン分解及びゲルクロマトグラフィを含む標準法の組合せによりヒト血漿よりカッターラボラトリーズにより精製された。　）ＩＢｓＡｇ　ｉ）１製物は、オフテルロニー分析及び免疫電気泳動ウィルスヤギ抗ヒト血清〔ミリヒら、Ｊ。

ｆｍｕｎｏｌ　、、１２９．３２０　（１９８２）　、引用することによりここに組込まれる〕によりテストされると、ヒト血清夾雑物を含まない。

天然ＨＢｓＡｇ／ａｄｗは、ペダーリンら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ＋、、２５６．６９７５　（１９８１）により先に記載された方法により単一の慢性的保有提供者の血漿から精製された。構造ポリペプチド（Ｐ２５）及びトリブチイックフラグメントＰ２５−１　（残基１−１２２）及びＰ２５−２　（残基１２３−２２６）は、やはりペダーリンら（前出）記載のように準備的ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりこの同じ）ＩＢｓＡｇ／ａｄｗ陽性提供者から調製された。第１図に示した合成ペプチドは、ここで述べた固相法により合成された。

ポリペプチド及びトリブチイックフラグメントは、凍結真空乾燥され、前述したように培養基に再懸濁され、ガンマ照射（５０００ラド）により殺菌された。

Ｂ、免疫化抗ポリペプチド抗体が、ラビットで作られた。ポリペプチドは、接合剤としてｍ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いてポリペプチドの存在する又は付加されたシスティンを介してキイホールリンベントヘモシアニン（ＫＬＨ）に接合された〔第Ｖｌ　（Ｃ１部参照〕。ラビットは、下記のスケジュールに従いポリペプチド−ＫＬＨ接合体により免疫化された：（］）第０日に皮下的に投与される、完全なフロイントのアジュバント（ＣＦ　Ａ）中のポリペプチドの２００μｇ　ｉ　ｆ２１第１４日の不完全なフロイントのアジュバント（ＴＦＡ）中のポリペプチドの２００ａｇ：及びｆ３）第２１日及び第９１日に腹膜内投与される、４ｍｇ明ぽんと共にポリペプチドの２００μｇ、動物は、最初の注射の１５週後に採血された。ポリペプチド１．７２及び７３は、ＫＬＨなしで注射された。ポリペプチドの上記の量は、担体重量を含まない。

マウスにおける抗体産生をインビボで研究するために、マウス群はＣＦＡ中の４．　Ｏ＃　ｇの天然ＨＢｓＡｇ／ａｄ又は１００／ｊｇのＰ７２で腹膜的注射により免疫化された。ペプチド接受マウスは、２及び４適間隔で同じ第二及び第三の免疫化を受けた。リンパ節増殖評価のためインビボプライム化を、８０μｌの体積のＣＦＡ中の合計１６．０μｇのＨＢｓＡｇを接受マウスの二本の後足裏に注射して行った。

Ｃ８抗ＨＢｓの測定合成ポリペプチド又は天然ＨＢｓＡｇでの免疫化により誘発された抗ＨＢｓ抗体、又はポリペプチド免疫化により誘発された抗ポリペプチド抗体は、二つの方法により測定された。マウス血清は、固相ＨＢｓＡｇ　（ａｄ又は鮫サブタイプ）又は合成ペプチド、ヤギ抗マウスＩｇＧを用いる間接免疫グロブリンクラス特異的ラジオイムノアッセイ　（ＲＩＡ）における抗ＨＢｓ及び抗ポリペプチド反応性について評価され、そしてミニヒら、Ｊ、　Ｉ＃１ｌｌｌＬＩＦＩＯ］、　、１２９．３２０（１９８２）記載のように１２″″Ｉラベルされたブタ抗ヤギＩｇにより現像された。

抗ＨＢｓ活性についてラビット血清を分析するために、赤血球凝集（ＨＡ）系が用いられた。ヒト０型Ｒｈマイナス赤血細胞は、ピアス（Ｖｙａｓ）ら、サイエンス、１７０，３３２　（１９７０）　（引用することにより組込れる）記載のように塩化第ニクロム法によりＨＢｓＡｇ　（ａｄ又は斂サブタイプ）でコーティングされた。コーティングされた細胞は、微小力価■底プレートにおいて０．２５ｍｊ＋の順次希釈されたテスト血清に加えられた。総ての抗ＨＢｓ評価は、用いられた精製手順によりＨＢｓＡｇ　調製物から除去されなかったかも知れない何らかのありうる抗体を夾雑ヒト血漿蛋白質へと中和するために、５〜ｌＯ％の正常ヒト血清中で実施された。

Ｄ、リンパ節増殖評価五匹の群は、ＣＦＡと１６μｇのＨＢｓＡｇ　（ａｄ又はＵサブタイプ）のエマルシヨンにより後足裏に免疫化された。１２日後にボブリテアルリンパ節（ＰＬＮ）細胞を採取し、種々の攻撃抗原により５Ｘ１０’細胞の濃度でインビトロで培養された。インビトロ抗原は、天然ＨＢｓＡｇ　（単一の提供者からの封（プールされた）、■（プールされた）又はａｄｓ　）　；ポリペプチドＰ２５　；　）リブティックフラグメントＰ２５−１及びＰ２５−２．及び本発明の合成ポリペプチド（Ｐ７３、Ｐ７２、Ｐ７１、Ｐ４９、Ｐ６、Ｐ５、Ｐ５ａ、Ｐ２、ＰＬ）を含んだ。

流れ出るポブリテアルリンパ節細胞は、各マウスから無菌的に取り出され、単一細胞懸濁物を与えるように薄くそがれた。細胞は、リン酸塩緩衝した食塩水（ｐｌ＋７．２）を含む平衡食塩溶液（ＢＳＳ）により二度洗われた。細胞は、ＢＳＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、２−メルカプトエタノール、必須及び非必須アミノ酸及びビタミンを含むクリックの培養基（クリックら、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　３．２６４　（１９７２）参照〕に再懸濁した。但し、クリックの培養基は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）及び１０μｇ　／　ｍ　ｌのゲンタミンの添加、及び胎児ウシ血清の代りに０．５％アイソジェニック正常マウス血清の置換により変更された。

抗原は、投与範囲に亘ってテストされた。しかし、第３及び４図に示す増殖応答は、下記のインビトロ投与量に対応する：天然１００μｇ　／　ｍβ。

０、１　ｍ　Ａの培養基中の生育しろるリンパ節細胞（４Ｘ１０’）が、（ａｌ　０．１　ｍ　ｊ！の射又は肛サブタイプのＨＢｓＡｇ　（２，０〜０．６μｇ／ｍＪ）、（ｂｌ陰性対照としての培養基又はオバルミン（２００μｇ／ｍ１）、又はｔｅｌ陽性対照としての精製した蛋白質誘導体（ＰＰＤ−５０μｇ／ｍｌ１）と共に、平底微小力価くぼみ（Ｆａｌｃｏｎ　３０７２、ファルコンプラスチックス社）に置いた。

培養物は、空気中に５％の二酸化炭素を含む加湿雰囲気中で３７℃で５日間インキュベートされた。

第４日に各培養物は収穫の１６〜１８時間前に、マイクロキューリ−ゴＨチミジン（’ＨＴ　ｄ　Ｒ）（６，７Ｃｉ　／ミリモル、ニューイングランドニュクリアー、ボストン、マサセフチュース）をパルス状に与えられた。刺激指数（Ｓｔ）としての比増殖は、テスト抗原のカウント７分（ｃｐｌｌ）を培養基対照のｃｐｓで割ったものに等しい、免疫化後１３日までに収穫された流出するＰＬＮ細胞のＨＢｓＡｇ特異的増殖応答は増殖するＴ細胞によることが従来示されていた〔ミリヒら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１３０．１４０１（１９８３））。

従って、分画されていないＰＬＮ細胞が、ここで報告する実験において用いられた。

■、ペプチド合成及び選択Ａ、ポリペプチド合成本発明のポリペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｔｅｌｄ　）ら（１９６３）　、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、８５　：　２１４９　；及びホウテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ　）ら（１９８０）　、Ｔｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔ、　Ｒｅｓ、。

１６：３１１−３２０、記載の固相法により化学的に合成された。

ここで用いられる比較的短いポリペプチドは、ＨＢｘＡｇの抗原決定基にほぼ対応する。

第１図は、ＫＢｘＡｇの２２６アミノ酸残基配列を示す。ここで述べる好ましい合成ポリペプチドのアミノ酸残基配列がまた、第１図及び第２図に示される。ある例では、システィンが、下記のように蛋白質担体への接合を助けるために、ポリペプチドのいくつかのアミノ末端又はカルボキシ末端に加えられた。総てのポリペプチドの組成は、アミノ酸分析により確認された。

一般に、免疫原又は合成ポリペプチドは、ＨＢｘＡｇの抗原決定基ドメインのアミノ酸残基に対応する多数のアミノ酸を用意すること、及びこれらアミノ酸を、該抗原決定基のペプチド配列に対応するペプチド配列をもつアミノ酸残基配列を持つポリペプチドへと合成することの段階により作られる。作られた合成ポリペプチドは、通常これを担体に結合して接合体を作り、そして有効量の接合体を生理学的に許容される希釈剤に分散することによりワクチンを作るために用いることができる。

ポリペプチドは好ましくは、システィン樹脂を用いて上述の固相法に従って合成される。メリフィールドら（前出）。

個々のアミノ酸の鎖鎖は、下記のように保護される：Ａｒｇ−）シル；　５ｅｒ −１Ｔｈｒ　−１Ｇｌｕ−及びＡｓｐ−０−ベンジル：　Ｔｙｒ　−０−ブロモヘンシロキシカルバミル；Ｔｒｐ−Ｎ−ホルミル。

Ｔｒｐ残基上のＮ−ホルミル基は、樹脂支持物からのポリペプチドの解離後に、１．０■／　ｍ　１．のポリペプチド濃度で１．０Ｍ重炭酸アンモニウムによる室温１６時間の処理により除去される。ヤマシロら（１９７３）　、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、３８　：　２５９４−２５９７゜各段階でのカップリングの効率は、ニンヒドリン又はピクリン酸によりモニターされ、好ましくは総ての場合に９９％より大きい。

ギシン（Ｇ１５ｉｎ　）（１９７２）　、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　Ａｃｔａ、、　５８　：　２４８−２４９；及びカイザー（Ｋａｉｓｅｒ　）（１９８０）、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、。

３４　：　５９５−５９８゜本明細書を通して、「免疫学的にほぼ対応する」という云葉は種々の文法的形でここで及び請求の範囲においてポリペプチド配列に関連して用いられるが、これは当該ポリペプチド配列が、このポリペプチドに結合しかつ（ａｌポリペプチド４９．４９ａ、７２及び７２ａに関して天然ＨＢｓＡｇの抗原決定基に結合する又は（′ｂ）ポリペプチドｌ、５．５ａ、６及び７１に関してＴ細胞増殖を誘発するところの抗体の産生を誘発することを意味する。すなわち本発明のペプチドは、ＨＢｓＡｇ分子の対応する部分が行うように免疫学的に機能し、同時にそれ自身に対する抗体の産生を誘発できる。

本明細書及び請求の範囲において「はぼ対応する」という云葉が種々の文法形でポリペプチド配列に関連して、記述されるポリペプチド配列上（アミン及びカルボキシ末端の一方又は両方における三つまでのアミノ酸残基）及びポリペプチド配列に沿う特定のアミノ酸残基における保守的置換のみの含有を意味して用いられる。

上述で用いられたような「保守的置換」という言葉は、一つのアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基により置き代えられていることを意味するために用いられる。保守的置換の例としては、１１ｅ　、　Ｖａｌ　、　Ｌｅｕ又はＭｅｔのような疎水性残基同志の置換、又はＡｒｇとＬｙｓ　、　ＧｌｕとＡｓｐ又はＧｌｎと＾ｓＷ１等々のような極性基間の置換があげられる。

いくつかの例では、一つのイオン性残基を反対に荷電されたイオン残基により置換すること、たとえばＡｓｐのＬｙｓによる置換が、これらイオン性基が単に溶解性補助を与えるだけであると考えられて保守的と呼ばれてきた。しかし一般に、本明細書で述べる置換が全蛋白質に比べて比較的短い合成ポリペプチド抗原上でのことであるので、イオン性残基を反対電荷の別のイオン性残基で置換することは、非イオン性残基とイオン性残基の間の置換、及び嵩ぼった残基たとえばＰｈｅ、　Ｔｙｒ又はＴｒｐと嵩ぼらない残基Ｇ１ｙ、Ｔｌｅ及びＶａｌ　の間の置換と同様に「根本的置換」であると考えられる。

「非イオン性」及び「イオン性」残基という言葉は、生理学的ｐＨ値で、各々、電荷を通常持たない又は電荷を通常持つアミノ酸残基を指す通常の意味で用いられる。非イオン性残基の例としては、Ｔｈｒ及びＧｉｎが挙げられ、イオン性残基の例としてはＡｒｇ及びＡｓｐが挙げられる。

「抗原」という言葉は歴史的に、抗体により結合されるものを指すため、及び抗体の生産を誘発するものを指すために用いられてきた。より最近の用法は、抗原の意味を抗体により結合されるものに限定し、一方、「免疫原」という言葉が抗体生産を誘発するものに対して用いられる。いくつかの例では、抗原と免疫原は同じものであり、たとえば合成ポリペプチドが、このポリペプチドに結合する抗体の生産を誘発するために用いられる場合である。

しかし、同じポリペプチド（Ｐｄ２）がまた全蛋白質たとえばＨＢ　ｘ　Ａ　Ｈに結合する抗体をも誘発し、この場合にポリペプチドは免疫原かつ抗原であり、一方、ＨＢｘＡｇは抗原である。本明細書で述べるものが免疫原的かつ抗原的である場合、それは一般には抗原と云われる。

Ｂ、ポリマーの調製本発明のポリマーは、多数のポリペプチド繰返し単位を含む抗原性ポリマー（合成マルチマー）を作るために互に連結されることができる。そのようなポリマーは、免疫学的反応の増加の利点を持ち、種々のポリペプチドがポリマーを作るために用いられる場合、ＨＢｓＡｇのいくつかの抗原決定基と免疫反応する抗体を誘発する追加的能力を持つ。

ポリマー（合成マルチマー）は、前述したようにポリペプチドを合成すること及びアミノ末端及びカルボキシ末端の両者のシスティン残基を加えて、ｄｉｃｙｓ末端ポリペプチドを形成することによって作られうる。その後、典型的実験室調製では、１０■のｄｉＣｙｓポリペプチド（非酸化形のシスティン残基を含む）は、０．１ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液２５０ｍＪに溶解される。

溶解されたｄｉＣｙｓ末端ポリペプチドは次に、得た溶液をゆっくりと約１８時間つまりエルマンテスト〔エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）、Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＋　８２．７０　（１９５９）参照）により検出しうる遊離メルカプタンがなくなるまで攪拌することにより、空気酸化される。

このように作られたポリマー（合成マルチマー）は、操返し単位として本発明のポリペプチドの多数を含む。これらポリペプチド繰返し単位は、酸化されたシスティン残基により互に結合されている。

Ｃ９蛋白質担体へのポリペプチドの結合合成ポリペプチドは下記の周知の方法を用いてキイボールリンベットヘモシアニ７（ＫＬＨ）又は破傷風トキソイド（ＴＴ）に接合された。初めの方法では、担体はｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化され、次にポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に加えられたシスティン残基を介して、リウ（Ｌｉｕ　）ら、Ｒｉｏｃｈｅ＋＊、、８０．６９０（１９７９）記載のようにポリペプチドに結合された。第二の方法では、ポリペプチドでは、周知のように０．０４％グルタルアルデヒド溶液を用いて、遊離アミノ基を介して破傷風トキソイド担体に結合されうる。たとえばクリブスティン（Ｋ１１ｐｓｔｅｉｎ　）　ら、（１９８３）　、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓｃ、、１４７：３１８参照。

前述のように、合成ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端に加えられたシスティン残基は、ジスルフィド結合及びミハエル付加反応生成物を介して接合体を形成するために特に有用であることが見い出された。しかし、接合体を作るために従来周知の他ノ方法モまた用いうる。追加的結合手順の例は、ジアルデヒドたとえばグルタルアルデヒド（上述）などの使用、担体へのアミド結合を形成するための水溶性カルボジイミドたとえば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用を包含する。

有用な担体は当該分野で周知であり、一般に蛋白質そのものである。そのような担体の例は、キイホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、アルブミンたとえばウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミン（各々ＢＳＡ又はＨ５Ａ）、赤血細胞たとえばヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）　、破傷風トキソイド、コレラトキソイドならびにポリアミノ酸たとえばポリ　（Ｄ−リシン：Ｄ−グルタミン酸）などである。

また周知のように、合成ポリペプチドをその担体に中間の結合基により結合することがしばしば有利である。上述のように、グルタルアルデヒドは、そのような結合基の一つである。しかし、システィンが用いられるとき、中間結合基は好ましくは、やはり上述したｍ−マ゛レイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）である。ＭＢＳは典型的にはまず、エステル−アミド交換反応により担体に付加される。その後に、上述のミハエル反応が続き、又はＭＢＳ付加の次に、ブロックされたメルカプト基たとえばチオール酢酸（ＣＨｉＣＯ３）ｌ　）のマレイミドニ重結合を横切る付加が行われうる。アシルブロッキング基解離の後に、ブロックを解かれた結合基メルカプタンと合成ポリペプチドの加えられたシスティン残基のメルカプタンの間にジスルフィド結合が形成される。

担体の選択は、抗原の決定基部分によりも、抗原の意図される最終用途に依存し、本発明に特に含まれない判断基準に基づく。

たとえば、もしワクチンが動物で用いられるのであれば、特定の動物で不都合な反応を起さない担体が選ばれるべきである。もしワクチンがヒトで用いられるなら、担体及び／又は得られる抗原の免疫化学的又は他の副反応のないこと、安全性及び効率（つまりヒトでの使用を意図されるすべてのワクチンに妥当する同じ配慮）に最大の配慮が払われる。

■、免疫化手順ここで用いられる接種物つまりワクチンは、酸化されたシスティン残基を介して互に結合された個々のポリペプチドのポリマーとして、又は担体に結合されたポリペプチドの接合体として、ポリペプチド自体の有効量を含む。−接種当りのポリペプチドの有効量は、なかんずく接種される動物種、動物体重及び選ばれた接種部分に周知のように依存する。ワクチンは典型的には、乾燥した固体のポリペプチド又はポリペプチドポリマーから、ポリペプチド又はポリペプチドポリマーを水、食塩水又はアジュバントに懸濁することにより、又はポリペプチドを担体に接合し、そして担体に結合したポリペプチド（接合体）を同様の生理学的に許容される希釈剤たとえばアジュバント（上述のような）に懸濁することにより作られる。

これら接種物は典型的には、−接種当り約２０μｇ〜約５００■の濃度のポリペプチドを含む。述べたポリペプチド量は、担体が用いられる場合、担体重量を除くポリペプチドの重量を指す。

ワクチンはまた、生理学的に許容される（受容できる）希釈剤たとえば水、リン酸塩緩衝される食塩水、又は食塩水を含み、更に典型的にはアジュバントを含む。完全フロイントのアジュバン）　（ＣＦＡ）　、不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）及び明ばんのようなアジュバントは、当該分野で周知の物質であり、いくつかの供給源から市販入手できる。

ワクチン貯蔵溶液は、ＣＦＡＳＴＦＡ又は明ばんから下記のように作られる一一接種当り望む量のポリペプチドを与えるのに十分な量の合成ポリペプチド接合体又はポリマー状ポリペプチドが７．２のｐＨ値でリン酸塩緩衝された食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に溶解される。次に等量のＣＦＡ、ＩＦＡ又は明ばんをポリペプチド溶液と混合して、水ニオイル比が約１：１である、ポリペプチド、水及びアジュバントを含むワクチンを得る。混合物を次にホモゲナイズして、ワクチン貯蔵溶液を得る。

前述のようにラビットは、完全フロイントのアジュバント（ＣＦ　Ａ）　、不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）又は明ばんに乳化されたポリペプチド接合体の２００〜４００■を含むワクチン（各個において５■／　ｍ　ｌ　）を、各々、第０．１４及び２１日に皮下及び腹膜内に注射された。各接種は、ワクチンの四回の注射より成った。マウスは、−往射当り上述の投与量の約１０分の１を用いて同じ方法で免疫化された。

動物は、最後の注射の後、７及び１４日で採血された。ある場合では動物は、明ばん中の促進注射を受け、必要ならその後採血された。対照免疫前血清は、各動物から最初の免疫化の直前に採血して得られた。

ワクチン貯蔵溶液はまた、キイホールリンベットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、Ｉ　ＦＡ　Ｃ不完全なフロイントのアジュバント）中のＫＬＨ，ＫＬＨ−明ばん吸収、ＫＬＨ−明ばん吸収−百日ぜき、エデスチン、チログロブリン、破傷風トキソイド、ＩＦＡ中の破傷風トキソイド、コレラトキソイド及びＩＦＡ中のコレラトキソイドを用いて作ることができる。

宿主動物に抗原の注射又は他の導入をすると、動物の免疫系は大量の抗体を作ることによって抗原に応答する。加工された抗原すなわち、合成ポリペプチドと抗体から形成された抗原の特異的抗抗原決定基は、興味の天然の抗原の決定基にほぼ対応するので、宿主は天然抗原に対して免疫になる。本発明がワクチンとして利用されるとき、これが望む結果である。

■　遅延型過敏症（皮）反応テスト）従来記述されている診断系及び評価法は、インビトロ評価法に基づく、評価法の特定の段階はインビボで実施できるが、実際の免疫応答はｍ織培養で測定される。しかし本発明はまた、Ｔ細胞応答のインビボ測定を含む診断系に適用できる。

そのような系の一例は、遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応又はより一般には皮フ反応テストとして知られているものである。

ＤＴＨ反応は、所定の抗原に以前さらされた（感作された）個体においてのみ起りうる。抗原に対する個体の最初の曝露は見うる変化を作らず、しかし個体の免疫状態は、その抗体に対する再度の曝露に対して過敏反応が起るように変えられる。すなわち、抗原（好ましくは、緩衝された食塩水中）を皮膚内又は皮膚下注射すると、注射部位に特徴的な皮膚病斑が生じる。この病斑は最初の抗原曝露後には生じない、第二の（又は攻ｌり抗原接種に対する反応は典型的には２４〜４８時間遅延されるので、この反応は遅延型過敏症と呼ばれる。

ヒトにおいて、感作性抗原に対する曝露は、病気（たとえばマイコバクテリウムツバキュロシスからの結核、サルモネラテイフィからの腸チフス、及びプルセラアボルタスからの流産）に責任ある微生物との接触により起り、そして感作は慢性的感染の結果として生じる。動物において、感作は、水、食塩水又はアジュバントに乳化された抗原の接種により達成されうる。

ヒト及び動物の両方において、過敏症は、生理的に許容しうる希釈剤たとえば食塩水溶液に溶解した抗原を皮膚に（皮膚内又は皮下に）注射することによってインビボでテストされる。ＤＴＨは通常、抗原により作られた抗体量の決定又は測定よりも敏感な診断評価である。たとえば蛋白質の僅かの量（２〜３百マイクログラＬ）がマウスのＤＴＨｉ作のために必要であり、一方、抗体産生を誘発するためには、はるかに多い投与量が必要である。

本発明のポリペプチド（とくにポリペプチド１．５．５ａ、６、及び７１）は、活性なＨＢｓＡｇ又はポリペプチド４９．４９ａ１７２及び７２ａでの免疫化（感作）後にヒト及びマウスＴ細胞の増殖を刺激するので、皮膚反応テストは攻撃抗原として本合成ポリペプチドの一以上を用いて行われた。

選択されたマウス系統は、完全フロイントのアジュバントのようなアジュバントに乳化された天然ＨＢｓＡｇで脇腹に皮肉注射により免疫化された。実験条件において、ＤＴＨ感作は、感作化抗原がアジュバント中で、好ましくは結核菌を含む完全タイプ中で投与された場合にのみ通常起る。

投与７日後に、マウスは、リン酸塩緩衝された食塩水（ＰＢＳ）の既知量中の（ａｌ天然ＨＢｓＡｇ又は山）−又は二基上の本合成ポリペプチドを含む抗原の所定量を用いて耳又は足裏で皮肉接種により攻撃される。対照マウスは、抗原を含まない同じ量のＰＢＳ用いて皮肉接種される。別の対照は、ＣＦＡのみで免疫化されたマウスを含む。

対照部位に比べての抗原注射部位における組織の肥大がＤＴＨ反応の証拠である。すなわち、耳及び足裏の肥大は、抗原での攻撃前及び攻撃後４．２４及び４８時間に測定される。

結果は、本発明の合成ポリペプチド（たとえばＰ７１）が、ＨＢｓＡＨに対する細胞性免疫の存在のためのインビボマウス診断系において有用であることを示す。

上記のポリペプチドの安全性及び有効性が動物研究で示された後に、ポリペプチドは、ＨＢｓＡｇワクチンを受ける人のためのヒト皮膚反応テストにおける攻撃抗原として用いろる。ポリペプチドは、上述のように合成され、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰｌ、Ｃ）法により精製され、殺菌され、そして発熱源テストされた。

ヒトＨＢｓＡｇワクチン接受者のＴ細胞増殖反応は、ポリペプチド特異性に対して全く可変でありうるので、ワクチン接受者及びワクチン投与されない対照として働く個体は一連のポリペプチドで攻撃される。ガイドラインとして動物研究からの結果を用いて、動力学及び最適抗原投与量がワクチン受領グループにおいて決定されうる。

ＨＢＶ急性及び慢性感粂された個体はまた、皮膚反応テストのための抗原として合成ポリペプチドを用いてＨＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞感作についても研究されうる。

各側において、攻撃抗原は、生理的に許容される溶液（約１ｍｆ）中の特定のポリペプチドを前側の手のひらの表面に皮肉注射することにより投与される。２５又は２７ゲージの針の使用は、通常、抗原の皮下投与よりも皮肉投与を保証する。皮下注射は、組織中での抗原の希釈をもたらし得、誤った陰性テストを作る可能性がある。次に注射部位が、攻撃後４．２４及び４８時に紅斑（皮膚発赤）及び硬化（腫れ）について観察される。

上述は、本発明を例示するためのものであって、制限するものではない。本発明の新規な概念の精神及び範囲から離れることなく、多数の変化及び改変がなされうる。ここで述べられる特定の組成及び使用に関する限定が意図されているのではなく、また暗示されているのではない。

浄書（内容に変更なしＸ（〕０）１＊ｒＰｒｏＴｈｒｓ＠ｒｃｙｓ！ＩｒｏＰｒａＴｈｒＣｙｓＰｒｏＧＬｙ’！ γｒ（ＩＩＬ）ｎ＊ＰｔｏＧＬｙＳ＠ｔＳ龜ｔＴｈｔτｈｒｓ＊ｒτｈｒＧＬｙｉ’ｔｏｃｙａ入τ９丁ｈｒｃｙｓ（１２５）　＋１３７）（１４０）　ｔｌｓｏ）　（１５４）Ｘ　１　ｅＰｒｏｗｌ　ｙｓ＠　ｒＴｈ　ｒＴ’ｈ　ｒＴｈ　ｒｓ＠　ｒＴｈ　ｒ（ｉｌｙＰｒｏＣｙ−公コｍｒＣｙｓ［１３０）　（１３））＋１２５１　、　（１３））（１０）ｌ　（１１０１（１２０）ＣｙｓＰｒｏＬ＊ｕＸ　ｌ　ａｌｌ　ｒｏＧｌｙｓ　＊　ｒＴｈ　ｒＴｈ　ｒＴｈ　ｒｓ　ｅ　ｒＴｈ　ｔＧｌｙＰｔ。

［１３０１（１ｍ〕）浄書（内容ｌこ変更なし）手続補正書く方式）％式％２、発明の名称　Ｔ細胞及びＢ細胞決定基の両者を含む合成り型肝炎ウィルスワクチン３、補正をする者事件との関係　出願人名　称　スクリップス　クリニック　アンド（氏名）　リサーチ　ファウンデーション４、代理人５、補正命令の日付　昭和６１年５月１３日国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ少くとも一つの合成ポリペプチドの有効量、（ｂ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ少くとも一つの合成ポリペプチドの有効量、及び（ｃ）生理的に許容される希釈剤を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
２．アミノ末端から（ａ）約位置３８〜５２及び（ｂ）約位置１１０〜１３７のＢ型肝炎ウィルス表面抗原のアミノ酸残基配列の一部に免疫学的にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの有効量及び生理的に許容される希釈剤を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
３．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式【配列があります】及び【配列があります】（ここでカッコ内の各アミノ酸残基は直前のアミノ酸残基の代替物である）により示されるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第２項に従うワクチン。
４．アミノ末端から（ａ）約位置４７〜５２及び（ｂ）約位置１１０〜１３７のＢ型肝炎ウィルス表面抗原のアミノ酸残基配列の一部に免疫学的にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの有効量及び生理的に許容される希釈剤を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
５．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式【配列があります】及び【配列があります】（ここでカッコ内の各アミノ酸残基は直前のアミノ酸残基の代替物である）により示されるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第４項に従うワクチン。
６．アミノ末端から約位置９５〜１３７のＢ型肝炎ウィルスによりコードされる天然の病原関連蛋白質のアミノ酸残基配列に免疫学的にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの有効量及び生理的に許容される希釈剤を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
７．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式【配列があります】（ここでカッコ内の各アミノ酸残基は直前のアミノ酸残基の代替物である）により表わされるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第６項に従うワクチン。
８．アミノ末端から（ａ）約位置１４０〜１５４及び（ｂ）約位置１１０〜１３７のＢ型肝炎ウィルス表面抗原のアミノ酸残基配列の一部に免疫学的にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの有効量及び生理的に許容される希釈剤を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
９．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式【配列があります】及び【配列があります】（ここでカッコ内の各アミノ酸残基は直前のアミノ酸残基の代替物である）により示されるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第８項に従うワクチン。
１０．アミノ末端から約位置１１０〜１５４のＢ型肝炎ウィルスによりコードされる天然の病原関連蛋白質のアミノ酸残基配列に免疫学的にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの有効量及び生理的に許容される希釈剤を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
１１．合成ポリペプチドが、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて式【配列があります】（ここでカッコ内の各アミノ酸残基は直前のアミノ酸残基の代替物である）により示されるアミノ酸残基配列を含む請求の範囲第１０項に従うワクチン。
１２．生理的に許容される希釈剤中の合成マルチマーの有効量を含むＢ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンであって、上記合成マルチマーは、（ａ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列の少くとも一つ、（ｂ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列の少くとも一つを含む多数のポリペプチド繰返し単位を含み（ここで少くとも二つのＣｙｓ残基が存在し、かつ上記合成マルチマーが、存在するＣｙｓ残基の少くとも二つから形成された少くとも一つの分子内シスチンジスルフィド結合を含むこと）、上記ワクチンは、宿主に導入されると宿主における抗体の産生及び胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該抗体は上記Ｂ型肝炎ウィルスと免疫反応し、そして該ワクチンはＢ型肝炎ウィルス感染から宿主を保護するものであるところのワクチン。
１３．合成マルチマーの分子内シスチンジスルフィド結合がポリペプチド内ジスルフィド結合である請求の範囲第１２項に従うワクチン。
１４．合成マルチマーのポリペプチド繰返し単位が、第一のポリペプチド繰返し単位のアミノ末端残基のアミノ基と第二のポリペプチド繰返し単位のカルボキシ末端残基のカルボキシル基との間に形成されたアミド結合により互に頭尾結合されている請求の範囲第１２項に従うワクチン。
１５．合成マルチマーが約２〜約３の上記ポリペプチド繰返し単位を含む請求の範囲第１４項に従うワクチン。
１６．合成マルチマーの分子内シスチンジスルフィド結合がポリペプチド間ジスルフィド結合である請求の範囲第１２項に従うワクチン。
１７．合成マルチマーのポリペプチド繰返単位が該ポリペプチドのＣｙｓ残基の間に形成されたポリペプチド間シスチンジスルフィド結合により互に結合されている請求の範囲第１６項に従うワクチン。
１８．Ｂ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンを作る方法において、（ａ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの少くとも一つ、及び左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドの少くとも一つを用意すること、及び（ｂ）上記合成ポリペプチドの有効量を生理的に許容される希釈剤に溶解又は分散することを含む方法。
１９．段階（ａ）の後でかつ段階（ｂ）の前に上記ポリペプチドを担体に結合して接合体を形成する段階を含む請求の範囲第１８項に従う方法。
２０．Ｂ型肝炎ウィルスによる感染に対するワクチンを作る方法において、（ａ）（ｉ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列の少くとも一つ、及び（ｉｉ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列の少くとも一つを含む多数のポリペプチド繰返し単位を持つ合成マルチマーを用意すること（ここで少くとも二つのＣｙｓ残基が存在し、合成マルチマーは存在するＣｙと残基の少くとも二つから形成された少くとも一つの分子内シスチンジスルフィド結合を含むこと）、及び（ｂ）上記合成マルチマーの有効量を生理的に許容される希釈剤に溶解又は分散することを含む方法。
２１．段階（ａ）の後でかつ段階（ｂ）の前に上記合成マルチマーを担体に結合して接合体を形成する段階を含む請求の範囲第２０項に従う方法。
２２．宿主におけるＢ型肝炎ウィルス抗体の存在を測定するための診断系において、左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ少くとも一つの合成ポリペプチドを含み、該合成ポリペプチドは、生理的に許容される希釈剤に含めて宿主に皮内投与されると宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発でき、該増殖は皮内投与部位における紅斑及び硬化により指示されるものであるところの診断系。
２３．Ｂ型肝炎ウィルスに対しすでに免疫化された宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発する方法において、（ａ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドを用意すること、及び（ｂ）上記合成ポリペプチドの有効量を生理的に許容される希釈剤に含めて宿主に投与することを含む方法。
２４．段階（ａ）の後でかつ段階（ｂ）の前に上記合成ポリペプチドを担体に結合して接合体を形成することの段階を含む請求の範囲第２３項に従う方法。
２５．宿主におけるＢ型肝炎ウィルス抗体の存在を測定する方法において、（ａ）左から右へかつアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて【配列があります】及び【配列があります】より成る群から選ばれたアミノ酸残基配列を持つ合成ポリペプチドを用意すること、及び（ｂ）生理的に許容される希釈剤に溶解又は分散した上記合成ポリペプチドの有効量を皮内投与して、宿主において胸腺由来細胞の増殖を誘発することを含み、上記増殖及び宿主におけるＢ型肝炎ウィルス抗体の存在は皮内投与部位における紅斑及び硬化により指示されるところの方法。