CN104031917A - 一种针对HBx的siRNA及其脂质体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对HBx的siRNA，以及用于转送该siRNA的脂质体。含有siRNA质粒，阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂。该脂质体不仅具有良好的体内外稳定性，可以很好地到达靶部分，而且获得了较高的转染效率，有利于其发挥其将siRNA运送细胞抑制乙肝病毒基因HBx表达的作用，另外，其还具有较低的毒性，有利于其应用于体内研究。

Description

一种针对HBx的siRNA及其脂质体制剂

技术领域

本发明涉及医药制剂领域，具体涉及一种针对HBx的siRNA，以及用于转送该siRNA的脂质体。

背景技术

RNA干扰（RNA interfering，RNAi）是指双链RNA进入细胞后诱导靶基因mRNA发生特异性降解，导致目标基因mRNA沉默的现象，是生物长期进化过程中形成的对病毒等外源物质的防御系统。长度为21-23nt的siRNA（Small interfering RNA，小干扰核酸）能够引发RNAi，可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，并具备的高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

HBV（乙型肝炎病毒）可导致急慢性肝炎及肝细胞癌。目前全球范围内约3.5亿人携带有HBV, 而其中每年约有100万死于HBV感染的慢性并发症, 如肝硬化、肝癌或两者并存。虽然目前已有预防用疫苗供应，但是对于慢性感染者的治疗选择仍然有限。研究表明，现有药物多数具有较强毒性和抗药性，因此更多的研究把目光集中到安全有效的RNAi上。乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白(HBx)，是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等。设计针对HBx的siRNA将为治疗乙肝病毒提供一个新的方向。

siRNA的制备方法可分为体外和体内两种。体外化学合成、体外转录及体外利用RNaseIII（核糖核酸酶III）将大片段的RNA切割成多个小片段siRNA。通过体外制备通常可以得到成熟有功能的siRNA，在体内可以直接起效，但缺点是不稳定易降解。体内表达通常使用表达载体，多为质粒和病毒，这种方法的优点是稳定，适用于体内长期研究，同时有利于体外大量扩增，缺点是需要利用体内的元件表达出目标siRNA，效率会受到一定影响。本发明的发明人采用构建siRNA表达质粒的方法体内制备siRNA。

目前制约siRNA临床应用的主要问题，一是如何将siRNA运送到靶部位。在体内及体外环境中存在大量的核酸酶，siRNA（或siRNA表达质粒）经过较长时间放置或是在体内运送的过程中即可被核酸酶完全降解，因此未经保护的siRNA（或siRNA表达质粒）很难到达靶部位发挥药效；二是如何得到较高的转染效率。转染RNA（RNA transfection）是将RNA分子导入细胞的过程。当siRNA运送到靶部位后，希望其可以有效地进入细胞以发挥其作用。

脂质体特有的性质使其成为siRNA的良好载体。脂质体按照其荷电性可分为中性脂质体，负电性脂质体和正电性脂质体，含碱基（胺基）脂质体例如十八胺等的脂质体荷正电。（《药物新剂型与新技术》第2版，陆彬主编，人民卫生出版社）

siRNA为水溶性荷负电分子，脂质体对普通药物的装载技术并不适用于siRNA。中国专利200710072417.9公开了通过将荷负电的siRNA先与带正电的鱼精蛋白形成复合物，再将该复合物装载到脂质体中的方法，提高了脂质体的包封率。美国专利US20030078225A1中采用脱水-再水化的方式载药，但包封率仅有50%左右。大多数研究则通过加入阳离子脂的方式提高siRNA脂质体的包封率。现常用的阳离子脂包括DOTAP（二油酰基三甲基磷酸铵）、BisHOP（1、2-二（十六烷氧基）-3-甲基氨基丙烷）及DOTMA（N-[1-(2、3-二油酰氧基)丙基-N、N、N-三甲基氯化铵]），这些阳离子脂能实现较高的包封率。在体外细胞实验中，利用这些阳离子脂质体制备的脂质体均有较高的转染效率（CN102144973A，CN101045037B，CN101801344A，US6656498B1，US20060002991A1），但这些含阳离子脂的脂质体都有一定的毒性，在进行体内体外实验时对剂量和给药方式有严格的要求，在一定程度上限制了其临床应用的可能（钟英强，《siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡抑制基因bcl-2 和环氧合酶-2基因表达的影响》，中华临床医师杂志，2010年04卷08期；邓益斌，《阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性研究》，中国科技论文在线，2008）。

98N12-5是一种新型阳离子脂，用于制备阳离子脂质体（Akinc，2008；Frank-Kamenetsky，2008），麻省理工学院申请的中国专利200680029788.2公开了98N12-5的结构如下

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脂质体进入体内后通常会被RES系统清除，不能运送到靶部位，经过聚乙二醇(PEG)修饰后，将降低脂质体被清除的几率，延长脂质体在血液系统的循环时间，从而使更多的脂质体进入到靶部位，发挥药效。PEG的链长度和PEG化密度与药效有关，链长度将决定其从脂质体上脱落的时间，从而影响体内循环，而脂质体表面PEG的亲水性降低了脂质体在组织间质中的转运和生物利用度。因此，有必要对PEG的种类和密度进行研究。

发明内容

本发明的发明人针对目前制约siRNA临床应用的主要问题，通过深入的研究，所发现的装载了针对HBx的siRNA及其脂质体制剂，不仅具有良好的体内外稳定性，可以很好地到达靶部分，而且获得了较高的转染效率，有利于其发挥其将siRNA运送细胞抑制乙肝病毒基因HBx表达的作用，另外，其还具有较低的毒性，有利于其应用于体内研究。

本发明提供一种siRNA序列，如SEQ ID NO.1所示：

5’- GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’ （SEQ ID NO.1）

该序列的筛选过程如下：

①根据乙肝病毒（HBV）基因组序列（ayw亚型，Gene bank assession no：AY661792）设计7个不同的可抑制乙肝病毒HBx基因的siRNA序列，并合成。序列分别为：

oligo1: 5’-GATCCTGCGCGGGACGTCCTT-3’

oligo2: 5’-GGTCTTACATAAGAGGACT-3’

oligo3: 5’-GAGGACTCTTGGACTCTCA-3’

oligo4: 5’-GCAATGTCAACGACCGACC-3’

oligo5: 5’-GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’

oligo6: 5’-TGCCCAAGGTCTTACATAA-3’

oligo7: 5’-CCTTGAGGCATACTTCAAA-3’。

②制备能够表达乙肝病毒基因HBx和萤火虫荧光素酶融合蛋白的质粒pHBx-Fluc（结构见附图1），通过检测萤火虫荧光素酶表达的变化来体现siRNA对HBx基因的抑制作用。

③将pHBx-Fluc转染到HEK293细胞中，再分别将合成的7个siRNA序列转染到HEK293细胞中，通过检测萤火虫荧光素酶的表达降低程度，来筛选7个序列中最有效的序列，初步筛选结果表明其中3个序列（oligo4、oligo 5和oligo 7）抑制效率较高（附图2）。

④仍利用转染了pHBx-Fluc的HEK293细胞，将初步筛选的3个序列分别按照不同的量转染到细胞中，观察siRNA的抑制作用是否具有剂量依赖效应。结果表明这种抑制作用具有剂量依赖效应，且其中序列oligo5：5’-GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’的抑制作用最强（附图3）。

本发明还提供一种siRNA表达载体，其特征在于它能在体内表达如SEQ ID NO.1所示的siRNA序列。该表达载体在体内能表达出抑制HBx的有功能的siRNA。

本发明还提供一种上述siRNA表达载体的制备方法，其特征在于含有如下步骤：

①初步筛选得到具有明显抑制HBx基因表达的siRNA序列：

5’-GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’ (HBV基因组 ayw亚型，Gene bank assession no：AY661792)。

②构建HBx的siRNA表达质粒。

1）首先按照如下结构合成siRNA表达序列：

Sense strand：

5’-AGCTAAAAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTTTTTA-3’

Antisense strand:

5’-GATCTAAAAAGCCTCCTAGTACAAAGACCTTTTTT-3’。

2）将上述的两条单链片段退火配对连接，形成一端为HindIII酶切末端另一端为BglII酶切末端的双链小片段。

3）将质粒pDual（其结构见附图4）分别使用HindIII和BglII进行双酶切，并通过凝胶回收大片段。

4）将酶切后的线性的质粒pDual片段与siRNA双链小片段连接，得到pDual-oligo5质粒。

③测序鉴定连接得到的pDual-oligo5质粒，结果表明连接成功。

本发明还提供一种含有上述siRNA表达载体的脂质体，其特征在于含有siRNA质粒，阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂。其中PEG化的磷脂为mPEG-Ceramide C₈。98N12-5：PEG化磷脂：胆固醇：siRNA质粒的摩尔比为42：8-12：46-50：10-35。

本发明还提供一种制备含有上述siRNA表达载体的脂质体的制备方法，其特征在于含有如下步骤：

1）空白脂质体制备：称取阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂，加入无水乙醇，60℃加热至全部溶解，和相应的缓冲液混合（体积比7:13）,60℃水化30min后，整粒，得到粒径合适的空白脂质体（含醇35%）备用。

2）siRNA质粒溶液制备：取siRNA质粒的浓溶液，用100mM乙酸钠缓冲液（pH5.2）、无水乙醇稀释成含醇35%的相应浓度的siRNA溶液。

3）载药：将空白脂质体和siRNA质粒溶液采用交叉流的方式等体积混合，制备出siRNA质粒脂质体，于37℃孵育30min。

4）透析：以蔗糖为透析液，对上述载药脂质体透析。

5）冻干：将透析后的脂质体进行冻干处理。

对制备得到的阳离子脂质体的理化性质进行分析，siRNA质粒阳离子脂质体的粒径在100-120nm左右，表面电位在+30-+60mV之间。

对制备的阳离子脂质体的包封率进行评价，方法如下：

采用Quant-iT PicoGreen试剂盒检测样品中siRNA质粒的荧光值（激发波长480nm，发射波长520nm，检测范围1ng/ml到1μg/ml）。将样品分成两份，分别用TE和曲拉通进行稀释，稀释到500ng/ml左右。用TE（Tris-EDTA缓冲液）稀释后检测荧光，该值为游离siRNA质粒的值，用2%的曲拉通稀释样品，检测荧光，该值为siRNA质粒总量。

包封率＝（1-游离siRNA质粒的值/siRNA质粒总量）×100%。

此方法测得的该阳离子脂质体的包封率在90%以上。

以下内容中所述的siRNA（或siRNA质粒）均指表达上述oligo5序列及表达它的质粒。

阳离子脂质体包裹siRNA（或siRNA质粒）后，在RNase中的稳定性得到明显提高，详见附图5。各样品：M. Marker； 1.siRNA酶切5min； 2.siRNA脂质体酶切5min； 3.siRNA酶切10min； 4.siRNA脂质体酶切10min；5.siRNA酶切20min；6.脂质体酶切20min； 7.siRNA酶切40min； 8.脂质体酶切40min；9.未酶切siRNA。

其中，条带的强度表示siRNA的量，图中2、4、6、8号为脂质体包裹的siRNA，可见2、4、6中siRNA的量几乎没有变化，8中的量稍有减少；1、3、5、7为裸露的未经包裹的siRNA，已经被完全降解，没有检测条带，说明siRNA（或siRNA质粒）被脂质体包裹后，其在RNase中的稳定性得到了明显提高。

因为在体内血液中也含有大量的RNase，可将进入体内的siRNA降解，附图6显示了模拟体内环境，考察siRNA和被脂质体包裹后的siRNA在血清中的稳定性的结果。各样品：1. siRNA对照（未加血清）；2. siRNA加血清后放置60min；3. siRNA脂质体对照（未加血清）；4. siRNA脂质体加血清后放置12h；5. siRNA脂质体对照（未加血清）；6. siRNA脂质体加血清放置24h。从图中可见，未加血清时经过脂质体包裹的和未经脂质体包裹的siRNA量基本一致，未见降解。未经包裹的siRNA在血清中放置60min后，siRNA几乎完全降解，只能检测到少量完整的siRNA，而经脂质体包裹的siRNA在血清中放置24h仍可检测到约50%。（方法参照文献siRNA-containing liposomes modified with polyarginine effectively silence the targeted gene）

附图7体现了siRNA质粒和被脂质体包裹后的siRNA质粒的药代动力学检测结果，可见未经包裹的siRNA质粒在体内的半衰期约为5min，经过包裹后延长到2h，经脂质体包裹明显延长了siRNA质粒在体内的半衰期。

附图8体现了不同类型阳离子脂质体包裹的质粒的转染效率差异。各样品：A．98N12-5转染后细胞，B.DOTAP转染后细胞，C.转染试剂转染后细胞，D．98N12-5转染细胞后表达GFP，E．DOTAP转染细胞后表达GFP，F．转染试剂转染细胞后表达GFP。利用性质与siRNA质粒相似的绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒pEGFP-C1质粒作为报告基因，直观的评价不同阳离子脂质体将质粒运送到细胞内的能力。方法如下：

将HEK293细胞接种于24孔板，每孔细胞接种量和培养条件均一致，培养24h后，在每孔中加入不同处方的阳离子脂质体（加入每种处方的质粒量一致），并使用市售的细胞转染试剂作为对照，共同孵育6h后更换为新鲜的细胞培养液，之后24h使用荧光显微镜观察每孔中细胞表达GFP的情况（陈扬超，《以GFP为报告基因优化CNE-2Z细胞脂质体转染条件的实验研究》，广东医学院学报，2001年第3期）。

从图8可见，A、B、C为在普通显微镜下观察到的细胞，D为加入98N12-5处方脂质体的细胞，其表达绿色荧光蛋白的细胞比例与加入市售转染试剂的细胞（F）相当，加入而DOTAP处方脂质体的细胞（E）几乎不表达绿色荧光蛋白，说明该处方未能将质粒运送到细胞中。因此，含有阳离子98N12-5的脂质体处方能更为有效的将质粒运动到细胞内。

附图9体现了不同阳离子脂制备的脂质体的细胞毒性差异。通过使用不同的阳离子脂98N12-5、C12-200、110N9-5和DOTAP制备的脂质体，将其按照不同剂量（以siRNA质粒量计）加入到生长于96孔板的HEK293细胞中，48h后使用MTT法检测细胞的活性，计算出细胞的死亡率，以此来比较不同剂量下不同处方的毒性差异。图9可见，在加入相同剂量的脂质体后（以siRNA质粒量计），含阳离子脂98N12-5处方的细胞死亡率最低，说明在相同的剂量下，该处方的毒性最小。

附图说明

附图1 质粒pHBx-Fluc的结构

附图2 7个siRNA序列对HBx的抑制效率

附图3 序列oligo4、5和7对HBx的抑制效率

附图4 质粒pDual的结构

附图5 siRNA和siRNA脂质体在RNaseA中稳定性考察结果

附图6 siRNA和siRNA脂质体在80%血清中稳定性考察结果

附图7 siRNA质粒脂质体药代动力学检测结果

附图8 不同阳离子脂质体包裹的siRNA的转染效率差异

附图9 不同阳离子脂质体的细胞毒性

具体实施方式

通过以下的具体例子，可以更加具体的说明本发明，但本发明不局限于以下例子。

实施例1

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制备方法如下：

1）空白脂质体制备：按上述处方称取磷脂混合物，加入无水乙醇，60℃加热至全部溶解，和相应的缓冲液混合（体积比7:13）,60℃水化30min后，整粒，得到粒径合适的空白脂质体（含醇35%）备用。

2）siRNA质粒溶液制备：取siRNA质粒的浓溶液，用100mM乙酸钠缓冲液（pH5.2）、无水乙醇稀释成含醇35%的相应浓度的siRNA溶液。

3）载药：将空白脂质体和siRNA质粒溶液采用交叉流的方式等体积混合，制备出siRNA质粒脂质体，于37℃孵育30min。

4）透析：以蔗糖为透析液，对上述载药脂质体透析。

5）冻干：将透析后的脂质体进行冻干处理。

Claims (7)

1.一种siRNA序列，如SEQ ID NO.1所示：

5’- GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’ （SEQ ID NO.1）。

2.一种siRNA表达载体，其特征在于它能体内表达如SEQ ID NO.1所示的siRNA序列。

3.一种如权利要求2所述siRNA表达载体的制备方法，其特征在于含有如下步骤：

①初步筛选得到具有明显抑制HBx基因表达的如SEQ ID NO.1所示的siRNA序列，②构建HBx的siRNA表达质粒，③测序鉴定连接得到的pDual-oligo5质粒。

4.一种含有如权利要求2所述siRNA表达载体的脂质体，其特征在于含有siRNA质粒，阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂。

5.一种如权利要求4所述脂质体，其特征在于98N12-5：PEG化磷脂：胆固醇：siRNA质粒的摩尔比为42：8-12：46-50：10-35。

6.一种如权利要求4或5所述脂质体，其特征在于所述PEG化磷脂为mPEG-Ceramide C₈。

7.一种制备如权利要求4-6中任一项所述脂质体的制备方法，其特征在于含有如下步骤：

①空白脂质体制备：称取阳离子脂98N12-5，胆固醇和PEG化磷脂，加入无水乙醇，加热至全部溶解，和缓冲液混合，水化，整粒，得到粒径合适的空白脂质体备用，②siRNA质粒溶液制备：取siRNA质粒的浓溶液，用乙酸钠缓冲液、无水乙醇稀释成siRNA质粒溶液，③载药：将空白脂质体和siRNA质粒溶液采用交叉流的方式等体积混合，制备出siRNA质粒脂质体，孵育，④透析：以蔗糖为透析液，对上述载药脂质体透析，⑤冻干。