CN105368860A - 一种重组质粒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种重组质粒载体及其构建方法和应用。本发明所述重组质粒载体包含诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述TK启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。本发明通过构建一个共表达两种荧光素酶的、可通过诱导启动子调控基因表达量的质粒载体，快捷简便的建立siRNA筛选模型，实现高通量、定量的筛选siRNA，并且该质粒能够用于过高或过低表达基因以及表达毒性蛋白的基因的功能研究。

Description

一种重组质粒载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组质粒载体及其构建方法和应用。

背景技术

RNA干扰(RNAinterfering，RNAi)是指双链RNA进入细胞后诱导靶基因mRNA发生特异性降解，导致目标基因mRNA沉默的现象，是生物长期进化过程中形成的对病毒等外源物质的防御系统。长度为21-23nt的siRNA能够引发RNAi，可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，并具备高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于基因功能探索和基因治疗领域。

siRNA沉默效率主要取决于19-21个碱基序列的合理设计，如何设计和筛选针对目的基因的高效特异性siRNA是基因沉默的关键。使用生物信息学、计算机辅助手段选择最佳siRNA是研究的热点之一。生物信息学可以优化siRNA核苷酸序列性质(如G/C比例、碱基变化以及序列中重复碱基数目等)；预测siRNA目的位置二级结构(二级结构预测可改善siRNA位点预测效率，80％的非作用位点可以通过二级结构预测来排除)；预测内部重复序列，避免siRNA自身形成发夹结构；实现与非目的基因的最小错配，以最小化非目的基因沉默。但是通过生物信息学计算出的序列只是模拟运算的结果，在体内外的复杂环境能否起效还需要进一步的验证。

体外筛选最常用的方法是利用表达目的基因的细胞株，将siRNA转染到细胞中，之后通过定量聚合酶链式反应(qPCR)或是蛋白质免疫杂交(WesternBlot)等方法，定量检测目的基因的表达变化来评价siRNA的作用效果。这一方法的缺点是，针对不同的目的基因研究需要选择不同的细胞株，对于有些基因，没有表达该基因的细胞株，还需要通过转基因或是诱导等方法建立，操作繁琐、费时、成功率低；并且，在定量检测的过程中，需要提取总RNA或总蛋白质，再进行qPCR或WesternBlot进行定量，整个过程步骤多，不仅费时还容易引起误差。

有研究者使用含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒载体，将需要研究的目的基因构建到该质粒中形成融合基因，表达融合蛋白，将其转染到任意细胞中即可作为筛选模型。在评价目的基因的siRNA作用效果时，只需观察GFP表达变化就可以表示目的基因表达的变化。该模型建立简便，评价方法直观，但缺点是定量检测十分繁琐，通常不用于定量分析。

之后使用荧光素酶基因代替GFP基因作为报告基因，其在具有上述优点的同时，利用在催化底物氧化过程中会发出生物荧光且荧光强度与荧光素酶的量正相关的特点，可以极其灵敏、高效的定量检测出基因表达量的变化，例如现有的siCheck载体。但是，由于基因本底原因，siCheck载体会造成基因表达量变化不明显，从而导致对siRNA筛选分析结果的不准确；而在表达毒性蛋白的基因的siRNA筛选时，毒性蛋白会对细胞造成损伤，导致筛选无法继续进行，因此siCheck载体不能用于过高或过低表达基因以及表达毒性蛋白的基因的siRNA筛选，同时，siCheck载体只能够表达出融合的mRNA，但是不能表达两个基因的融合蛋白(只能表达出荧光素酶蛋白)，因此，该质粒不能用于基因功能研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种重组质粒载体及其构建方法和应用，使所述重组质粒载体能够快速准确高通量的筛选分析siRNA。

本发明的另一个目的是提供一种重组质粒载体及其构建方法和应用，使所述重组质粒载体能够应用于过高或过低表达基因以及表达毒性蛋白的基因的siRNA筛选分析。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种重组质粒载体，包含诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。

本发明将两种荧光素酶基因表达于同一质粒，萤火虫荧光素酶基因为主报告基因，海肾荧光素酶基因为内参基因。作为主报告基因的萤火虫荧光素酶基因的启动子为诱导型启动子。在萤光虫荧光素酶基因的5’端加入多克隆位点，可将目的基因插入萤火虫荧光素酶基因前端形成融合基因，表达融合蛋白，使萤火虫荧光素酶基因与目的基因不仅能够表达融合mRNA，还能够表达融合蛋白；另外，通过改变加入诱导药物的时间和剂量，调控融合蛋白的表达时间和程度，使其能够用于表达量过高或是过低基因和表达毒性蛋白基因的siRNA筛选，以及基因功能研究。

作为内参基因的海肾荧光素酶基因用组成型低表达启动子调控表达，避免使用高表达启动子造成因为海肾表达量过高导致检测不到目的基因表达量的变化而造成假阴性结果的现象。而内参基因的加入使得筛选分析siRNA的结果更加严谨和准确。

作为优选，所述诱导型启动子来源于四环素操纵子诱导调控系统、脱皮激素类诱导系统、FK506调控系统、纳巴霉素诱导系统或RU486诱导系统；更优选地，所述诱导型启动子为Tet-responsivePtightpromoter。

作为优选，所述组成型低表达启动子为TK启动子。

作为优选，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有多种限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸片段。

作为优选，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有选自AgeI、ApaI、AscI、Bpu1102I、BstEII、BstXI、Bsu36I、CvnI、DraIII、Eco47III、Eco56I、Eco72I、EcoRV、EspI、FseI、I-PpoI、MstII、NaeI、NruI、PacI、PflMI、PinAI、PmaCI、PmeI、SauI、SfiI、SnaBI、SpeI、SplI、SpoI、SrfI、SunI、SwaI、Tth111I中一种或两种以上限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

作为优选，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有AgeI、Eco47III、EcoRV、NaeI、SpeI限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

作为优选，所述多克隆位点双链核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。

作为优选，还包括抗性标记和polyA，所述polyA分别位于萤火虫荧光素酶基因3’端和海肾荧光素酶基因3’端。更优选地，所述polyA为SV40polyA。

作为优选，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

此外，本发明还提供一种重组质粒载体的构建方法，包括：

提供诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因并连接各部件获得重组质粒载体；

其中，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。

所述诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因可以通过酶切、PCR扩增或体外合成等方法获得，所述连接可通过连接酶进行连接。

作为优选，所述构建方法包括：

从包含诱导型启动子、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因的质粒中酶切获得各部件，然后与合成的多克隆位点通过酶切、连接获得重组质粒载体；

其中，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。在连接各部件时，可根据质粒上对应的酶切位点进行相应的酶切并连接。

作为优选，所述诱导型启动子为来源于四环素操纵子诱导调控系统、脱皮激素类诱导系统、FK506调控系统、纳巴霉素诱导系统或RU486诱导系统；更优选地，所述诱导型启动子为Tet-responsivePtightpromoter。

作为优选，所述组成型低表达启动子为TK启动子。

作为优选，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有多种限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸片段。

作为优选，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有选自AgeI、ApaI、AscI、Bpu1102I、BstEII、BstXI、Bsu36I、CvnI、DraIII、Eco47III、Eco56I、Eco72I、EcoRV、EspI、FseI、I-PpoI、MstII、NaeI、NruI、PacI、PflMI、PinAI、PmaCI、PmeI、SauI、SfiI、SnaBI、SpeI、SplI、SpoI、SrfI、SunI、SwaI、Tth111I中一种或两种以上限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

作为优选，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有AgeI、Eco47III、EcoRV、NaeI、SpeI限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

作为优选，所述多克隆位点双链核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。

作为优选，还包括在所述重组质粒载体上插入抗性标记和polyA，所述polyA分别位于萤火虫荧光素酶基因3’端和海肾荧光素酶基因3’端。更优选地，所述polyA为SV40polyA。

作为优选，所述提供诱导型启动子和萤火虫荧光素酶基因具体为：

使用限制性内切酶HindIII和XbaI分别酶切pTRE-tight质粒和pGL3-control质粒，酶切后使用T4连接酶，连接酶切获得的1.7Kb的pGL3-control质粒片段和2.6Kb的pTRE-tight质粒片段获得含有Tet-responsivePtightpromoter和萤火虫荧光素酶基因的质粒pTRE-Fluc。

作为优选，所述提供组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因具体为：

采用两端分别带有NsiI和SalI酶切位点的TK启动子的引物，从pRL-TK质粒上扩增TK启动子片段；

使用限制性内切酶NsiI和SalI酶切pRL-null质粒和TK启动子片段，酶切后使用T4连接酶，连接酶切获得的3.3Kb的pRL-null质粒片段和TK启动子片段，获得含有组成型低表达TK启动子和海肾荧光素酶基因的质粒pTK-Rluc。

其中，所述两端分别带有NsiI和SalI的TK启动子的引物优选为SEQIDNO:4-5所示核苷酸序列；为了提高酶切效率，本发明优选在从pRL-TK质粒上扩增TK启动子片段后，NsiI和SalI酶切pMD-18Teasy质粒并插入TK启动子片段获得pMD18T-TKpromoter质粒，然后用NsiI和SalI分别酶切pRL-null质粒和pMD-18Teasy质粒，使用T4连接酶，连接酶切获得的3.3Kb的pRL-null质粒片段和0.7Kb的pMD18T-TKpromoter质粒片段，获得含有组成型低表达TK启动子和海肾荧光素酶基因的质粒pTK-Rluc。

根据本发明所述构建方法的核心策略，本发明还提供一种最为优选的构建方法，包括：

使用限制性内切酶HindIII和XbaI分别酶切pTRE-tight质粒和pGL3-control质粒，酶切后使用T4连接酶，连接酶切获得的1.7Kb的pGL3-control质粒片段和2.6Kb的pTRE-tight质粒片段获得含有Tet-responsivePtightpromoter和萤火虫荧光素酶基因的质粒pTRE-Fluc；

采用两端分别带有NsiI和SalI酶切位点的TK启动子的引物，从pRL-TK质粒上扩增TK启动子片段；NsiI和SalI酶切pMD-18Teasy质粒并插入TK启动子片段获得pMD18T-TKpromoter质粒，然后用NsiI和SalI分别酶切pRL-null质粒和pMD18T-TKpromoter质粒，使用T4连接酶，连接酶切获得的3.3Kb的pRL-null质粒片段和0.7Kb的pMD18T-TKpromoter质粒片段，获得含有组成型低表达TK启动子和海肾荧光素酶基因的质粒pTK-Rluc；

使用限制性内切酶XhoI分别酶切pTRE-Fluc质粒和pTK-Rluc质粒，酶切后使用T4连接酶，连接酶切获得的2.3Kb的pTRE-Fluc质粒片段和4.0Kb的pTK-Rluc质粒片段，获得同时包含诱导型启动子的萤火虫荧光素酶基因和组成型低表达启动子的海肾荧光素酶基因的质粒；

将合成的两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点的多克隆位点，与用KpnI和NcoI酶切得到的6.3Kb的同时包含诱导型启动子的萤火虫荧光素酶基因和组成型低表达启动子的海肾荧光素酶基因的质粒片段连接，获得所述重组质粒载体。

本发明所述重组质粒载体应用于乙肝病毒基因HBx的siRNA筛选时，其能够准确的筛选分析多种siRNA对乙肝病毒基因HBx的抑制率，将筛选出的抑制率最高的siRNA用乙肝病毒转基因小鼠验证，小鼠肝脏中的HBx基因的mRNA表达在给药后3天、7天均显著降低，说明本发明构建的重组质粒载体可以有效地筛选目的基因的siRNA。同时，本发明能够通过改变加入诱导剂的时间来调控基因的表达时间，可以使毒性基因只在短时间内表达，因此降低持续表达这类基因对细胞的损伤，使其应用于毒性基因的siRNA筛选及功能研究。本发明通过加入诱导剂的量来选择基因合适的表达量，使其适用于过高表达或过低表达基因的研究。

由以上技术方案可知，本发明通过构建一个共表达两种荧光素酶的、可通过诱导启动子调控基因表达量的质粒载体，快捷简便的建立siRNA筛选模型，实现高通量、定量的筛选siRNA，并且该质粒能够用于过高或过低表达基因以及表达毒性蛋白的基因的功能研究。

附图说明：

图1示本发明所述重组质粒载体的质粒图谱；

图2示利用本发明所述重组质粒载体筛选针对HBx基因的siRNA序列的柱形图，其中横坐标为不同序列的siRNA序号，纵坐标为基因的相对表达量；

图3示siRNA抑制乙肝病毒转基因小鼠中的HBxmRNA表达的柱形图，其中纵坐标为HBxmRNA相对表达量，横坐标为试验小鼠编号，白色柱形图为给药前结果，黑色柱形图为给药后结果；

图4示细胞转染本发明所述重组质粒载体和psiCHECK质粒后加入不同剂量的诱导剂基因表达的变化，横坐标为加入诱导剂的浓度，纵坐标为基因的相对表达量；

图5示本发明所述重组质粒载体应用于自杀基因HSV-TK研究，A为转染pTRE-HSVTK-Fluc-Rluc质粒后24h，B为转染pcDNA3.1-HSVTK质粒后24h，C为转染pTRE-HSVTK-Fluc-Rluc质粒后48h，D为转染pcDNA3.1-HSVTK质粒后48h。

具体实施方式：

本发明公开了一种重组质粒载体及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的重组质粒载体及其构建方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中所用术语解释：

1.载体：把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。

2.质粒：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于染色体或核区DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子(covalentlyclosedcircularDNA)，也称为cccDNA，其大小通常在1～100Kb范围内。

3.质粒载体：质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的，可以将目的DNA片段构建到质粒载体中，运送进受体细胞中进行繁殖或表达，使受体细胞获得想要的表型。

4.多克隆位点：(multiplecloningsite，MCS)，是包含多个限制性酶切位点(restrictionsite)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker)，是基因工程中常用到的质粒载体的标准配置序列。MCS中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。通过多克隆位点可以将一个或多个外源DNA片段插入到多克隆位点所在的区域中。

5.启动子：RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。

6.荧光素酶：是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称，其是受荧光蛋白基因转录和翻译下指导合成的荧光蛋白实质上就是荧光素酶，可以催化底物反应发出生物荧光，目前作为报告基因最常使用的是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

本发明中所采用的质粒均为市售商品质粒。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：构建可诱导表达的萤火虫荧光素酶pTRE-Fluc质粒

商业化的pTRE-tight质粒和pGL3-control质粒(购自Clontech公司)中分别含有四环素敏感的诱导型启动子片段(Tet-responsivePtightpromoter，包括一个Tetresponseelement(TREmod)和minimalCMVpromoter(PminCMV△))和萤火虫荧光素酶基因(Fluc)。将上述两种质粒转化到DH5α感受态细胞中，分别扩大培养后，提取两种质粒。

使用限制性内切酶HindIII和XbaI分别酶切pTRE-tight和pGL3-control质粒。经酶切后，pTRE-tight质粒为一条2.6Kb的片段(含有Tet-responsivePtightpromoter)，而pGL3-control质粒被酶切为两条约为1.7Kb(含有Fluc)和3.5KB的片段。

分别回收pTRE-tight质粒2.6Kb的片段和pGL3-control质粒1.7Kb片段。

使用T4连接酶将1.7Kb的Fluc基因片段连接到2.6Kb的pTRE-tight质粒片段上，获得含有Tet-responsivePtightpromoter和萤火虫荧光素酶基因的质粒pTRE-Fluc。

实施例2：含有组成型低表达TK启动子和海肾荧光素酶基因的pTK-Rluc质粒

设计两端分别带有NsiI和SalI酶切位点的TK启动子的引物(引物序列如下，序列表中如SEQIDNO:4-5所示)，首先从pRL-TK质粒(购自promega公司)上扩增TK启动子。之后将该片段连接到pMD-18Teasy载体(购自invitrogen公司)中构建pMD18T-TKpromoter质粒，一方面利用该质粒扩增TK启动子片段；另一方面酶切质粒比直接酶切PCR片段效率更高，操作更便捷。

Sense：5’-GCGATGCATAATGAGTCTTCGGACCTCGCGGG-3’

Antisense：5’-CGCGTCGACAAGCTTGATTCTTCTGACACA-3’

使用限制性内切酶NsiI和SalI分别酶切pRL-null(购自promega公司)和pMD18T-TKpromoter质粒。经酶切后，pRL-null质粒为一条3.3Kb的片段(含有海肾荧光素酶基因片段Rluc)，而pMD18T-TKpromoter质粒被酶切为两条0.7Kb(含有TK启动子片段)和3.3KB的片段。

琼脂糖电泳分别回收pRL-null质粒2.6Kb的片段(含有Rluc基因片段)和pMD18T-TKpromoter质粒0.7Kb片段(TK启动子片段，TKpromoter)，并通过T4连接酶连接，构建同时含有组成型低表达TK启动子和海肾荧光素酶基因的pTK-Rluc质粒。

实施例3：构建本发明所述重组质粒载体

将已构建好的pTRE-Fluc质粒和pTK-Rluc质粒转化到DH5α感受态细胞中，扩大培养后，提取两种质粒。

使用限制性内切酶XhoI分别酶切pTRE-Fluc质粒和pTK-Rluc质粒。经酶切后，pTRE-Fluc质粒被酶切为两条2.0Kb和2.3kb的片段(含有Tet-responsivePtightpromoter-Fluc片段)，而pTK-Rluc质粒被酶切为一条4.0KB的片段(含有TKpromoter-Rluc片段)。

琼脂糖电泳分别回收pTRE-Fluc质粒2.3Kb的片段(含有Tet-responsivePtightpromoter-Fluc片段)和pTK-Rluc质粒4.0Kb片段(含有TKpromoter-Rluc片段)。

使用T4连接酶连接回收得到的两条片段，得到同时包含诱导型启动子的萤火虫荧光素酶基因和组成型低表达启动子的海肾荧光素酶基因的质粒。

合成含有多种限制性内切酶的寡核酸片段(酶切位点除两端的KpnI和NcoI之外，其余酶切位点都是选择在所有的序列中没有出现的，且为常见易购买的限制性内切酶)包括KpnI、AgeI、Eco47III、EcoRV、NaeI、SpeI和NcoI序列如下，序列表中如SEQIDNO:1-2所示：

Forward：5’-CAACCGGTAGCGCTAGCCGGCAACTAGTAC-3’

Reward：5’-CATGGTACTAGTTGCCGGCTAGCGCTACCGGTTG

GTAC-3’

将上述的两条单链片段退火配对连接，形成一端为KpnI酶切末端，另一端为NcoI酶切末端的多克隆位点双链小片段。

将上述的同时包含诱导型启动子的萤火虫荧光素酶基因和组成型低表达启动子的海肾荧光素酶基因的质粒用KpnI和NcoI酶切，回收6.3Kb的片段。

T4连接酶连接6.3Kb片段和退火形成的多克隆位点小片段，得到最终的可诱导表达的双荧光素酶质粒载体pTRE-Fluc-Rluc质粒，即本发明所述重组质粒载体，质粒图谱见图1。该质粒包括两个核心部分：一部分从5’到3’顺序依次为Tet-responsivePtightpromoter片段、多克隆位点(MCS)和萤火虫荧光素酶基因Fluc；另一部分从5’到3’顺序为TK启动子片段和海肾萤火虫荧光素酶Rluc。

测序鉴定所构建的重组质粒载体，结果表明构建成功，测序结果如SEQIDNO:3所示。

实施例4：本发明重组质粒载体pTRE-Fluc-Rluc应用于乙肝病毒基因HBx的siRNA筛选

1、HBx基因的插入

设计引物从乙肝转基因小鼠肝脏RNA中扩增HBx基因，引物序列如下，序列表中如SEQIDNO:6-7所示：

Xe-f:5’-CCCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTG-3’(上游引物带HindIII位点)

Xe-r:5’-CATGCCATGGCGGCAGAGGTGAAAAAGTTG-3’(下游引物带NcoI位点)

将扩增得到的片段连接到pMD-18Teasy载体中，得到T-easy-HBx质粒。

使用限制性内切酶HindIII和NcoI分别酶切pTRE-Fluc-Rluc质粒和T-easy-HBx质粒。经酶切后，T-easy-HBx质粒被酶切为两条0.5Kb和3.3kb的片段，而pTRE-Fluc-Rluc质粒被酶切为一条约为6.2KB的片段。

琼脂糖电泳分别回收T-easy-HBx质粒0.5Kb的片段和pTRE-Fluc-Rluc质粒6.2Kb片段。

使用T4连接酶连接回收得到的两条片段，得到带有可诱导启动子的HBx与Fluc融合表达的，Rluc表达作为内参基因的质粒pTRE-HBx-Fluc-Rluc。

2、筛选最佳诱导药物剂量

使用HEK293Tet-OnAdvanced细胞株建立HBx筛选细胞模型，将该细胞培养于含10％FBS，800ng/ml的G418的DMEM高糖培养液中，待细胞状态良好时按照1×10⁵细胞/孔接种于24孔培养板中。培养24h，当细胞生长到60％-65％汇合时，使用lipofectamine2000，按照与质粒为2μl：0.8μg的比例/孔，转染pTRE-HBx-Fluc-Rluc质粒。转染6h后换液，换液后分别加入不同浓度的强力霉素(Doxycycline，Dox)诱导萤火虫荧光素酶的表达。24h后按照双荧光素酶检测试剂(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem)说明步骤检测荧光素酶的相对表达量。结果表明，Doxycycline的浓度在低于1000ng/ml时，随Dox浓度的增加，荧光素酶的相对表达量也增加；在高于1000ng/ml时，荧光素酶的表达量变化不大，因此，选择1000ng/ml为诱导剂量。

3、筛选抑制乙肝病毒基因HBx表达的siRNA序列

根据软件分析设计7条HBx的siRNA序列及一条NC(negativecontrol)序列(阴性对照)，并使用化学方法合成，序列信息如下，序列表中如SEQIDNO:8-15所示：

序号	siRNA序列(19-21nt)
		1	5’-GATCCTGCGCGGGACGTCCTT-3’
2	5’-GGTCTTACATAAGAGGACT-3’
		3	5’-GAGGACTCTTGGACTCTCA-3’
4	5’-GCAATGTCAACGACCGACC-3’
		5	5’-GGTCTTTGTACTAGGAGGC-3’
6	5’-TGCCCAAGGTCTTACATAA-3’
		7	5’-CCTTGAGGCATACTTCAAA-3’
NC	5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’

将HEK293Tet-OnAdvanced细胞株培养于含10％FBS，800ng/ml的G418的DMEM高糖培养液中，待细胞状态良好时按照1×10⁵细胞/孔接种于24孔培养板中。培养24h，当细胞生长到60％-65％汇合时，按照与lipofectimine2000：pTRE-HBx-Fluc-Rluc质粒：siRNA为2μl：0.1μg：20pmol/孔的比例分别转染pTRE-HBx-Fluc-Rluc质粒和7种不同的siRNA。转染6h后换新鲜培养液，换液后加入1000ng/ml的强力霉素(Doxycycline，Dox)诱导萤火虫荧光素酶的表达。24h后按照双荧光素酶检测试剂(Dual-LuciferaseReporterAssaySystem)说明检测荧光素酶的相对表达量。结果表明不同的序列对HBx基因的抑制效率不同，抑制率在10％-60％之间，其中，以序号5的siRNA的抑制率最高，对应序列如SEQIDNO:12所示，结果见图2。

实施例5：siRNA抑制乙肝病毒转基因小鼠肝脏中的HBx基因的mRNA表达

利用C57BL/6j-TgN(AlblHBV)44Bri乙型肝炎病毒转基因小鼠品系，在给药前通过外科手术取少许肝脏，小鼠恢复之后，按照实验剂量注射筛选得到的siRNA序列(实施例4中序号5)，连续给药三天，将小鼠分为两组，分别在给药后3天和7天时断颈处死小鼠，取小鼠肝脏。分别提取给药前后小鼠肝脏组织的总RNA，通过荧光定量PCR的方法，以β-actin基因作为内参，比较给药前后HBx基因的mRNA表达变化。结果表明给药后3天(第1-4号鼠)和7天(5、6号鼠)小鼠肝脏组织中HBx基因的mRNA表达都有明显的降低(图3)。

实施例6：通过加入不同剂量的诱导药物调控目的基因的表达量

使用HEK293Tet-OnAdvanced细胞株，将该细胞培养于含10％FBS，800ng/ml的G418的DMEM高糖培养液中，待细胞状态良好时按照1×10⁵细胞/孔接种于24孔培养板中。使用lipofectamine2000将pTRE-Fluc-Rluc质粒和siCHECK质粒转染到细胞中。转染6h后，换新鲜培养液并分别加入不同浓度的强力霉素(Doxycycline，Dox)诱导Fluc的表达。24h后使用双荧光素酶检测试剂检测荧光素酶的相对表达量。结果表明，带有可诱导启动子的质粒中荧光素酶的相对表达量随Dox加入剂量的增加而升高，而siCHECK的表达量没有变化(图4)。由于在pTRE-Fluc-Rluc质粒中，目的基因与Fluc为融合蛋白，因此可以通过改变Dox的加入量来选择基因合适的表达量，使其适用于过高表达或过低表达基因的研究。

实施例7：pTRE-Fluc-Rluc质粒应用于自杀基因HSV-TK研究

PCR方法扩增两端带有KpnI和NcoI酶切位点的HSV-TK基因片段，并将其插入到pTRE-Fluc-Rluc质粒中，构建成pTRE-HSVTK-Fluc-Rluc质粒。将构建的pTRE-HSVTK-Fluc-Rluc质粒与对照质粒pcDNA3.1-HSVTK使用lipofectamin2000分别转染到相同数量的HEK293Tet-OnAdvanced细胞内，由于HSV-TK基因编码的酶蛋白可以使一些无毒或低毒的前药(如GCV丙氧鸟苷)转化为强细胞毒性物质，因此如果HSV-TK表达且培养基中有GCV存在就会对细胞有杀伤作用。6h更换培养液加入GCV(丙氧鸟苷)。分别于转染后24h和48h在显微镜下观察细胞，见图5。结果表明，在未加入Dox时，转染pTRE-HSVTK-Fluc-Rluc质粒的细胞几乎不表达HSV-TK基因，因此培养24h和48h后细胞状态良好。而转染对照质粒pcDNA3.1-HSVTK的细胞，在24h后已有大量细胞死亡(图5)。由于pTRE-Fluc-Rluc质粒能够通过加入诱导剂的时间来调控基因的表达时间，可以使毒性基因只在短时间内表达，因此降低持续表达这类基因对细胞的损伤，使其应用于毒性基因的siRNA筛选及功能研究。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (21)

1.一种重组质粒载体，其特征在于，包含诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。

2.根据权利要求1所述重组质粒载体，其特征在于，所述诱导型启动子来源于四环素操纵子诱导调控系统、脱皮激素类诱导调控系统、FK506调控系统、纳巴霉素诱导调控系统或RU486诱导调控系统。

3.根据权利要求1所述重组质粒载体，其特征在于，所述组成型低表达启动子为TK启动子。

4.根据权利要求1所述重组质粒载体，其特征在于，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有多种限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸片段。

5.根据权利要求4所述重组质粒载体，其特征在于，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有选自AgeI、ApaI、AscI、Bpu1102I、BstEII、BstXI、Bsu36I、CvnI、DraIII、Eco47III、Eco56I、Eco72I、EcoRV、EspI、FseI、I-PpoI、MstII、NaeI、NruI、PacI、PflMI、PinAI、PmaCI、PmeI、SauI、SfiI、SnaBI、SpeI、SplI、SpoI、SrfI、SunI、SwaI、Tth111I中一种或两种以上限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

6.根据权利要求5所述重组质粒载体，其特征在于，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有AgeI、Eco47III、EcoRV、NaeI、SpeI限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

7.根据权利要求6所述重组质粒载体，其特征在于，所述多克隆位点双链核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。

8.根据权利要求1所述重组质粒载体，其特征在于，还包括抗性标记和polyA，所述polyA分别位于萤火虫荧光素酶基因3’端和海肾荧光素酶基因3’端。

9.根据权利要求1所述重组质粒载体，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

10.权利要求1-9任意一项所述重组质粒载体在筛选分析siRNA中的应用。

11.权利要求1所述的重组质粒载体的构建方法，其特征在于，包括：

提供诱导型启动子、多克隆位点、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因并连接各部件获得重组质粒载体；

其中，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。

12.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，包括：

从包含诱导型启动子、萤火虫荧光素酶基因、组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因的质粒中酶切获得各部件，然后与合成的多克隆位点通过酶切、连接获得重组质粒载体；

其中，所述诱导型启动子位于多克隆位点5’端，所述多克隆位点位于萤火虫荧光素酶基因5’端，所述组成型低表达启动子位于海肾荧光素酶基因5’端。

13.根据权利要求11或12所述构建方法，其特征在于，所述诱导型启动子来源于四环素操纵子诱导调控系统、脱皮激素类诱导调控系统、FK506调控系统、纳巴霉素诱导调控系统或RU486诱导调控系统。

14.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，所述组成型低表达启动子为TK启动子。

15.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有多种限制性内切酶酶切位点的寡核苷酸片段。

16.根据权利要求15所述构建方法，其特征在于，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有选自AgeI、ApaI、AscI、Bpu1102I、BstEII、BstXI、Bsu36I、CvnI、DraIII、Eco47III、Eco56I、Eco72I、EcoRV、EspI、FseI、I-PpoI、MstII、NaeI、NruI、PacI、PflMI、PinAI、PmaCI、PmeI、SauI、SfiI、SnaBI、SpeI、SplI、SpoI、SrfI、SunI、SwaI、Tth111I中一种或两种以上限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

17.根据权利要求16所述构建方法，其特征在于，所述多克隆位点为两端为KpnI酶切位点和NcoI酶切位点，且含有AgeI、Eco47III、EcoRV、NaeI、SpeI限制性酶切位点的寡核苷酸片段。

18.根据权利要求17所述构建方法，其特征在于，所述多克隆位点双链核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示。

19.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，还包括在所述重组质粒载体上插入抗性标记和polyA，所述polyA分别位于萤火虫荧光素酶基因3’端和海肾荧光素酶基因3’端。

20.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，所述提供诱导型启动子和萤火虫荧光素酶基因具体为：

使用限制性内切酶HindIII和XbaI分别酶切pTRE-tight质粒和pGL3-control质粒，酶切后使用T4连接酶，连接酶切获得的1.7Kb的pGL3-control质粒片段和2.6Kb的pTRE-tight质粒片段获得含有Tet-responsivePtightpromoter和萤火虫荧光素酶基因的质粒pTRE-Fluc。

21.根据权利要求11所述构建方法，其特征在于，所述提供组成型低表达启动子和海肾荧光素酶基因具体为：

采用两端分别带有NsiI和SalI酶切位点的TK启动子的引物，从pRL-TK质粒上扩增TK启动子片段；

使用限制性内切酶NsiI和SalI酶切pRL-null质粒和TK启动子片段，酶切后使用T4连接酶，连接酶切获得的3.3Kb的pRL-null质粒片段和TK启动子片段，获得含有组成型低表达TK启动子和海肾荧光素酶基因的质粒pTK-Rluc。