CN108587933A - 组成诱导型酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组成诱导型酵母工程菌及其构建方法。同时包含需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中，通过一次抗生素筛选即可获得同时组成型和诱导型表达所需蛋白的酵母基因工程菌，以表达β‑甘露聚糖酶为例，同单独组成型或诱导型表达β‑甘露聚糖酶的工程菌相比，β‑甘露聚糖酶发酵活力显著提高；该方法操作简单，可用于提高其它异源蛋白在酵母基因工程菌中的表达水平。

Description

组成诱导型酵母工程菌及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，本发明涉及可同时组成型和诱导型表达蛋白或多肽的酵母基因工程菌及其构建方法。
背景技术
毕赤酵母表达系统被广泛用作于异源蛋白的表达，其中，由GAP启动子启动的组成型表达和AOX1启动子启动的诱导型表达应用最为广泛，而两者结合起来可大大提高异源蛋白的表达水平。通过广泛查阅国内外文献和专利发现，目前组成型和诱导型共表达的毕赤酵母基因工程菌的构建均是通过两次转化、两次筛选和双抗性筛选(J.M.Wu,et al.,Enzyme and Microbial Technology,33(4):453–459；Xiuping He,et al.,Enzyme andMicrobial Technology,43(1):13-18；中国专利200910191241.8)。目前的方法费时、费力且价格昂贵，而本发明采用将组成型和诱导型表达盒串联起来通过一次转化和单抗性筛选即可获得相应的毕赤基因工程菌。
β-甘露聚糖酶是一类水解β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的内切水解酶，属于半纤维素酶类。其可水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖。甘露聚糖在自然界中含量丰富，广泛存在于植物细胞中，如大豆、谷类种子、魔芋精粉、田青胶、角豆胶、澳大利亚蒲葵等(Dhawan S.&Kaur J.,Critical reviews in biotechnology,27(4):197-216)。β-甘露聚糖酶广泛应用于造纸、食品、医药、纺织、饲料和石油开采等领域，成为近年来研究的热点(van Zyl W,et al.,Process Biochemistry,45(8):1203-1213)。
目前，在微生物(细菌、放线菌和真菌)、植物和低等动物中均发现β-甘露聚糖酶的存在(Chauhan PS,et al.,Applied microbiology and biotechnology,93:1817-1830)。真菌和细菌来源的β-甘露聚糖酶具有宽泛的温度和pH作用范围，催化活力高，活力稳定而具有显著的工业应用优势(Akino,et al.,Appl.Microbial Biotech,26:323-327)。由于野生菌株发酵水平低，导致β-甘露聚糖酶价格昂贵，不能满足工业应用需求。近年来，国内外采用基因工程手段以提高β-甘露聚糖酶表达水平，如中国发明专利201110086452.2和201110410537.1，但将组成型和诱导型表达盒串联起来通过一次转化和单抗性筛选构建高效表达β-甘露聚糖酶的毕赤基因工程菌还未见报道。
α-淀粉酶是一种内切葡萄糖苷酶，作用于淀粉糖链内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键以降低黏度起到液化作用。中温α-淀粉酶是一种重要的工业用酶，广泛用于食品、酿造、饲料、药品、纺织和日化用品等领域，市场需求量大。欧美国家着手该酶的研发较早，近年来采用分子育种技术不断进行生产菌株更新换代，发酵水平较高。我国进行中温α-淀粉酶的研发起步晚，多通过购买国外技术或采用传统育种技术获得生产菌株，现代分子定向育种技术未被充分利用，发酵水平落后于欧美国家。近年来，国内外采用基因工程手段以提高中温α-淀粉酶表达水平，如中国发明专利201110006353.9，但将组成型和诱导型表达盒串联起来通过一次转化和单抗性筛选构建高效表达中温α-淀粉酶的毕赤基因工程菌还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有组成型和诱导型共表达异源蛋白的毕赤酵母基因工程菌构建技术，需要两次转化、两次筛选和双抗性筛选的不足，提供一种通过一次转化和筛选即可获得组成型和诱导型共表达异源蛋白的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法。
组成诱导型酵母工程菌，是将含有需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中获得的酵母工程菌。
所述的组成诱导型酵母工程菌：所述的组成型表达盒是包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达盒，所述的诱导型表达盒是包含诱导型醇氧化酶启动子的表达盒，所述的酵母为毕赤酵母。
所述的组成诱导型酵母工程菌：所述的需要表达的蛋白基因是能被毕赤酵母正确表达的蛋白基因，优选包括：β-甘露聚糖酶基因或中温α-淀粉酶。
所述的组成诱导型酵母工程菌：β-甘露聚糖酶基因序列如SEQ ID No.1所示，中温α-淀粉酶基因序列如SEQ ID No.2所示。
所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将需要表达的蛋白基因序列克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的质粒的多克隆位点中，得到组成型表达质粒；
(2)将步骤(1)中所述的需要表达的蛋白基因序列克隆到包含诱导型醇氧化酶启动子质粒的多克隆位点中，得到诱导型表达质粒；
(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶线性化组成型表达质粒和诱导型表达质粒，所述的能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶命名为X；在上述质粒的非表达盒区域内任一限制性内切酶位点都是唯一的；
(4)回收两种质粒中含需要表达的蛋白基因的片段，连接两个片段，命名为组成诱导型质粒；
(5)将上述组成诱导型质粒用限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过平板筛选获得组成诱导型酵母工程菌。
所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，
步骤(1)将需要表达的蛋白基因克隆到pGAPZαA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pGAPZα-gene；
步骤(2)将需要表达的蛋白基因克隆到pPICZZαA/B/C或pPICZ6αA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pPICZα-gene。
步骤(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶X线性化pGAPZα-gene和pPICZα-gene。
步骤(4)回收BamHI、X线性化pGAPZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BglП、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene；或回收BglП、X线性化pGAPα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BamHI、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，也命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene。
当克隆的基因为β-甘露聚糖酶基因时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-man，质粒pPICZα-gene为pPICZα-man，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-man-pPICZα-man，
当克隆的基因为中温α-淀粉酶时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-amy，质粒pPICZα-gene为pPICZα-amy，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-amy-pPICZα-amy。
步骤(5)将组成诱导型质粒用任一位于GAP启动子或AOX1启动子序列内的限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过含Zeocin或Blasticidin的平板筛选获得表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株。
现有技术中进行双基因片段的连接时，一般是直接将一个质粒用BglII和BamHI进行双酶切获得片段A，另一个质粒用BamHI进行单酶切获得片段B，然后回收相应片段进行连接，此外BamHI单酶切的质粒还需要经过CIAP脱磷处理后才能用于连接，是为了防止载体自连。连接后转化大肠杆菌后还需要挑取单克隆培养，培养后再提取质粒用BglII和BamHI进行双酶切检测插入的顺序是否正确，因为两端都是相同的缺口，连接的时候会有正向和反向，检验正确的才能算获得了双拷贝质粒。本发明避免了脱磷处理步骤和挑单克隆培养提质粒酶切验证的步骤，省时省力。此外，现有技术仅仅是针对于组成型+组成型，诱导型+诱导型的质粒组合，还没有出现组成型+诱导型的质粒组合。
本发明首次将包含需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中，通过一次抗生素筛选即可获得同时组成型和诱导型表达所需蛋白的酵母基因工程菌。以表达β-甘露聚糖酶为例，同单独组成型或诱导型表达β-甘露聚糖酶的工程菌相比，β-甘露聚糖酶发酵活力显著提高。而且该基因工程菌在发酵前期的菌体生长(未加甲醇之前)阶段也可大量产酶；与单独组成型基因工程菌相比，该基因工程菌在菌体湿重达到最大后仍能继续快速产酶，而一般的组成型基因工程菌在菌体湿重达到最大以后几乎不再产酶。同单独的组成型或诱导型基因工程菌相比，此工程菌显然具有更大的应用优势，可广泛用于高效表达蛋白质或多肽。本发明方法操作简单，也可用于提高其它异源蛋白在酵母基因工程菌中的表达水平。
本发明还成功的构建了组成型和诱导型共表达中温α-淀粉酶的重组菌株，将该菌株于无葡萄糖的YPD培养基中，并加入0.5-1.0％甲醇；每12h加入0.5-1.0％的甲醇并取样测定上清中中温α-淀粉酶酶活。摇瓶诱导表达96小时后，发酵液中中温α-淀粉酶活达最大，为356U/mL，是组成型基因工程菌的1.25倍，诱导型基因工程菌的1.47倍。
因此，本发明的构建方法不仅可以用于β-甘露聚糖酶基因和中温α-淀粉酶基因的表达，还包括所有能被毕赤酵母正确表达的蛋白基因的表达。
附图说明
图1：本发明中β-甘露聚糖酶基因的PCR扩增。泳道M为DNA marker；泳道1为PCR扩增的β-甘露聚糖酶基因man。
图2：本发明构建的重组质粒pGAPZα-man和pPICZα-man的琼脂糖凝胶电泳检测结果。泳道M为DNA marker；泳道1为重组质粒pGAPZα-man的BamHI和内切酶X(位于非表达盒区域任一内切酶)双酶切产物；泳道2为重组质粒pPICZα-man的BamHI和内切酶X双酶切产物；泳道3为重组质粒pGAPZα-man的BglП和内切酶X双酶切产物；泳道4为重组质粒pPICZα-man的BglП和内切酶X双酶切产物。
图3：本发明构建的重组质粒pGAPZα-man-pPICZα-man的琼脂糖凝胶电泳检测结果。泳道M为DNA marker；泳道1为重组质粒pGAPZα-man-pPICZα-man的BamHI酶切产物。
图4：本发明构建的组成型(GAP，发酵培养60h)、诱导型(AOX1，发酵培养96h)和组成诱导型共表达(GAP-AOX1，发酵培养96h)酵母基因工程菌在摇瓶水平的的发酵活力，A为β-甘露聚糖酶，B为中温α-淀粉酶。
图5：本发明构建的组成诱导型酵母基因工程菌在50L发酵罐中的β-甘露聚糖酶发酵活力。■为发酵液中β-甘露聚糖酶酶活，●为菌体湿重。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，不会对本发明形成限制。
实验材料和试剂
1、菌株及载体：表达载体pGAPZαA/B/C(包括pGAPZαA、pGAPZαB和pGAPZαC三种载体中的任一种)、pPICZZαA/B/C(包括pPICZZαA、pPICZZαB和pPICZZαC三种载体中的任一种)和pPICZ6aΑ/B/C(pPICZ6aΑ、pPICZ6aB和pPICZ6aC三种载体中的任一种)，毕赤酵母菌株X-33、GS115、SMD1168或KM71H购自于Invitrogen公司。
2、试剂：T4连接酶、限制性内切酶、Pfu DNA Polymerase、反转录试剂盒购自于Fermentas公司，RNA提取试剂盒购自于Promega公司，刺槐豆角购自于Sigma公司，其它试剂均为国产试剂，可从一般的生化试剂公司购买。
3、培养基：
(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7.0)和LLB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，pH7.4)；在LB或LLB液体培养基中加入1.5％琼脂粉得到相应的固体培养基。
(2)酵母菌培养基YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖)和YPDS(2％蛋白胨，1％酵母粉，2％葡萄糖，1M山梨醇)；在YPD或YPDS液体培养基中加入1.5％琼脂粉得到相应的固体培养基。
4、补料培养基A：称500g葡萄糖溶于1L水中，于121℃灭菌15min冷却后加入12mL的PTM1溶液。
5、补料培养基B：甲醇1L，加入12mL的PTM1溶液。
6、PTM1溶液：6.0g/L CuSO4·5H2O,0.08g/L NaI,3.0g/L MnSO4·H2O,0.2g/LNa2MoO4·2H2O,0.02g/L H3BO3,0.5g/L CoCl2,20.0g/LZnCl2,65.0g/L FeSO4·7H2O,0.2g/Lbiotin,5ml/L浓H2SO4。以上溶液用0.22μM滤膜过滤除菌。
下述实施例中所采用方法如无特殊说明均为常规的方法；所述引物，序列测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
实施例1、β-甘露聚糖酶及其编码基因的获得
本发明中的β-甘露聚糖酶为来源于真菌Aspergillus sp.T16的β-甘露聚糖酶的改造序列，该酶的氨基酸序列及其对应编码基因序列的获得参见中国发明专利CN201310190483.1。
本发明中的β-甘露聚糖酶对应的编码基因序列如SEQ ID No.1。各种氨基酸和碱基在本发明序列中的简写如表1，β-甘露聚糖酶氨基酸序列中第34、55和129位点氨基酸为脂肪族类氨基酸，即第34、55和129位的Xaa可以为A、G、I、L或V；第101、170和204位点氨基酸为带电荷类氨基酸，即第101、170和204位的Xaa可以为D、E、R、K或H；第54、56、112和306位点氨基酸为芳香族类氨基酸，即第54、56、112和306位的Xaa可以为F、W、Y、H；SEQ ID No.1所示的序列中，s可以为g或c；k可以为g或t；y可以为c或t；b可以为t、c或g；d可以为t、a或g；r可以为a或g；v可以为c、a或g；n可以为a、t、c或g。
表1各类氨基酸和碱基在本发明序列中的简写
实施例2、组成型或诱导型表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌的构建
以中国发明专利CN201310190483.1中改造获得的β-甘露聚糖酶基因man为模板，以ManF-5CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCTTCGCCAGCACCTCCGG3和ManR-5GCTCTAGATCAAGCACTACCAATAGCAGCAACATG3为引物，进行PCR扩增，PCR扩增参数为：95℃变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃充分延伸15min。用Xho I和Xba I双酶切pGAPZαA、pPICZZαA质粒，同时双酶切上述PCR产物，用T4连接酶将双酶切PCR产物与双酶切质粒纯化产物进行连接。将连接产物通过热激法转入E.coli DH5α，挑取阳性克隆子菌落PCR鉴定后测序。提取测序正确的重组质粒pGAPZα-man和pPICZα-man，电击转化毕赤酵母X33，涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS平板，30℃培养2-3天。
挑取上述组成型β-甘露聚糖酶重组菌株于YPD培养基中，28℃，250rpm培养60小时后，β-甘露聚糖酶重组菌株发酵液中酶活达到最大，为539U/mL(图4)。
挑取上述诱导型β-甘露聚糖酶重组菌株接种于无葡萄糖的YPD培养基中，并加入0.1-1.0％甲醇；每12h加入0.5-1.0％的甲醇并取样测定上清中甘露聚糖酶酶活。摇瓶诱导培养96h后，发酵酶活达最大为457U/mL(图4)。
实施例3、组成型和诱导型共表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌的构建
1、β-甘露聚糖酶组成型和诱导型共表达载体的构建
提取实施例2中正确构建的组成型质粒pGAPZα-man和诱导型质粒pPICZα-man，用限制性内切酶BamHI和内切酶NcoI线性化pGAPZα-man，BglП和内切酶NcoI线性化pPICZα-man(图2)；通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收以上线性化产物中含β-甘露聚糖酶基因的片段，用T4连接酶连接以上两个片段，命名为pGAPZα-man-pPICZα-man；将连接产物通过热激法转入大肠杆菌，挑取阳性克隆子菌落PCR鉴定后测序。
2、β-甘露聚糖酶组成型和诱导型共表达酵母基因工程菌的构建
提取上述质粒pGAPZα-man-pPICZα-man用BglП线性化(图3)后电击转化毕赤酵母菌株X33，通过含Zeocin(或Blasticidin)的平板筛选获得可同时组成型和诱导型表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株。
挑取上述组成型和诱导型共表达β-甘露聚糖酶的重组菌株于无葡萄糖的YPD培养基中，并加入0.5-1.0％甲醇；每12h加入0.5-1.0％的甲醇并取样测定上清中β-甘露聚糖酶酶活。摇瓶诱导表达96小时后，发酵液中β-甘露聚糖酶酶活达最大，为701U/mL，是组成型基因工程菌的1.32倍，诱导型基因工程菌的1.50倍(图4)。
3、β-甘露聚糖酶组成型和诱导型共表达酵母基因工程菌高密度发酵
挑取上述组成型和诱导型共表达β-甘露聚糖酶的重组菌株接种于YPD培养基中，28℃，250rpm培养24小时后按1.0-10.0％的接种量接种到2L YPD培养基中，温度28℃，按如下方式进行高密度发酵调控：
接种6-14小时后，培养基中葡萄糖含量降至0.5％以下，此时开始流加补料培养基A；培养基中的葡萄糖含量用DNS法检测，流加策略为发酵培养基溶氧量反馈控制，溶氧量由溶氧电极测定，范围为0-100％，流加葡萄糖使溶氧量维持在20％-30％之间，原理是毕赤酵母在葡萄糖(碳源)充足时，活性变高，耗氧量增高，发酵培养基的溶氧量降低；如果葡萄糖缺乏，酵母没有可利用的碳源，活性变差，发酵培养基的溶氧量就会升高，这时只要设置发酵罐在溶氧量高于30％时缓慢泵入补料培养基A补充碳源，待溶氧量降低后停止补料，下一次高于30％时再次泵入补料培养基A，依次循环。
当菌体湿重达到0.15-0.4g/ml左右时，停止流加补料培养基A，待溶氧开始快速上升一段时间后一次加入0.5-1.0％的补料培养基B。这是毕赤酵母碳源转换的过程，补料培养基A碳源为葡萄糖，补料培养基B碳源为甲醇，因为存在葡萄糖阻遏效应，有葡萄糖存在的时候，毕赤酵母是无法利用甲醇的，所以只有等葡萄糖消耗完毕的时候才能加入甲醇，因此，溶氧快速上升的时候即可视为葡萄糖被消耗完毕，大约为半个小时，此时需要完全消耗培养基中的葡萄糖。
待溶氧再次快速升高后，开始流加补料培养基B，根据发酵罐自动控制系统，会不断开始或停止流加，使溶氧保持相对稳定。发酵过程中每12小时取样测定菌体湿重和发酵液中的β-甘露聚糖酶。
按以上方式发酵培养96小时后，发酵液上清中β-甘露聚糖酶酶活达3800U/mL，发酵液经板框压滤除去菌体后即可获得液体β-甘露聚糖酶。从图5可以看出，与单独甲醇诱导型基因工程菌不同，该基因工程菌在发酵前期的菌体生长(未加甲醇之前)阶段也可大量产酶；与单独组成型基因工程菌相比，该基因工程菌在菌体湿重达到最大后仍能继续快速产酶，而一般的组成型基因工程菌在菌体湿重达到最大以后几乎不再产酶。同单独的组成型或诱导型基因工程菌相比，此工程菌显然具有更大的应用优势，可广泛用于高效表达蛋白质或多肽。
采用DNS法对本发明制备的高温β-甘露聚糖酶进行活性分析。具体测量方法如下，取500μL稀释合适倍数的β-甘露聚糖酶溶液加入到500μL溶于0.1M磷酸盐缓冲液的1.0％的刺槐豆角(pH4.5)中，于80℃反应10min后，加入1000μL DNS溶液，沸水煮5min后用冷水冷却，于540nm测量吸光度。
酶活定义：在pH4.5、80℃、1min催化终浓度为0.5％的刺槐豆角(Sigma G0753)产生1μmol甘露糖所需要的酶量为一个酶活单位。
本发明的实施例虽然采用的是中国发明专利CN201310190483.1中的β-甘露聚糖酶基因序列，但采用其他β-甘露聚糖酶基因序列经过本发明方法构建后得到的工程菌也与本发明一样，比相应的单独的组成型或诱导型基因工程菌更具优势。
实施例4、组成型和诱导型共表达中温α-淀粉酶的酵母基因工程菌的构建
1、中温α-淀粉酶编码基因的合成与克隆
根据GenBank编号J01542.1的序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成长度为1449的中温α-淀粉酶(α-amylase)基因，具体见SEQ ID No.2，并且采用本发明的方法亚克隆至载体质粒pGAPZαA和pPICZαA，命名为pGAPZα-amy-pPICZα-amy。
2、中温α-淀粉酶组成型和诱导型共表达酵母基因工程菌的构建
提取上述质粒pGAPZα-amy-pPICZα-amy用BglП线性化后电击转化毕赤酵母菌株X33，通过含Zeocin(或Blasticidin)的平板筛选获得可同时组成型和诱导型表达中温α-淀粉酶的酵母基因工程菌株。
挑取上述组成型和诱导型共表达中温α-淀粉酶的重组菌株于无葡萄糖的YPD培养基中，并加入0.5-1.0％甲醇；每12h加入0.5-1.0％的甲醇并取样测定上清中中温α-淀粉酶酶活。摇瓶诱导表达96小时后，发酵液中中温α-淀粉酶活达最大，为356U/mL，是组成型基因工程菌的1.25倍，诱导型基因工程菌的1.47倍(图4)。
采用国家标准GB T 24401-2009中的方法对本发明制备的中温α-淀粉酶进行活性分析。
本发明的实施例虽然采用的是已报道的中温α-淀粉酶基因序列，但其目的是为了证明采用基因序列经过本发明方法构建后得到的工程菌也与本发明一样，比相应的单独的组成型或诱导型基因工程菌更具优势。
序列表
<110> 中南大学
<120> 组成诱导型酵母工程菌及其构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1035
<212> DNA
<213> 曲霉(Aspergillus sp. )
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> s为g或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> n为a、t、c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> b为t、c或g
<220>
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<222> (102)..(102)
<223> n为a、t、c或g
<220>
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<222> (160)..(160)
<223> y为c或t
<220>
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<222> (161)..(161)
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<222> (168)..(168)
<223> b为t、c或g
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<222> (301)..(301)
<223> v为c、a或g
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<222> (302)..(302)
<223> r为a或g
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<222> (303)..(303)
<223> n为a、t、c或g
<220>
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<222> (334)..(334)
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<222> (335)..(335)
<223> d为t、a或g
<220>
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<222> (336)..(336)
<223> b为t、c或g
<220>
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<222> (385)..(385)
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<222> (386)..(386)
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<220>
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<222> (508)..(508)
<223> v为c、a或g
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<222> (509)..(509)
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<220>
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<222> (510)..(510)
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<222> (610)..(610)
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<220>
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<222> (611)..(611)
<223> r为a或g
<220>
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<222> (612)..(612)
<223> n为a、t、c或g
<220>
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<222> (916)..(916)
<223> y为c或t
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<222> (917)..(917)
<223> d为t、a或g
<220>
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<222> (918)..(918)
<223> b为t、c或g
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<222> (1017)..(1017)
<223> k为g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1032)..(1032)
<223> y为c或t
<400> 1
tccttcgcca gcacctcsgg cctccaattc accattgacg gagaaactgg ctacttcgca 60
ggtacgaaca gctactggat cggtttcctc actgacaacn bngacgtcga cctcgtcatg 120
ggccacctga agtcgtccgg cctcaagatc ctccgcgtgy dbnbnydbaa cgatgtcacc 180
tcgcagccct cctccggcac agtctggtac caactgcacg aggacggcaa atcgactatt 240
aacacgggtg ccgacggtct ccagcgcctc gactacgtcg tctcgtctgc cgaacaacac 300
vrnatcaaac tcatcatcaa cttcgtcaac tacydbaccg actacggtgg tatgtctgcg 360
tacgtgagcg cgtatggcgg atccnbngag acggatttct ataccagtga taccatgcag 420
agtgcctatc agacatatat caagacggtc gtggagcggt acagtaactc ctcggcggtg 480
tttgcgtggg agttggcgaa tgagccgvrn tgtccgagtt gcgatacttc tgtgttgtat 540
aactggattg agaagacgag taagtttatt aaggggttgg atgcggatcg tatggtttgt 600
attggtgatv rnggcttcgg tctcaacatc gactcggacg gcagctaccc ttatcaattc 660
tccgagggct tgaactttac gatgaacctc ggtatcgata ctattgactt tggtaccctc 720
cacttgtacc ctgatagctg gggcacctcc gacgactggg gcaacggctg gatcaccgcc 780
cacggcgcag cctgcaaagc ggccggcaag ccatgtctcc tggaggaata cggagtcacc 840
tcgaaccact gcagtgtgga gggctcgtgg cagaagacag cgctcagcac aacgggcgtc 900
ggcgcggatc tgttcydbca gtatggtgat gatttgagta ccgggaagtc gccggatgat 960
gggaatacta tctactatgg gactagtgat tatcagtgcc tggtgacgga tcatgtkgct 1020
gctattggta gygct 1035
<210> 2
<211> 1452
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 2
gtaaatggca cgctgatgca gtattttgaa tggtatacgc cgaacgacgg ccagcattgg 60
aaacgattgc agaatgatgc ggaacattta tcggatatcg gaatcactgc cgtctggatt 120
cctcccgcat acaaaggatt gagccaatcc gataacggat acggacctta tgatttgtat 180
gatttaggag aattccagca aaaagggacg gtcagaacga aatacggcac aaaatcagag 240
cttcaagatg cgatcggctc actgcattcc cggaacgtcc aagtatacgg agatgtggtt 300
ttgaatcata aggctggtgc tgatgcaaca gaagatgtaa ctgccgtcga agtcaatccg 360
gccaatagaa atcaggaaac ttcggaggaa tatcaaatca aagcgtggac ggattttcgt 420
tttccgggcc gtggaaacac gtacagtgat tttaaatggc attggtatca tttcgacgga 480
gcggactggg atgaatcccg gaagatcagc cgcatcttta agtttcgtgg ggaaggaaaa 540
gcgtgggatt gggaagtatc aagtgaaaac ggcaactatg actatttaat gtatgctgat 600
gttgactacg accaccctga tgtcgtggca gagacaaaaa aatggggtat ctggtatgcg 660
aatgaactgt cattagacgg cttccgtatt gatgccgcca aacatattaa attttcattt 720
ctgcgtgatt gggttcaggc ggtcagacag gcgacgggaa aagaaatgtt tacggttgcg 780
gagtattggc agaataatgc cgggaaactc gaaaactact tgaataaaac aagctttaat 840
caatccgtgt ttgatgttcc gcttcatttc aatttacagg cggcttcctc acaaggaggc 900
ggatatgata tgaggcgttt gctggacggt accgttgtgt ccaggcatcc ggaaaaggcg 960
gttacatttg ttgaaaatca tgacacacag ccgggacagt cattggaatc gacagtccaa 1020
acttggttta aaccgcttgc atacgccttt attttgacaa gagaatccgg ttatcctcag 1080
gtgttctatg gggatatgta cgggacaaaa gggacatcgc caaaggaaat tccctcactg 1140
aaagataata tagagccgat tttaaaagcg cgtaaggagt acgcatacgg gccccagcac 1200
gattatattg accacccgga tgtgatcgga tggacgaggg aaggtgacag ctccgccgcc 1260
aaatcaggtt tggccgcttt aatcacggac ggacccggcg gatcaaagcg gatgtatgcc 1320
ggcctgaaaa atgccggcga gacatggtat gacataacgg gcaaccgttc agatactgta 1380
aaaatcggat ctgacggctg gggagagttt catgtaaacg atgggtccgt ctccatttat 1440
gttcagaaat aa 1452
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
ccgctcgaga aaagagaggc tgaagcttcc ttcgccagca cctccgg 47
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gctctagatc aagcactacc aatagcagca acatg 35

Claims (10)

1.组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：是将含有需要表达的蛋白基因的组成型表达盒和诱导型表达盒串联在一起导入酵母宿主细胞中获得的酵母工程菌。
2.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：所述的组成型表达盒是包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达盒，所述的诱导型表达盒是包含诱导型醇氧化酶启动子的表达盒，所述的酵母为毕赤酵母。
3.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：所述的需要表达的蛋白基因是能被毕赤酵母正确表达的蛋白基因，优选包括：β-甘露聚糖酶基因或中温α-淀粉酶。
4.根据权利要求1所述的组成诱导型酵母工程菌，其特征在于：β-甘露聚糖酶基因序列如SEQ ID No.1所示，中温α-淀粉酶基因序列如SEQ ID No.2所示。
5.权利要求1-4任一项所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将需要表达的蛋白基因序列克隆到包含三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的质粒的多克隆位点中，得到组成型表达质粒；
(2)将步骤(1)中所述的需要表达的蛋白基因序列克隆到包含诱导型醇氧化酶启动子质粒的多克隆位点中，得到诱导型表达质粒；
(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶线性化组成型表达质粒和诱导型表达质粒，所述的能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶命名为X；
(4)回收两种质粒中含需要表达的蛋白基因的片段，连接两个片段，命名为组成诱导型质粒；
(5)将上述组成诱导型质粒用限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过平板筛选获得组成诱导型酵母工程菌。
6.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
步骤(1)将需要表达的蛋白基因克隆到pGAPZαA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pGAPZα-gene；
步骤(2)将需要表达的蛋白基因克隆到pPICZZαA/B/C或pPICZ6αA/B/C的多克隆位点中，构建的质粒命名为pPICZα-gene。
7.根据权利要求6所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
步骤(3)用限制性内切酶BamHI或BglП和能切割非表达盒区域的任一限制性内切酶X线性化pGAPZα-gene和pPICZα-gene。
8.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
步骤(4)回收BamHI、X线性化pGAPZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BglП、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene；或回收BglП、X线性化pGAPα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段和BamHI、X线性化pPICZα-gene中含需要表达的蛋白基因的片段，连接以上两个片段，也命名为pGAPZα-gene-pPICZα-gene。
9.根据权利要求8所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
当克隆的基因为β-甘露聚糖酶基因时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-man，质粒pPICZα-gene为pPICZα-man，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-man-pPICZα-man，
当克隆的基因为中温α-淀粉酶时，质粒pGAPZα-gene为pGAPZα-amy，质粒pPICZα-gene为pPICZα-amy，pGAPZα-gene-pPICZα-gene为pGAPZα-amy-pPICZα-amy。
10.根据权利要求5所述的组成诱导型酵母工程菌的构建方法，其特征在于，
步骤(5)将组成诱导型质粒用任一位于GAP启动子或AOX1启动子序列内的限制性内切酶线性化后转化毕赤酵母菌株，通过含Zeocin或Blasticidin的平板筛选获得表达β-甘露聚糖酶的酵母基因工程菌株。
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