CN113332263B - 一种共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒、制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种共载HBx‑siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒、制备方法及其用途。本发明建立针对HBx的小干扰RNA，选取具有保肝作用的五味子油，利用阳离子脂质体可以同时装载水溶性物质和脂溶性物质的特性，将两者同时装载于阳离子脂质体内，对其制备工艺进行优化，并对最优工艺下制备出的共载HBx‑siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒进行体外抑制乙型肝炎的药效学研究。实验证明，在阳离子脂质体纳米粒中五味子油具有良好的协同HBx‑siRNA抑制乙型肝炎的作用。

Description

一种共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒、制备 方法及其用途
技术领域
本申请涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒、制备方法及其用途。
背景技术
脂质体是由天然或合成磷脂和胆固醇构成，拥有很好的生物相容性。胆固醇主要功能是可以调整脂质双分子层的流动性，使该载体更为稳固。由两层磷脂分子排列形成可以同时包裹水溶性成分及脂溶性成分球体。脂质体介导制备简单，原料无毒副作用，可以防止目的基因被核酶的降解。阳离子脂质体的亲水基团和疏水基团是阳离子脂质体重要组成部分，含有负电荷DNA/RNA可与含正电荷的阳离子头部在静电作用下转运穿过细胞膜，形成的静电则是其主要力量；而疏水基团可增加在机体里的循环时间并且是构成其稳固性重要因素。阳离子脂质体用作运输载体的优点有：1)可以确保目的基因在机体内不被降解。2)可以靶向性的将目的基因送达至靶组织或细胞。3)可以高效的通过细胞以及核膜，整合到宿主细胞内，使靶mRNA基因表达沉默。4)可以同时装载脂溶性和水溶性药物。
五味子为木兰科(Magnoliaceae)植物五味子的干燥成熟果实，五味子特指为北五味子。目前对于五味子化学成分中木质素、多糖、挥发油等有更多的研发。五味子酚经过加强血清中SOD活性并且除去脂质的MDA来阻挡自由基等氧化损伤而起到抗氧化的效果。五味子油中含有大量的五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲等成分。研究发现五味子甲素和五味子乙素是治疗肝损伤的主要活性成分，五味子甲素可以抑制转氨酶的释放，促进受损肝细胞恢复，使肝细胞再生。研究表明五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素可以改善肝功能、减轻肝细胞脂质过氧化损伤的作用，是保肝作用的主要物质基础。
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒诱发的以肝脏病变为主的传染性疾病。乙型肝炎可逐渐发展为慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞癌，也可引发肝外病变。乙型肝炎病毒可自身进行复制并可进行逆转录过程，因此病毒基因组可整合到机体中，使病毒在机体中难以彻底清除且存在潜在的致癌隐患。成熟乙型肝炎病毒可入侵其他健康肝脏细胞内，不断的复制、侵袭，导致免疫受损。基因治疗是当今医治乙型肝炎的新式方法，此方法可以完全除去体内的乙型肝炎病毒，可以彻底医治乙型肝炎以及由乙型肝炎引发的其他并发症。RNA干扰技术是当今医治乙型肝炎的新兴基因治疗方法。siRNA技术是目前应用最广泛的RNAi技术，并广泛应用于抗乙型肝炎的治疗。脂质体作为一种非病毒载体，具有无传染性、无载体容量制约、化学结构可操控，无致瘤危险和抗原性，可同时装载水溶性物质和脂溶性物质的特点。利用此特点，在装载了siRNA水溶性药物的同时，希望选取一种脂溶性药物，能够达到协同治疗乙型肝炎的作用。
发明内容
本发明建立针对HBx的小干扰RNA，选取具有保肝作用的五味子油，利用阳离子脂质体可以同时装载水溶性物质和脂溶性物质的特性，将两者同时装载于阳离子脂质体内，对其制备工艺进行优化，并对最优工艺下制备出的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒进行体外抑制乙型肝炎的药效学研究。
为了实现上述技术目的，本发明采用了如下技术方案：
一种共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒，所述纳米粒包括HBx-siRNA、五味子油和阳离子脂质体；所述阳离子脂质体的膜材包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇(CHOL)。
优选的，所述DOTAP与CHOL的质量比为2:1-4:1。
优选的，所述阳离子脂质体纳米粒的粒径为134nm，Zeta电位为44mV。
优选的，所述阳离子脂质体纳米粒的包封率为81.37％、载药量为16.25％。
优选的，所述HBx-siRNA序列为：正义链5′-GAAUCCUCACAAUAC CGCATT-3′，反义链5′-UGAGAGUCCAAGAGU CCUCTT-3′。
进一步地，本发明还提供了所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒的制备方法，采用薄膜分散法，包括如下步骤：
(1)制备载五味子油脂质体；
(2)制备共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒。
所述步骤(1)具体如下：称取DOTAP和CHOL的质量比为2:1-4:1，加入到圆底烧瓶中，加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸直到瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入10ml去离子水，超声处理30min，按照五味子油与脂质体的质量比为1:4-1:6，加入处方量的五味子油，超声50-70min，得到乳白色的载五味子油脂质体。
优选的，DOTAP和CHOL的质量比为3:1；五味子油与脂质体的质量比为1:5；加入五味子油后的超声时间为70min。
所述步骤(2)具体如下：取冻存的HBx-siRNA，4000rpm离心1min，加入0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)震荡摇晃使其溶解；取含有25μgHBx-siRNA的溶液加入等质量的透明质酸(HA)溶液混合，室温静置10min形成HA-siRNA；以HA-siRNA与鱼精蛋白(PRTM)的体积比为1:1进行均匀混合，在室温下静置10min，得到HA-siRNA-PRTM复合物；在配置好的HA-siRNA-PRTM复合物中加入50μl的载五味子油脂质体，室温静置10min；加入50μl DSPE-PEG2000，在50℃水浴锅中静置10min，即得到共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒。
进一步地，本发明还提供了一种基因药物制剂，所述基因药物制剂包括所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒和药学上可接受的辅料成分。
进一步地，本发明还提供了所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(一)本发明使用薄膜分散法优化五味子油阳离子脂质体的制备工艺条件，确定最佳工艺为：DOTAP与胆固醇的质量比为3:1，五味子油与脂质体的体积比为1:5，超声时间为70min。采用电荷自主装原理，siRNA所带有的负电荷与阳离子脂质体所带有的正电荷在电荷效应下互相吸引，但是siRNA的分子量太小，当其单独与阳离子脂质体结合时不能稳固的产生聚合作用。因此，选择HA和siRNA形成携带负电荷的共轭物再和携带正电荷的PRTM在电荷作用下自主形成HA-siRNA-PRTM复合物。
(二)粒径是评判脂质体在体内能否通过被动靶向作用通过细胞膜的关键理化指标；Zeta电位是判断脂质体是否稳定的关键性指标。通过优化工艺条件，得到共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒的粒径为134nm、Zeta电位为44mV，脂质体的稳固性和透膜性均达到了指标要求。
(三)共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒的包封率为81.37％、载药量为16.25％，证明药物活性成分脂质体中具有较好的包封率和载药量。
(四)共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒的体外药效学研究表明，各给药组对乙型肝炎的药效：共载HBx-siRNA+五味子油组>载HBx-siRNA组>载五味子油组，证明了五味子油具有良好的协同HBx-siRNA抑制乙型肝炎的作用。
附图说明
图1为透射电镜观察脂质体纳米粒的外观图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
实验材料
(1)五味子油批号：2018-10-22-1江西森海植物油有限公司；
(2)HBx-siRNA由苏州吉玛基因股份有限公司合成。所述HBx-siRNA序列为：正义链5′-GAA UCC UCA CAA UAC CGC ATT-3′，反义链5′-UGA GAG UCC AAG AGU CCU CTT-3′。
五味子油阳离子脂质体的制备工艺条件优化
设定膜材比(X1)、药脂比(X2)、超声时间(X3)为考察因素，以五味子油包封率(Y)为评价指标，每个因素设置5水平。分别用代码-α、-1、0、+1、+α表示，对于三因素的星点设计α＝1.682。实验因素与水平安排见表1、实验结果见表2。
表1.星点设计-效应面法的因素水平表
Figure BDA0003102228440000051
表2.星点设计实验安排结果
Figure BDA0003102228440000052
通过Design Expert 8.0软件分别对各因素的各水平进行二次多项式方程拟合，并根据方程通过Design Expert 8.0软件绘出三维效应面和二维等高线，选取较优组合。二次方程拟合：
Y＝-597.65636+51.56546＊X1+59.73183＊X2+12.21704＊X3-3.05824＊X1＊X2+0.44088＊X1＊X3+0.78736＊X2＊X3-11.40424＊X1 2-10.23924＊X2 2-0.12149＊X3 2，p<0.05，R2＝0.8765，说明回归方程关系显著，符合要求。方差结果分析见表3。
表3.方差结果分析
Figure BDA0003102228440000061
结果分析，Y模型项p<0.05，证明所得回归方程效果显著。在Y模型方程中，X3，X2X3，X1 2，X2 2，X3 2都是显著项，是Y的显著影响因素。使用statistica6.0软件处理后得到二维等高线及三维效应面图，确定得到最优方案为：DOTAP与胆固醇的质量比(膜材比)为3:1，五味子油与脂质体的体积比(药脂比)为1:5，超声时间为70min。
综上所述，本发明确定了所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒的最优制备方法，采用薄膜分散法，包括如下步骤：
(1)制备载五味子油脂质体：称取DOTAP和CHOL的质量比为3:1，加入到圆底烧瓶中，加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸直到瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入10ml去离子水，超声处理30min，按照五味子油与脂质体的质量比为1:5，加入处方量的五味子油，超声70min，得到乳白色的载五味子油脂质体；
(2)制备共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒：取冻存的HBx-siRNA，4000rpm离心1min，加入0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)震荡摇晃使其溶解；取含有25μg HBx-siRNA的溶液加入等质量的透明质酸(HA)溶液混合，室温静置10min形成HA-siRNA；以HA-siRNA与鱼精蛋白(PRTM)的体积比为1:1进行均匀混合，在室温下静置10min，得到HA-siRNA-PRTM复合物；在配置好的HA-siRNA-PRTM复合物中加入50μl的载五味子油脂质体，室温静置10min；加入50μlDSPE-PEG2000，在50℃水浴锅中静置10min，即得到共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒。
脂质体纳米粒的表征
按照上述最优制备工艺制备得到阳离子脂质体纳米粒样品，分别取适量样品加到比色皿和样品池内，用粒度仪检测粒径和Zeta电位。结果显示，在最佳工艺条件下制得共载HBx-siRNA+五味子油阳离子脂质体纳米粒的粒径为134nm，Zeta电位为44mV。脂质体的稳固性和透膜性均达到了指标要求。
按照上述最优制备工艺制备得到阳离子脂质体纳米粒样品，取5μl滴加在铜网上，室温静置至干燥。将铜网置于透射电镜下观察脂质体的形态。观察结果见图1。如图1所示，共载HBx-siRNA+五味子油阳离子脂质体纳米粒呈不规则的类圆形。
脂质体纳米粒包封率的测定
按照上述最优制备工艺制备得到阳离子脂质体纳米粒样品，取适量的溶液进行离心，取上清液，在492nm条件下，采用多功能酶标仪测定吸光度值，根据标准曲线计算出游离FAM-HBx-siRNA浓度，记为C。
包封率计算公式：EE(％)＝(M-C×V)÷M×100％。
载药量计算公式：载药量＝微粒制剂中所含有的药物÷微粒制剂的总量×100％。
其中EE是包封率，V是样品体积，M是溶液中总的FAM-HBx-siRNA的含量，检测结果如表4所示。
表4.共载HBx-siRNA+五味子油阳离子脂质体纳米粒的包封率和载药量
Figure BDA0003102228440000071
根据测定结果计算得，共载HBx-siRNA+五味子油脂质体纳米粒的包封率为81.37％，载药量为16.25％，证明HBx-siRNA在脂质体中具有良好的包封率和载药量。
体外药效学研究
1、MTT检测细胞增殖抑制实验
(1)收集处在对数生长期的HepG2.2.15细胞，弃去原培养液，量取2ml PBS重复清洗两次。量取1ml 0.25％胰酶消化液，缓慢摇晃，使胰酶消化液平铺细胞表面。
(2)迅速放入37℃，5％CO2培养箱中放置2min。显微镜下观察细胞消化状态，细胞收缩变圆。量取5mlα-MEM完全培养基加入培养瓶，结束消化，重复多次缓慢吹打细胞，使其变成单细胞悬液。置于15ml无菌离心管中，800rpm，5min室温离心。
(3)缓慢倒去上清液，吸入适量α-MEM完全培养基，对收集的细胞计数。根据细胞计数结果，量取α-MEM完全培养基调整到每100μl有细胞约104个，将细胞接种于96孔板内，并使每孔含有细胞悬液100μl。
(4)将96孔板放入细胞培养箱内放置24h，至HepG2.2.15细胞单层平铺孔底，弃去原培养基。加入制备好的浓度为20nM、40nM、60nM、80nM、100nM的共载HBx-siRNA+五味子油的阳离子脂质体纳米粒，选取0nM浓度作为阴性对照组，每组设3个复孔。
(5)放入条件为37℃，5％CO2培养箱内，放置24h、48h。将96孔板放入细胞培养箱内放置24h，至HepG2.2.15细胞单层平铺孔底，弃去原培养基。分别加入载五味子油、载HBx-siRNA、共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒α-MEM基本培养基100μl。
(6)以100μlα-MEM基本培养基作为阴性对照组，每一组设置3个复孔。放入条件为37℃，5％CO2培养箱内，放置24h、48h。在避光条件下，每孔分别量取5mg/ml MTT溶液20μl，放到条件为37℃，5％CO2培养箱内，放置4h。
(7)取出96孔板，倒去每孔内上清液，每孔中分别量取150μLDMSO溶液，把96孔板放到摇床上慢速避光震荡10min。在490nm波长下，使用酶标仪，检测各孔OD值，并记下各组数据。
不同浓度共载HBx-siRNA和五味子油阳离子脂质体纳米粒对HepG2.2.15细胞的体外增殖抑制情况；经载五味子油、载HBx-siRNA、共载HBx-siRNA与五味子油阳离子脂质体处理的HepG2.2.15细胞的体外增殖抑制情况，结果如表5、表6所示。
表5.不同浓度阳离子脂质体纳米粒对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用
Figure BDA0003102228440000091
Figure BDA0003102228440000092
注:与阴性对照组比较，*P＜0.05
表6.阳离子脂质体纳米粒对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用
Figure BDA0003102228440000094
Figure BDA0003102228440000093
注:与阴性对照组比较，*P＜0.05
在给药24h后，20nM、40nM、60nM、80nM、100nM浓度的脂质体对HepG2.2.15细胞抑制率分别是7.97％、20.1％、37.98％、45.73％、54.63％。在给药48h后，20nM、40nM、60nM、80nM、100nM浓度的脂质体对HepG2.2.15细胞抑制率分别是17.84％、33.33％、56.47％、68.87％、74.38％。与阴性对照组进行对比，各组都具有统计学意义(P<0.05)。说明共载HBx-siRNA和五味子油脂质体纳米粒对HepG2.2.15细胞增殖的抑制具有剂量依赖性。通过公式计算得共载HBx-siRNA和五味子油脂质体纳米粒在24h、48h抑制HepG2.2.15细胞增殖50％时的药物浓度(IC50)为53.5nM、107.4nM。
在给药后24h时，载五味子油组的抑制率为20.22％，载HBx-siRNA组的抑制率为42.82％，共载HBx-siRNA和五味子油组的抑制率为52.78％。在给药后48h时，各组的抑制率明显增加，载五味子油组的抑制率为25.10％，载HBx-siRNA组的抑制率为59.26％，共载HBx-siRNA和五味子油组的抑率为73.59％。与阴性对照组进行对比，各组都具有统计学意义(P<0.05)。由实验数据可知，在相同的给药时间内，共载HBx-siRNA和五味子油组的抑制率＞载HBx-siRNA组＞载五味子油组＞阴性对照组。共载HBx-siRNA和五味子油阳离子脂质体纳米粒对HepG2.2.15细胞的增殖具有较好的抑制作用。
由实验数据可知，各组随着时间的增加，各组脂质体对HepG2.2.15细胞增殖的抑制率在不断的增加。各组药物对HepG2.2.15细胞增殖的抑制存在时间依赖性。
2、划痕实验检测细胞迁移能力
(1)收集处在对数生长期的HepG2.2.15细胞，倒掉旧培养液，加入2ml PBS重复清洗2次。量取1ml 0.25％胰酶消化液，缓慢摇晃，使胰酶消化液平铺细胞表面。迅速放入37℃，5％CO2培养箱中放置2min。显微镜下观察细胞消化状态，细胞回缩变圆。
(2)量取5mlα-MEM完全培养基结束消化，重复多次缓慢吹打，使其变成单细胞悬液。置于15ml无菌离心管中，800rpm，5min室温离心。缓慢倒去上清液，量取适量α-MEM完全培养基，对收集的细胞计数。
(3)将细胞接种至6孔培养板上，每孔细胞密度为4＊105个，在37℃，5％CO2培养条件下放置至次日。HepG2.2.15细胞单层铺满孔底，弃去原培养基。将移液枪头垂直与板底部，从板底的一侧到另一侧画一条水平直线。每孔量取2ml PBS，轻轻水平摇晃清洗细胞表面，除去划下的细胞碎片，反复清洗3次。
(4)给药组分别加入载五味子油、载HBx-siRNA、共载HBx-siRNA和五味子油阳离子脂质体纳米粒含1％FBS的α-MEM培养基2ml。用含有1％FBS的α-MEM培养基作为阴性对照。放置到37℃，5％CO2培养箱内12h、24h后观察细胞划痕，测量划痕宽度。
划痕愈合率计算公式：划痕愈合率(％)＝(0h划痕宽度-12h/24h划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。
结果如表7所示。
表7.阳离子脂质体纳米粒对HepG2.2.15细胞迁移能力抑制作用
Figure BDA0003102228440000111
Figure BDA0003102228440000112
注:与阴性对照组比较，*P＜0.05
细胞划痕实验是用来测定细胞迁移能力的一种手段。细胞能感受到划痕的“伤口”所在，可以延着微管组织向划痕所在的位置垂直移动。“伤口”愈合的越慢，说明HepG2.2.15细胞迁移的越慢，说明载药脂质体对于乙型肝炎的抑制能力越强。
在12h时，阴性对照组、载五味子油组、载HBx-siRNA组、共载HBx-siRNA和五味子油组的划痕愈合率分别为(48.5±8.5)％、(17.0±5.4)％、(9.2±1.8)％、(3.6±1.4)％，与阴性对照组进行对比，各组都具有统计学意义(P<0.05)。在24小时后，阴性对照组的划痕基本愈合，而其他三组虽有愈合，但是愈合速度明显减慢，由以上数据可知，共载HBx-siRNA和五味子油组对HepG2.2.15细胞迁移能力的抑制作用大于载HBx-siRNA组大于载五味子油组大于阴性对照组。由实验可知，本发明载体具有较好的抑制HepG2.2.15细胞迁移的能力。
3、ELISA法检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg的含量
(1)收集处在对数生长期的HepG2.2.15细胞，弃去原培养液，量取2ml PBS重复清洗两次；量取1ml 0.25％胰酶消化液，缓慢摇晃，使胰酶消化液平铺细胞表面；迅速放入37℃，5％CO2培养箱中放置2min。显微镜下察看细胞消化状态，细胞回缩变圆；量取5ml完全培养基结束消化，重复多次缓慢吹打细胞，使其变成单细胞悬液。
(2)置于15ml无菌离心管中，800rpm，5min室温离心；缓慢倒掉上清，量取适量α-MEM完全培养基，对收集的细胞计数；以每孔4＊105的密度接种到6孔细胞培养板上，在条件为37℃，5％CO2培养箱内放置至次日。
(3)在细胞平铺至孔底80％-90％时开始实验；倒掉原培养基，2mlPBS重复清洗2次；分别加入载五味子油、载HBx-siRNA、共载HBx-siRNA和五味子油阳离子脂质体纳米粒α-MEM培养基2ml。以2mlα-MEM基本培养基作为阴性对照组，每一组设3个复孔；放置到培养条件为37℃，5％CO2培养箱内，放置48h；48h后收取各组细胞上清液至灭菌后的离心管中，2500rpm离心20min，收集上清。结果如表8。
表8.阳离子脂质体对HBsAg和HBeAg水平的影响
Figure BDA0003102228440000121
Figure BDA0003102228440000122
注:与阴性对照组比较，*P＜0.05
在给药48h后，载五味子油组、载HBx-siRNA组、共载HBx-siRNA与五味子油组分别与阴性对照组相比细胞上清液中的HBsAg和HBeAg的水平均有下降，并且对于抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的水平，共载HBx-siRNA与五味子油组大于载HBx-siRNA组大于载五味子油组大于阴性对照组，与阴性对照组进行对比，各组都具有统计学意义(P<0.05)。由数据可知，本发明的阳离子脂质体纳米粒具有较好的抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的作用。
综上所述，通过MTT、细胞划痕、ELISA药效学实验表明，各给药组对乙型肝炎的药效：共载HBx-siRNA+五味子油组>载HBx-siRNA组>载五味子油组，证明了五味子油具有良好的协同HBx-siRNA抑制乙型肝炎的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对技术方案做出若干修改或等同替换，这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒，其特征在于，所述纳米粒包括HBx-siRNA、五味子油和阳离子脂质体；所述阳离子脂质体的膜材包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇(CHOL)。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质体纳米粒，其特征在于，所述DOTAP与CHOL的质量比为2:1-4:1。
3.根据权利要求1或2所述的阳离子脂质体纳米粒，其特征在于，所述阳离子脂质体纳米粒的粒径为134nm，Zeta电位为44mV。
4.根据权利要求3所述的阳离子脂质体纳米粒，其特征在于，所述阳离子脂质体纳米粒的包封率为81.37％、载药量为16.25％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，包括如下步骤：
(1)制备载五味子油脂质体；
(2)制备共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：
称取DOTAP和CHOL的质量比为2:1-4:1，加入到圆底烧瓶中，加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸直到瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入10ml去离子水，超声处理30min，按照五味子油与脂质体的质量比为1:4-1:6，加入处方量的五味子油，超声50-70min，得到乳白色的载五味子油脂质体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，DOTAP和CHOL的质量比为3:1；五味子油与脂质体的质量比为1:5；加入五味子油后的超声时间为70min。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体如下：
取冻存的HBx-siRNA，4000rpm离心1min，加入0.1％焦磷酸二乙酯(DEPC)震荡摇晃使其溶解；取含有25μg HBx-siRNA的溶液加入等质量的透明质酸(HA)溶液混合，室温静置10min形成HA-siRNA；以HA-siRNA与鱼精蛋白(PRTM)的体积比为1:1进行均匀混合，在室温下静置10min，得到HA-siRNA-PRTM复合物；在配置好的HA-siRNA-PRTM复合物中加入50μl的载五味子油脂质体，室温静置10min；加入50μl的 DSPE-PEG2000，在50℃水浴锅中静置10min，即得到共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒。
9.一种基因药物制剂，其特征在于，所述基因药物制剂包括权利要求1-8中任一项所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒和药学上可接受的辅料成分。
10.权利要求1-8中任一项所述的共载HBx-siRNA和五味子油的阳离子脂质体纳米粒在制备治疗乙型肝炎的药物中的用途。
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