JP2002509157A

JP2002509157A - Ｂ型肝炎ウイルスのｘプロテインに由来するペプチド抗原を含むリポソーム

Info

Publication number: JP2002509157A
Application number: JP2000540149A
Authority: JP
Inventors: タエイェオンキム; キヤンリー; ジンソーチャン; スンヨーチョ; ユキェオンホワン; ミェオンジュンチョイ; ホンセオクチェオン
Original assignee: モガンバイオテクノロジーリサーチインスティチュート
Priority date: 1998-01-19
Filing date: 1998-01-19
Publication date: 2002-03-26
Also published as: CN1286696A; US6380359B1; AU5681598A; WO1999036434A1; DE69820486D1; EP1049711A1; EP1049711B1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスに対するヒトの免疫を調節する役割を演じる新規のペプチド抗原を含むリポソームに関する。より具体的には、本発明はＨＢＶＸプロテインに由来し、該ウイルスに対する細胞障害性Ｔ−リンパ球を誘導するか、又は該ウイルスに対し免疫耐性を誘導する抗原のエピトープに対応するペプチド群、及び該ペプチド群を含み前記ウイルスに特異的なＣＴＬを生成させる細胞性免疫を誘導するｐＨ感受性リポソームに関する。Ｘプロテインに由来するＸ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７のようなペプチド抗原はヒト体内に存在するＨＢＶ抗原を認知できるＣＴＬを活性化し、同時にそのＣＴＬにより認知され得るため、前記リポソームはＨＢＶ関係疾患の予防と治療に用いることを企図する治療剤の開発に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景技術分野本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対するヒトの免疫を調節する役割を有
する新規のペプチド抗原を含むリポソームに関する。より具体的には、本発明は
ＨＢＶのＸプロテインに由来し、該ウイルスに対する細胞障害性Ｔ−リンパ球（
ＣＴＬ）を誘導するか、又は該ウイルスに対し免疫耐性を誘導する抗原のエピト
ープに対応するペプチド群、及び当該ペプチド群を含み前記ウイルスに特異的な
ＣＴＬを生成させる細胞性免疫を誘導するｐＨ感受性リポソームに関する。

【０００２】従来技術の説明ＨＢＶが人体に感染すると、該ウイルスを取り除くために様々な生理的反応が起
きるが、これらの反応のうち最も重要な反応の一つは感染された細胞を破壊して
取り除くことであり、このような過程を通して最終的にウイルス感染から回復す
ることができる。このような感染細胞の破壊は細胞毒性を有する他の種類の細胞
により行われ、この細胞はＣＴＬと呼ばれる。ＣＴＬが細胞毒性を発揮するには
、まず最初に感染したウイルスのタンパクに由来するある種のペプチドを認知し
なければならない。一般に、ウイルスタンパクは感染細胞内で合成された後、細
胞内分解過程を通して８個ないし１５個のアミノ酸からなる短いペプチドに転換
される。このようにして生成されたペプチドの一部が細胞内の主要組織適合抗原
（ＭＨＣ）と結合した形で細胞表面に現れると、ＣＴＬがこれらを認知して感染
細胞を破壊する。一方、ＭＨＣはクラスＩとクラスIIに分類され、クラスＩのＭ
ＨＣの方がクラスIIのＭＨＣと比べるとＣＴＬの誘導において重要な役割を演じ
ることが知られている。しかしながら、ＣＴＬが認知するタンパク（ペプチド）
部位はウイルスタンパクの分解により生成されたペプチドの中で、特定のアミノ
酸配列を有するものに限定されることが報告されている（参照：Ｆｒｅｍｏｎｔ
，Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９１９−９２６（１９９２）；
Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：９２９−９
３４（１９９２））。

【０００３】従って、このような特定部位のアミノ酸配列の発見を通し、該アミノ酸配列に対
応するペプチドを化学的に合成及び生産することができるようになり、これらの
ペプチドを利用してヒト体内で肝炎ウイルスを特異的に認知するＣＴＬを人工的
に誘導するか、又は免疫抑制などの他の免疫反応を調節することにより、肝炎ウ
イルスにより誘発される疾患の効果的な予防や治療が可能になる。

【０００４】このような認識に基づいて、多くの研究者らが肝炎ウイルスタンパクの分解によ
り生成されるペプチドの中でＣＴＬにより認知されるペプチドのアミノ酸配列を
見出すために鋭意研究を重ねた結果、いくつかの特定のアミノ酸配列が見出され
ており、今後の発見も期待されている。また、肝炎関連疾患の予防や治療にこの
ようなペプチドを用いるには、なるべく多い種類のペプチドを同時に用いること
が必要であり、ペプチドの種類に応じてその効果が異なってくる。従って、この
ようなペプチドのアミノ酸配列の発見は非常に重要な意味を持つ。

【０００５】Ｂ型肝炎の予防及び治療に用いるペプチドでＣＴＬにより認知されることが報告
されているペプチドは主にＨＢＶのＳ（表面抗原）タンパクとＣ（コア）タンパ
クに由来している。しかしながら、遺伝子導入マウスを用いた一連の研究の結果
、ＸプロテインがＨＢＶの関係する肝癌に直接関与していることが明確になった
にもかかわらず、ＨＢＶの抗原タンパクの一つであるＸプロテインに由来するペ
プチドはこれまでのところ報告されていない（参照：Ｈｏｙｈｎｅｅｔａｌ
．，ＥＭＢＯＪ．，９：１１３７−１１４５（１９９０）；Ｋｉｍｅｔａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：３１７−３２０（１９９１））。

【０００６】一方、リン脂質を水中に分散すると、極性の頭部基は水の方に配向し、疎水性の
尾部は疎水性相互作用により集合して「リポソーム」と呼ばれる二層構造の球形
の閉鎖小胞を形成する。このようなリポソームは生体膜のモデル研究だけでなく
、薬物送達システムにおける担体としても幅広く用いられてきた（参照：Ｌｅｅ
，Ｊ．Ｗ．ａｎｄＫｉｍ，Ｈ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．，２９７：３５４（１９９２）；Ｈａｈｎ，Ｋ．Ｈ．ａｎｄＫｉｍ，Ｈ．，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０：６３５（１９９１）；Ｙｕｎ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄ
Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０５：４０６（１９８９）；Ｋｉｍ
，Ｊ．ａｎｄＫｉｍ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：７８６７（１
９８６）：Ｋｉｍ，Ｊ．ａｎｄＫｉｍ，Ｈ．，ＫｏｒｅａｎＢｉｏｃｈｅｍ
．Ｊ．，１８：４０３（１９８５））。

【０００７】最近、リポソームが免疫学分野にも適用できることが報告され、そえによりワク
チンの担体又はアジュバントとしてのリポソームに関する研究が促進された（参
照：Ｒｏｏｉｊｅｎ，Ｎ．Ｖ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：１１７０（１９９３）
）。一般に、リポソームを静脈注射するとそれらは血液内に豊富に存在するマク
ロファージ（ＭＯ）により容易に捕獲され、ＭＯは抗原の免疫プロセシングとと
もにリポソーム抗原のプロセシングにおいても非常に重要な役割を果たす。

【０００８】さらに、最近ｐＨ感受性リポソームを用いてある種のタンパク又は、ペプチドに
特異的なＣＴＬ反応を誘導する方法が開発され（参照：Ｒｅａｄｄｙ，Ｒ．ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４１：１５７（１９９１）
；Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５
：１４３（１９９１）；Ｎａｉｒ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，
１７５：６０９（１９９２）；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４７：２８６０（１９９１）；Ｚｈｏｕ，Ｆ．ａｎｄＨｕ
ａｎｇ，Ｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１：１１３９（１９９３））ｐＨ感受性リポ
ソームはサブユニットワクチンを開発するためのタンパク又はペプチド抗原の担
体及びアジュバントシステムとして幅広く利用されている。これに関連して、本
発明者らは抗癌薬物の選択的な輸送を可能にするｐＨ感受性リポソームの製造方
法を報告している（参照：Ｃｈｏｉ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１１２：６９４（１９９２））。

【０００９】発明の要約本発明により、ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチドの中でＣＴＬにより特
異的に認知される一連のペプチド群が提供される。なお、ＨＢＶＸプロテイン
に由来するペプチド抗原を含むｐＨ感受性リポソームも提供される。本発明者ら
は、前記リポソームがＨＢＶのペプチド抗原に特異的なＣＴＬが生成されるよう
に細胞性免疫を誘導することにより、ＨＢＶ関係疾患の予防及び治療に用いるこ
とを企図する治療剤の開発に利用できることを見出した。

【００１０】従って、本発明の主な目的は、ＣＴＬにより認知されてウイルスに対し細胞毒性
を示すことができるＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド抗原を提供するこ
とである。本発明の別の目的は、前記ペプチド抗原を含み、細胞性免疫を誘導することがで
きるｐＨ感受性リポソームを提供することである。

【００１１】図面の簡単な説明本発明の上記の目的及び他の目的並びに特徴は、以下の添付図面及び説明により
明らかになるであろう。図１Ｔ２細胞の表面に発現されるＨＭＣクラスＩ分子の変化を蛍光強度で示す
グラフである。図２Ｔ２細胞に対するＣＴＬの細胞毒性を示すグラフである。図３（Ａ）は、ヒト肝細胞癌によるチャレンジを受けたヌードマウスにおける
腫瘍形成を示すグラフである。（Ｂ）は、ＨＢＶＸプロテインに由来するペプ
チド抗原により刺激されたＣＴＬ処理の後の、ヌードマウスにおける腫瘍根絶を
示すグラフである。

【００１２】発明の詳細な記述ＭＨＣクラスＩ分子と結合するペプチドは、特異的なアミノ酸配列を有するとい
う先の知見に基づき、ＨＶＢＸプロテインの全体アミノ酸配列よりＭＨＣクラ
スＩ分子と結合し得るペプチドの配列分析を行った。すなわち、ヒトＭＨＣクラ
スＩ分子の一つであるＨＬＡ−Ａ２に結合し得るペプチドはＮ−末端から２番目
に位置するアミノ酸及び、Ｃ−末端のアミノ酸がロイシン、バリン、又はイソロ
イシンであるため（参照：Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２５７：９２９−９３４，１９９２）ＨＢＶＸプロテインの全体アミノ
酸配列から、前記条件を満足させるアミノ酸配列をスクリーニングし、ＨＬＡ−
Ａ２に結合し得るペプチド、すなわちヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合することに
よりＣＴＬ反応を誘導することができるペプチド抗原を、ＨＢＶＸの抗原タン
パクの分解により生成されたペプチドの中から、分子の３次構造に基づいて選択
した（参照：下記表１）。このように決定されたアミノ酸配列に従って、ペプチ
ドを化学的に合成した。ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド、すなわちＸ
３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７のアミノ酸配列を下記表１に示した。

【００１３】

【表１】

【００１４】なお、本発明は前記９個のアミノ酸からなるペプチドだけでなく、前記ペプチド
のＮ又はＣ末端に１個ないし５個のアミノ酸を加えたペプチド及びその機能的等
価物も含む。本発明において、「機能的等価物」という用語は前記ペプチドのア
ミノ酸配列の中で、１個ないし２個が置換された全てのペプチドを意味するもの
として用いられる。例えば、置換はＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；
Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；及び、Ｐ
ｈｅ、Ｔｙｒのような組み合わせを含む。

【００１５】ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド抗原を含むｐＨ感受性リポソームを製
造するために、ホスファチジルエタノールアミン−β−オレイル−γ−パルミト
イル（ＰＯＰＥ）とコレステロールヘミサクシネート（ＣＨＯＨ）をモル比で６
：４ないし８：２、最も好ましくは７：３で混合し、又はＰＯＰＥ／ホスファチ
ジルエタノールアミン（ＰＥ）／ＣＨＯＨをモル比で３：３：４ないし４：４：
２、最も好ましくは３．５：３．５：３で混合し、最終的にリン脂質の薄膜を形
成した。次いで、このように製造されたリポソームをＨＢＶＸプロテインに由
来する上記ペプチド抗原を含む緩衝溶液に添加した。これに関して、ＨＢＶＸ
プロテインに由来するペプチド抗原を含有するリポソームは１種類以上のペプチ
ド抗原とリン脂質を１：５ないし１：２５のモル比、最も好ましくは１：２０の
モル比になるように混合して製造される。また、本発明により製造されたｐＨ感
受性リポソームはリン脂質として最高で１モル％のモノホスホリルリピッドＡを
追加して含んでもよい。

【００１６】本発明のリポソームはヒトにＣＴＬ反応を誘導するペプチド抗原を被包（ｅｎｃ
ａｐｓｕｌａｔｅ）しており、さらにペプチドの担体として用いられるｐＨ感受
性リポソームも被包されているペプチドの起源であるウイルスに特異的なＣＴＬ
反応を誘導することができる。従って、上記ペプチドを含むｐＨ感受性リポソー
ムがヒトの細胞性免疫を誘導し得ることが明らかに証明される。

【００１７】本発明のペプチドのアミノ酸配列を記載するにあたってＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ標準
法による一文字表記の略号を以下のように用いた：アミノ酸略号アラニンＡアルギニンＲアスパラギンＮアスパラギン酸ＤシステインＣグルタミンＱグルタミン酸ＥグリシンＧヒスチジンＨイソロイシンＩロイシンＬリジンＫメチオニンＭフェニルアラニンＦプロリンＰセリンＳスレオニンＴトリプトファンＷチロシンＹバリンＶ

【００１８】実施例以下の実施例を通して本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これ
らの実施例にその範囲を限定されるものではない。

【００１９】例１：Ｘプロテイン内のＭＨＣ分子と結合しうるペプチドの決定ヒトのＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ２と結合し得るペプチドはＮ末端か
ら２番目に位置するアミノ酸とＣ末端のアミノ酸がロイシン、バリン又は、イソ
ロイシンであることから（参照：Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２５７：９２９−９３４（１９９２））、このような条件を満足さ
せるアミノ酸配列をＨＢＶＸプロテインの全体アミノ酸配列より最初にスクリ
ーニングし、分子の３次構造を考慮してＨＬＡ−Ａ２分子が結合しうるペプチド
を最終的に選択した（参照：上記表１）。その後、このように決定されたアミノ
酸配列に基づいて、当業界で周知の方法によりペプチドの化学的な合成を行った
。

【００２０】例２：ペプチドの合成及びＭＨＣ分子との結合度の測定ＨＢＶのＸプロテインに由来する上記表１に示すペプチドを含む７種類の異なる
ペプチドを化学的に合成し、これらをリン酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」）に
溶解した。これらのペプチドがＣＴＬの誘導に関係するＭＨＣクラスＩ分子に結
合し得るか否かを調べるために、各ペプチドをＴ２細胞株に１００、６４、３２
、１６、８、４、２及び１μｇ／ｍｌの各濃度になるように加え、３７℃で４時
間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し未反応ペプチドを取り除き、該細
胞をヒトＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ２．１に対するＢＢ７．２抗体を
加えた後、４℃で１時間反応させた。該細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ここにフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合させた抗マウス免疫グロブリ
ン抗体を加え４℃で１時間反応させた。次いで、該細胞等の蛍光強度を蛍光分光
器（ＦＡＣＳｃａｎ，ＢＥＣＴＯＮＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）により測定し、その
結果を図１に示した。

【００２１】図１から分かるように、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７などの５種類のペプチ
ドがＴ２細胞の表面にあるＭＨＣクラスＩ分子とうまく結合することが見出され
た。本実験に用いたペプチドを下記表２に示す。

【００２２】

【表２】

【００２３】本実施例で用いたＴ２細胞株は細胞内のペプチドの輸送経路に異常があり、ＭＨ
ＣクラスＩ分子がペプチドと適正に結合できないため、分子構造に不安定化をも
たらし、その結果、正常生育温度である３７℃で培養した場合にＭＨＣ分子の発
現が低い。しかしながら、Ｔ２細胞をＭＨＣ分子と結合できるペプチドを含有す
る培養液で培養すると、該ペプチドがＴ２細胞表面のＭＨＣ分子と結合してＭＨ
Ｃ分子の安定性が高まり、その結果としてＭＨＣ分子の発現が増加する。この知
見に基づき、ＢＢ７．２抗体の細胞表面への結合度を測定することにより、Ｔ２
細胞表面のＭＨＣ分子への特定ペプチドの結合を分析することができる。

【００２４】例３：ＣＴＬによるペプチドの認知度の測定あるペプチドがＭＨＣ分子と結合するということによってＣＴＬによるペプチド
の認知を証明することはできない。そこで、実施例２においてＭＨＣ分子との結
合度を測定するために使用したペプチドがヒト体内でＨＢＶを認知しうるＣＴＬ
によって実際に認知されるかどうかを調べるため、さらに実験を行った。

【００２５】すなわち、一般献血者から抗ＨＢＶ抗体が陽性（ＥＬＩＳＡ値：１．０以上）の
血液を集め、遠心して血球細胞を採取した。この血球細胞から赤血球を取り除き
、残りの白血球に上記ペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度に加えた後、３７℃で５
％ＣＯ₂含量に維持されたＣＯ₂インキュベーターで培養した。培養開始から２
日後、１０単位のインターロイキン−２を培養液に添加してさらに３日間細胞を
培養した。その後、同じＭＨＣを有する血球細胞をマイトマイシンＣで不活性
化して刺激細胞として培養液に加えた。さらに上記ペプチドとインターロイキン
−２を培養液に添加し、細胞をさらに７日間培養した。その後、これらの血球細
胞が特定ペプチドを表面に有するＴ２細胞を認知し破壊するかどうかを測定し、
その結果を下記表３及び図２にそれぞれ示した。

【００２６】

【表３】

【００２７】培養された血球細胞によるＴ２細胞の破壊を以下のように測定した：Ｔ２細胞に
１００μｇ／ｍｌのペプチドを加え、３７℃で３時間反応させた。その後、該細
胞を充分洗浄し未反応ペプチドを取り除き、放射性ソジウムクロメート（Ｃｒ⁵¹ ）を加え３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で２時間反応させた。その後、ＲＰＭＩ培養液で充分洗浄し未反応のナトリウムクロメートを取り除き、ＰＢＳで洗
浄した血球細胞と一定の比率で混合し、３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で４時間反応させた。得られた培養液を回収してガンマ線の強度を測り、血球細胞の
Ｔ２細胞、すなわち標的細胞に対する細胞毒性を測定した。

【００２８】上記表３から分かるように、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７及びＰ５の場合は培
養した血球細胞により認知され、これらの中でＰ５は公知のペプチドとして（参
照：Ｎａｙｅｒｓｉｎａ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：
４６５９−４６７１（１９９３））、本実施例において採用した実験方法が適切
であることを証明する陽性コントロールの役割を果たしていることがわかった。

【００２９】例４：ペプチド抗原を含むｐＨ感受性リポソームの製造ＰＯＰＥ／ＣＨＯＨ（７：３モル比）からなるリン脂質又はＰＯＰＥ／ＰＥ／Ｃ
ＨＯＨ（３．５：３．５：３モル比）からなるリン脂質をガラスバイアルに入れ
て有機溶媒に溶解した。その後、窒素ガスを吹き込みバイアル中に脂質薄膜を形
成させた。次いで、被包（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）されたペプチドを含有す
る緩衝液（ｐＨ８．０）を脂質膜に添加し充分水和させた後、激しく攪拌して多
層膜小胞（ＭＬＶ）を製造し、これをソニケーターにかけることにより小型の単
層膜小胞（ＳＵＶ）を製造した。このようにして得られたＳＵＶを室温で２ない
し１２時間インキュベートした後、液体窒素で急激に冷凍し室温で徐々に解凍す
る過程を３ないし４回繰り返すことにより、ペプチドを含むリポソームを製造し
た。このようにして、ペプチドとリン脂質を１：２０のモル比で混合することに
より最終的にリポソームを製造した。これに関して、使用したペプチドはＨＢＶ
Ｘプロテインに由来し、ＭＨＣクラスＩ分子と結合してＣＴＬ反応を誘導する
ことができるペプチド抗原であった（参照：上記表１）。

【００３０】このようにして得られたリポソームの物理的安定性及び、ｐＨ感受性を以下のよ
うに調べ、従来のｐＨ感受性リポソームに比べ、エタノール処理による破壊が少
なく、リポソームの内容物の漏出程度が非常に低いことが示された：（１）物理的安定性の測定上記で製造されたリポソームの物理的安定性を、リポソーム溶液にエタノールを
添加してリポソームの混濁度の変化を計測することにより測定した。エタノール
処理により、リポソームが破壊されその結果混濁度が低下するため、４００ｎｍ
での吸光度の変化を計測してリポソームの安定性を測定した。その結果、本発明
のペプチドを含有するリポソームは、従来のｐＨ感受性リポソームよりも高い物
理的な安定性を有することが見出された。

【００３１】（２）ｐＨ感受性の測定上記ペプチドを含有するリポソーム内に１２．５ｍＭ８−アミノナフチレン−
１，３，６−トリスルホン酸二ナトリウム塩（ＡＮＴＳ）、４５ｍＭｐ−キシ
レンビス（ピリジニウム）ブロミド（ＤＰＸ）、６８ｍＭＮａＣｌ及び１０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ８．０）を被包し、被包されていないＡＮＴＳ及
びＤＰＸをセファデックスＧ−５０カラム（１×２０ｃｍ）を用いて除去してリ
ポソーム溶液のみを回収した。リポソーム内のリン脂質の濃度は、バスコブスキ
ー法により測定した（参照：Ｖａｓｋｏｖｓｋｙ，Ｖ．Ｅ．，Ｋｏｓｔｅｔｓｋ
ｙ，Ｅ．Ｙ．ａｎｄＶａｓｅｎｄｉｎ，Ｉ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
．，１１４：１２９（１９７５））。

【００３２】ｐＨ感受性の実験でカラムを通過するリポソーム溶液の蛍光強度を「０％漏出」
と定義し、トライトンＸ−１００で破壊されたリポソーム溶液の蛍光強度を「１
００％漏出」と定義した。各ｐＨ値（７．５、６．９、６．４、５．９、５．４
、４．９及び４．５）を有する緩衝溶液２ｍｌに濃縮したリポソーム（３０μＭ
）を加え３７℃で３０分間放置した。その後、蛍光を計測してｐＨ感受性を測定
した。この際、蛍光は分光蛍光計（ＦＰ−７７７，ＪＡＳＣＯ，Ｊａｐａｎ）を
用いて、励起波長３６０ｎｍ及び発光波長５４５ｎｍで計測した。

【００３３】その結果、本発明のペプチドを含有するリポソームは、コントロールとして用い
られた従来のｐＨ感受性リポソーム（〜８０％）に比べ、リポソーム内容物の漏
出が少ないこと（〜２０％）が明らかになった。

【００３４】例５：ペプチドを含有するｐＨ感受性リポソームによる細胞性免疫の誘導ペプチドの担体としてのｐＨ感受性リポソームがペプチドの由来するウイルスに
特異的なＣＴＬ反応を誘導し得るかどうか調べるため、合成ペプチドを被包する
ｐＨ感受性リポソームを製造し、一連の方法で細胞毒性試験を行った。ヒトＭＨ
ＣクラスＩ分子の一つであるＨＬＡ−Ａ２に結合し得るペプチドの細胞免疫性は
、人体を利用して調べるべきなので、マウスＨＭＣクラスＩ分子に結合し得るＨ
ＩＶ及び、ＨＣＶプロテインに由来するペプチド（参照：下記表２）を用いた間
接的な実験を行った。これに関して、ＰＯＰＥ／ＣＨＯＨ（７：３モル比）から
なるリン脂質組成物を用いて、前記ペプチドを含むｐＨ感受性リポソームを得た
。次に、前記リポソームでマウスを免疫化し、Ｔリンパ球をマウスから単離し、
Ｃｒ⁵¹でラベルした標的細胞を認知した後のＴリンパ球の細胞毒性を測定した。

【００３５】

【表４】

【００３６】ＨＩＶの場合、Ｂａｌｂ／ＣマウスをＲ１５Ｋ又はＴ２６Ｋペプチドを含むｐＨ
感受性リポソームで免疫化し、追加接種してから４週間後に脾臓を切り取り、ホ
モジナイザーを用いて２ｍｌのＲＰＭＩ細胞培養液中でホモジナイズした。こう
して得られたホモジネート２ｍｌを２ｍｌのフィコールに加え、１，５００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離した。フィコールと細胞培養液の間に位置するＴリンパ球
を分離し、１５ｍｌのＲＰＭＩ−１０細胞培養液に加え、１，０００ｒｐｍで遠
心して、ＲＰＭＩ−１０培養液で３回洗浄した。Ｔリンパ球を５×１０⁶／ｍｌの細胞濃度に希釈して２４穴プレートに入れ免疫化したペプチド抗原を２μＭの
最終濃度になるように加えた。次いで、この細胞を３日間３７℃で５％のＣＯ₂ を含むＣＯ₂インキュベーター中で培養し、エフェクター細胞として用いた。ＨＣＶの場合、５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをＤ８Ｌペプチド抗原を含むリポソ
ームで免疫化し、上記と同様な方法によりＴリンパ球を単離してエフェクター細
胞として用いた。一方、標的細胞としては、ＨＩＶの場合、Ｂａｌｂ／Ｃマウス
と同様なＭＨＣクラスＩを有するｐ８１５細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ６４）を用い
、ＨＣＶの場合は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同様なＭＨＣクラスＩを有するＲＭ
Ａ細胞（参照：Ｈｏｓｋｅｎ，Ｎ．Ａ．ａｎｄＢｅｖａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．，１７５：７１９（１９９２））又は、ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣＴＩ
Ｂ３９）を用いた。

【００３７】前記各標的細胞に、免疫化したペプチドを１００μＭ入れ３７℃で１６時間反応
させ、ＲＰＭＩ細胞培養液で２回洗浄した。その後、放射性ソジウムクロメート
（Ｃｒ⁵¹）を細胞に加え３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で２時間反応させた。反応後、ＲＰＭＩ細胞培養液で充分洗浄し未反応のソジウムクロメートを取り
除き、リン酸緩衝溶液で洗浄したエフェクター細胞と下記表５に示す種々の混合
比率で混合し、３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で４時間反応させた。得られた培養液を回収してガンマ線の強度を計測することにより、エフェクター細胞の
標的細胞に対する細胞毒性を測定した（参照：表５）。

【００３８】表５から分かるように、Ｒ１５Ｋ、Ｔ２６Ｋ及びＤ８Ｌペプチド抗原で免疫化さ
れたマウスの脾臓から単離したエフェクター細胞が標的細胞を認知して殺せるこ
とが明らかとなった。さらに、マウスをｐＨ感受性リポソームを用いてＣＴＬ反
応を誘導するペプチド抗原で免疫化した場合、ウイルスに特異的なＣＴＬを産生
し細胞性免疫が誘導できることが見出された。

【００３９】

【表５】

【００４０】ＨＩＶ及びＨＢＶタンパクに由来するペプチドを含むｐＨ感受性リポソームを用
いて行った細胞性免疫誘導についての間接的実験から次のような事実が明確に証
明された：すなわち、ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド抗原はヒトにお
いてＣＴＬ反応を誘導し（参照：実施例３）、該ペプチドを含むｐＨ感受性リポ
ソームも、該ペプチドが由来するウイルスに特異的なＣＴＬ反応を誘導すること
ができるため、ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド抗原を含む前記リポソ
ームは細胞性免疫を引き起こすことができ、それが次にヒトのＣＴＬ反応を誘導
することができる。

【００４１】例６：ＨＢｘ特異的Ｔ細胞によるヒト肝細胞癌の根絶ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド抗原（すなわち、ＨＢｘペプチド）で
刺激されたＣＴＬによる腫瘍の根絶を次のように調べた：Ｂａｌｂ／Ｃをベース
とするヌードマウスに１×１０⁷ないし２×１０⁷の異なる細胞数でヒト肝細胞癌
を皮下注射し、このヌードマウスに腫瘍形成試験を行った。３日後に腫瘍が検出
され、５日後に腫瘍ができているマウスの尾部の静脈にＨＢｘペプチドで刺激さ
れたＣＴＬを１．５×１０⁸の細胞数で養子移入した（参照：図３（Ａ））。その結果、腫瘍のサイズは処置後２日目から減少し始め、４日目には腫瘍が完全に
根絶されたことが証明された（参照：図３（Ｂ））。図３（Ａ）及び３（Ｂ）に
おいて、（−●−）及び（−▲−）はそれぞれ２×１０⁷、１×１０⁶の腫瘍細胞
によるチャレンジを示し、Ｔ．Ｐ．はＣＴＬによる処理時点を示す。

【００４２】以上に明確に説明及び証明したように、本発明はＨＢＶＸプロテインに由来し
、該ウイルスに対するＣＴＬを誘導するか、又は該ウイルスに対し免疫耐性を誘
導する抗原のエピトープに対応するペプチド群を含み、ＨＢＶに対する細胞性免
疫を誘導し得るｐＨ感受性リポソームを提供する。Ｘプロテインに由来するＸ３
、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７のようなペプチド抗原はヒト体内に存在するＨＢＶ
抗原を認知できるＣＴＬを活性化し、同時にそのＣＴＬにより認知され得るため
、ＨＢＶＸプロテインに由来するペプチド抗原を含む当該ｐＨ感受性リポソー
ムはＨＢＶ関係疾患の予防及び治療に用いることを企図する治療剤の開発に利用
することができる。

【００４３】

【配列表】

（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：財團法人牧岩生命工學研究所ほか（Ｂ）町：３４１、ポジュングリ、クースングミュン（Ｃ）都市：ヨンギン、キョンギド（Ｄ）州：なし（Ｅ）国：大韓民国（Ｆ）郵便コード（ＺＩＰ）：４４９−９１０（Ｇ）電話：０２−７４１−０６１１（Ｈ）テレファックス：０３３１−２８１−６６２２（ii）発明の名称：Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来するペプチド抗原を含むリポソーム（iii）配列の総数：１０（iv）コンピューター読み取り形式：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテント−イン・リリース＃１．０，バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）（２）配列番号１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号１： His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val 1 5 （２）配列番号２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号２： Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu 1 5 （２）配列番号３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号３： Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala 1 5 （２）配列番号４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号４： Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu 1 5 （２）配列番号５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号５： Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu 1 5 （２）配列番号６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号６： Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala 1 5 （２）配列番号７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：Ｂ型肝炎ウィルス（xi）配列の記載：配列番号７： Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala 1 5 （２）配列番号８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１５アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：ＨＩＶ（xi）配列の記載：配列番号８： Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile 1 5 10 Gly Lys 15 （２）配列番号９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２６アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：ＨＩＶ（xi）配列の記載：配列番号９： Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile 1 5 10 Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys 15 20 25 （２）配列番号１０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：８アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖：無関係（Ｄ）トポロジー：無関係（ii）分子の型：ペプチド（iv）オリジナルソース：（Ａ）生物：ＨＣＶ（xi）配列の記載：配列番号１０： Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu 1 5

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者リーキヤン大韓民国、キョンギド 449−840、ヨンギン、ソージエウプ、サムスン４アパートメント 102−301 (72)発明者チャンジンソー大韓民国、ソウル 140−240、ヨンサンク、セオビンゴドン、シンドン−Ａアパートメント 15−1101 (72)発明者チョスンヨー大韓民国、ソウル 142−070、カンブクク、スユドン 262−69 (72)発明者ホワンユキェオン大韓民国、キョンギド 449−840、ヨンギン、ソージエウプ、ドン−Ａアパートメント 111−802 (72)発明者チョイミェオンジュン大韓民国、キョンギド 463−050、スンナム、ボーンダンク、セオヒュンドン、ウースンアパートメント 228−309 (72)発明者チェオンホンセオク大韓民国、キョンギド 420−022、プチェオン、ウォンミク、ジュン２ドン、グリーンタウン 1309−1402 Ｆターム(参考） 4C076 AA19 BB11 CC07 CC35 DD63 FF16 4C084 AA02 BA01 BA08 BA17 CA01 DC50 MA01 MA24 NA14 ZB072 ZB332 4C085 AA02 BA89 CC08 EE01 GG02 4H045 AA11 BA15 CA02 DA86 EA29 FA10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来するペプチドであって、
細胞障害性Ｔリンパ球により認知されてＢ型肝炎ウイルスに対して細胞毒性を示
し、アミノ酸配列が下記の配列（配列番号１）で表されるペプチド：ＨＬＳＬＲＧＬＦＶ
【請求項２】Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来するペプチドであって、
細胞障害性Ｔリンパ球により認知されてＢ型肝炎ウイルスに対して細胞毒性を示
し、アミノ酸配列が下記の配列（配列番号２）で表されるペプチド：ＶＬＨＫＲＴＬＧＬ
【請求項３】Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来するペプチドであって、
細胞障害性Ｔリンパ球により認知されてＢ型肝炎ウイルスに対して細胞毒性を示
し、アミノ酸配列が下記の配列（配列番号３）で表されるペプチド：ＡＭＳＴＴＤＬＥＡ
【請求項４】Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来するペプチドであって、
細胞障害性Ｔリンパ球により認知されてＢ型肝炎ウイルスに対して細胞毒性を示
し、アミノ酸配列が下記の配列（配列番号４）で表されるペプチド：ＣＬＦＫＤＷＥＥＬ
【請求項５】Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来するペプチドであって、
細胞障害性Ｔリンパ球により認知されてＢ型肝炎ウイルスに対して細胞毒性を示
し、アミノ酸配列が下記の配列（配列番号５）で表されるペプチド：ＥＩＲＬＫＶＦＶＬ
【請求項６】ペプチド抗原を含むｐＨ感受性リポソームであって、リン脂質と
細胞障害性Ｔリンパ球により認知されてＢ型肝炎ウイルスに対し細胞毒性を示す
Ｂ型肝炎ウイルスのＸプロテインに由来する１つ以上のペプチドを５：１ないし
２５：１のモル比で混合することにより製造されるリポソーム。
【請求項７】ペプチド抗原がＨＬＳＬＲＧＬＦＶ、ＶＬＨＫＲＴＬＧＬ、ＡＭ
ＳＴＴＤＬＥＡ、ＣＬＦＫＤＷＥＥＬ、及びＥＩＲＬＫＶＦＶＬからなる群より
選択される、請求項６に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項８】リン脂質が５０％又はそれ以上のホスファチジルエタノールアミ
ン−β−オレイル−γ−パルミトイルを含有する、請求項６に記載のｐＨ感受性
リポソーム。
【請求項９】リン脂質がホスファチジルエタノールアミン−β−オレイル−γ
−パルミトイル及びコレステロールヘミサクシネートを６：４ないし８：２のモ
ル比で混合することにより製造される、請求項６に記載のｐＨ感受性リポソーム
。
【請求項１０】リン脂質が最高で１モル％のモノホスホリルリピッドＡをさら
に含むように製造される請求項９に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項１１】リン脂質がホスファチジルエタノールアミン−β−オレイル−
γ−パルミトイル、ホスファチジルエタノールアミン及びコレステロールヘミサ
クシネートを３：３：４ないし４：４：２のモル比で混合することにより製造さ
れる、請求項６に記載のｐＨ感受性リポソーム。
【請求項１２】リン脂質が最高１モル％のモノホスホリルリピッドＡをさらに
含むように製造される、請求項１１に記載のｐＨ感受性リポソーム。